T. A. BROWNProfessor of Biomolecular Archaeology,Department of Biomolecular Scences,

UMISI Manchester, UK

CLONAGEM/\

GENICAE ANALISE DE DNA

Uma introduo4a Edio

Tiaduo:Henrique Bunselmeyer Ferreira

Bilogo, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).Mestre em Gentica, UFRGS.

Doutor em Gentica e Biologia Molecular, UFRGS.Ps-Doutorado no Albert Einstein coltege of Medicine, Nova Iorque, EUA.

Professor adjunto IV do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, uFRGS.orientador do Programa de Ps-Graduao em Biologia celular e Molecular, UFRGS.

Pesquisador associado do Centro de Biotecnologia, UFRGS.Luciane Maria Pereira Passaglia

Biloga. UFRGS.Doutora em Gentica e Biologia Molecular, UFRGS.

Ps-Doutorada na Universidade da Califmia, Berkeley, EUA.Professora adjunta IV do Departamento de Gentica, UFRGS.

orientadora do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Biotogia Molecular, UFRGS.Pesquisadora associada do centro de Biotecnologia, UFRGS, na reade FixaoBiolgica do Nitrognio, e do Departamento de Gentica, UFRGS, nas ireas de

Gentica Molecular de Microrganismos e Gentica e Biotecnologia vegetal.

2003

1a Edio

do DNA recombi-ias sobre esses as-

For parte do leitor -de um estudan-

to A em Biologia.os termos no-

e reforar o tex-el.

r anos de bioqumi-p'ara alguns pesqui-

nmero de bilo-cionagem gnica po-

texto poder ser-recombinante, para

s excelentes livros-ito considervel pe-

esses livros-textos. quej tiveram al-

fornecer. Minhao livro de Old e

devo agradecer avrs- projeto seguisse o\ottingham, e com

: todos os effos ea maior parte

certa ou a frase ade-

i,

,I

I

Parte 1

Parle2

Sumrio

Princpios Bsicos da Clonagem Gnica e daAnlise de DNA... .... 11

1 Por que a Clonagem Gnica e aAnlise de DNA So Importantes............... 132 Veculos pata a Clonagem Gnica: Plasmdeos e Bacterifagos ............. ...... 253 Purificao de DNA a Partir de Clulas Vivas.......... .................. 394 Manipulao de DNA Purificado........... .................. 635 Introduo de DNA em Clulas Vivas ......... ............ 956 Vetores de Clonagem para E. coli............. ............. 1157 Vetores de Clonagem para Eucariotos .............. .....I3-98 Como Obter um Clone de um Gene Especfico........... ............. 1659 A Reao em Cadeia da Polimerase............... ....... 187

Aplicaes da Clonagem Gnica e da Anlise deDNA na Pesquisa .203Estudando aLocalizao e a Estrutura do Gene ....205Estudando a Expresso e a Funo dos Genes.. .....225Estudando Genomas ........253

t

II,,

tI

*

ry

10

11

12

T. A. Brown

:.:f \^-F!

':-r::-.:!-':::.:.--i:i::::l::orit:l::trt:a\::-li)ilia,'::l:i:.',:r:.:::!tt:\':q EWi ; m"un mu anb erp m1-3su LqTuq m : .*'"ro,

"r o,.rq *qp:q apn,J 1c o :nb e u:1-eu-orsrq ssou Ep oeienmuo-- e a a:o-r :nb:odsfllm r[T ;ru a5-;NJ u- trF trf 'Lcm o roro r zFru r:nu m. ?]lo-r l-,.l-aF J :!'w :n o otrro anb r "c:1'o-remq m lL ruE:p

rc xmh o *F'dng.sJd:u:[ m:]rl:ji&: ro ? ilL-'rq;E oE\ LIEF5 ':(Ja uou o zra\ Eol rti( L':-qutu\..-o-\L::'{-ni n:s o on:nb \Tt" :r

o

*i9t!tII

IELGorl

10 SuMRto

Parte 3Aplicaes da Clonagem Gnica e da Anlise deDNA na Biotecnologia........

..2ls13 Produo de Protenas a partir de Genes Clonados

..................277Clonagem Gnica e Anlise de DNA na Medicina

...................2ggClonagem Gnica e Anlise de DNA naAgricultura................................... 319Clonagem Gnica e Anlise de DNA na Cincia Forense

........ 335Glossrrio

.................... .......347ndice

............367

'::::r1nor rrrd ocinri: J^il oru .rl3 :nb ttcl o :.rc1os oqlg o t.ltd :ur:u atur 1ii.:lf:r:J:r:irnrl-aruo--1 lrr.ftf,u!-rJsrreieuos::t:oPL{netlopu?n,.'ossrnoursuuuanberolrog'oqlg'?rPoJlnoun::duasualsel4i'oroq:Jp srp g w'^oq: uau anb rrp uaa'tsJl oqlfq un e sru'f,oJ ? opuq rrqll:q apod 1os o anb erp uaa'zr:olsrq rssou tp otSrnurluo: r 9 a:ol anb:o6opuus uJ f,o,\ 9s'sss: ouor serp ug opunu op roreu r'rpn8e rzalsrr Bun 1lo^ :J ze;s:p as rapur anb o opnl anb erp uaa'o:unq un eru rr:8apa: anb o opnl atuada: ap g'rr:uasnr ens e ef,orl3 opqes op of,uFs 'lep uou o zrp ?JoJ 9 os o'lqueurv'of,sriu?f,1 'Ied nas o oes anb stlp uL,

t415

I6

cz

*F9t!

.IELGna

I ....277L................ .... zes

L ... 3ret .... 33s;

PARTE 1PRINCIPIOS BASICOS DA

CLONAGEM GNICA E DAANALISE DE DNA

i

l--................ .... 367I

i

Ir..i(a:Ilf \[t- | 'o:srrtrer3 r.rei

',r:::qno: r:;r1 ocill] Ja?t oru :l: :nb rrd o :-r1os oqlg o r;rrC ;ro::sa aru y; f::orlru I cnuuuo-r ouro: ':rci{r:rrr:d suaSnros::t{ sop urn etPi opuLn}

,.'ossr noursua au uenb a:ol rog 'oq[g'?p oJlno un a:duas ual s?W o]oqlp srp w'J^oq: uau:nb rrp uea'tsr] oqlrq un stu'uoJ el opurl Jrqprq apodlos o anb erp uaa'euglsrq essou ep og5rnurluo: r a a:ol anb:o4'opnus uJ aJo os'sss ouof, serp ug'opunu op rowu e'epn8e ezalsrrl Bun Btlo zrgsep as rapue anb o opnt anb rrp uJ'o)Jnq un erl er:8apua anb o opnt aguada: ap g'tr:uasn Bns r eJoq3 op?q?s op orJuls o'lp uou o zrp ef,oJ el os o'trrlueuryo:sr:ue:g'red nas o ogs anb sap ue1,,

Gt'LGIta

Cnprulo 1Por Que a Clonagem Gnica e a

Anlise de DNA So lmPortantes

O desenvolvimento inicial da gentica' I 3O advento da clonagem gnica e da reao em cadeia

da polmerase, 14O que clonagem gnica?. I 5OquePCR?,16

Pol que a clonagem gnica e a PCR so toimportantes, l6

Como encontrar o seu caminho ao longo deste livro,22

Em meados do sculo XIX, Gregor Mendel formulou um conjunto de regras para explicar aherana de caractersticas biolgicas, as quais assumiam' basicamente, que cada propriedadetreredirria de um organismo controlada por um fator, chamado de gene, que uma partcu-la fsica presente em algum local na clula. A redescoberta das leis de Mendel, em 1900, mar-cou o nascimento da gentica, a cincia que busca o entendimento do que so esses genes ede como eles funcionam exatamente.

1.1 O desenvolvimento inicial da gentica

Em seus primeiros 30 anos de vida, a nova cincia cresceu a uma velocidade espantosa. Aidia de que os genes residem em cromossomos foi proposta porW. Sutton' em i903' e fece-beu suporte experimental de T. H. Morgan, em 1910. Morgan e colaboradores desenvolveram,ento, as tcnicas paa mapeamento gnico, e, at I922,j haviam produzido uma anliseabrangente das posies relativas de mais de 2.000 genes nos quatro cromossomos da mosca-das-frutas, a Drosophila melanogaster.

Apesar do brilhantismo desses estudos genticos clssicos, no houve um real entendi-mento da natwezamolecular do gene at a dcada de 1940. De fato, apenas aps os experi-mentos de Avery, Macleod e Mccarty, em 1944, e de Hershey e chase, em 1952, algum pas-sou a acreditar que o cido desoxirribonuclico (DNA) era o material gentico: at ento, erageralmente aceito que as protenas constituam os genes. A descoberta da funo do DNA foium grande estmulo para a pesquisa gentica, e muitos bilogos famosos (Delbrck, Chargaff,

'l::or1uo: uetl or{ru;l Jr3: ou l :nb ttr o a,it1o: oqly o r::rd malr:: atul 1-

p "p w..\oq: ueu anb erp u:1'tsrft oqlrrq un s?u'rloJ eI opurJnql:q apod 1os o anb zrp ruaa'rtrglsrq

essou ep ot5tnurluo: t a ::ol enbrod.oppuJs aJ JJo gs.sss ouoJ srrp ug.opunu op Jorru r'epn8e ezatsrll ?un tlo^ g'zgsap as reput anb o opnt anb erp uJ oseJnq un ?JIa el:8apaa anb o opn1 atuader ap g.er:uasn? ns eJorf, op?qgs op orJurs o'lp uou o zlp tfoJ tl Ios o'f,quv'otrsltruerJ'red nes o ots anb selp uaa,,

IE.IELIEoa

14 T. A. Bnowr.r

Crick e Monod estavam entre os mais influentes) contriburam para a segunda grande era dagentica. Em 14 anos

- de 1952 a1966

- a estrutura do DNA foi elucidada, o cdigo genti-

co decifrado e os processos de transcrio e de traduo descritos.

1.2 O advento da clonagem gnica e da reao emcadeia da polimerase

Esses anos de atividade e descoberta foram seguidos por um peodo de calmaria, um anticl-max, no qual parecia, para alguns bilogos moleculares (como a nova gerao de geneticistasse autodenominava), que havia poucos aspectos de importncia fundamental ainda no-escla-recidos. Na verdade, havia uma frustrao em funo de as tcnicas experimentais disponveisno final da dcada de 1960 no serem suficientemente sofisticadas para permitir o estudo dosgenes com maiores detalhes.

Depois, nos anos de l91I a 1913, a pesquisa gentica foi novamente acelerada por uma re-voluo na biologia experimental, conforme descrito na poca. Uma metodologia completa-mente nova comeou a ser desenvolvida, viabilizando o planejamento e a realizaq se nocom failidade, pelo menos com sucesso, de experimentos previamente impossveis. Tais m-todos, chamados de tecnologia de DNA recombinante ou de engenharia gentica, com ba-se essencialmente no processo de clonagem gnica, abriram uma nova grande era para a ge-ntica, conduzindo a rpidas e eficientes tcnicas de seqenciamento de DNA, as quais per-mitiram que as estruturas de genes individuais fossem determinadas. Isso culminou, na dca-da de 1990, com os projetos de seqenciamento massivo de genomas, incluindo o projeto hu-mano, que foi completado em 2000. A partir da, foram desenvolvidos procedimentos para oestudo da regulao de genes individuais, o que permitiu que os bilogos moleculares enten-dessem como aberraes na regulao gnica podem resultar em doenas humanas, como ocncer. Essas tcnicas geraram a biotecnologia moderna, que coloca os genes em funciona-mento para a produo de protenas e de outros compostos necessrios medicina e aos pro-cessos industriais.

Durante a dcada de 1980, quando o entusiasmo gerado pela revoluo da clonagem g-nica estava no seu auge, parecia quase impossvel imaginar que estava prestes a surgir maisum processo igualmente inovador e revolucionrio. De acordo com o folclore do DNA, KaryMullis inventou a reao em cadeia da polimerase (PCR) durante uma viagem de carro alongo da costa da Califrnia, em uma noite de 1985. A sua idia genial foi a concepo deuma tcnica relativamente simples, que funciona como um complemento perfeito para a clo-nagem gnica. A PCR tornou mais fceis muitas das tcnicas que antes, apesar de possveis,eram de difcil execuo, quando dependendo apenas da clonagem gnica. Ela estendeu o al-cance da anlise de DNA e fez com que a biologia molecular encontrasse novas aplicaes,inclusive em reas fora do seu campo tradicional, de medicina, agricultura e biotecnologia. Aecologia molecular, a arqueologia biomolecular e a cincia forense de DNA so apenas trsdas novas disciplinas que surgiram como uma conseqncia direta da inveno da pCR, e osbilogos moleculares esto buscando novas maneiras de utilizar o DNA para responder ques-tes sobre a evoluo humana e o impacto de mudanas ambientais na biosfera. Trinta nosaps a revoluo da clonagem gnica, ainda estamos andando em uma montanha-russa, sempreviso de final para a excitao provocada por ela.

i;r'.::fll \-f!- I 'o-rsr:rurr1 r-rci

',r;:orluor trrti oeli:t J:\:l ()u .rl3 .rnb rt.l o o:qos oqlq o urd :l:r:s: :rru y; ruol\:u : .!iln()- r)ruor ':EiDUr,rd suaSn:osrrtl sop r1 rtr,l opurnl;

,.'ossr noursua eu uanb elol roJ 'oql5 '?Ip Jlno un arduas ual sEW of,oqjap fip w:roq: ueu:nb erp uaa'tsrJt oqlrlq un sru'?]oJ I opur1:eqp:q apod 1os o anb erp uaa er:gtsrq msou rp oe5rnunuo: r a a:ol anb:od'oPnus uJ 3f,o^ os'sass ouof, serp ug'opunu op Jorru e'epn8e ezatsrJl ?un ?lo ![ ze;sap as raput anb o opnl anb erp uJ oJ?f,nq un erra err8apua anb o opru atuad:: ep g'er:uasn ?ns ? eJor{r op?qgs op oJurs o'elp uou o zrp rfoJ gl Ios o'Jquury'otrsrfurJC'rd nas o oes anb serp ruea,,

13 O qut!\$ $

rlt

ilro@s[lsl

z*,:

o6r!

.t!LGoa

Ct-onncev GNtcA E Ar'rlrse oe DNA 15

Erande era dacdigo genti-

um anticl-de geneticistas

no-escla-disponveis

o estudo dos

por uma re-completa-

se nao

eis. Tais m-comba-

era para a ge-as quais per-

na dca-o projeto hu-

para olares enten-

como oem funciona-

e aos pro-

clonagem g-a surgir mais

doDNA, Karyde carro ao

r:ncepo dero para a clo-de possveis,

estendeu o al-aplicaes,

apenas trsda PCR, e os

)noer ques-Trinta anos

sem

1.3 O que clonagem gnica?

Figura 1.1As etapas bsicas da clo-

nagem gnica.

As etapas bsicas de um experimento de clonagem gnica so descritas a seguir (Figura 1.1).

(1) Um fragmento de DNA, contendo o gene a ser clonado, inserido em uma molcula deDNA, chamada de vetor, para produzir uma quimera ou molcula de DNA recombi-nante.

1 Construo de uma molcula deDNA recombinante

p .,,"["* O rf:'*i*"o*de DNA

+

2 Transporte para o interior daBactria

clula hospedeirao

3 Multiplicao da molculade DNA recombinante Bactria portadora

da molcula deDNA recombinanteoo

_OOO^

4 Diviso daclula OO

ohospedeira

-7)

5 Numerosas divises /celulares Iresultando Iem um clone {

Colnias bacterianascrescendo em meio slido

oo'oo6(

oriF:J xv 'o:st:rUe:; r::ed

'-r:::r1uo: L:re d odl"l J^l o?u Jl inb r:d o :.rqos oqlg o r:r:d ;l.r:ls: erx y;f lroilitl I :nuuuo- oulol strcirur-r.J su;Snrol:ci :op Lrnr rtlq oputn|.. oss noursu u uanb e:ol rog oqlll'prp oJlno un ::duas ua1 st141.o:oq:p rrp J w'^oq: uau anb zrp uaa'lsrrt oq1rrqun a stu'rro; ?I opul f,eqprq apod 1os o anb erp ual.rrrgtsrq essou ep or5rnuquo: e e atol anb:o4'opnus uJ ef,o 9s'sJss3 ouof, stq) ug opunu op roreu e'epn8t ezalsrJt run Bllo^ :J'ze;sap :s rapue anb o opnl anb etp uJ'of,?f,nq un eJtl err8apua anb o opru atuada: ap g tr:uesn Bns E rfoqf, opeqes op orf,u[s o 'Ip uou o zrp BfoJ BI Ios o'tr{uuy'of,srf,u?JJ 'r?d nas o oes anb serp ruaa,,

ozM:oIEt

'LGt,la

16 T. A. Bnowru

O vetor funciona como um veculo que transporta o gene para o interior de uma clulahospedeira, a qual , em geral, uma bactria, embora outros tipos de clulas vivas pos-sam tambm ser utilizados.No interior da clula hospedeira, o vetor multiplica-se, produzindo numerosas cpiasidnticas no apenas de si prprio, mas tambm do gene que ele carega.Quando a clula hospedeira se divide, cpias da molcula de DNA recombinante sopassadas prognie, na qual o vetor replica-se novamente.Depois de um grande nmero de divises celulares, produzida uma colnia, ou clone,de clulas hospedeiras idnticas. Cada clula do clone contm uma ou mais cpias damolcula de DNA recombinante; diz-se, ento, que o gene carregado pela molcula deDNA recombinante est clonado.

1.4 O que PCR?A reao em cadeia da polimerase muito diferente da clonagem gnica. Em vez de utilizaruma srie de manipulaes envolvendo clulas vivas, a PCR executada em um nico tubode ensaio, a partir da mistura de DNA com um conjunto de reagentes e da sua colocao emum termociclador, um equipamento que permite que a mistura seja incubada em uma srie detemperaturas que so variadas de uma maneira pr-programada. As etapas bsicas de um ex-perimento de PCR so as seguintes (Figura 1.2):

(1) A mistura aquecida a94"C, temperatura na qual as pontes de hidrognio, que mantmunidas as duas cadeias da molcula de DNA de fita dupla, so rompidas, causando adesnaturao da molcula.(2) A mistura resfriada a 50 a 60'C. As duas fitas de cada molcula poderiam reunir-se aessa temperatura, mas a maioria no o faz porque a mistura contm um grande excessodepequenasmolculasdeDNA,chamadasdeoligonuclffianelam com as molculas de DNA em posies especficas.(3) A temperatura elevada at 74oC,,con_s_ideradg-qrlq4!a&_4 atividade da DNA-polime-.ase a"ffiqffi-"na mistura. p;"ndo"-;; mais sobr DN'timi;ses na pgina 67. Neste estgio, tudo o que precisamos para entender o processo que,durante essa etapa da PCR, a DNA-polimerase de Taqliga-se a uma extremidade de ca-da iniciador e sintetiza novas fitas de DNA, complementares s molculas de DNA.molde. Agora, temos quatro fitas de DNA, em vez das duas com as quais iniciamos areao.(4) A temperatura novamente elevada at94"C.As molculas de DNA de fta dupla, cadauma das quais consistindo em uma fita da molcula original e uma nova fita de DNA,desnaturam, gerando fitas simples. Isso inicia um segundo ciclo de desnaturao-anela-

,..

mento-sntese, ao final do qual existem oito fitas de DNA. Com a repetio do ciclo por| 25 vezes, a molcula de fita dupla com a qual iniciamos convertida em mais de 50 mi-i ttrOes de novas molculas de DNA de fita dupla, cada uma delas uma cpia da regio da{ molcula inicial delimitada pelos stios de anelamento dos dois iniciadores.

(2)

(3)

(4)

(s)

1.5 Por que a clonagem gnica e a PcR so to importantesA clonagem gnica e a PCR so procedimentos relativamente simples (Figuras 1.1 e 1.2). Porque, ento, elas so consideradas de tanta importncia na biologia? Isso se explica principal-

1j!iTf \rt- 'o:sr,rrrelJ t:ril

';;:e rluo: rred odrurl r ?t o?u lJ ;rb rcd o orqos oqlg o utd .u:::rs: cru: yi r:f orirl- : rnuuuo-. ouro:'srrrr:ur-d suf,aflrosrrd sop uir rif,} opu?n|

,.'ossr noursua au uanb a:ol roJ 'oq[g'erp oJ]no un arduas ual s?W oroqJp Erp J seut oq: uau anb erp ua1'tsrt or{lrJq un seu'roJ ?l opuq rrqg:q apod 1os o enb np uaa zt:gtsrq essou tp oeSenunuo: e e elol anbrod'opuuszJJro^os'sssouof,serpug'opunuopf,oreue'epntrzalsrJl?unBllo gzrgsapasrapueenboopntanbrrpuJo:?f,nqunef,rlerrSapua anb o opu aluadar ap g'zr:uasnr sns r rJorlJ op?qgs op oJue[s o'Ip uou o zrp aoJ el Ios o'Jr{wuy'o:snuerg'rcd nas o oes anb serp u:a,,

Frgunans eapas hsidarea@ em

ohe da @inre

oz

*5aGt

'LGIta

CLorunoeu Grurcn e ANLrsE oe DNA 17

o interior de uma clulas de lulas vivas pos-

indo numerosas cpiase ciuTega.DNA recombinante so

uma colnia, ou clone,uma ou mais cpias da

pela molcula de

Em vez de utilizarem um nico tubo

ufun sua colocao emem uma srie de

hsicas de um ex-

reun-se aEXCCSSO

foiciadores, que

& fita dupla, cadafita de DNA,

do ciclo pornrais de 50 mi-ia da regio da

e 1.2). Porprincipal-

Figura 1.2As etapas bsicasda reao em ca-

deia da polimerase.

l.l

?_:.rrli:l \t. 'o:struc-r; tred

'-r:::tluo:r L::rd odlsit J at o?rl 3[3 -]nb rrd o c,rty-rs oq15 o r:r:d :,r::rsa :rxr

p ep wr^oq: uau anb ap uaa'lsrf,l oqlrq un s?u'Bf,oJ ? opuq r?qyrq apod 1os o anb erp ual errglsrq rssou ep oeenuquo: e : a:ol anbro4opeues uJ tro^ gs'sss ouoJ srp ug opunu op Joreu r'epn8e ezalsut eun Btlo !J ze;sap as rapur anb o opnl enb erp uJ'of,anq un ?f,rl er:8apue anb o opnt atu:d:: ap g'er:uasn

ns ?Joqtr op?qgs op ortru?rs o'elp uou o zrp eroJ g Ios o'Jqueuryois3ueJ{'rd nes o oes anb srrp ua1,,

oz

**, GG

,GLGIta

DNA-molde

1 Desnaturao doDNA-molde

- 94'C

3',

5',

c

3',

3', 5',

5',

2 Anelamento dosoligonucleotdeos iniciadores-

50-60"c

3',

3', 5'.

ttt5' \'--lniciadores ^\ 5'

T--f-

5', 3',

3 Sntese de novoDNA

- 74.C

3', 5',

llllltttttrrrrr5', .J

3' 5'

5', 3',

3', 5',

5', o

3' 5',

5', 3',

I

i4 Repetio do ciclo 25-30 vezes

18 T. A. Bnowr'r

mente porque elas permitem a obteno de uma mostra pura de um gene individual, separa-do de todos os outros genes da clula.

1.5.1 lsolamento de genes por clonagemPara entender exatamente como a clonagem pode produzir uma amostra pura de um gene,considere o experimento bsico da Figura 1.1, mas desenhado de maneira um pouco diferen-te (Figura 1.3). Nesse exemplo, o fragmento de DNA a ser clonado um dos membros de umamistura de muitos fragmentos diferentes, cada um dos quais portador de um gene diferenteou de parte de um gene diferente. Na realidade, essa mistura poderia ser todo o complementogentico de um organismo

- de um humano, por exemplo. Cada um desses fragmentos in-

serido em uma molcula de vetor distinta, para produzir uma famflia de molculas de DNArecombinante, uma das quais portadora do gene de interesse. Geralmente, apenas uma mo-lcula de DNA recombinante transportada para o interior de uma clula hospedeira indivi-

dual- dconjungene de SUaS i

Na acapclonesque c0sanimgura l.

FigurO proden

sd(

a "/

Frasmentosde DNAox7( ) \ construeo de molculasVetores \---,/

\e Oru recombinantes

oo/

lntroduo em bactrias

Cada recombinantecarrega umfragmento dierente

IPlaqueamento

oooCada colnia contm mltiplascpias de apenas uma molculade DNA recombinante

Figura 1.3A clonagem permite quefragmentos de DNA indivi-duais sejam puriicados.

iloriF:l \-H\ 'o:srruu3 e:rd

';;:e :1uo: r::et odrt ?: oNU ala .rnb rtci o :;qos oqlg o t-rtc{ .r,r;r:sa oru: y: rrlolirq r Enuuuo-. ouro:'scdr:rrr-rd su:6nrosr.rd sop uir tir, oplrnf

,.'ossr noursua au uanb a:ol toJ 'oq1g'elp orlno un a:dues ual s?W of,orljJpsrpgw'J oq:tuauanbr4ruaa'tsrtoqlrqruns?u'?JoJeiopuq:rqpqapodlosoanberpua;'er:gtsrqrssoutpor5tnurtuo:r9a:olanb:o4'opuus zJ lo gs'sJss ouo: serp ug opunu op f,oreu r'epne rzalsrr eun Btlo [ zegsap :s rapue enb o opnl anb erp uJ'otr?Jnq un eJrl tr:8apua anb o opnt atuada: ap g'a:uasnr Ens E uorlJ oprqrs op orruls o'p uou o zrp efoJ elos o']{u?urv'otrsrf,u?JJ'Ied n:s o ops anb strp uaa,,

:e.. Effi.5I i:gIE

.IELGU

a

Ct-orueeeu GNtcA E Aruuse oe DNA 19

individual, separa-

pura de um gene,ira um pouco diferen-dos membros de umade um gene diferentetodo o complemento

fragmentos in-de molculas de DNA

, apenas uma mo-la hospedeira indivi-

sejam purificados.

dual, de modo que cada clone contm mltiplas cpias de apenas uma molcula, embora oconjunto final de clones possa conter muitas molculas de DNA recombinante diferentes. Ogene de interesse est agora separado de todos os outros genes presentes na mistura originale suas caractersticas especficas podem ser estudadas detalhadamente.

Na prtica, a chave para o sucesso ou o fracasso de um experimento de clonagem gnica a capacidade de identificar um determinado clone de interesse em meio aos muitos outrosclones diferentes que so obtidos. Se considerarmos o genoma da bactria Escherichia coli,que contm pouco mais de 4.000 genes diferentes, poderamos, em princpio, considerar de-sanimadora a tarefa de encontrar um determinado gene dentre todos os clones possveis (Fi-gura 1.4). O problema torna-se ainda mais assustador se lembrarmos que as bactrias so or-

Figura 1.4O problema da

seleo.

Uma poro muitorPE pequena do genomade E. coli

trpD

trN

trpB

trpA

\O gene a serclonado

I9 =t unav- &--rry!k tpE trpD

. A-. LgsP

trpA

oComo podemos selecionarou identificar apenas um gene?

srorlPl xuv 'orsouug errd

ra:oquo: r:.rcil odul?: a rl o?u .r13 :nb lzd o o;qos oqqg o r*d au:sa arur y;Erro,rill s?nuuuo: ouro:'srzdr:uxd suaSmos;ar sop Mn elpJ opu?n|1.;ossr noursua auruanb elol rog'oqlll'Erp oJno un::duas uet s?W'oJor{)Jp srp mb^oq: uau anb erp uaa'tsrn oqlrJqrun s?ru'?JoJ gl opurr reqp:q apod 1os o anb erp ua; er:91srq essou rp oe5rnuquo: e a a:ol anb:o4'oprluszq;ro^os'sssouoJserpug'opunuopJoreue'epnrezalsrl?un?llo ll'ztysapasrapueanboopntenberpueaore:nqunuuer:8apera enb o opnl aluadar ep g'er:uasn? ?ns r ior{f, op?q?s op or:uIs o'Ip ruou o zrp BJoJ gI Ios o '3Jr{rnuv'oJsr:uerJ'r?d nes o oes anb serp ruaa,,

G,IELIErta

20 T.A.BRowN

ganismos relativamente simples e que o genoma humano contm aproximadamente 10 vezesmais genes. Contudo, conforme explicado no Captulo 8, vrrias estratgias diferentes podemser utilizadas para assegurar a obteno do gene correto ao final de um experimento de clona-gem. Algumas dessas estratgias envolvem modificaes do procedimento bsico de clona-gem, de modo a determinar que somente clulas contendo a molcula de DNA recombinantedesejada possam dividir-se, fazendo com que o clone de interesse seja automaticamente sele-cionado. Outros mtodos envolvem tcnicas que viabilizam a identificao do clone a pairde uma mistura de muitos clones diferentes.

Depois da sua clonagem, praticamente no existem limites pra as informaes que po-dem ser obtidas a respeito da estrutura ou da expresso de um gene. A disponibilidade de ma-terial clonado estimulou o desenvolvimento de mtodos analticos para o estudo de genes,com a introduo constante de novas tcnicas. Os mtodos para o estudo da estrutura e da ex-presso de um gene clonado so descritos nos Captulos 10 e 11, respectivamente.

1.5.2 Isolamento de genes Por PCRA reao em cadeia da polimerase tambm pode ser utilizada para a obteno de uma amos-tra pura de um gene. Isso ocorre porque a regio da molcula de DNA de partida que copia-da durante a PCR o segmento delimitado pelas posies de anelamento dos dois oligonu-

cleotdentas ofiiamemo&tmatfo

Umrde rmgainda r

(r) nrENfrNft(F$(?JHFCctt

Ackca franFrexer.det."nq[Ecrdgfd isohcmobsE-

Alrde grocrykmmial ftrrl- 1Inffidosgwllam

LllmrDIIIA&ewe&lo emgEnl OEmimeft mnm&{azodtir,furl Irmml

shEo

trpE

trpD

trtrpB

$Qts

aro'f

Reao em cadeiada polimerase

x vrios milhesFigura 1.5lsolamento de ge-nes por PCR.

'::::rpro: L:,rrcl ocirit 3t olu [3 Jnb cd o ::r1os oqlg o r:vd aru:sr aru yir:J![ r Enuuuo,r ouro: 'sr:dr:rrr-rd su:5:losr:d sop [rn E]ieJ opun],, ossr noursuo au uanb a:ol ro{ oql5'rrp oJrno un ::duas ua1 s?W'oJorllJp Brp sm'^og: uau anb erp uraa.lsrrt oqllq un 9 s?u,rroJ g opuqrnlprq apodlos o anb rrp uaa.errgtsrq essou p o5enuquo: r a a:ol anb:o4'opnus zJ ?tro^ 9s'sss ouof, s?rp u opunu op roreu r'epn8e zalsrrt ?un etlo !J'zeJsap as rapur anb o opnl enb erp ua;'orernq un r:rl er:8apua anb o opru aluadar ep g'a:uasnr ?ns e ?Joqf, op?qes op ortru[s o'lp uou o zp ?]oJ EI los o'3rlueuryo3sr3u?f,J'ed nas o oes anb sIp uL,

Gt'LGU

a

Clotueev Grurcn e ANLtsE D DNA 21.10

vezes

diferentes podemde clona-

ml bsico de clona-D\A recombnante:,maticamente sele-r do clone a partir

que po-ilidade de ma-

! estudo de genes,'J, estrutura e da ex-rmente.

:o de uma amos-urtida que copia-r dos dois oligonu-

(l)

(2)

cleotdeos iniciadores. Se os iniciadores anelam de ambos os lados do gene de interesse, mui-tas cpias do mesmo sero sintetizadas (Figura 1.5). O resultado o mesmo de um experi-mento de clonagem gnica, mas o problema de seleo no existe, pois o gene desejado au-tomaticamente "selecionado", em conseqncia das posies de anelamento dos iniciadores.

Um experimento de PCR pode ser completado em poucas horas, ao passo que a obtenode um gene por clonagem pode levar semanas ou meses. Por que, ent, a clonagem gnicaainda uilizada? Isso se deve a duas limitaes da pCR:

Para que os iniciadores posicionem-se corretamente, em ambos os lados do gene de in-teresse, as seqncias desses stios de anelamento devem ser conhecidas. fcit sinteti-zar um iniciador com uma seqncia predeterminada (ver p. 1g0), mas se as seqnciasdos stios de anelamento so desconhecidas, impossvel a produo de iniciadores ade-quados. Isso significa que a PCR s pode ser utilizada para isolar genesj previamenteestudados

- o que deve ser feito por clonagem.

H um limite para a extenso de seqncias de DNA, as quais podem ser copiadas porPCR. Cinco quilobases (kb) podem ser copiadas com relativa facitidade e pode-se lidarcom segmentos de at 40 kb com atilizao de tcnicas especializadas. Entretanto, taissegmentos so mais curtos do que a extenso de muitos genes, especialmente aqueles dehumanos ou de outros vertebrados. Se necessria uma verso intacta de um gene lon-go, a clonagem deve ser utilizada.

oz

*:o@

A clonagem gnica , portanto, a nica maneira de isolar genes longos ou genes que nun-ca foram estudados anteriormente. Mas a PCR ainda possui muitas aplicaes imprtantes.Por exempl_o, I4e-g$_o_que_g..qg$lcia de q,p_ggng seja descoqhecida, ainda pode sei possveladetgrminao de sgqgp.q-gla-s_.g2ropriadas para um par de iniciadreg, 9m us no qunheld.q99tre,,9.geqtiQry.iggggggeqe eqq!y,91_qtte g{Lqm grgatilgg qlt"ryl. um lene quefoi isolado e seqenciado a partir de, digamos, aunaongo"ii",'l.trto, ser utilizadocomo base para projetar um par de iniciadores pra o isolamento do gene humano equivalen-te.

Alm disso, existem muitas aplicaes nas quais necessrio o isolamento ou a detecode genes cujas seqncias j so conhecidas. uma pCR de genes de globina humanos, porexemplo, ilizada em testes para verificao da presena de mutaes que podem causar aanemia hemoltica chamada talassemia. A projeo de iniciadores adequados para essa pCR fcil, pois as seqncias dos genes de globina humanos so conhecidui. RpOr a pCR, as c-pias dos genes so seqenciadas ou estudadas de alguma outra maneira para determinar se al-guma mutao talassmica est presente.

Uma outra aplicao clnica da PCR envolve a utilizao de iniciadores especficos para oDNA de um vrus patognico. Um resultado positivo indica que uma amostra contm o vruse que a pessoa que a forneceu deve ser tratada para evitar o estabelecimento da doena. A rea-o em cadeia da polimerase exrremamente se-nsvrel: png_g_g{-tgg-e1q-_cui$-4$_o-p.g de C.e,e4qseia

-qs4.+!!-*de-.s-d-""tfues_de*_D']jss'_q_qg-b;p".-,]--olcuta de DNA namt"q191a rniqlll. rltq.pig{t"ifi-q"-a"que t|.c"!ig?

-c-gpaz dedetectar vrus ns estgios mais iniciaisde uma infeco, arlm.qllan$o.as tranceJa r"Ctro no t utu-nto. su gno. sensibilida-de faz com que a PCR tabm possa ser utilizada com DNA proveniente de amostras de me-dicina legal, como cabelo ou manchas de sangue secas, ou at mesmo de ossos de pessoasmortas h bastante tempo (Captulo 16).Figura 1.5

lsolamento de ge-nes por PCR.

r.':::f \{Y 'r)-:tlu?-i:l 'lr(l

'.r;r;r1tlr: rrer octt-J 3af,1ou il3 Jnb ird o:;qos oqlg o ur:d:,r.r:rsr::ri yp Erp w:\oq: uau anb erp uaa'lsrrt oqluq un e seu'uoJ gl opuq:rqp:q apod 1os o :nb rrp ue1'euotsrq rssou rp oe5enurluo: r e a:ol anb:od'oPuues uJ Jo^ os'sss ouoJ sEIp ug'opunu op roreu e'epn8e ezalstJl ?un

lo iJ'zrgsap as rapur anb o opnt anb erp uaa.o:r:nq un r:n eu8apua anb o opru aluad:r ap E-rr:uasnB ens ? ef,oqtr opqs op orJuIrs o 'lap uou o zp eloJ ?l los o.Jrlueuv.of sJuef,J,rrd nes o ots anb s"p *".1^,

IE.GLIEoa

1.6 como encontrar o seu caminho ao rongo deste IivroEste livro explica como a clonagem gnica, a pcR e outras tcnicas de anlise deexecutadas e descreve as aplicaes dessas tcnicas na biologia moderna. As aplicobertas nas segunda e terceira partes do livro. A Parte2 descreve como genes e geestudados, enquanto a Parte 3 considera as diversas aplicaes da clonagem gnica ena biotecnologia, na medicina, na agricultura e na cincia forense.

Na Parte 1, abordamos os princpios bsicos. A maioria dos nove captulos rv | -..,'' ',,'., , '.r,'.,

'-r:::rluo: rrcd ocft.r:l ^Jl olu Jla inb rrd o :;qos oq13 o r;rrd :,r.r::sl aru yep ep e sstu ' oq: uau enb rrp ua; elslr oqIJq un s?u'BroJ 9l opu- leqyrq apod 1os o anb erp uaa er:grsrq essou rp oernurluo: r a a:o,r anbro4'opus zJ ro^ os'sssa ouotr srrp ug.opunu op rorrur e,epn8r ezatsrJt ?un

lo :[.ze;sap :s repunb o opl ..b rrp *ea.o:ernq urn r:n er:5apao enb o opnl aluadar ap g'tr:uasnt ?ns 3 ?Jorp opqts op orf,urs o'lp uou o zp rrog "11o,

o..Dqreurv.o3sJw.rJ,red nas o on anb selp uL,

'el ClassificA classifirtrcr$[iqa clffiffisll Ph

njus!) Ph

resisorpoptltxn4s-tfrCotr

l{l Plastnu

l5l Ptrnpbfltas d

2.15 Plasmdc

o2

*5g6G

,GLGrta

ganismo

colicoliydomonas e outrosnlidomonas putidafucreium tumefaciens

o em clonagem. Entre_l $ob algumas circunstn_

rnunado pasmdeo quetuores que controlam o

possui um va-las grandes) ou igual

u'esente na clula embinante possm ser

_s"rtlos. Os plasm_sexual en-

o do plasm-:ucteriana. A con_re

*genes de trans_s no tipo no_

irrostncias, serpresentes na

rmsna clula aoii,uru,r" sabe-se que

Para serem

pela clu-e diferentes

na mesma

slml-n-

els pe-

Ct-oruncev Gurcn e ANLtsE oe DNA 29

Figura2.4Transerncia de plasmdeo entreclulas bacterianas por conjuga-o. As clulas doadora e recep-

tora fixam-se uma outra poruma mbria, um apndice oco

presente na supedcie da cluladoadora. Uma cpia do plasm

deo , ento, passada paraac-lula receptora. Acredita-se que a

transerncia ocorra atravs dafmbria, mas isso ainda no oi

comprovado. A transerncia por Joutros meios (por exemplo, dire- itamente pelas paredes celulares !das bactrias) permanece sendo

,

uma possibitidade. J

Clula doadora Clula receptora

Plasmdeo conjugativo

o o

2,1.4 Classificao dos plasmdeos

ColEl de E. coli.

A classificao mais til dos plasmdeos de ocorrncia natural baseada na principal carac-terstica codificg!3leleqggng!{lasmidiais. os cinco principais ripos de plasmdeo, de acor-do com essa classificao, so osiegte:-

\(l) Plasmdebs de fertilidade ou "F' crregam apenas genes trae no possuem qualqueroutra caractestica alm da capacidadei promoverem a transferncia plasmidial con-jugativa. Exemplo: plasmdeo F de E. coli.(2) Plasmdeos de resistncia ou "R" caegam genes que conferem bactria hospedeiraresistncia a um ou mais agentes antibacterianos, como o cloranfenicol, a ampicilina ouo mercrio. Plasmdeos R so muito importantes para a microbiologia cnca, pois apropagao dos mesmos em populaes naturais pode ter srias conseqncias no trata-mento de infeces bacterianas. Exemplo: Rp4, comumente encontr do em pseudomo_) "ry.ryas ocorre_ndg rambm em muiras o uie; -

^--

' (3) Plasmites-eol codificam tiinas. poti:inas-q m.ram outras bacrrias. ExemoloExemplo:Plasmdeos degradativos permitem que a bactria hospedeira metabolize molculas in-comuns, como o tolueno e o cido saliclico. Exemplo: ToL de pseudomonas putida.Plasmdeos de virulncia conferem patogenicidade bactria hospedeira. Exemplo:plasmdeos Ti de Agrobacterium tumefociens,que induzem to-or", de galha em plan-tas dicotiledneas.

2.1-5 Plasmdeos em outros organismos que no bactriasO fato de os plasmdeos serem bastante comuns em bactrias no implica, de maneira alguma,que eles tambm o sejam em outros organismos. O plasmdeo eucaritico mais bem caracteri-zado o crculo de 2 pm, que ocoe em muitas linhagens da levedura Saccharomyces cerevi-

a

*io

(4)

(s)

IEt'LGoa

if::''r]:-!.::::rLro-oliior's.r.r,ur-rts,e.ruos'rlserprunrrr.lopurnf;]:i:::lr:l*tff;:'":;'iulfJ;i:'ji::;r"r:Jp Erp su:aoq: uau anb erp uaa lslr oqll]q un 9 t"*'".-1^91 opt.r1*qprq apodlos o anb erp uaa.rr:grsrq essou ep or5rnurruo: t a e:ol anb:od'oPlus nJ JJo-\ os'sess ouof, s'rp uA.opunu op ror"-

"."p.3" "r.lrr, "*. "rio^ g.r"3r.p ., ,.prrt op.r ..b "rp,ra1.o:rrnq un rru.r8apae :nb o opru aluada: ap g'er:uasne Ens t ef,oqtr op"q", op orr"1* o'ayap aurouo zrp r.j

"11o, o,...qr?uv.ofsrJurf,J,red nas o ors anb selp uq1

..

30 T. A. Bnowrrr

siae. A descoberta do plasmdeo de 2 1tm teve um impacto bastante positivo, pois permitiu aconstruo de vetores para a clonagem de genes utilizando esse organismo de grande importn-cia industrial como hospedeiro (p. 140). Contudo, a busca de plasmdeos em outros eucariotos(como, por exemplo, fungos filamentosos, vegetais e animais) mostrou-se infrutfera, suspeitan-do-se que muitos organismos superiores simplesmente no abrigam plasmdeos no interior desuas clulas.

i

I

I

I

i

I

I

2.2 Bacterifagos

ri(\rI:l \y | 'o..r'.'u".t, L'r,'a

'-r::oririo: rrecl ocirs:rt 3:\a] orr il .rnb ttd o lqos ot11g o t:r:d :,ur:sr azur tr; r: joljrrl r Erunllo- ouio: 'sietl:ur-rd su:5aros;rr sop urn et1:,y opu:n)., oss noursu u uanb a:ol rog or{Ig'trp oflno un a:duas uet se141'oroq:p srp J ffi'^oq: uau anb erp uaa'tsrrt orlrJq un s?u'?JoJ gl opu{reqp:q apod 1os o anb zrp u:1'er:otsrq tssou ep ot5enuguo: e a a:ol anb:o4'opnus uJ Jo^ os'soss ourof, sBrp ug'opunu op Jomu e'rpn-8e ezatsrJt ?un ?lIo g'ze3sep as rapue anb o opnt anb erp uJ'o3ef,nq un Jrl er:8apaa :nb o opru aluadu ap g'rt:uasn? Bns r eJorlf, opeqgs op oiuals o'alp ruou o zlp ef,o; 9l Ios o 'alqueuv'of,slf,uef,C 'Ed nes o ots anb sap uaa,,

2.2.1 Caractersticas bsicas dos bacteriagosBacterifagos ou fagos, como so comumente conhecidos, so vrus que infectam especifica-mente bactrias. Como todoyos vrus, os fagos possuem uma estrutura bastante simples. Elesconsistem merarente e-ma molcula de DNA (ou, ocasionalmente, de cido ribonuclicoIRNAI) portadora de alguns genes, inclusive vrios para a replicao do fago, envolvida poruma cobertura protetora ou capsdeo, formada por molculas proticas (Figura 2.5).

O padro geral de infeco, que o mesmo para todos os tipos de fago, um processo detrs etapas (Figura 2.6).(1) A partcula do fago fixa-se na superfcie externa da bactria e injeta o seu cromossomo

de DNA no interior da clula.(2) A molcula de DNA do fago replicada, leralmente por enzimas especficas, codifica-das por genes do seu prprio cromossomo.(3) Outros genes do fago dirigem a sntese dos componentes proticos do capsdeo e novaspartculas virais so montadas e liberadas da bactria.

Com alguns tipos virais, todo o ciclo de infeco completado de forma muito rpida,possivelmente em menos de 20 minutos. Esse tipo de infeco rpida chamado de ciclo lti-co, pois a liberao das novas paqtculas virais est associada lise da clula bacteriana. O as-pecto mais caraterstico de umficlo de infeco ltico oo Ua sntese das protenas docapsdeo ocorer imediatamente aps a replicao do DNA do fago, cujas molculas nuncaso maltidas em uma condio estvel na clula hospedeira.

2.2.2 Fagos lisognicosDiferentemente de um ciclo ltico, a infeco lisognica caracteizada pela reteno da mol-cula de DNA do fago na bactria hospedeira, possivelmente ao longo de muitos milhares de di-vises celulares. Com muitos fagos lisognicos, o DNA viral inserido no genoma bacteriano,de uma maneira similar insero epissmica (Figura 2.3b). Aforma integrada do DNA do fa-go (chamada de profago) quiescente e a bactria portadora (referida como um lisgeno) , emgeral, fisiologicamente indistinguvel de uma clula no-infectada. Entretanto, o profago acabasendo liberado do genoma da bactria hospedeira e o fago reverte para o modo ltico, lisando aclula. O ciclo de infeco O" l"-Ua. (I),rlq&gg lirgJgqqslpic!, q lqoJg$_qe_ryegra21_

Um nmero limitado de fagos lisognicos segue um ciclo de infeco diferente. QuancloM13 ou um fago aparentado a ele infecta E. coli, novas partculas virais so continuamentemontadas e liberadas da clula. O DNA de Ml3 no integrado no genoma bacteriano e no setorna quiescente. Com esses fagos, a lise celular nunca ocoffe e a bactria infectada pode conti-nuar a crescer e a dividir-se, embora a uma velocidade menor do que a de clulas no-infecta-das. A Fgura 2.8 mostra o ciclo de infeco de Ml3.

FOs dois tipos prit

estrutua de agos: (ie cauda (por exe

{b) filamentoso (po,r

Fgura 2O padro geral de ibcao de uma clu

bacteriana por ubacteiag

IE.IELGoa

positivo, pois permitiu ade grande importn-

em outros eucariotosinfrutfera, suspeitan-

no interior de

infectam especifica-bastante simples. Elesde cido ribonuclico

do fago, envolvida por(Figura 2.5).

fago, um processo de

o seu cromossomo

especficas, codifica-

do capsdeo e novas

de forma muito rpida, chamado de ciclo lti-

bacteriana. O as-tese das protenas do

cujas molculas nunca

pela reteno da mol-muitos milhares de di-no genoma bacteriano,

do DNA do fa-umlisgeno) , em

o profago acabamodo ltico, lisando a

na 2.7.diferente.

is so continuamentebacteriano e no se

ia infectada pode conti-de clulas no-infecta-

oriFf l(lv 'o:souer3 r:ec

'-rr:;rJuo: e:ecl ocini:t et olu l f,nb rttl o c;qos oq15 o r:rrJ:,r;::sa azur y;trfo, rsq E ?nuuuo: ouro:'stednur-rd suauuosr:d soF rrrn e.p; opu?n)., ossr noursua au uanb a:ol ro{ oqlg '?rp oJlno urn a:duas ual sBW'oJor{JaP srP s?rrr'^oqr tuau anb erp uaa'tslr oq1rrqun seu'ef,oJ ?l opuT Jeqp:q epod 1os o enb rrp uea'errgtrsrq essou ep orSenurluoc e 9 a:ol anb:o4'opluszqttro^c'ssouolsepug'opunuoproeur'epn8eezalsr:teunello !J'zeJsapasrapuzanboopnlenberpuaa'o:anqunerler:8apua enb o optu eluadar ap g'tnuesne ens ? ?Jor{J op?q?s op onuTrs o'lp uou o zrp eroJ gl los o 'trr{ueulr'otrsrtru?J{'red nes o oes enb serp uaa,,

IEt'LGoa

Cr-orueceu Guca e ANLtsE oe DNA 31

Figura 2.5

Molculasde protena(capsdeo)

Molcula de DNA

(a) Cabea e cauda (b) Fitamentoso

(ls dois tipos principais deffrrra de agos: (a) cabea.- ccilrda (por exemplo, l,) e,ffi flamentoso (por exemplo,

M13).

Figura 2.6Opdro geral de in-lhode uma clula

bacteriana por umbacteriago.

Partcula do fagoDNA

1 O ago ixa-se bactriae injeta o seu DNA

componentes Ido capsdeo i

3 Os componentes do capsdeo so sintetizados,novas partculas so montadas e liberadas

32 . A. Bnowlt

{I

III\,

Apesar de haver uma variedade muito grande de bacterifagos, somente e M13 chegarama desempenhar papis importantes como vetores de clonagem. As propriedades desses dois fa-gos sero agora consideradas com maiores detalhes.

Organizao gnica na molcula de DNA de ?',O l, um exemplo tpico de fago de cabea e cauda (Figura 2.5a). O DNA est contido na es-trutura polidrica da cabea e a cauda serve para fixar o fago superfcie bacteriana e injetaro DNA na clula (Figura2.1).

.A n,ljr,llbfitulr&. flq,dirr**:'- ts f,c'cudus F:gulrtrTars.l Igf:i3 ;' i

Uma partcula do fago fixa-se a uma clula deE. coli e injeta o seu DNA

-{ DNA de Cromossomo bacteriano

/\/ \ Diviso celular

/ \_

lnduo:A O DNA de desliga-se do

cromossomo bacteriano

B Novas partculas do fago sdproduzidas (ver etapas 2 e 3da Fig.2.6)

Gs'

de " circulariza

\

igura2.7O ciclo de ineco lisogni-ca do bacteriago 1".

Fr$e Zgffiii,iurrMtM m nitsae':

m Mrnercfu3rrirri'

:? .

Ftguli nnwopr !E..ltco

rIr0ffir,."arl* as D35@ uE's pgr3rri"a.!

nm ftLrr"nces acs agr,"enmcs de g

I. ::il \\' | 'o...r..rir'.r1 , rlc

',Lr:-.oruo: u:rlcdu;t J l oru Ji3 Jnb re d o ::qos or11ll o urd ;r:::rs.. :rut yp Erp : su'-\oq: ueu anb erp ual otsrJt or{lrf,q un sBu'ero.1 e[ opurT Jeqp:q apod 1os o anb erp ua1'er:glsrq rssou ep oe5enuquo: e a elol enb;o4oprluas ze_ JJo-\ os'sss ouof, srrp ug'opunu op Jorru e'epn8e ezalsrJl ?un tIo^ zt;sap as repur anb o opnt enb trp uaa o:z:nq un un er:8ape:e anb o opn: atu:d:: :p E rr:uasn ns rroqf, opqgs op oJuaps o'Iep uou o zrp uoJ rl Ios o'elquelV'otrsnueq'rrd nas o ors anb s?lp u{,,

o

*s1o6E

'LIEoa

Cronneenit Gnrcn e Aruuse oe DNA 33

somenteeMl3chegaramropriedades desses dois fa-

O DNA est contido na es-perffcie bacteriana e injetar

A molcula de DNA de ", que tem um tamanho de 49 kb, vem sendo extensivamente es-tudATiEhfu-d'fi 6sq*ri-en6i*;a"m.Emconseqnciadisso, as posies e as identidades da maioria dos genes da molcula de DNA de l, soionhe-cidas (Figura 2.9).Uma caracterstica do mapa gentico de que os genes relacionados emtermos de funo esto agrupados em regies especficas do genoma. Por exemplo, todos osgenes que codificam componentes do capsdeo esto agrupados no tero esquerdo da molcu-

Fago M13

Fmbria-- DNA de M1 3

O fago M13 fixa-se a umafmbria de uma clula deE. coli e injeta o seu DNA

\enlicaeo do DNA de Mt3

,r.ffi"Novos fagos Ml3 ttso continuamente f o o" m

-

"go.::iJ#ff":iii"U% M13

I \ o..u,,ll'i.l:;"."-^ de M13ffi / \:ll,i3crescer

,m#\...-Figura 2.8

O clclo de inecodo bacterifago

M13.

Figura 2.9O mapa gentico de ,mostrando as posies

dos genes importantes eas unes dos agrupa-

mentos de genes.

o 2 4 6 810 12 14 16 1820222426?83032343638404244464849kb

u;

2.7de infeco lisogni-

do bacteriago ),.

:_iLtil:J \lv

'::::r1rro:r L:,rrci ociltJl oJt u ilo .lnb rrii

34 T. A. Bnowlr

la e os genes que controlam a integrao do profago no genoma do hospedeiro esto agrupa-dos na sua regio central. O agrupamento de genes relacionados extremamente importantepaa o controle da expresso do genoma de , pois ele permite que os genes sejam ativados ouinativados em grupo, e no individualmente. O agrupamento tambm importante pata aconstruo de vetores de clonagem derivados de , (descritos no Captulo 6).

As ormas linear e circular do DNA de ?uUma segunda caracterstica de , relevante para a construo de vetores de clonagem, a con-formao da molcula de DNA. A molcula mostrada na Figura 2.9 ltnear, com duas extre-midades livres, e representa o DNA presente na estrutura da cabea do fago. Essa molcula li-near consiste em duas fitas de DNA complementares, com bases pareadas de acordo com asregras de \atson-Crick (isto , DNA de fita dupla). Entretanto, em.cada extremidade damolcula existe um segmento curto, de 12 nucleotdeos, no qual o DNA de fita simples (Fi-gura 2.10a). As duas fitas simples so complementaes e, portanto, capazes de parear suas ba-ses entre si para formar uma molcula circular totalmente de fita dupla (Figura 2.10b).

Fitas simples complementares so, com freqncia, referidas como extremidades ttade'sivastt ou extremidades coesivas, porque o pareamento de bases entre elas pode unir as duasextremidades de uma molcula de DNA (ou as extremidades de duas molculas de DNA di-ferentes). As extremidades coesivas de 1" so chamadas de stios cos e tm duas funes dis-tintas durante o ciclo de infeco de ,. Primeiramente, elas permitem que a molcula de DNAlinear injetada na clula seja circularizada, o que um pr-requisito para a insero no geno-ma bacteriano (Figura 2.7).

A segunda funo dos stios cos um pouco diferente e necessria depois que o profagofoi removido do genoma hospedeiro. Nesse estgio, produzido um grande nmero de novasmolculas de DNA de l" pelo mecanismo de replicao por crculo rolante (Figura 2.10c), noqual uma fita de DNA contnua "rolada paraforc" da molcula-molde. O resultado um ca-tenano, que consiste em uma srie de genomas lineares de unidos pelos seus stios cos, cu-ja funo agoraatuar como seqncias de reconhecimento pra uma endonuclease, que cli-va o catenano nos stios cos, produzindo genomas de l" individuais. Essa endonuclease, que o produto do gene da molcula de DNA de , cria as extremidades coesivas de fita simples,alm de agir em conjunto com outras protenas pa.ra empacotar cada genoma de em uma es-trutura de cabea do fago.

( Como se ver no Captu\6. os processos de clivagem e empacotamento reconhecem ape-I nas os stios cos e as seqncis imediatamente adjacentes a eles. A mudana da estrutura dasJ regies internas degenoma de , por exemplo, pela insero de novos genes, no tem efeitoI sobre esses eventos, desde que o tamanho total do genoma de l, no seja demasiadamente al-I terado.L

M13: um fago filamentosoM13 um exemplo de fago filamentoso (Figura 2.5b) epossui uma estrutura completamentedistinta daquela de . Ademais, a molcula de DNA de M13 muito menor do que o genomade , com uma extenso de 6.407 nucleotdeos. Ela circular e tem a caracterstica incomumde consistir inteiramente em DNA de fita simples.

'-n::t1rn: rrecl ociurJl oal u 13 nb r;d o :lqos oqyq o urd ut:rs: :rrrr y

Jp BTp w',\oq: u:u anb erp uaa.lsrrl orlTrrq un sru.eJoJ gl opuqrrqprq apod 1os o anb rrp ual.errglsrq rssou rp or5enurluo: e a a:ol anbro4'opuuas uJ f,o^ os'Fsse ouof, serp u opunu op roreu r'epn8r zalsrrt ?un etlo u'ze;sap as rapur anb o opnl snb erp uI'oJfnq un eJrl err8apu::nb o opru etuadar:p g'rr:uasna ?ns ? uorJ oprqts op ortrulrs o'lp uou o zrp eloJ l Ios o'ir{ueu\r'o:sriutf,J'red nes o oes anb sBIp uJ,,

FrgurAsbrsiyasna brortscto ht

o2

*5oGt

'LGoa

Croneeeu Grurcn e ANLtsE oe DNA 35

hospedeiro esto agruPa- extremamente imPortanteos genes sejam ativados ou

importante para a6).

declonagem,acon-2.9 linear, com duas extre-

do fago. Essa molcula li-pareadas de acordo com as

em cada extremidade dao DNA de fita simPles (Fi-

capazes de parear suas ba-dupla (Figura 2.10b).como extremidades ttade'

entre elas pode unir as duasduas molculas de DNA di-cos e tm duas funes dis-

que a molcula de DNApara a insero no geno-

depois que o profagoum grande nmero de novas

rolante (Figura 2.10c), no. O resultado um ca-

pelos seus stios cos, cu-uma endonuclease, que cli-

. Essa endonuclease, que coesivas de fita simplesgenoma de l,

"- u-u

"rlmento reconhecem ape-

A mudana da estrutura dasnovos genes, no tem efeito

I no seja demasiadamente al-

uma estrutura comPletamentemuito menor do que o genomae tem a caractestica incomum

e"lril-nTrf x{!- -o-utirr:l er:ii

'-rr:;r1to: trec{ ocru.l ?t oxu la nb trt{ o :rqos oqlq o r:L:d :,r:::sl crur y; ruo!I{ E nu!u!- o[ro] 'qdIf,tIud su:SRros:.rcl sop uin rtle,] opuxn.)., ossr noursua au uanb a:ol roJ or{ig '?rp oJtno un e:duas ua1 sEW.o]oqlJP zp sw:Nqr uau anb np uaa'elsJl oqprq un s?u'BroJ gl opurT Jeql:q apod 1os o anb rrp uaa rr:glsrq essou ep or5enurluo: e a e:ol anb:o4'oPuuszgJ.fo^c's3ssouof,ffpuA'opunuoptroreue'epn8ezalsr:tBunllo !J'zeJsapasrapuranboopnlanberpuraa'o:unqunerner:8a1tu: anb o opm eluadu:p E'muasnt ens B ef,oqf op?q?s op orJurs o'Ip uou o zrp eJoJ ?l los o'lqu?uy'o:sr:ue:g'red nas o ors anb serp uaa,,

Figura 2.10As ormas linear e circular do DNA de . (a) A forma linear, mostrando as extremidades coe-sivas esquerda e direita. (b) O pareamento de bases entre as extremidades coesivas resultana forma circular da molcula. (c) A replicao por crculo rolante produz um catenano denovas molculas de DNA linear de , que so empacotadas individualmente nas cabeasdo fago medida que novas partculas de so montadas.

Gt'LGU

a

(a) A orma linea da molcula de DNA de Extremidade coesiva esquerda Extremidade coesiva direita

CCCGCCGCTGGA::::-GGGCGGCGACCT

(b) A orma circular da molcula de DNA de l"

(c) Replicao e empacotamento do DNA de cos cos O catenano

rola para forada molculade DNA de l.

qT-I l"'

A endonucleasecodiicada pelogene A cliva ocatenano nosstios cos

oo

HH

o'HComponentes proticosdo capsdeo

Novas partculas deagos so montadas

36 T.A. BRowN

O tamanho menor da molcula de Ml3 implica possuir espao paa um nmero menor degenes do que o genoma de . Isso possvel porque o capsdeo de M13 construdo a partirde mltiplas cpias de apenas trs protenas (requerendo apenas trs genes), ao passo que asntese da estrutura de cabea e cauda de l, envolve mais de 15 protenas diferentes. Alm dis-so, Ml3 segue um ciclo de infeco mais simples que o de e no necessita de genes para ainsero no genoma do hospedeiro.

A injeo de uma molcula de DNA de M13 em uma clula de E. coli ocoe atravs dafrmbria, a estrutura que conecta duas clulas durante a conjugao sexual (Figura2.4).Umavez no interior da clula, a molcula de fita simples atua como molde para a sntese de umafita complementar, resultando em uma molcula de fita dupla normal (Figura 2.11a). Essamolcula no inserida no genoma bacteriano, sendo, emvez disso, replicada at que mais de100 cpias estejam presentes na clula (Figura 2.1 1b). Quando abactna se divide, cada c-lula-filha recebe cpias do genoma do fago, que continua a replicar-se, mantendo, assim, oseu nmero total por clula. Conforme mostrado na Figura 2.11c, novas partculas do fago socontinuamente montadas e liberadas, com aproximadamente 1.000 novos fagos sendo produ-zidos a cada gerao de uma clula infectada.

As vantagens de Ml3 como um veculo de clonagemf V,arios aspectos tornam M13 atraente como base para um veculo de clonagem. Seu genomaJ menor do que 10 kb, um tamanho bem dentro da faixa ideal para um vetor em potencial.t Al- do que, a forma replicativa (RF) de fita dupla comporta-se de maneira bastante simi-

lar a um plasmdeo e pode ser tratada como tal para propsitos experimentais. Ela prepara-da facilmente a partir de uma cultura de clulas de E. coli infectadas (p. 59-60) e pode ser**iiff i:|,ffil::T tg;t 1ll, gene s clonado s em um veror derivado de M 1 3 pode --rem ser obtidos na forma de DNA de fita simples. Verses de fita simples de genes clonados jso teis para virias tcnicas, especialmente para seqenciamento de DNA e mutagnese ir

,'

vitro (p.212 e243). A utilizao de um vetor derivado de M13 uma maneira fcil e confi- ivel para a obteno de DNA de fita simples para esse tipo de trabalho. )

{

2.2.3 Vrus como veculos de clonagem paraoutros organismosA maioria dos organismos vivos infectada por vrus e, por isso, natural que haja umgrande interesse na possibilidade de que vrus possam ser utilizados como veculos de clo-nagem para organismos superiores. Isso especialmente importante quando lembramos queplasmdeos no so comumente encontrados em oulros organismos. que no bactrias e le-veduras (p. 31).

De fato, os vrus possuem um potencial considervel como vetores de clonagem para al-guns tipos de aplicao com clulas de animais. Os vrus de mamferos, como o simian vi-rus 40 (SV40), os adenovrus e os retrovrus, alm dos baculovrus, de insetos, so aque-les que receberam mais ateno at agora. Esses vrus so discutidos com maior profundi-dade no Captulo 7.

(cl

Figura IO ciclo rrem. (a)replicatiMolcnlmontag

oz

*t:o

TNOJECI JJOAV

I

IE,GLIEt,a

EI Jols q tp elrd 3nb tu

Croruncev Gurcn p Arurrse oe DNA 37

um nmero menor de13construdoapartirgenes), ao passo que a

diferentes. Alm dis-necessita de genes para a

E. coli ocorre atravs dasexual (Figura 2.4). U ma

para a sntese de uma(Figura 2.11a). Essaicada at que mais de

ria se divide, cadac--se, mantendo, assim, o

partculas do fago sofagos sendo produ-

clonagem. Seu genomaum vetor em potencial.maneira bastante simi-

imentais. Ela prepara-(p. 59-60) e pode ser

derivado de Ml3 pode]ples de genes clonados

{DNA e mutagnese in /maneira fcil e confr-)

natural que haja umcomo veculos de clo-

quando lembramos queque no bactrias e le-

de clonagem para al-ros. como o srmtan vb, de insetos, so aque-com maior profundi-

Figura 2.11O ciclo de ineco de M13, mostrando os dierentes tipos de replicao do DNA que ocor-rem. (a) Aps a infeco, a molcula de DNA de ita simples de M13 convertida na formareplicativa (RF) de fita dupla. (b) A RF replica para produzir mltiplas cpias de si prpria. (c)Molculas de ita simples so sintetizadas por replicao por crculo rolante e utilizadas namontagem de novas partculas de M13.

IE,IELGU

a

::::.=

:.::::':::r:

(a) lnjeo de DNA deita simples na clulahospedeira, seguidapela sntese dasegunda ita

A partcula deM13 injeta seuDNA na clula

DNA de fitasimples

DNA de fita dupla:lorma replicativa (RF)

(b) Replicao da RFpara produzir novasmolculas de ita dupla

A RF replica pelo mecanismo de crculo rolantepara produzir DNA de ita simples linear

(c) Produo contnuade agos M13maduros

DNA circularizado

-##Partculas maduras do fago

7^\

oxo\\/^/

%

d eroA ztrgrslq p elred anb r$E

Cnprulo 3uma descrio deta-

Dubuque. [Uma boa in- Purificao de DNA a Partir de Clulas Vivas

Preparao de DNA celular total, 39Preparao de DNA plasmidial, 47

Preparao de DNA de bacterifagos, 55

/ A engenharia gentica demanda, em diferentes momentos, a preparao de pelo menos trs ti-I pos distintos de DNA. Primeiramente, um DNA celular total, muitas vezes necessrio como\ ura fonte de material a partir do qual so obtidos os genes a serem clonados. O DNA celularI total pode ser aquele conseguido a partir de uma cultura de clulas bacterianas, vegetais ou,l animais ou de qualquer outro tipo de organismo em estudo.\ O segundo tipo um DNA plasmidial puro, cuja preparao d-se a partir de uma culturaI bacteriana, seguindo as mesmas etapas bsicas que a purificao do DNA celular total, com aI diferena crucial de que, em algum estgio, o DNA plasmidial deve ser separado do compo-I nente principal de DNA cromospmico tambm presente na clula.\ Finalmente, PNA de fago breciso se um veculo de clonagem derivado de bacterifago

for utilizado. DNA de fago em geral preparado a partir de partculas virais e no a partir declulas infectadas, de modo que inexiste problema associado contaminao com DNA bac-teriano. Entretanto, so imprescindveis tcnicas espeliais para a remoo do capsdeo viral.Uma exceo a forma replicativa de fita dupla Oe Mt:, a qual prep arada apartir de clu-las de E coli, damesma maneira que um plasmdeo bactenanor/

Preparao de DNA celular totalOs fundamentos da preparao de DNA so mais facilmente compreendidos se for considera-do primeiramente o tipo mais simples de procedimento de purificao, utilizado quando todoo complemento de DNA de uma clula bacteriana necessrio. As modificaes que se im-pem para a preparao de DNA de plasmdeos e de fagos podem, ento, ser descritas maistarde.

e30t!,t!LGoa

TJe INOJd AE ols q ep 3lrd 3nb ru

40 T. A. Bnowlr

O procedimento paa a preparao de DNA total a partir de uma cultura de clulas bacte-rianas pode ser dividido em quatro estgios (Figura 3.1).

As clulas bacterianas so cultivadas e depois recuperadas da cultura e concentradas.As clulas so rompidas para liberar seu contedo.Este extrato celular tratado para a remoo de todos os seus componentes, exceto o

(1)(2)(3)

nitrrfatoaosad

rli indr{) conlI

\ extrlida,trat(adecom

uma

DNA.(4) A soluo de DNA resultante concentrada.3.1.1 Multiplicao bacteriana em cultura e recuperao

das clulas cultivadasA maioria das bactrias pode ser multiplicada sem maiores dificuldades em um meio lquido(caldo de cultura). O meio de cultura deve prover uma mistura eqirilibrada dos nutrientes es-senciais, ein concentraes que permitiro o desenvolvimento e a diviso eficiente das bact-rias. Os dois meios de cultura tpicos so detalhados na Tabela 3.1 .

M9 um exemplo de meio definido, no qual todos os componentes so conhecidos. Essemeio contm uma mistura de nutrientes inorgnicos para prover elementos essenciais, como

Figura 3.1As etapas bsicas para a preparao de DNA celular total a partir de uma cultura bacteriana.

Tab

Mei

Mei

disendquaduma

tos. ias/nsldacDfi

PlumeVelordo drtria:pensi

1 As bactrias so cultivadas emmeio de cultura e recuperadaspor centriugao

2 As clulas so recuperadasdo meio e rompidas para gerarum extrato celular

-9'--:'t"ffl Centriugao/\

/\/--:-- = ---

\(.-:___:JCultura bacteriana

\Extrato celular

ODNAconcentrado

)-RttttL]lt ',tl\:-r'---DNA puro

O DNA puriicado apatir do extrato celular

oJSd 330,\IE,IELGrta

Bin r9lslq ?p alrd enb ru

Croruncev Guce e ANLtsE DE DNA 41de clulas bacte-

e concentradas.

exceto o

:n um meio lquidodos nutrientes es-

eficiente das bact-

io conhecidos. Esse

nitrognio, magnsio e clcio' alm de glicose, como fonte de carbono e energia. Na prtica,fatores de crescimento adicionais, como elementos-trao e vitaminas, devem ser adicionadosao M9 para que ele seja capaz de sustentar o desenvolvimento bacteriano. A definio preci-sa dos elementos necessrios depende da espcie a ser cultivada.

O segundo meio descrito na Tabela 3.1, o de Luria-Bertani (LB), um pouco diferente, .

indefinido ou complexo, o que significa que a identidade e a quuiaud" precisas dos seus' componentes so desconhecidas. Isso ocorre porque dois dos seus ingredientes, a triptona e o.

extrato de levedura, so misturas complexas, de compostos qumicos desconhecidos. Na rea-lidade, a triptona supre as bactrias com aminocido e pequenos peptdeos, enquanto o ex_trato de levedura (uma preparao seca de clulas ae levdura puui-.nt. alg".iJury *p."a demanda por iritrognio, acares e nutrientes orgnicos e inorgnicos. Meios complicadoscomo o LB no necessitam de suplementao adiciorial e sustentam o desenvolvimento deuma ampla gama de espcies bacterianas.

Tabela 3.1 A composio de dois meios tpicos para o cultivo de clulas bacterianasos essenciais, como Meio Componente g/l de meio

Meio M9

LB (meio de Luria-Bertani)

NarHPO.NH2PO4NaClNH4CtMgSO,GlicoseCaCl.,TriptonaExtrato de leveduraNaCl

6,03,00,51,00,52,00,01510510

cultura bacteriana.

t

Meios definidos devem ser utilizados quando as bactrias tm de ser cultivadas sob con-dies precisamente controladas. Isso, contudo, no necessrio quando as bactrias estosendo cultivadas simplesmente como uma fonte de DNA

",

no "uro,

u- meio completo ade_quado. Em meio LB, a 37"c e.coT raeo proporcionada por agiiaao a 150 a 250 rpm emuma plataforma rotatria. clulas de \ coti dividem-se "-

*o" o-u u", a cada 20 minu-tos, at que a cultura atinja uma densidade mxima de aproximadam*,"_k_:-^^l-_d*;r";las/ml. o aumenro do n-mero de clul-as na culrura. po$g.

.

^gr 10nf-tgr+.g.g p_e. l.p_ lpituta .da den_-I*,ffi;i ioo 'i;i'r.i,piiln"ur" compripento de onda, uma unidade deDO corresponde a aproximadamente 0,g x lOe clulas/ml. :' ; i -- '

' Pra aprtrife"ffiititelili;fffiilffim esrar concentradas no menor vo-lume possvel. Por isso' as clulas da cultura so sedimentadas por centrif'ugao (Figura 3.3).velocidades de centrifugao moderadas so suficientes para r"di-"nt- as bactrias no fun-do de um tubo de centfuga, o que permite que o meio de cultura seja removido. Assim, bac-trias oriundas de 1.000 ml de uma cultura cm densidade celular

-*i-u podem ser ressus-pensas em um volume de l0 ml ou menos.

,v *,=.,t8l( [f*\ I\ \ ..\t \ rl

-(fato celular

-'r70-red JJOA e{-{ols q Yp rlred 3nb ur

Clorunceu GHtca e ANLlsE oe DNA 43

em uma

ptica (DO). (a)passa luz de um

da cultura medi--

-log,o (intensidade. em um espectro-a partir de uma

cr.rlturas com densida-

- por sua vez, envol-

coli, aprpia paredeTodas essas barreiras

ididas em mtodos f-ntodos qumicos, nos

mmmmmrnur4 rruou'd

Figura 3.3Sedimentao de bact-

rias por centrif ugao.

quais a lise celular causada pela exposio a agentes qumicos que afetam a integridade dasbaneiras celulares. Os mtodos qumicos so mais comumente utilizados quando as clulasbacterianas devem ser liSadas visando preparao de DNA.

A lise qumica via de regra envolve um agente que ataca a parede celular e um outro querompe a membrana da clula (Figura 3.4a). Os agentes qumicos a serem utilizados dependemda espcie de bactria envolvida. PanE. col e organismos aparentados, o enfraquecimento dapared celular , em geral, feito com lisozima, tetracetato de etilenodiamina (EDTA) ou umaiombinao de ambos. A lisozima uma enzima que est presente na clara do ovo e em secre-

o.z

*ia,a

::--:::--:.:,- ::rl o.iill:t :-\.al (ru :1e :tlh itJ o :rqus c'q1t1 o t'lr:d :luf,si 3n Vi ,rosmu:r;r;-:rr'r::-:::--::f,-ossrnous:auuanbetro^tol'oqllI'?rp""""l-::|^t::t:^:i::i;*[ - --

* **atql Eopourqprqapodlos o anb trpuaa'tr:glqqesp mmm rtprrst u:"r- *".;'-J*p " "p''b ory *-"::{:::::":"":Hll:-

G.zIELIEIta

xtulffi

ffiffi ;;1" ;;;J; *;l ;r r"; ;'rrru'urv'of, slruerg'nd nas o ots anb strp ual,,

(a) Lise das clulas

Rompimento da parede celular

Rompimento damembrana celular

_-_?----l- -- l^

Extrato cel u la r

--\D

(b) Centriugao para remoo dos resduos celulares

I l :l

-

l---- I '-- DNA' RNA' Protenas

5Jilil:1' centriugao. qResduos celulares

44 T. A. Bnowlr

es como algnmae a saliva, sendo capaz de digerir os compostos polimricos que conferemngidez parede celular. O EDTA, por sua vez, remove ons de magnsio essenciais preserva-o da estrutura global do envoltrio celular, alm de, tambm, inibir enzimas celulares capa-zes de degradar DNA. Sob certas condies, o enfraquecimento da parede celular com lisozi-ma e EDTA suficiente para romper as clulas bacterianas, mas, em geral, um detergente, co-mo o dodecilsulfato de sdio (SDS), tambm adicionado. Detergentes auxiliam no processode lise removendo molculas de lipdeos, o que provoca o rompimento das membranas celula-res.

Depois de as clulas terem sido lisadas, a etapa final da preparao do extrato a remoodos resduos celulares insolveis. Componentes como fraes da parede celular parcialmentedigeridas podem ser sedimentados por centrifugao (Figura 3.4b), deixando o extrato celu-lar como um sobrenadante razoavelmente limpo.

3.1.3 Purificao de DNA a partir de um extrato celularAlm do DNA, um extrato celular bacteriano contm'quantidades significativas de protenase RNA. Para deixar o DNA em uma forma pura, vrios procedimentos podem ser utilizadosna remoo desses contaminantes.

Figura 3.4Preparao de um extrato celular: (a) lise das clulas e (b) centrifugao do extrato celularpara remoo de resduos insolveis.

Ara decidolentatcas filada Icom l

Figura 3.5Remoo decontaminan-tes proticospor eldrao

com enol.

Ercom probkmas irns mmoa

Polip'rAI

vidasA nircleasr

81"4 ConctCom no ntes do dc

OrNa pnNalrcidostado srcelent,luo isrrreti

Ior-r4E]rorElC Til[i. :z

*r.q

'::--+:iio: r,rrd odrut 31rl oru .i nb rt. o :.tqos oqlg o urd :l::rs: otut yss;6ffas;:'i i:r -:r i:a: : l::r r

-.'os nomsua au uanb afo^ ol 'oq[g'?Ip o:lno un arduas u] sBW'oloqtrM @qmFrq r wruJ g[ op,rrrl rtqgrq apod 1os o anb erp u:1'er:91m4 essou ep or5enuuuo: t a a:ol anb:odryrryr rp^ utpnsr u:rm zun E{o.\ f 'zejsp s lapw anb o opnt anb erp uea'o:anq un an er:8ap

G,IELt!Ita

LE

uory oGqtr p o!ru3q-s o'aIP :ou o zrp EoJ El los o 'leqmuv'of,srJwrJ 'red nas o oes anb seIP uL,

CLoruneetr Gnrcn e Aruuse oe DNA 45:,:[imricos que conferem

io essenciais preserva-: enzimas celulares capa-

:e.arede celular com lisozt-geral. um detergente, co-

l;es auxiliam no processo: rlas membranas celula-

doextratoaremooFtr:de celular parcialmente

. Jeirando o extrato celu-

slsnificativas de protenasros podem ser utilizados

-_

____\

Fgura 3.5Hernoo deounaminan-hs proticospor extrao

corn enol.

A maneira-padro de desproteinizar um extrato celular adicionar fenol ou uma mistu-ra de fenol e clorofrmio 1:1. Tais solventes orgnicos precipitam protenas, mas deixam oscidos nuclicos (DNA e RNA) em soluo aquosa. Assim, se o eitrato celular misturadolentamente com o solvente e as fases so separadas por centrifugao, as molculas proti-cas ltcam na interface entre as camadas aquosa e orgnica, na forma de uma massa coagu-lada branca (Figura 3.5). A soluo aquosa de cidos nuclicos pode ento ser removidacom uma pipeta.

-.-------------

Fase aquosa(DNA + RNA)

lnterface(protenascoaguladas)

Fenol

Extrato celularMistura comfenol

Separao das asespor centrifugao

Extrato celular

NA, protenas

iIFes

I

lrifugao do extrato celular

:-_I,-+

Em alguns extratos celulares, o contedo protico to grande que uma nica extraocom fenol mostra-se insuficiente para purificar completamente os cidos nuclicos. Esseproblema poderia ser resolvido pela realizao de vrias extraes sucessivas com fenol,mas isso no desejvel, pois cada etapa de mistura e de centrifugao resulta em quebrasnas molculas de DNA. A soluo , ento, tratar o extrato celular com uma protease, co-mo a pronase ou a proteinase K, antes da extrao com fenol. Essas enzimas quebram ospolipeptdeos em unidades menores, as quais so mais facilmente removidas pelo fenol.

Algumas molculas de RNA, especialmente de RNA-mensageiro (mnN), so remo-vidas pelo tratamento com fenol, mas a maioria permanece com o DNA na soluo aquosa.A nica maneira eficiente de remover o RNA trata a preparao com a enzima ribonu-clease, que degrada rapidamente tais molculas em suas subunidades ribonucleotdicas.

S.1.4 Concentrao de amostras de DNAcom freqncia, uma preparao bem-sucedida resulta em uma soluo densa de DNA, queno necessita de qualquer concentrao adicional. Entretanto, s vezes, so obtidas solu-es diludas, sendo, ento, importante considerar mtodos para o aumento da concentra-o do DNA.

O mtodo de concentrao utilizado iom mais freqncia a precipitao com etanol.Na presena de sal (estritamente falando, ctions monovalenter, .o-o os ons de sdio[Na-]) e a uma temperatura de

-20'C ou menos, o etanol absoluto precipita com eficinciacidos nuclicos polimricos. com uma soluo densa de DNA, o etanol pode ser deposi_tado sobre a amostra, provocando a precipitao das molculas na interfa.. U- truqul ex-celente consiste em empurrar um basto de vidro pelo etanol para que ele mergulhe na so-luo de DNA. Quando o basto removido, as molculas de DNA aderem a ele e podemser retiradas da soluo na forma de uma longa fibra (Figura 3.6a). Alternativamenre, s o eta-

o2

*slo

r : nn:.FJ.r ,i;.ir::*::: rr,::.::-. ..,,..5,,'";'ii:*;ff;:t;'.:,ilf.:",i;::ff::.:'1,':il,.r:m mffi upm}.[.::ssr rrluq rm: *tro,l EI opuqnqprq apod los o a.b erp uaa'orrril

"rror "p o":".rrtro, e r rro^ ,.brr4

LMliff* mmmJ 5@ mf omnIE oP loro e'zpn8e ezarsut Bun rtlo^ 'ze;sap as rapur anb o opnl anb erp u:a.o:e:nq un an err3afim'dal:g tr'mmosmm r uog- oP"q op oDuJIs o'JIp Juou o zrp ero; rl Ios o'trr{uruv.o:sr:uerg,red nas o ors anb srrp rr"a,,

G,:GLIEoa

46 T. A. Bnowlr

Basto de vidro

de DNA

Soluo de DNAconcentrada DNA precipitado

coletado porcentriugao

Figura 3.6Coleta do DNA por pre-cipitao com etanol.(a) Etanol absoluto depositado sobre umasoluo concentradade DNA. As fibras deDNA podem ser recu-peradas com um bas-to de vidro. (b) Parasolues menos con-centradas, o etanol adicionado (em umaproporo de 2,5 volu-mes de etanol absolulopara 1 volume de solu-o de DNA) e o DNAprecipitado coletadopor centriugao.

A mulsar de as rtes em hirrompirnerrianas r-iata clulasde parededo com alrede celul

Lma rp@nentq!i!uma ex.tr8cm_-d[itm qanno ser sute spectomordos 1

u*m dc(CTABt-rnado a rrrrboidraros-pois- coletcompleroo RNA po

Um sesui duas pdissolr,e tr5er utilizpresena (_-8ar. penqumiss5 1lular. mescare na cclica e re:

\- rnente por., Euanirlina

molculas

nol misturado com uma soluo de DNA diluda, o precipitado pode ser coletado por cen-trifugao (Figura 3.6b) e depois novamente dissolvido em um volume adequado de gua. Aprecipitao com etanol tem a vantagem adicional de deixar cadeias curtas e componentesmonomricos de cidos nuclicos em soluo. Assim, nesse estgio, ribonucleotdeos produ-zidos por tratamento com ribonuclease so perdidos.

3.1.5 Medio da concentrao do DNA crucial conhecer exatamente quanto do DNA est presente em uma soluo quando da exe-cuo de um experimento de clonagem gnica. Felizmente, a concentrao de uma soluo deDNA pode ser precisamente medida pela espectrofotometria de absorbncia de ultraviole-t (UV). A quantidade de radiao IfV absorvida por uma soluo de DNA diretamente pro-porcional quantidade de DNA na amostra. Via de regra, a absorbncia medida a260 nme,nesse comprimento de onda, uma absorbncia (Aruo) de 1,0 corresponde a 50 pg de DNA defita dupla por ml.

A absorbncia de ultravioleta tambm pode ser utilizada para a verificao da pureza deuma preparao de DNA. Com uma amostra pura de DNA, arazo das absorbncias a 260 nme a 280 nm (Aruo/Arro) 1,8. Razes menores que 1,8 indicam que a preparao est contami-nada com protenas ou com fenol.

3.1.6 Preparao de DNA celular total de outros organismosque no bactrias

Bactrias no so os nicos organismos cujo DNA pdde ser necessrrio. DNA celular total de,por exemplo, plantas ou animais pode ser fundamental se o objetivo do projeto de engenhariagentica for a clonagem de genes de tais organismos. Embora as etapas bsicas da purificaode DNA sejam as mesmas para qualquer organismo, a introduo de algumas modificaespode ser exigida em decomncia das caractersticas especiais das clulas que esto sendo uti-lizadas.

t2 Preparaq.+prific'alal ilg rrmalquido- xcnraro dpiao c-oqdeos e a

'-r:::tiuo:r trrd ocltrtal J l olu Jli rtb rcd o ::qos oqltl o urd ;rat:rsl arnt yrrruil: -ir.:flJf,:tr;1i11s'r;.:j;..;rrinr:luopurn|.;os$nou$uuuanberolrog'oq[g'?IpoJlnounerduasua]s2141'o:oq:

fubrr4, mrn1-ax-n oqlrq tm 9 su'soJ gl opurlr?rilrrq apod 1os o enb ?Ip uJ'ttf,otslq ?ssou ep otSenurluo: t a a:ol anb:o4Lmxw Lionmcr- sp u:I -opm op roro r'epn8e ezatsrJl ?un etlo !J'ze;s:p as rapw :nb o opnl anb erp u3l'otrunq un eiln rr:8ep

t!.IELt!oa

rudm:ry' g-m:uasrc rur EoqJ opeqrs op ortruIs o'lp uou o zrp ef,oJgIos o 'lqu?uryorsrf,uttrg'red n:s o oes anb srrp uaa,,

3.6

Cr-oruncev Grurcn e ANLrsE DE DNA 47

A multiplicao das clulas em meio lquido pode, muitas vezes, no ser adequada, ape-sar de as culturas de clulas vegetais e animais estarem se tornando cadavez mais importan-es em biologia. Entretanto, as principais modificaes so, em geral, exigidas na etapa denompimento das clulas. Os agentes qumicos utilizados para o rompimento de clulas bacte-rianas via de regra no funcionam com outros organismos: a lisozima, por exemplo, no afe-ta clulas vegetais. H enzimas degradantes especficas disponveis para a maioria dos tiposde parede celular, mas, muitas vezes, tcnicas fsicas, como a triturao do material congela-do com almofariz e gral, so mais eficientes. Clulas animais, por sua vez, r,o possuem pa-rede celular e podem ser lisadas por um simples tratamento com detergente.

Uma outra considerao impgrt4nte diz respeito ao contedo bioqumico das clulas apartiids qqAiq_q PNe gs!4 $endo _extrado. Na maioria das bactrias, os principais compo-q911e9 b-!og{mi,c-g-q p_{e_sgllgq ell,um extrato celular so pqot_9in4q, DNA e RNA, de modo queuma extrao com fenol e/ou um tratamento com protease, qe_ullo pql3,Igfno{o_ {o RNAcom rlbonladarmmostra d;DNCp*". E tr"t-t"J"

^ "l"l' tu*t-.n-tm quantidaaesfiitlii-tie ioJ"mptnts bioqumicos, esses tratamentos podemno ser suficientes para liberar DNA puro. Tecidos vegetais so particularmente difceis nes-re aspecto, pois mg-ip.9*y9_ze_s_g59it9{q1_g-rqndgs ggantidqdes de carboidratos, que no so re-movidos por qx-trg{g

-c_gq.le_19!_P*ol-t!p-o.933*4b-oldggem $jerryti,va deve ser utilizada.Um dos mtodos disponveis usa um detergente chamado brometo de cetiltrimetilamnio

{CTAB), que forma um complexo insolvel com cidos nuclicos. Quando o CTAB adicio-nado a um extrato celular vegetal, o complexo cido nuclico-CTAB precipita, deixando car-boidratos, protenas e outros contaminantes no sobrenadante (Figura 3.7). O precipitado ,de-pois. coletado por centrifugao e ressuspenso em NaCl (cloreto de sdio) lM, que desfaz ocomplexo. Os cidos nuclicos podem ento ser concentrados por precipitao com etanol eo RNA pode ser removido por tratamento com ribonuclease.

Um segundo mtodo envolve um composto denominado tiocianato de guanidina, que pos-sui duas propriedades que o tornam til para a purificao de DNA. Primeiro, ele desnafura edissolve todos os compostos bioqumicos que no so cidos nuclicos, podendo, portanto,ser utilizado para liberar DNA de virtualmente qualquer tipo de tecido. Em segundo lugar, napresena de tiocianto de guanidina, o DNA liga-se fortemente a partculas de slica (Figura-1.$s). permitindo que o DNA seja facilmente recuperado da mistura de outros compostos bio-qumicos desnaturados. Uma das possibilidades a adio de slica diretamente ao extrato ce-lular. mas mais conveniente que seja utilizada uma coluna cromatogrfica. A sflica colo-cada na coluna e o extrato celular, ento, adicionado a ela (Figura 3.8b). O DNA liga-se s-lica e retido na coluna, enquanto os compostos bioqumicos desnaturados passam direta-mente por ela. Depois da lavagem dos ltimos contaminantes com a soluo de tiocianato de"

. _suanidina, o DNA recuperado pela adio de gua, que desestabiliza as interaes entre as -molculas de DNA e a slica.

do DNA por pre-com etanol.absoluto

sobre uma

As ibras deItA podem ser recu-:eradas com um bas-5o de vidro. (b) Parasolues menos con-:entradas, o etanol :dicionado (em uma:rcporo de 2,5 volu--es de etanol absoluto:ara 1 volume de solu-:o de DNA) e o DNA:recipitado coletado:,:,r centriugao.

:er coletado por cen-adequado de gua. A

:'Jrtas e componentesr :n:,nucleotdeos produ-

i{t.ico quando da exe-r de uma soluo de

de ultraviole-'\ diretamente pro-

;i' s :edida a 260 nm e,-t 50 pg de DNA de

a:ao da pureza deubs.rrbncias a 260 nm

;o est contami-

lN-{ celular total de,rreto de engenhariarr',,usicas da purifi cao

"!lLt Fnas modifi cae s,Jre esto sendo uti-

3-2 Preparao de DNA plasmidial,\ purificao de plasmdeos a partir de uma cultura bacteriana envolve a mesma estratgia ge-ral de uma preparao de DNA total. As clulas contendo plasmdeos so cultivadas em meiolquido, sedimentadas por centrifugao e rompidas para a preparao do extrato celular. O-rtrato desproteinizado, o RNA removido e o DNA provavelmente concentrado por preci-pitao com etanol. Entretanto, existe uma importante distino entre a purificao de plas-mdeos e a de DNA celular total. Em uma preparao de plasmdeos sempre necessrio se-

o

*:

,F: ,: i :j, ,,;:;"1*:;j":l:#.:1i:,:':?iJ:::;:5N'Ld: l:milmhrr ro-I:rrcrquJ:-::ro-rro-IEI opuqrrquqpodloso:nbrrpueaerf,otsrEssouepoe5enuguo:eea:olanbro4tlq0il, r 'inwt ilru I itrr:r Ef lcLr= L1r lomu t'e1nr ez:tsrfl run ello^ E zrJsap as r:pur anb o opnl anb erp uJ oJ?Jnq un ef,rl err8apqF!@ tiluiuI;ru *F EE--lrr r-5 r lo:- opeq op ottruFs o 'Jp uou o zrp rrJ tl los o 'f,equruv'oJsr:ue:g'ftd nas o ors anb serp uea,,

G.GLGIta

48 T. A. Bnowlr

CTAB

\Complexo cidoExtrato celular

Complexo cidonuclico-CTAB precipitado

Precipitao

DNA puro i?[,itli'3;",

Clorunceu GNrcA E ANLrsE oe DNA 49

(a) Ligao do DNA a partculas de slica

/r-:x-'@Partculas de slica \\6\y

(b) Purificao de DNA por coluna de cromatograia

Extrato celular

+ffiW}

Compostosbioqumicosdesnaturados

@-'t=.@'@

Agua

Molculas de DNA

w

H

Partculasde slica

ull,lH

-_ ti-"i-.-/\:-7

Descarte

DNA

i

bacteriano que tambm

difcil, embora essencial se osa presena de quantidades

de clonagem pode levar a re-is para a remoo de DNA

mtodos. individualmentebastante puro.

entre o DNA plasmidialpossuem apenas 87o do

do que isso. Tcnicas ca-DNA grandes deveriam, por-

tambm diferem quanto A, o termo conformao re-conformaes mais simples

no so circulares, mas, du-

-1p-.sq1rs3 rrrd odrul "^t o?u la .lnb cd o o:qos oqlg o :;ud lursr orur yrm: mihrmld miru!i !{l iin r:g,t oprnn}..'os$ nonff ru unb a:ol rog oqlg'etp ortno un a:dus u3l sery'oJo{f

ffirpmq:m-ooryqrm szu?ro;yloprqnq1uq apod 1os o anb ap uI'?rrotsrq?ssouep oe5znurtuo: r a a:olanb:o4rqlnpslmoprow e?pn8e rzatsut erlm etlo^ A zr;sap es rapue anb o opnl anb ap uaa'orernqun an er:8ap

Figura 3.8Purificao de DNA pelo mtodo do tiocianato de guanidina e da slica. (a) Na presena dotiocianato de guanidina, o DNA liga-se a partculas de slica. (b) O DNA puriicado em umaooluna crornatogrf ica.

IE.t!LGoa

JDg-EJryrt lnr r cloqJ opeqgs op oouIs o'lp uou o zrp roJ el los o rf,Jrlu?uy'o]sr:urtg'rcd nas o ogs anb serp uaa,,

50 T. A. Bnowrrr

rante a preparao do extrato celular, o cromossomo sempre quebrado e gera fragmentos li-neares. Um mtodo para separao de molculas circulares de lineares resultar, pr1anto, emplasmdeos puros.

3.2.1 Separao com base no tamanhoEm geral, o fracionamento por tamanho executado no estgio de preparao do extrato ce-lular. Se as clulas so lisadas sob condies cuidadosamente controlads, ocorre apenas umaquantidade mnima de quebra do DNA cromossmico. Os fragmentos de DNA resultantes soainda muito grandes

- muito maiores que os plasmdeos

- e podem ser removidos, juntamen-

te com os resduos celulares, por centrifugao. Esse processo tambm facilitado pelo fatode que o cromossomo bacteriano est fisicamente fixado ao envoltrio celular, de modo queos fragmentos cromossmicos sedimentam com os resduos celulares se essa interao n rompida.

O rompimento das clulas deve, portanto, ser executado de maneira bastante branda para

:e. Bm r,l^E:1i{ 1r{ ilir Fl

;ttl"'t ,UfittrSlll:. ruLl-ii,ufillt filllutllf iltfi ltff'lto:

-.rmmu

;lr r &,fuS]!llJ{l tIuxlLijul,*,tt!tLf:*ringr,ffro

r,lii!ffiiirf,$ e

impedir a quebraa lise controlada

generalizada do DNA bacteriano. Paru E. coli e espcies aparentadas a ela.executada conforme mostiado na Figura 3.9. o tratamento com EDTA e li-

Figura 3.9Preparaode um lisadoclarificado.

sozima feito na presena de sacarose, o que impede que as clulas rompam-se imediatamen-

Cromossomo bacteriano

Lisozima+ EDTA

...........................".............'...*

Sacarose 25%

Plasmdeos

Membrana .'/celular intacta

Parede celularrompida

Plasmdeos o2IV.aa

I

I rriton x-t ooto\ ^,.ab /-

.^ /' '

-\oExtrato celular

Lisadoclariicado

Grandesfragmentosde DNA

+-Centriugao

Resduos celulares

Eseroplasto

\-_ :; r::-.1

r' :: ::.:.:::i-io:.rirrlop,{rr,,.,r.r"'"1r,,:'.'ri:.jj,::1:il::lrJiffin:'i.::;'j;'l#;:;:gr m; ::i rrp ur'lll ollluq un r $u'croJ e opuq rrqir:q apod 1os o anb rrp ua1'orrii1"*o.,

"p oe5enunuo: e a a:olnb:o4

F-r : fL--a qT! uf .opunlu op lornu e,epn-Br ezetsrJt un ?tlo^ g.zeSsap :s rapur anb o opnl anb erp uJ.of,ernq un ?nl e,raplw,;: :: I -EDusn? Ens e Elo]] op?qs op orluars o ,lp ruou o zp troj ? os o,lqu?uv.of,st:ue:g,rrd nes o ors :nb srrp rraa,,

oz

*s1oIE

.ELGrta

t,e e SWt4rilf$ trt

tllf tiitmli rrritihdldurmulnforulurrrnur, i&f

,ufu'nmam"dUr

uClLir:q,:tliiu uLlm

tuCiuu 'llhf

;p'lirlt,tu1Nrmrirdurur

11|ti(rrtElI]jlflEl!1tl, if,'Itrrill,iitlr utt[

-llnnlllrr,lll4n|l,mtnrmmrudii tdrrt;|ltr 4l:

lmtttittuttllr, lnffi rrfl ttilttum"rfiMilim' I

llllr riiilrrlllffiirriillMll i$MnlillrM -

i illliillil'tfln1Imdirxtrudllui

uultl,fl 1 tttjmr uLl

nur| utl[, r||l{ulutltrr unmnr llirrltttluru

Dlrl{trr illlntnluttu,,idlffulir

rrtttrrrrnt{ttttu * dim*rnn

CLorunoev GNrcA E ANLrsE oe DNA 51

r quebrado e gera fragmentos li-: Lineares resultar, portanto, em

;io de preparao do extrato ce-controladas, ocoe apenas umalmentos de DNA resultantes soDdem ser removidos, juntamen-n tambm facilitado pelo fatorur otrio celulaq de modo queclulares se essa interao no

b maneira bastante branda parafr e espcies aparentadas a ela,

O tratamento com EDTA e li-- a-r rompam-se imediatamen-

Figura 3.9Preparaode um lisadoclarificado.

Figura 3.10lMurms conformaes de DNA de ita dupla circular:lmlt srnerenrolado

- ambas as itas esto intactas;

'h l roular aberto -

uma ou ambas as fitas pos-suem uma quebra.

-

Corte

(a) Superenrolado (b) Circular aberto

te. Em vez disso, so formados esferoplastos, clulas com paredes celulares parcialmente de-gradadas, que retm uma membrana citoplasmticaintacta. A lise celular , ento, induzidapela adio de um detergente no-inico, como o Triton X-100 (detergentes inicos, como oSDS, causam quebras cromossmicas). Esse mtodo provoca poucas quebras no DNA bacte-riano, de modo que a centrifugao resulta em um lisado clariicado, consistindo quase queinteiramente em DNA plasmidial.

Contudo, um lisado clarificado ainda conter, invariavelmente, algum DNA cromossmi-co. Ademais, se os prprios plasmdeos so molculas grandes, eles tambm podem sedimen-tar juntamente com os resduos celulares. Assim, o fracionamento por tamanho raramente suficiente por si s, devendo-se considerar modos alternativos para a remoo dos contami-nantes de DNA bacteriano.

\22 Separao com base na conormaoAntes de se considerar como as diferenas conformacionais entre plasmdeos e DNA bacte-riano podem ser utilizadas para separar os dois tipos de DNA, deve ser analisada mais deta-thadamente a estrutura geral do DNA plasmidial. No estritamente correto dizer que plas-mdeos tm conformao circular, pois crculos de DNA de fita dupla podem, na realidade,adotar duas configuraes alternativas bastante distintas. A maioria dos plasmdeos existe naclula como molculas superenroladas (Figura 3.10a). O superenrolamento ocore porque ahlice dupla do DNA plasmidial parcialmente desenrolada durante o processo de replicaoplasmidial por enzimas chamadas de topoisomerases (p. 70). A conformao superenroladasomente pode ser mantida se ambas as fitas polinucleotdicas estiverem intactas, da o nomemais tcnico de DNA circular covalentemente fechado (ccc, do ingls covalently closed-circular). Se uma das fitas polinucleotdicas quebrada, a hlice dupla retorna ao seu estadonormal relaxado e o plasmdeo adota a sua conformao alternativa, denominada de circularaberta (oc, do inglsopen-circular) (Figura 3.10b).

O superenrolamento importante na preparao de plasmdeos porque molculas supe-renroladas podem ser facilmente separadas de DNA no-superenrolado. Dois mtodos dife-rentes so comumente utilizados, os quais tm capacidade de purificar DNA plasmidial a par-tir de extratos celulares brufos, embora, naprica, sejam obtidos resultados melhores quan-do um lisado clarificado primeiramente preparado.

Desnaturao alcalinaA base dessa tcnica a existncia de uma estreita faixa de pH na qual DNA no-superenro-lado desnaturado, enquanto plasmdeos superenrolados no o so. Se, com a adio de hi-

az#g:9

:.---:lJrrl-r r.rril odu:.l:atrl ouu.lil rnb rrd o:.rr1os or11r1 o urc x.rrrsr orul g@ .- : r :: ::: :::.:ri;

.ossrnoursuaauuanba:o^roc'oqg'rlporlnounarduasuslsBl/^{ oJorlfXumr .r cr: r :tsrr rc- n: !u'ro_J pl opurl rsqlrrq apod 1os o anb erp uI ?rrgtsr{ essou ep oe5rnurluo: r a a:ol anbro4rr$r; r im: l flr J-rc::---u p ronu e 'tpnr eztsl:] Eun ello^ E ZBJsp s rpur nb o opnr anb erp uJ of,rrnq un ?rrl rr:8aplndil ;r : m-Es:x ms f, Ei.q-- otlEqe\ op of,uFs o'JIJp uou o zrp rloJ gl Ios o 'atquuy oJsrf,ur:g 'rcd nas o os anb stlp uaa,,

IE

,GLIErta

52 T.A.Bnowru

drxido de sdio a um extrato celular ou a um lisado clarificado, o pH ajustado para l2,O a12,5, aspontes de hidrognio do DNA no-superenrolado so rompidas, o que causa o desen-rolamento da hlice dupla e a separao das duas cadeias polinucleotdicas (Figura 3.1 1). Se,depois disso, adicionado cido, essas fitas de DNA bacteriano desnaturado reagregam-se emuma massa desorganizada. A rede insolvel formada pode, ento, ser sedimentada por centri-fugao, deixando o DNA plasmidial puro no sobrenadante.

Figura 3- 1Puriicao deplasmdeos pelomtodo de des-naturao alca-lina.

cula formde de flunde a densrde flutuaqforma umsidade poao tratm

Adem(EtBr) pcO brometcentes. prmento resnear. O Dde desenrda densidapenas a iformam upondente

A cenmtodo ucado sulseparadoRNA prus9 o tubo iplasmidiado dotubDNAplagura 3.14t pronto

Centriugao em,dade de cloreto

diente de densidacdo por centriuga@r

(b) Separao dRNA em um gradi

? DNA linear4z- -+-/ :ffi\/ *r"PIasmdeossuPerenrolados

-

pH 12,0a 12,5

5V-t{3

DNA linear defita simples

io, ,,0

Centrifugao

-

Plasmdeossuperenrolados Sedimento de

3q

r

/abq\ \

de DNA linearsde

DNA linear

BrtIrt!rII(o

Uma vantagem adicional desse procedimento que, sob certas circunstncias (especifica-mente, lise celular por SDS e neutralizao com acetato de sdio), a maioria das protenas edo RNA tambm se torna insolvel e pode ser removida pela etapa de centrifugao. A extra-o com fenol e o tratamento com ribonuclease podem, portanto, no ser necessrios se o m-todo de desnaturao alcalina utilizado.

Centriugao em gradiente de densidade de brometo deetdeo-cloreto de csioEssa uma verso especializada da tcnica mais geral de equilbrio ou centrifugao emgradiente de densidade. Um gradiente de densidade produzido pela centrifugao deuma soluo de cloreto de csio (CsCl) a uma velcidade muito elevada (Figura 3.12a). Ogradiente formado porque a fora centrfuga elevada puxa os ons de csio e de cloreto emdireo ao fundo do tubo. A migrao dos ons no tubo contrabalanada por difuso, demodo a levar ao estabelecimento de um gradiente, com as maiores densidades de CsCl emdireo ao fundo.

Macromolculas presentes