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Clase 4
Citogenética Médica y
Mutagénesis
Qué es la Citogenética?
Es la ciencia que tiene por objeto el estudio de la estructura y comportamiento cromosómico, a través de técnicas de microscopía.
Qué son los cromosomas?
“Cuerpos coloreados” (cromo: color; soma: cuerpo).
Cromosoma: unidad de organización, estructura microscópica.
Es un estado permanente dentro del ciclo celular, pero su condensación es máxima en metafase.
Cómo se empaqueta el ADN?I. Nucleosoma: octámero de
H2A, H2B, H3 y H4 + ADN (146 pb).
II. Solenoide o fibra de cromatina de 30 nm: empaquetamiento helicoidal (6 nucleosomas), interviene la H1.
III. Bucles o fibra de 300 nm: andamio proteico al que se unen los bucles (e/ 20 y 100.000 pb).
IV. Cromátide o fibra de 700 nm:bucles enrrollados “cable de teléfono”. Máximo nivel de compactación: cromosoma metafásico.
Elementos básicos del cromosomaCentrómeroLongitudinalmente divide al cromosoma en cromátidas y
transversalmente en brazos.I. Centrómero propiamente dicho o constricción 1ria.:
formado por ADN satélite asociado a proteínas específicas.II. Cinetocoro: placas proteicas en las cuales se insertan los
microtúbulos.Telómero• Protege y estabiliza a los cromosomas.• Constituído por repeticiones en tándem de TTAGGG, una de
las cadenas tiene mayor longitud. Su elongación se acorta con cada ciclo celular, por la telomerasa.
Orígenes de replicación• Replicones o unidades de replicación,• En el genoma humano hay 20.000 funcionales, representan el 10
% del total de replicones.
Así...
El cromosoma no sólo tiene información para la síntesis bioquímica de las proteínas, sino información esencial para su propia estabilidad y replicación, para su ordenamiento mitótico e interfásico y para el acceso a su propia información.
Cómo se caracteriza un conjunto cromosómico?
Constantes Cromosómicas
Número: set cromosómico básico haploide (n). En humanos n = 23, 22 autosomales y 1 gonosoma (X ó Y). En las células somáticas de los organismos de reproducción sexuada el número cromosómico es diploide (2n). En humanos 2n = 46 (Tjio y Levan, 1956), 44 autosomales y 2 gonosómicos (46,XX; 46,XY).
Morfología1. Tamaño del cromosoma:
grandes, medianos y pequeños.2. Posición del centrómero:
metacéntrico, submetacéntricoy acrocéntrico.
EstructuraPara poner de manifiesto las diferencias ultraestrusturales existentes entre los diferentes pares cromosómicos así como la posible aparición de anomalías estructurales se utilizan las técnicas de bandeo.
Tipos de bandeo:• Bandeos longitudinales Q, G y R• Bandeos específicos C, T y Nor• Bandeos de alta resolución.
Las bandas Q y G+ y R-, son ricas en A-T, son pobres en genes y de replicación tardía. Las bandas Q-, G- y R+, son ricas en C-G, y en genes activos que se replican tempranamente.
CariotipoA partir de las tres constantes cromosómicas puedo establecer el
cariotipo (ordenamiento sistemático de los cromosomas). Los cromosomas se ordenan de a pares, de mayor a menor tamaño y de acuerdo a la posición del centrómero.
Según lo establecido por ISCN (Sistema Internacional de Nomenclatura en Citogenética Humana), la clasificación básica comprende 7 grupos
Obtención de CromosomasLos cultivos celulares se pueden realizar a partir de diferentes tejidos.
- Diagnóstico prenatal: líq.amniótico y vellosidad corial.
- Diagnóstico postnatal: sangre periférica, médula ósea, células tumorales, etc.
Las células crecerán en suspensión (células hematopoyéticas) o en monocapa (vellosidades coriales, líquido amniótico, piel).
El procesamiento será directo (células en división: médula, vellosidades, células tumorales) ó indirecto (células estimuladas: linfocitos, líquido amniótico, ganglio).
0.5 a 5 ml de sangre periférica (heparina)
siembra de las células en medio de cultivo(aminoácidos, vitaminas, sales, nucleótidos) +
suero (hormonas y factores de crecimiento) + antibiótico +mitógeno (induce la división celular; Ej.: Fitohemaglutinina)
Incubación a 37 ºC durante 48 a 72 hs
Agregado de un agente antimitótico(impide la formación del huso mitótico; Ej.: colchicina)
Agregado de solución hipotónica(para lograr dispersión cromosómica)
Fijación de las células(detiene la auto lisis y preserva el material)
Goteo del material sobre portaobjetos
Coloración(homogénea o bandeo) Cariotipo
Citogenética Clínica
Se trata de la investigación y diagnóstico de patologías cromosómicas,a nivel fetal “Diagnóstico Prenatal” y en individuos ya nacidos y adultos“Diagnóstico Postnatal”.
Anomalías Cromosómicas
Se presentan en 1 de cada 150 nacidos vivos.
Son la principal causa conocida de retraso mental y de pérdida de la gestación.
Se observan anomalías cromosómicas entre el 50 y el 20 % de los abortos espontáneos del 1er y 2do trimestre.
Se clasifican en:
Anomalías del Número
Anomalías de la Estructura
Célula Euploide: 23 o 46 cromosomas en su núcleo.
Célula Heteroploide: se alejan del número exacto de cromosomas. Puden ser:
Poliploides: presencia adicional de uno o más set haploide completo en la célula
Aneuploides: pierden o ganan algún/os cromosomas.
Anomalías Numéricas
Anomalías del Número de Cromosomas
Triploidías (3n = 69).
Tetraploidía (4n = 92).
Poliploidías
AneuploidíasPuden ser autosómicas o
gonosómicas
Aneuploidías Autosómicas
Monosomías (2n -1= 45):una única copia de un cromosoma en una célula (incompatibles con la gestación a término).
Trisomías (2n +1= 47):tres copias.
Causas: No-disyunción;
Anafase lag.
Ejemplos de trisomíasTrisomía 21 (47, XY,+21), Sindrome de Down: frecuencia 1/750 nv.
Trisomía 18 (47,XX,+18), Sindrome de Edwards: 1 de cada 6.000 nv. El grado de retraso es mayor que en S. de Down.
Trisomía 13 (47,XX,+13), Sindrome De Patau: 1 de cada 12.000 nv.
Trisomías y Edad Materna
La mayoría de las trisomías aumenta su prevalencia a medida que avanza la EM.
2 factores:
Por envejecimiento celular y cambios en el medio hormonal;
Se pierde la capacidad de reconocer concepciones anormales y eliminarlas.
Ej. Down: en < 30 años 1/800; a los 35 años 1/400; a los 40 años 1/100.
Aneuploidías GonosómicasLas consecuencias son menos graves que las aneuploidías de los autosomas, debido a la inactivación del X.
Ejemplos
Monosomía del X (45, X0), Sindrome de Turner: frecuencia 1 en 2700 mujeres nv.
Sindrome de Klinefelter (47,XXY): 1 de cada 1.000 varones nv.
(47,XXX): 1 de cada 1.000 mujeres nv.
48,XXXX o 49,XXXXX: aumento del retraso mental y físico.
47,XYY: 1 en 1.000 varones nv (trastornos menores de conducta y CI disminuído levemente).
Resumiendo
Del total de concepciones humanas:
50 % terminan en abortos ocultos
10 % terminan en abortos reconocidos
80 % en el 1er trimestre
50% por AC
AC: 52 % T Autosomas; 20 % M X; 16 % 3n; 6 % 4n; 4 % ACE; 2 % Otros.
40 % llegan a término
Anomalías de la estructura cromosómica
Desequilibradas: la redistribución causa una pérdida o ganancia de material cromosómico.
Equilibradas: no hay pérdida ni ganancia.
Las anomalías estructurales, especialmente las desequilibradas, pueden originar enfermedades en los individuos o en su descendencia.
EquilibradasTranslocaciones: intercambio de material genético entre cromosomas no
homólogos. Frecuencia 1/500 individuos.
Translocaciones Recíprocas: las roturas ocurren en dos cromosomas diferentes y el material se intercambia mutuamente. El portador suele ser normal, su descendencia puede ser: normal, portadora de la translocación o presentar duplicaciones o deleciones del material genético.
Translocaciones Robertsonianas: se pierden los brazos cortos y se funden los brazos largos de los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22. El nro. cromosomico disminuye en 1. El portador presenta fenotipo normal, pero su descendencia puede heredar la adición o pérdida de un cromosoma acrocéntrico.
Ej.: t(14;21) segregación adyacente: S. Down
Inversión: es el resultado de dos roturas en un cromosoma, seguidas de la reinserción del fragmento en orden invertido. Puede ser: i. Pericéntrica (incluye el centrómero) o i.Paracéntrica (no lo incluye). Alrededor de 1 de cada 1.000 personas es portadora de una inversión. Los progenitores suelen tener fenotipo normal, pero pueden tener hijos con duplicaciones o deleciones.
Desequilibradas Deleciones: causada por una rotura cromosómica y la consiguiente pérdida del material genético
Ejs.:
- S. de cri-du-chat: del (5p)
- S. De Wolf: del (4p)
Microdeleciones: deleciones muy pequeñas, identificadas con las técnicas de bandeo de alta resolución y citomoleculares. Ejs.: S. de Prader-Willi (15q paterno); S. de Angelman (15q materno).
Duplicaciones: copias extras de un segmento cromosómico. Pueden originarse de cruzamientos desiguales o aparecer en la descendencia de portadores de una translocación recíproca.
ResumiendoAnomalías cromosómicas
Expresión fenotípica
La mayoría se asocia con retraso del desarrollo en niños y retraso mental.
Alteraciones de la morfogénesis facial, que producen rasgos característicos.
Retraso del crecimiento.
En la mayoría de los trastornos cromosómicos autosómicos aparecen con frecuencia aumentada defectos cardíacos congénitos.
Citogenética del Cáncer
Mientras las cromosopatías se producen por errores en las gametas, las redistribuciones cromosómicas en células somáticas son causantes de tumores. La combinación de citogenética convencional, FISH y análisis molecular permite la clasificación de las neoplasias y la monitorización del efecto del tratamiento.
Leucemias
LMC t(9;22) (q34;q11)
LMA t(8;21) (q22;q22)
Tumores sólidos
Linfoma de Burkitt t(8;14) (q24;q32)
Retiniblastoma del (13) (q14)
Tumor de Wilms del (11) (p13)
Cuándo se solicita un cariotipo?Diagnóstico Prenatal
Edad materna ( > 35 años); Alto riesgo determinado mediante marcadores bioquímicos en suero materno y ecográficos; Alteraciones cromosómicas estructurales balanceadas en los padres; Hijos previos conCromosomopatías o Retraso mental; Infertilidad en la pareja; Riesgo laboral.
Diagnóstico PostnatalFacies peculiar; Microcefalia; Prematuridad; Genitales
ambiguos; Ginecomastia; Retraso del desarrollo y trastornos del aprendizaje; Retraso mental; Talla alta/baja; Amenorrea; Abortos repetidos; Azoospermia; Tumores sólidos y leucemias
Mutagénesis
La citogenética se utiliza también para medir el efecto de agentes mutagénicos valorando la presencia de ACN y ACE.
Mutagénesis
Agentes genotóxicos (químicos, físicos y biológicos), artificiales y naturales, pueden producir alteraciones sobre el genoma, en células somáticas y germinales. Estos eventos pueden ser causa de cáncer y defectos
del desarrollo.
Químicos: existen más de 70.000 sustancias químicas, muchas de ellas genotóxicas.
Físicos: radiaciones ionizantes (rayos X) y no ionizantes (rayos UV).
Biológicos: virus.
Ensayos deGenotoxicidad
Se pueden utilizar para evaluar el accionar de diversos agentes mutagénicos.
De Nivel Primario: procariotas.De Nivel Secundario: líneas celulares.De Nivel Terciario: animales de laboratorio.De Nivel Cuaternario: poblaciones expuestas.
Existen diversas técnicas citogenéticas para realizar esta evaluación:
Análisis de Aberraciones Cromosómicas Estructurales (ACE).Ensayo de micronúcleos (MN).Ensayo de electroforesis en gel de células individuales (Cometa).
TIPO
SUBCROMÁTIDA
-Brechas intersticiales o gaps (chtg, chrg)
- Adhesividad cromosómica (tas)
TIPO
CROMÁTIDA
- Fractura de cromátida (chtb, chrb)
TIPO
CROMOSOMA
- Cromosomas en anillo (r)
-Intercambios Asimétricos o Cromosomas
dicéntricos (dic)
-- Fragmentos Cromosómicos (ace)
Análisis de ACE
Ensayo de MN
Los MN son pequeñas masas de cromatina que se ubican próximos a los núcleos en interfase.
Se originan durante la división celular por la pérdida de fragmentos y/o cromosomas enteros.
Permiten detectar diferentes tipos de lesiones:Roturas de doble cadena del ADNRoturas de cadena simpleCromosomas dicéntricosNecrosis y apoptosis
0.5 a 5 ml de sangre periférica (heparina)
siembra de las células en medio de cultivo(aminoácidos, vitaminas, sales, nucleótidos) +
suero (hormonas y factores de crecimiento) + antibiótico +mitógeno (induce la división celular; Ej.: Fitohemaglutinina)
Incubación a 37 ºC durante 72 hs
Agregado de un agente bloquedor de la citosinesis(impide la formación de la membrana plasmática; Ej.: citocalasina B)
Agregado de solución hipotónica(para lograr dispersión cromosómica)
Fijación de las células(detiene la auto lisis y preserva el material)
Goteo del material sobre portaobjetos
Coloración(homogénea o bandeo)
Ensayo Cometa
Consiste en la electroforesis en gel de células únicas.
Es una técnica muy sensible que detecta rompimientos de cadenas sencillas. Se basa en la migración, durante la electroforesis, de fragmentos rotos de ADN.
Se mezclan las células con agarosa y se siembran en un portaobjetos que presenta otra capa de agarosa, se sumergen en solución de lisis y se desnaturaliza el ADN. Luego se realiza la corrida electroforética. Se colorea el ADN con bromuro de etidio y se estima el daño en el ADN a partir de la observación del “cometa”.
Concluyendo
Una célula mutada puede desencadenar:
Procesos neoplásicos, teratogénicos o apoptóticos.
En los estudios de monitoreo genotóxico es importante contar con biomarcadores de gran sensibilidad y bajo costo, que puedan ser aplicadas en diversos tipos de muestras y poblaciones.
Dieta
Estabilidad
Genómica
Exposición a carcinógenos dietarios
Farmacogénesis
Síntesis y Reparación del ADN
Apoptosis
Micronutrientes
Niveles sub-óptimos
Fracturas en la cadena de ADN
Lesiones oxidativas
Importantes en la
prevención de
Enfermedades
Degenerativas.
Bibliografía Sugerida
Jorde LB, Carey JC, Bamshad MJ, White RL (2004). Genética Médica. Harcourt Brace. España.
Solari AJ (2004). Genética Humana. Fundamentos y aplicaciones en medicina. Ed Médica Panamericana. Argentina.
McKinlay RJ, Sutherland GR (1996). Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. Oxford University Press. Oxford.