植物分子育種に利用可能な プロモーター群とその作成方法 - jst · 2016. 3....
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植物分子育種に利用可能なプロモーター群とその作成方法
岐阜大学・応用生物科学部 教授 山本 義治
国際農林水産業研究所（JIRCAS） 主任研究員 圓山 恭之進
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成長ストレス耐性
育種におけるトレードオフ育種におけるトレードオフ育種におけるトレードオフ育種におけるトレードオフ
• ストレス耐性付与は調節的に行うべき
• プロモーターの選択が重要
• 栽培現場の環境にフィットさせる必要
恒常的ストレス誘導性野生型
プロモーター篠崎ら2004
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DREB：乾燥ストレス応答の制御因子
• 篠崎（理研）らにより単離（1998）
• 乾燥・塩害・低温ストレス応答を統括的に制御
• 恒常的発現によりストレス耐性付与（効果大）、矮化を併発（1999）
• 誘導的発現による育種利用の可能性（2004）
• 誘導的発現を利用しても野外圃場では矮化
プロモーターリソースの不在がDREB育種利用のボトルネックにプロモーターリソースの不在がDREB育種利用のボトルネックに
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有用遺伝子プロモーター
ストレス誘導性プロモーター
• 高い育種ニーズ
• リソース不備が分⼦育種のボトルネックに
ストレス誘導性プロモーター
• 高い育種ニーズ
• リソース不備が分⼦育種のボトルネックに
まとめ：プロモーター開発の必要性
JST ALCA山本プロジェクトJST ALCA山本プロジェクト
• 先端的なプロモーター開発スキームを開拓・整備しつつ、開発したプロモー
ターを活用した分子育種を⾏い、植物バイオマス増産を実現
• 先端的なプロモーター開発スキームを開拓・整備しつつ、開発したプロモー
ターを活用した分子育種を⾏い、植物バイオマス増産を実現
今回紹介したいアウトプット今回紹介したいアウトプット
• 環境ストレス応答性合成プロモーター
• ゲノム情報と我々の経験に基づくプロモーター作成技術
• 環境ストレス応答性合成プロモーター
• ゲノム情報と我々の経験に基づくプロモーター作成技術
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メリット
・予測に基づけば自在に設計（リスク有）
・先⾏研究が殆どない 特許化に有利
・データ蓄積による設計技術の向上（優位性）
・精密制御の可能性
メリット
・予測に基づけば自在に設計（リスク有）
・先⾏研究が殆どない 特許化に有利
・データ蓄積による設計技術の向上（優位性）
・精密制御の可能性
リスク
・既知の制御配列だけでは開発できない
・発現予測が困難
・設計上のノウハウが必要？
リスク
・既知の制御配列だけでは開発できない
・発現予測が困難
・設計上のノウハウが必要？
有用遺伝子コア領域
？？
合成プロモーター開発
・基礎研究への貢献・基礎研究への貢献
機能エレメントを用いて人工プロモーターをデザインする
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ゲノム配列から⼀括抽出 遺伝子発現データを用いる
プロモーターに含まれる機能配列の予測法
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コアとなる論⽂
• Hayami et al, . Plant Physiol 169: 840-855, 2015.
• Yamamoto et al, Nucleic Acids Res 36, D977-
D981, 2008.
• Hieno et al, Nucleic Acids Res 42:D1188-
D1192, 2014.
• Yamamoto YY et al, BMC Plant Biol 11, 3,
2011.
• Maruyama et al, DNA Res 19, 37-49, 2012.
• Yamamoto et al, Plant J 60: 350-362, 2009.
• Yamamoto et al, BMC Genomics 8:67, 2007.
① 位置情報を利用したプロモーター構成因子の一括抽出
③ プロモーターデータベースの作成
④ 遺伝子発現情報を用いた転写制御配列予測
⑤ 予測に基づく機能性合成プロモーターの作成
② 大規模実験によるプロモーター位置の同定
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REG TATA box Y Patch
At1g10960 ferredoxin precursor isolog
-100CATAGAGACAATCACCAAGAAGATAACACAAGAGCCCACACATCG
-55TACGCCACGTGGCAGATTCACCTCTTTATAATCCTCTCTCCCTCACGCCACG TCTTATAA TCCTCTCTCGCCACGT CTTATAAA CCTCTCTCGCCACGTG CTCTCTCCCCACGTGG TCTCTCCCCACGTGGCACGTGGCA
-11 +1ACGGTTTCTAC G
YR Rule
LDSS-positive octamers
ppdb: Plant Promoter Database
•Arabidopsis, rice, Physcomitrella, & poplar
•TSS info, core & regulatory elements
•2007. 6 first release
•2008. 4 ver 2.0
•2010. 11 ver 2.1
•2013. 6 ver 3.0
• ref: NAR 2008, 2014
ppdb: Plant Promoter Database
~50,000 access/month (from USA, EU, China, Japan...)
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シス配列予測シス配列予測
プロモーター配列プロモーター配列
遺伝子発現情報を用いた転写制御配列の予測
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従来技術：
ポジティブグループに存在するコンセンサス配列を抽出（Gibbs
Sampling, MEME）
TSS
motif
従来技術とその問題点
問題点：
・低い正解率 ポジティブグループにおいて主要なものしか
検出できない
・高い偽陽性 コンセンサス配列が機能配列とは限らない
新規機能配列の予測には不十分
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全プロモーター 環境応答性プロモーターセット
0
1
2
3
4
5
6
-800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0
Position from TSS
乾燥応答性RD29Aプロモーター
Rela
tive A
ppeara
nce R
atio (
RA
R)
Rela
tive A
ppeara
nce R
atio (
RA
R)
Rela
tive A
ppeara
nce R
atio (
RA
R)
Rela
tive A
ppeara
nce R
atio (
RA
R)
頻度比較する
開発した新規予測技術
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方法方法方法方法 予測予測予測予測 正解正解正解正解 不正解不正解不正解不正解 非検出非検出非検出非検出 正解率正解率正解率正解率 検出感度検出感度検出感度検出感度
Gibbs
Sampler0 0 0 9 0% 0%
MEME0 0 0 9 0% 0%
RARf-based
scan（Yam
method）12 7 3 1 58~67% 88~89%
Prom data:RD29A (drought response, Yamaguchi-Shinozaki, 1994; Narusaka 2003),RD29B (drought response, Uno 2000)PR1 (SA response, Lebel, 1998; Pape 2010)
予測の検証①
プロモーター配列DB
プロモーター配列DB
Yamamoto et al, BMC Plant Biol 11, 39, 2011
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予測の検証②
ELIP2ELIP2ELIP2ELIP2光防御光防御光防御光防御
ALMT1ALMT1ALMT1ALMT1リンゴ酸トランスポーター
chelating Al3+3+3+3+, recruiting PGPR, recruiting PGPR, recruiting PGPR, recruiting PGPR
応答 UV-B, 強光, 低温, Al, 酸性土壌, 病原菌, H2O2
位置、長さ-783, 8
bp-583, 10
bp-149, 8 bp -526, 8 bp -360, 8 bp -320, 8 bp -297, 8 bp
-282, 8 bp
-270, 8 bp -257, 8 bp -191, 8 bp
Element C B A A B C D E F G H
役割 ↓UV-B/強光/低温, 組み合
わせで作用非ストレス下で抑制
非ストレス下で抑制
Al活性化
↑ ↑ ↑ -Al
活性化
機能性 YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes YesYesYesYes NoNoNoNo YesYesYesYes
TF CAMTA?HY5/ERF
?ZF? ? ? CAMTA2 STOP1 ? ? ?
正解率：10/11 = 91%正解率：10/11 = 91%
新規エレメント予測新規エレメント予測
2013.2.6.
Al3+Controlリンゴ酸
酸性土壌ではAl イオンが可溶化される
ALMT13+
Hayami et al, Plant Physiol 169: 840, 2015Tokizawa et al, Plant Physiol 167: 991, 2015
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 本技術においては対照区との頻度⽐較による予測を⾏う
ことで、⾼感度かつ⾼い正解率を実現することに成功し
た。
• 本技術の適用により、予測をもとにした合成プロモー
ターの作成が可能になった。
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想定される用途
分子育種のツールとして
• 環境ストレス耐性強化
• 物質生産
• 誘導的な物質⽣産にも（毒性物質・成⻑阻害物質の⽣産）
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合成プロモーター開発：概略
環境ストレス応答、ストレス系植物ホルモン応答を示
すもの
開発中
開発完了 • 高温ストレス応答
• 低温ストレス応答
• UV-B・強光・低温ストレスの複合応答
• 土壌ストレス応答（塩害、酸性土壌／Alイオン）
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合成プロモーター開発 ①高温ストレス応答
⾼温処理
37oC 30分
Heat Shock Element (HSE)
• これまで天然プロモーターを利⽤
BGノイズが無視できない程度あった
• シロイヌナズナ・イネゲノム情報をもと
に再予測、合成プロモーターによる動作
検証
（未発表)
根の細胞に
レーザー照射
（低ノイズ）
植物の誘導系としても利用可（低BG＆高誘導）植物の誘導系としても利用可（低BG＆高誘導）
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合成プロモーター開発 ②紫外線ストレス応答
Element BELIP2+AELIP2
• シロイヌナズナのUV-B、強光、低温ストレス
応答を担う新規プロモーターエレメントとして
予測（Plant Physiol, 2015)
• 合成プロモーターを用いた機能解析により動作
証明（Plant Physiol, 2015 同上)
Element B-ATATA
BA
UV-Bパルス照射
LUCB
LUCA
LUCB A
LUC
12~14塩基x3
• ストレス応答には2因子の組み合わせが必要
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50 mM 500 mM
Peak time = 0.25 h
Peak time = 3 h
Peak time = 3.5 h
Peak time = 6.5 h
Peak time = 8 h
Peak time >17 h
Peak time = 0.25 h Peak time = 0.5 h
応答なし
合成プロモーター
0
4,500
4,500
0
0
25,000
0
7,000
0
50,00050 mM 500 mM
50 mM 500 mM
0
50,000
0
8,000
※海水の塩濃度： ~600 mM
NaCl応答NaCl添加
合成プロモーター開発合成プロモーター開発合成プロモーター開発合成プロモーター開発 ④④④④土壌（塩）ストレス応答土壌（塩）ストレス応答土壌（塩）ストレス応答土壌（塩）ストレス応答
0
10,000
0
50,000
• Na/Al/Cu/Cd応答の大規模発現データ（BMC Plant
Biol, 2009）をもとに予測・作成
発光レポーターS1
発光レポーターS2
発光レポーターS1 S2
発光レポーターS3 S4
発光レポーターS5 S6
発光レポーターS7 S8
発光レポーターS9 S10
発光レポーターS11 S12
発光レポーターS13 S14
12塩基x3
組み合
わせが必
要
応答なし 応答なし
応答なし
応答なし
応答なし
応答なし
応答なし
応答なし
応答なし
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合成プロモーター開発合成プロモーター開発合成プロモーター開発合成プロモーター開発 ⑤⑤⑤⑤ 低温ストレス応答低温ストレス応答低温ストレス応答低温ストレス応答
低温処理
4oC 1h
• シロイヌナズナの概日リズム応答性プロモーターエレ
メントとして同定
（Scripps研のグループ：Science, 2000)
• シロイヌナズナ、イネの遺伝子発現データをもとに低温応
答性エレメントとして予測（再発見）
（DNA Res, 2012)
• 機能検証により予測どうり低温応答エレメントでもあるこ
とを確認
（未発表、右図)
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合成プロモーター合成プロモーター合成プロモーター合成プロモーターの育種利用の育種利用の育種利用の育種利用シロイヌナズナ
圓山G
恒常性プロモーター 低温誘導性プロモーター
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• ある程度の数のプロモーターを開発してきたが、ニーズにぴたりとマッチするものを提供できるほどの規模にはなっていない。
• ニーズに合わせた受託開発にも対応します。
実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題
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• 組換え植物を利用した物質生産や分子育種には
必ず役立ちます。
企業への期待企業への期待企業への期待企業への期待
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本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権
• 発明の名称： プロモーター構成配列の抽出法並びに
抽出された転写制御配列
• 特許番号 ： 特許5247009
• 出願人： 理化学研究所
• 発明者： 山本義治、市田裕之、阿部知子
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産学連携の産学連携の産学連携の産学連携の経歴（山本）経歴（山本）経歴（山本）経歴（山本）
• 2002-2006年 理研サイクロトロン部門に所属
（代表：阿部知子）
多数の産官学研究開発機関と提携し
放射線（重イオンビーム）育種を推進
• 2011- JST ALCA事業に採択（代表）
プロモーター開発
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お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先
科学技術振興機構
環境エネルギー研究開発推進部
ＴＥＬ ０３－３５１２ － ３５４３
ＦＡＸ ０３－３５１２ － ３５３３
e-mail alca＠jst.go.jp