組換えプ ロウイルスLTRの

遺伝子転写プ ロモーター活性

岡山大 学医 学部癌 源研 究施 設生化 学部 門(指 導:小 田琢 三教 授)

光 延 文 裕

(昭和63年3月23日 受稿)

Key words:転 写プ ロ モー ター 活性,プ ロ ウイル スLTR, DNAト ラ ンス フエ クシ ョン,

ク ロラム フェニ コー ルアセ チル トラ ンスフ ェラーゼ遺 伝子

緒 言

HTLV-I1),2)が 成 人T細 胞 白血病(ATL)の 病

因 ウイル ス3)～5)として分 離 され,さ らにHIVが

獲 得性 免疫不 全症 候群(AIDS)の 病 因 ウイル ス

として分 離 され て6)～8)以来,ヒ トの病 気におけ る

レ トロ ウイル スの病 因 として の重要性 が 注 目さ

れ るよ うにな った.ま たサル にお いて, HTLV

Iに 近 縁 なサ ル ウイル ス(STLV-I)9)とAIDS

関連 サ ル ウイル ス(SIV, SRV-1, SRV-2)10)～13)

が 発見 され,さ らにHTLV-I, HIV自 体 もあ る

種 のサ ルに対 して感染性 を有す る こ とが わか っ

た14).15). Odaら は,先 に ヒ トリンパ芽球 様株 化

細胞 の一種 よ り産 生 され る レ トロ ウイル スを見

出 し16),17),その細 胞DNAに 組 込 まれ たブ ロウイ

ル スゲ ノム を クローニ ン グ した18)～20)).その全 塩

基配 列 と遺伝 子構 造 を決 定 した とこ ろ19)～21),逆

転 写 酵素(pol)遺 伝 子 の一部 とLong Terminal

Repeat(LTR)の 塩 基配 列が,リ スザ ル 内在性

レ トロ ウ イル ス(SMRV)の それ22),23)と高 い相

同性 を示 した ので,本 ウイル スはSMRV-Hと

仮称 され た20).21),しか し, SMRVの 他 の領域 の

塩 基配列 は未知 の ため,本 ウイル スとSMRVと

の 詳細 な関係 は未 だ明 らかに な ってお らず,そ

れ らの病 原性 につ い て も不 明 な点が 多い.

レ トロ ウイル スの遺伝 子発 現 は宿 主細胞 に組

込 まれ たプ ロ ウイルスDNAの 転写 に よって行 な

われ る.プ ロ ウイル ス遺伝 子の 転写 活性 は一般

に遺 伝子 の上 流 にあ る5'LTRのU3内 のプ ロモ

ー ター領域 の塩 基 配列 と宿 主細 胞の動 物種 と組

織細 胞の種 類 な らびに レ トロウイル スの遺伝 子

自身に よって支 配 され る諸 因子 に よって調節 さ

れ る.そ して,レ トロウ イルスのLTRは その ウ

イル スの病 原性 を決定 す るのに非 常に 重要 な要

素 であ る24)～26)ばか りでな く,組 織 細胞 指向性 を

決定す る主 要 な要 因で ある26)～28). LTRは 構造 遺

伝 子 を コー ドしてい ないが,ウ イル スゲ ノムの

転写,終 結 に必要 なシ グナルが 存在 して い る29).

即 ちU3, R, U5部 分 か ら成 るLTRのU3部 分 に

はエンハンサー配列 及 びプ ロモー ター配列(CAT

ボ ッ クス, TATAボ ックス)が,そ してR(あ

る い はU3)部 分 に は ポ リA付 加 シ グ ナ ル

(AATAAA)が 見 出 されて い る. LTRは また,

ウイルスゲ ノムの宿 主DNAへ の組込みの際に も

重要 な役 割 を果 た してい る.さ らに ウイル スの

組 込み部 位 に隣接 す る宿 主遺伝 子 を活性化 し,

それ によ って動物 に腫瘍 を引 き起 こす こ とが あ

るこ とも知 られ ている30)～33).このよ うにLTR活

性 は ウイル スの遺伝 子調 節や生 物学 的特 性 に重

大 な影響 を及ぼす と考 え られ て いる.

そ こで本研 究 では, SMRV-HLTRの 遺伝 子

発 現調節 の機構 を明 らかにす るために, SMRV

-HLTRの 遺伝 子転写 プロモーター 活性 をSV40

初期 遺伝 子 プ ロモー ターお よび ラウ ス肉腫 ウ イ

ルス(RSV)LTRの 遺伝 子転 写プ ロモー ター活

性 と共 に,ヒ ト及 び種 々 の動 物 由 来細 胞 へ の

DNAト ラ ンスフ ェ クシ ョンに よるCAT(ク ロ

ラム フェニ コール アセチル トランスフェ ラーゼ)

ア ッセ イ法 を用 いて比較 研究 した.

507

508　 光 延 文 裕

材 料 と 方 法

1. 細 胞株 と培地

Cf2Th(ATCC CRL 1430), CV-1, HeLa細

胞 は, 10%ウ シ血 清 を含む ダルベ ッコ変 法 イー

グル培地(DMEM,日 水 製薬)を 用 いて, NIH3

T3, DPSO 114/74(ATCC CCL 194)細 胞 は,

10%ウ シ胎 児血清(GIBCO)を 含むDMEMを

用 い て培養 した.

Jurkat, Raji細 胞 は, 10%ウ シ胎 児血 清 を含

むRPMI1640培 地(日 水 製薬)を 用 いて培養 し

た.

図1　 pSMH-LTRの 構築 の模 式 図

細 い 線 はベ ク ター,太 い線 はSMRV-Hプ ロ ウ イル ス ゲ ノム,波 線 はSMRV-Hプ ロ ウイ ル スのflanking

sequenceを 示 す. Ampは ア ン ピシ リン耐 性 遺 伝 子, onは プ ラス ミ ドの 複製 開 始 部位 を示 す.制 限酵 素

の 略 号 は以 下 の とお りで あ る.B: BamHI, Bg: Bg1II, E: EcoRI, H: HindIII, S: Sa1I, Sm: SmaI,

P: PstI,

図2　 pUCSMHcatの 構 築 の模 式 図

SV40はSV40初 期 プ ロモ ー ター, U3, R, U5はSMRV-HLTR, CATは ク ロ ラム フ ェニ コー ル アセ チ ル

トラ ン ス フェ ラー ゼ遺 伝 子, Intron+PASはSV40の 小 型腫 瘍抗 原 遺伝 子 由来 の イ ン トロ ン(介 在 配列)

とポ リA付 加 シグ ナル を示 す. Ampは ア ン ピシ リン耐性 遺 伝 子,oriは プ ラス ミ ドの 複 製 開始 部 位 を示

す.制 限 酵素 の 略号 は 以 下 の とお りで あ る. A: AatI, B: BamHI. E: EcoRI, H: HindIII, S: Sa1I,

Sm: SmaI, P: PstI.

2. 酵 素 と試薬

制 限酵素, DNAポ リメラー ゼI(Klenow断

片), T4 DNAリ ガーゼ は東洋 紡績 か ら,エ キ

ソヌ クレアー ゼIII, S1ヌ ク レアー ゼ,大 腸菌 ア

プ ロウイル スLTRの 転 写プ ロモー ター 活性　 509

ルカ リホ スフ ァ ターゼ(BAP)は 宝酒 造か ら,

アセ チル コエ ンザ イムA(ア セ チルCoA),ク ロ

ラム フェニ コー ルはSigma社 よ り購 入 した.

3. CATプ ラス ミドの構築

pBR322のBamHI-EcoRI部 位 にf1anki㎎

sequenceを 含 むSMRV-Hの 全 プロ ウイルスゲ

ノム を挿 入 したpSMHよ り, 3'側LTRとflan

king sequenceを 含 むBamHI-EcoRI断 片の 両

端 をDNAポ リメ ラー ゼI(Klenow断 片)で 平

滑末端 に しpUC8のSmaI部 位 に図1の ような方

向に挿 入 したものをpSMH-LTRと した. pSMH

-LTRをBamHI-PstIで 切 断 し,エ キ ソヌ クレ

アー ゼIIIで3'末 端 よ りLTR部 分 をさ まざまに

欠失 させ た. Slヌ クレアーゼ, DNAポ リメラー

ゼI(Klenow断 片)処 理後T4DNAリ カー ゼ

を用 いて,プ ラス ミ ドを環状 に し,大 腸菌 に ト

ラ ンスフ ォー メー シ ョン後 クロー ンを選 び出 し,

そこでプ ラス ミドを用 いたサ ンガー法34)によって,

残 存 した末端 の塩 基配列 を決 定 し,適 当 な長 さ

に 欠失 した クロー ンを選 び 出 し, U5部 位 を75bp

含 む クロー ンpSMH-LTR1を 得 た. pSMH-

LTR1を 図2の よ うに してAatI-Hind IIIで切 断

し,その断片 を用 いてpUCSMHcatを 構 築 した.

同様 にベ クター と してpUC8を 用 いて,図3の よ

うにpSV2cat35), pRSVcat36)よ りpUCSV2cat,

pUCRSVcatを 構 築 した.さ らに, pUCSV2cat

よ りSV40初 期プ ロモー ター を含 むPvu II-Hind

III断片 を除去 したもの を構築 しpUCOcatと した.

図3　 pUCSV2cat, pUCRSVcatの 構 築 の模 式 図

SV40はSV40初 期 プ ロモー ター, U3, R, U5はRSVLTR, CATは クロ ラム フ ェニ コー ル アセ チ ル トラ

ン ス フェ ラー ゼ 遺伝 子, Intron+PASはSV40の 小 型腫 瘍 抗 原遺 伝 子 由来 の イ ン トロ ン(介 在 配列)と ポ

リA付 加 シ グナ ル を示す. Ampは ア ン ピシ リン耐性 遺 伝 子, oriは プ ラ ス ミ ドの複 製 開 始部 位 を示 す.

制 限 酵素 の 略 号 は以 下 の とお りであ る. B: BamHI, E: EcoRI, H: Hind III, M: Mlul, S: Sa1I,

Sm: SmaI, P: PstI, Pv: PvuII.

4. DNAト ラン スフェ クシ ョン

DNAト ランスフェ クシ ョンに使用 したプ ラス

ミドは,す べ て アル カ リ-SDS法 で調 製 した後,

塩 化 セ シウム-臭 化 エ チ ジウム平衡 密度 勾配遠

心 法37)によ って純 化 した.

Cf2Th, CV-1, NIH3T3, HeLa, DPSO114/

510　 光 延 文 裕

74細 胞に対 しては, Gormanら に よ る リン酸 カ

ルシウム沈殿 法35)の, LuthmanとMagnussonに

よる変 法38)を用 いた.ト ランス フェクシ ョンの前

日に60mmデ ィ ッシュに2～5×105細 胞 を植 え込

み,当 日 トラ ンスフ ェ クシ ョンの3～4時 問 前

に血 清 を含 む新 しいDMEM 5mlと 交換 した.そ

して10μgの プ ラス ミ ドで,リ ン酸 カル シウム沈

殿 を作製 し,細 胞 に応 じた濃度 の クロ ロキン と

と もに細 胞 に対 して加 え た.炭 酸 ガ ス インキュ

ベー ター 内 で, 37℃ で4時 間放 置 した後,沈 殿

を除去 し,血 清 を含 まな いDMEMで4回 洗 浄

後,血 清 を含 むDMEMを 加 えた,炭 酸 ガス イン

キュベ ー ター で48時 間培養 後細 胞 を回収 した.

Cf2Th細 胞 で は10μM, DPSO 114/74細 胞 では

50μM,他 の細胞 で は100μMの クロ ロキ ン濃 度

を使 用 した.

Jurkat, Raji細 胞 に対 しては, DEAEデ キス

トラン法39),40)を用 いた. 0.8～1×107細 胞 を集め,

血清 を含 まないDMEMで2回 洗 浄後, 10μgの

DNAと250μg/mlのDEAEデ キ ス トラ ン と50

mMTris-HCI(pH 7.4)を 含 む,血 清 を含 まな

いDMEM 2mlに 懸濁 した. 37℃ で1時 間 インキ

ュベー トした後,血 清 を含 まないDMEMで2回

洗浄 し, 10%ウ シ胎児 血清 を含 むRPMI培 地10

mlに 懸濁 した.炭 酸 ガ ス インキ ュベ ー ター で48

時間 培養後,細 胞 を回収 した.

5. CATア ッセ イ

トランス フェ クシ ョン した細 胞 を回収 し,氷

冷 した リン酸緩 衝液 で3回 洗浄 した.そ して,

170μlの0.25MTris-HCI(pH 7.8)に 懸濁 し,

凍 結 と融解(ド ライア イス ーエ タノー ル浴3分

間 と37℃ の温浴3分 間 を1サ イ クル とす る)を

3回繰 り返 して細胞 を破壊 した.次 に,内 因性 の

脱 アセチ ル化酵 素 を失 活 させ るため に60℃10分

間加 熱後41),マ イクロチ ュー ブ用 遠心機 で15分 間

遠 心 し,そ の上 清 を酵素 反応 に用 い た.蛋 白量

の測定 は,ウ シ血清 ア ルブ ミン を標 準 蛋 白質 と

してパ イ オ ラ ッ ドプ ロ テイ ンア ッセ イキ ッ トを

用 いて行 な った.

細 胞 抽 出 液(10-40kl)に0.25MTris-HCI

(pH 7.8)を 加 え45μlと し, 5μlの30mMア セ

チ ルCoA, 0.2μlの100mMク ロラム フェニ コー

ル を加 え, 37℃ で15分 か ら3時 間反 応 させ た.

反 応液 に400μlの 酢 酸エチルを加 えて激 しく振 り,

基 質及 び生成 物 を酢酸 エ チル層 に抽 出 し,ド ラ

フ ト内 で一昼 夜放 置 し乾燥 させ た.

Retention time (minutes)

図4　 HPLCに よ るCAT反 応 産 物 の分 離 パ ター ン

各 ピー クの 示 す物 質 は 以下 の とお りであ る.

a: 1, 3-ジ ア セ チ ル クロ ラム フ ェ ニ コー ル

b: 3－ア セチ ル クロ ラム フ ェニ コー ルc: 1

-ア セチ ル ク ロラム フェニ コー ル d:未 反応

クロ ラ ム フェ ニ コー ル.

クロ ラム フェ ニ コー ル とその ア セチル化 産物

との分 離に は, Hartzellら の高速 液体 ク ロマ ト

グラ フ ィー(HPLC)に よる方法 を用 い た421)～44).

乾燥 した試料 を妾 日調 製の メタ ノー ル:ク ロロ

ホルム(5: 95)混 液100μlに 溶 か し,そ の うち

10μlをHPLCに イン ジェ ク トした. HPLCは,

日立 製655A-11形,カ ラ ム はTSKgel Silica-

60(東 洋 曹達工 業)を 用 い た.流 速は1.5ml/min

で,検 出 は280nmの 吸光 度 に よった.ピ ー クの

面積 比 か らアセ チル化 の割合 を計 算 し,酵 素 活

性 を求 めた. HPLCに よる クロラム フェ ニ コー

ル とそのア セチ ル化産物 の分 離 のパ ター ンは図

4に 示 した.酵 素 活性 の単位 は, 1mgの 蛋 白量

当た り37℃, 1時 間 でアセ チル化 した クロ ラム

フェニ コー ルのナ ノモル数(nmoles/mgprotein/

h)で 表 現 した.酵 素活 性 の比較 は,直 線的 な酵

プ ロウイ ルスLTRの 転 写プ ロモー ター 活性　 511

素 反応 に収 まる よ うな細 胞抽 出液量 と反 応時間

を用 いて行 な った.そ して少 な くとも2回 以上

の トラ ンス フェ クシ ョン実 験 を行 ない結果 の再

現 性 を確 認 した.以 上 の実 験 を ま とめ たのが図

5で あ る.

図5　 転写プロモーター活性の解析の手順

結 果

1. CATプ ラ ス ミ ドの構 築

遺伝 子転写 プ ロ モー ター 活性 を測 定す る方法

としては,プ ロモー ターの下 流 にCAT遺 伝 子 を

連 結 したプ ラス ミ ドを細胞 に トランス フェ クシ

ョンし細胞 内で発 現 したCAT活 性 を測定す るい

わ ゆ るCATア ッセ イ法 が主 に用 い られ ている.

本研 究 にお いて も各種 プ ロモー ター 配列 の下流

に材料 と方法 に示 した様 にCAT遺 伝 子 を連結 し

CATア ッセ イ を行 な った.

SMRV-HLTRは, 341塩 基対(bp)のU3部

分, 12bpのR部 分, 103bpのU5部 分 の計456

bpか ら成 る19)～21)が,転写 活性 の測定 のためには,

3'側LTRよ り上 流190bp, U3, R部 分 の全 部,

それ らに続 くU5部 分75bpを 含 む618bpの 断 片を

使 用 した. SMRV-HLTRの 遺伝 子転 写 プ ロモ

-タ ー活性 と比較す るプ ロモー ター としては,

SV40の 初期 プ ロモー ター及 び ラウス肉腫 ウイル

ス(RSV)の3'側LTRを 用 い た.そ れ ぞれの

プロモー ターの下流 には細菌 宙来 のCAT構 造 遺

伝 子,さ らにSV40の 小 型腫瘍 抗原 遺伝 子由来 の

イ ン トロ ン(介 在配列)及 び ポ リA付 加 シグナ

ル が加 え られて いて一つ の転写,翻 訳ユ ニ ッ ト

を構 成 して い る.

最 近, pBR322DNA内 の配列 が 哺乳動物 培養

細 胞にお け る一 時 的発現 に影響 を与 え る可能性

が報 告 され てお り45), CATプ ラ ス ミ ド内にお け

るpBR322の 要素 をプ ラス ミド間で同一 にす るた

め にベ クター としてはすべ てpUC8を 使 用 した.

トランスフェクション実験 に用 いたpUCSV2cat,

pUCRSVcat, pUCSMHcatはCAT遺 伝子 を含

む転 写ユ ニ ッ トがベ クターであ るpUC8のSmaI

-PstI部 位 に挿 入されたものである.なおpUCSV2

catよ りSV40初 期プ ロ モー ター を含 むPvu II-

Hind III断片 を除玄 した もの をpUCOcatと した.

2. 線維芽 系株化 細 胞や上 皮系株 化細 胞 におけ

るCAT遺 伝 子の発 現

SMRV-HLTR, SV40初 期 プ ロモー ター 及 び

RSV LTRの 遺伝 子転 写 プ ロモ ー ター 活性 を調

べ るため に,マ ウス,イ ヌ,リ スザ ル,ア フ リ

カ ミ ドリザ ル及 び ヒ トの線維 芽 系 または上 皮系

の株化 細胞 においてCATア ッセイを試みた結果

を図6に ま とめ た.

図6　 線維芽系及び上皮系培養細胞における相対的

CAT活 性

SMRV-HLTRは マ ウス線維 芽細 胞(NIH3

T3),ア フ リカ ミ ドリザ ル 腎由来細 胞(CV-1)

ではSV40初 期プ ロモー ター およびRSV LTRに

比 して比較 的強 い転写 プ ロモー ター活 性 を示 し

た,ヒ ト子宮頸癌 細 胞(HeLa)で はSV40初 期

512　 光 延 文 裕

プ ロモー ター よ りも強 いが, RSV LTRに 比べ

ると弱 い転 写 プ ロモー ター活性 を示 した.そ し

て, SMRVの 許容 細胞 で あ るイ ヌ胸腺 細胞(Cf2

Th)で は,い ずれ のプ ロモー ター に比 して も比

較的 強 い転 写 プ ロモー ター活性 を示 した.次 に,

細胞 内にSMRVゲ ノム を内在性 レ トロウイルス

として持 っている リスザル肺 細胞(DPSO114/74)

で は, SV40初 期 プ ロモ ー ター お よびRSV LTR

の両 者 に比 して弱 い転 写プ ロモー ター 活性 しか

示 さ なか った.

3. ヒ トリンパ球 系 株化 細胞におけるCAT遺 伝

子 の発現

ヒ トリンパ球 系株化 細 胞でのSMRV-HLTR,

SV40初 期 プロモー ター 及びRSVLTRの 遺伝 子

転写 プ ロモー ター 活性 を調べ るため, T細 胞系

と してJurkat細 胞, B細 胞系 としてRaji細 胞

を用 いてCATア ッセ イを行 なった.そ の結果 を

図7, 8に ま とめ た.ま ずJurkat細 胞 にお いて

は, SMRV-HLTRの 転 写 プ ロ モー ター 活 性

(92.8nmoles/mg protein/h)はSV40初 期 プ ロモ

ー ター の それ(2 .5nmoles/mg protein/h)に 比

して約40倍, RSV LTRの ぞれ(46.2nmoles/mg

protein/h)に 比 して約2倍 の強 い転写 プ ロモー

ター 活性 を示 してい るこ とがわ か った.そ して,

SMRV-HLTRはRaji細 胞 においてもSV40初

期プ ロモー ター及 びRSV LTRに 比 してか な り

強 い転写 プ ロモー ター 活性 を示 して い た.以 上

の よ うに, SMRV-HLTRはSV40初 期 プ ロモ

ー タ-及 びRSVLTRに 比較 して,マ ウス,イ

ヌ,ア フ リカ ミ ドリザ ル及 び ヒ トの線維芽 系 株

化 細胞 や上皮 系株 化細 胞 で も比較 的強 い転 写 プ

ロモー ター 活性 を有す るが,ヒ トリンパ球 系株

化 細胞 にお いて特 に 強 い転 写 プ ロモー ター活性

を有す るこ とが 明 らか に な った.

図7　 Jurkat細 胞 に お け る各CATプ ラ ス ミ ドの

CAT活 性

略 号の 示 す もの は以 下 の とお りで あ る, C:ク

ロラム フ ェニ コー ル, AC:ク ロ ラム フ ェニ コ

ー ルの ア セ チ ル化 産物,

図8　 ヒ トリンパ球 系細胞における相対的CAT活

性

考 察

レ トロウイル スのLTRは らウ イル スゲ ノムの

転 写 を調節 す る活性 を有 し,ウ イルス ゲ ノムが

宿 主細 胞 に組込 まれ るために も必要 であ る29).ウ

イル スが組 込 まれ た部 分 に隣接 す る宿 主 遺伝 子

を活性 化 しそれ に よっ て動 物 に腫 瘍 を引 き起 こ

す こ とが あ るこ とも報 告 され て いる30)～33).

い くつか のマ ウ ス白血病 ウイル スで 引 き起 こ

され る 白血 病の 組織細 胞指 向性 は,そ の ウイル

スのLTRの 組 織におけ る転 写 活性の違 いによる

とい われ てい る26)～28).さらにLTR内 のエ ンハ

ンサー 配列 に よ って,こ れ らの ウイル スの 白血

病 誘発 性が 決定 され る とい うこ とも示唆 され て

お り26), LTRの 転写 活性 と病 原性 とが非 常 に密

接 な関係 にあ る と考 え られて い る.リ スザ ル内

在 性 レ トロ ウイル ス(SMRV)は,同 細 胞 内 で

は発現 せ ず異種 指 向性 に イヌや ヒ ト等 の細 胞 内

では発 現 し,完 全 な ウイル ス を産 生す る.ま た

ヒ トリンパ芽球 様株化 細 胞 の一種 では, SMRV

-Hと 仮 称 され た レ トロウ イル ス を産 生 して お

り16),20),21),この ウイル スは混 合培 養 で も遊 離 ウ

イルス で も ヒ トリンパ球 系細 胞 に感染 す る こ と

プ ロ ウイル スLTRの 転写 プ ロモー ター 活性　 513

が証 明 され てい る.こ のSMRV-Hの 転写 活性

調節 機構 を明 らか にす るこ とは,ヒ トお よび ヒ

ト以外 の霊長 類 レ トロ ウイル スに よ り引 き起 こ

され る病 気 の発坐 機構解 明 の ために役 立つ もの

と考 え られ る.

そこでSMRV-HLTRの 遺伝 子転 写プ ロモー

ター活性 をSV40初 期 遺 伝子 およびRSVLTRプ

ロモー ター 活性 と共 に,ヒ トお よび種 々 の動物

由来細 胞 でCATア ッセ イ法 を用 いて調 べ た.

SMRV-HLTRは,か な り広 い範囲 の動物種 の

細 胞 にお いてSV40初 期 プ ロモー ター 及びRSV

LTRと 比較 して強い転 写プ ロモー ター 活性 を有

して いた.し か し, SMRV-HLTRは, SMRV

をプ ロ ウイル ス と して持 って いるが発 現 のみ ら

れな い リスザ ル肺 培養 細胞 で は用 いた3種 のプ

ロモー ター の 中で最 も転写 プ ロモー ター活性 が

弱か った.リ スザ ル肺培養 細 胞に おい てSMRV

-HLTRの 転 写 プ ロモー ター活性 が比較 的弱 い

理 由 は本実験 の み では説 明で きな いが, SMRV

が本細 胞 では 内在 性 であ るこ とと関連 が あるか

も知れ ない.マ ウスや トリの 内在性 ウ イルス で

は,プ ロウイル ス ゲ ノム の メチル化 に よるウ イ

ルス遺伝 子の発 現調 節が知 られ てい る46)が 今後

考 慮 に入 れて ゆかね ばな らな い.

SMRV-HLTRはSV40初 期 プ ロモー ター及

びRSV LTRと 比較 して,ヒ トT及 びB細 胞系

の株 化 細胞 にお い て非常 に強 い遺伝 子転写 プ ロ

モー ター活性 を有 してい た.こ の こ とは,本 ウ

イルスが ヒ トリンパ球 系細 胞であ るJurkat細 胞

に感染 し,さ ちに同細 胞 で高 いウ イルス産 生能

を有 す るこ とや本 ウイル ス を産 生 してい る ヒ ト

リンパ芽 球様 株化 細 胞がBリ ンパ球 系で ある こ

ととよ く一致 して いる.以 上 の よ うに本 プ ロウ

イル スLTRが ヒ トリンパ球 系細 胞において強 い

遺伝 子転 写 プ ロモー ター活性 を有 す るこ とは,

この ウイル スの ヒ トリンパ球 系細 胞 に対す る親

和性 が強 い こ とを示 して い る.従 って,本 研 究

は,今 後本 プ ロ ウイル スLTRを 含 むベ クターに

種 々 の遺伝 子 を組込 ん で その組換 え体 を ヒ トリ

ンパ球 系 細胞へ 導 入す る ことに よっ て遺伝 子発

現 とその生 物作 用 を解析 す る上 に有意 義 であ る

と考 え られ る.

結 語

1. ヒ トリンパ芽 球様 株化 細胞産 生 レ トロウ イ

ルス(SMRV-H)の プ ロウ イルスLTRの 遺

伝 子転写 プロモーター活 性 をSV40初 期 遺伝 子

お よび ラ ウス肉腫 ウイル ス(RSV)LTRの プ

ロモー ター活性 と比較 研究 す るため に,そ れ

らのLTRま たはプロモー ター の下 流 に クロラ

ム フェ ニ コー ルア セチル トランス フェラー ゼ

(CAT)の 遺伝 子 を組込 んだ組 換 えプ ラス ミ ド

を構築 した.そ の組 換えプ ラス ミ ドを ヒ トお

よび動 物 由来培養 細 胞にDNAト ランスフェク

シ ョン し, CATア ッセ イ法で転 写プ ロモー タ

ー活性 を測定 した.

2. SMRV-HLTRは,マ ウス,イ ヌ及 びア フ

リカ ミ ドリザル 等の動 物由来 培養細 胞 では,

いず れ もSV40初 期 プ ロモー ターお よびRSV

LTRよ りも比較 的強 い転 写プ ロモー ター を示

した.ヒ トの子 宮頸癌 培養 細胞 では, SV40初

期 プロ モー ター とRSV LTRの 中間 の転 写 プ

ロモー ター 活性 を示 した.

3. SMRV-HLTRは,リ スザ ル肺 培養細 胞 で

は, SV40初 期 プ ロモー ターお よびRSV LTR

に比 して弱い転写 プ ロモー ター 活性 しか示 さ

ず, SMRVの 異種 指 向性 との関連 が示 唆 され

た.

4. SMRV-HLTRは,ヒ トT及 びB細 胞系 の

培養細 胞 にお いては, SV40初 期 プ ロモー ター

お よびRSV LTRに 比 して はるか に強い転 写

プ ロモ-タ ー活性 を有 してお り,本 ウイル ス

の ヒ トリンパ球 系細 胞に対 す る親 和性 が強 い

こ とを示 して い る.従 って,本 研 究 は,今 後

本プ ロウイルスLTRを 含むベ クター に種 々の

遺伝 子 を組込 んで その組換 え体 を ヒ トリンパ

球系 細胞 へ導 入す る ことに よって遺 伝子発 現

とその生 物作用 を解 析す る上 に有意 義 であ る

と考 え られ る.

本研究を遂行するにあた り,終 始,御 指導 と御校

閲を賜わ りました恩師,小 田琢三教授 に深 く感謝の

意を捧げます。さらに,実 験遂行 にあたり,終 始快

く御協力下 さいました研究室の皆様 に心から御札申

し上げ ます.

514　 光 延 文 裕

文 献

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プ ロウイル スLTRの 転写 プ ロモー ター 活性　 515

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516　 光 延 文 裕

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プ ロウイル スLTRの 転 写 プ ロモー ター 活性　 517

Transcriptional promoter activities of recombinant proviral

long terminal repeats

Fumihiro MITSUNOBU

Department of Biochemistry, Cancer Institute,

Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan

(Director: Prof. T. Oda)

The transcriptional promoter activity of the proviral long terminal repeat (LTR) of a

retrovirus produced in a human lymphoblastoid cell line was studied in a variety of cell types,

in comparison with that of the simian virus 40 (SV40) early promoter and Rous sarcoma virus

(RSV) LTR. Recombinant plasmids containing these promoter sequences linked to the chlor

amphenicol acetyltransferase (CAT) gene were constructed and tested in a transient assay

system to measure relative rates of transcriptional activites in different cell types, including

human lymphoblastoid cell lines. The transcriptional activity of this proviral LTR was much

higher than that of the SV40 early promoter and RSV LTR in various cell types, especially in

human lymphoblastoid cell lines. This result is consistent with the fact that this retrovirus is

a lymphotropic virus. This proviral LTR could be useful for the analyses of the expression and

biological activity of various genes in human lymphoblastoid cell lines.