每一步都有价值

分子生物学实验流程解决方案

每一步都有价值不论您进行PCR还是克隆实验，我们的Invitrogen™和Applied

Biosystems™分子生物学产品都可以帮助您更快速地获得结

果，使您对结果更有信心，同时减少了优化步骤。从核酸分离

到克隆的每一步，我们都可以为您提供鼎立支持。

在本手册中，您可以找到助您加速科学发现的研究工具。如需

更多信息，请登录 thermofisher.com/everystepcounts

在科学发现的旅程中，每个步骤都是您达成研究目标的关键。

作为您成功进行分子生物学实验的合作伙伴，我们可以提供全

套实验流程解决方案，以帮助您推进研究的每一步。

分子生物学涉及对核酸的结构、表达和功能的研究。通常情况

下，基因组DNA和总RNA被从细胞和组织中分离提取出，用于

诸如逆转录、PCR和克隆等下游应用。克隆实验不仅需要使用

限制性内切酶和DNA连接酶，还需要采用PCR、DNA重组和基

因合成等技术。为了确保实验成功，必须采用电泳方法确认核

酸样本的纯度、特异性和质量。

核酸分离 逆转录 克隆和基因合成核酸电泳PCR

核酸分离 4 克隆文库

基因组DNARNA分离

定量和分析

逆转录 11 逆转录酶

RT引物

PCR 14仪器

塑料制品

试剂

引物

纯化

核酸电泳 21琼脂糖凝胶

凝胶提取

DNA分子量标准

DNA染料

克隆和基因合成 24限制酶克隆

TOPO克隆

Gateway克隆

GeneArt无缝克隆与组装

GeneArt第二型限制酶组装

GeneArt基因合成

转化

质粒分离

学习资料 33 常见问题 35 订购信息 37

目录

4

核酸分离

有机萃取 过滤膜 磁珠

说明 酚-氯仿溶液 玻璃纤维、硅胶衍生物或离子交换膜 0.5–1 μm颗粒，包含顺磁核心和改性壳

优点 • 核酸酶快速变性

• 核酸稳定化

• 便携

• 易于使用

• 通量灵活性

• 自动化

• 无堵塞风险

• 更高的靶点捕获效率

• 快速采集和样本浓缩

• 自动化

• 规模可扩展

缺点 • 使用有机试剂，会产生相关废物

• 人工密集处理

• 容易堵塞

• 生产规格的结合能力固定

• 自动化需要真空或离心系统

• 颗粒可能会进入样本

• 颗粒在粘性溶液中缓慢迁移

• 难以实现大体积样本的自动化

工艺 在含有酚的溶液中对样本进行匀浆处理，然后离心。在离心过程中，样本分离为三相：有机相、含有核酸的水相以及含有变性蛋白质的中间相。

裂解样本，利用离心或真空力使样本通过膜。冲洗和洗脱溶液相继通过膜，通过离心或真空将样本收集至管内。

在溶液中裂解样本，使其与磁珠结合(基于特定的表面修饰)。施加外部磁场，快速收集颗粒。通过几次释放、重悬和重新捕获步骤，分离目标核酸。

核酸

分离

不论您使用RNA还是基因组DNA (gDNA)，核酸分离都是分子生物学流程中关键的第一步。表1介绍了常见分离方法的优点和存在的挑战。

表1. 核酸分离方法。

5

使用我们的在线工具查找您的目的

基因的克隆，如CloneRanger™选择

指南和Ultimate ORF浏览器。

更多信息，请登录 thermofisher.com/

cloneranger

thermofisher.com/ultimateorfbrowser

实用建议

核酸

分离

预制克隆/克隆文库我们可提供多种类型的克隆文库-包括Ultimate™ ORF克隆、哺乳动物基因文库

(MGC)全长克隆、细菌人工染色体(BAC)和P1人工染色体(PAC)克隆、酵母缺失和

GFP克隆等。

如需查看全部克隆文库，请登录 thermofisher.com/cloning

Ultimate ORF克隆Ult imate ORF克隆是将已经完整测序的人和小鼠开放阅读框 (ORF)，克隆至

Gateway™入门载体中，适用于多种表达系统的各种蛋白质表达。

经济实惠型的Ultimate ORF克隆LITE是不包括最终QC步骤的相同克隆。

快速追踪表达和分析• 众多选择-超过16,000种Ultimate人ORF克隆以及超过2,500种Ultimate小鼠ORF

克隆

• 订购简单-使用在线Ultimate ORF浏览器

• Gateway™ pENTR™221形式-1小时重组克隆至表达载体，加快了表达和分

析速度

• 100%的氨基酸匹配保证-根据GenBank™、Ensembl™ 和Swiss-Prot™数据库

进行了序列验证。在运输前，克隆培养物必须通过包括末端测序在内的严格的质

量检测，以确认该克隆的正确性

6

• 如需查看我们的实验方案视频库，请登录

thermofisher.com/nucleicacidisolationvideos

• 您的DNA分离可实现自动化-请登录

thermofisher.com/kingfisher 了解更多信息

• 在许多情况下，我们不推荐在核酸分离过程中进

行涡旋混匀，因为这样会剪切DNA，引起污染或

影响最终的样本。敬请仔细阅读实验方案。

信息

核酸

分离

基因组DNA分离我们的gDNA分离技术指南将帮助您鉴别适合您的样本类型和特定流程的产品。

请登录 thermofisher.com/gdnaprep 了解更多信息

7

核酸

分离

8

核酸

分离

RNA分离我们的RNA分离技术指南将帮助您鉴别适合您的样本类型和特定流程的产品。

请登录 thermofisher.com/rnapreps 了解更多信息

• 您的RNA分离可实现自动化-请登录

thermofisher.com/kingfisher 了解更多信息

• 如需查看我们的实验方案视频库，请登录

thermofisher.com/nucleicacidisolationvideos

• RNA处理存在一定的挑战。您可在此次免费的

网上研讨会中了解RNA酶控制的全部信息：

thermofisher.com/rnabasicswebinar

• 如果您尚未准备好处理RNA样本，只需将其置于

Invitrogen RNAlater稳定溶液中保存待用。请登录

thermofisher.com/stabilizerna

信息

9

核酸

分离

10

核酸

分离

定量和分析

对于涉及核酸的工作流程，测定样本浓度(数量)和纯度(质量)通常是一个必需的步

骤。您越了解样本，实验失败的潜在风险就越低。QubitTM

3定量平台为DNA、RNA

和蛋白的定量提供了一种创新的方法。与紫外吸收检测法相比，它具有更高的准

确度和灵敏度，成本却大为降低。定量准确度的提高将为任何分子生物学工作带

来更为优质的结果。

Qubit 3平台适用于极低浓度或难以处理的样本的高灵敏度检测，即便存在污

染物(如RNA中的DNA；存在dNTP)，亦可准确分析dsDNA、ssDNA、总RNA或

microRNA。尤其适合新一代测序(NGS)、qRT-PCR、基因分型和/或突变分析、

RNA分析。

特点与优点• 选择性-Qubit 3定量平台能够进行选择性定量，它可区分DNA、RNA、蛋白和

游离核苷酸，因此与不具备区分能力的紫外吸收检测方法相比，结果更为准确；

• 灵敏性-Qubit 3定量平台的灵敏度远远高于紫外吸收检测方法，能够检测一些

低丰度样品；

• 简单直观-5.7英寸彩色触摸屏，5秒内快速计算样品浓度，最多存储1000个结果

• 个性化-个性化设置常规应用，可通过MyQubit软件和网络工具创建个性化assay

快速、简单、重复性佳；比光谱法更为可靠，让您对结果更有信心。

Kevin Barr，西安大略大学(university of western ontario)

它使我能够检测浓度非常低的样品。优质、快速、简单

Silvia Rodriguez，巴塞罗那医学研究所 (IRB)

根据Qubit检测结果，Nanodrop将血斑样品中RNA含量高估大约10倍，这

一数值与cDNA含量以及我们从样品中获得的qPCR数值相符。

Julia Busik，美国密歇根州立大学助理教授(michigan state university)

客户之声

11

9 kb

6

3

1.5

0.5

23.1 kb9.46.6

2.32

No inhibitors0.05% Bile salts0.01 U/uL Heparin

10%

isopr

opan

ol

5%

BugBus

ter

0.00

25%

Form

alin

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III

SS

III

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III

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III

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III

SS

III

SS

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IV

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BL

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N

N

λ D

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I

SSIV P T

8.0 kb6.0

4.03.02.0

1.51.0

0.5

N

A

B C

• 野生型莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的热稳定性较

差，最适温度为37°C–42°C。SuperScript IV逆转录酶经过

改造，具有较高的热稳定性，可以耐受高达65°C的温度。

• SuperScript IV逆转录酶的合成能力为1,500个核苷酸，较

野生型M-MLV逆转录酶的合成能力高65倍。

信息

逆转录逆转录是使用单链RNA作为模板，由逆转录酶(RT酶)介导的单链DNA (互补DNA

或cDNA)的合成过程。cDNA可作为PCR扩增的模板，亦可用于构建cDNA文库或

RNA测序等。选择正确的用于cDNA合成的逆转录酶，是检测样本中的低丰度RNA

并获得高产量全长cDNA的关键。选择适当的逆转录酶需要考虑的因素包括：

灵敏度

在处理低拷贝基因或来源复杂且在纯化过程中RNA会降解的样本时，使用能够从

极少量的起始RNA中生成cDNA的逆转录酶至关重要(图1A)。

热稳定性

热稳定性逆转录酶可使反应在更高的温度下进行(图1B)，有助于使具有二级结构

或高GC含量的RNA变性。对于复杂RNA，在更高温度下进行逆转录可实现较长的

cDNA合成、更高的cDNA产量以及更佳的RNA群覆盖。

合成能力

合成能力是指聚合酶在不释放模板的条件下连续加入核苷酸的能力。具有高合成

能力的RT可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链，且酶在生成全长cDNA效

率越高(图1C)。图1. 选择正确的逆转录酶。SuperScript IV (SSIV)的灵敏度(A)、热稳定性(B)和合成能力都会影响

cDNA的数量和长度(C)。

�gure 5

3.00

2.75

2.50

2.25

2.00

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

SSIII SSIV P BR Q BL N

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d d

evia

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Reverse transcriptases

Degraded Arabidopsis RNATarget: WRKY TF 70

40

38

36

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32

30

28

Ct

log10(ng degraded RNA)

Degraded Arabidopsis RNATarget: WRKY TF 70

Input RNAAmount

100 ng

10 ng

1 ng

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0.75

0.50

0.25

0.00

SSIII SSIV P BR Q BL N

Sta

ndar

d d

evia

tion

Reverse transcriptases

Degraded Arabidopsis RNATarget: Gin synthetaseDegraded Arabidopsis RNA

Target: Gin synthetase

VariabilitySensitivity

Input RNAAmount

100 ng

10 ng

1 ng

SSIII

SSIV

P

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Q

BL

N

40

38

36

34

32

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28

260 0.5 1.0 1.5 2.0

Ct

log10(ng degraded RNA)

SSIII

SSIV

P

BR

Q

BL

N

逆转

录

12

逆转

录

逆转录酶选择指南

产品形式 单酶 第一链合成试剂盒适用于RT-qPCR的

第一链合成试剂盒预混液

推荐产品 Invitrogen SuperScript IV逆转录酶 Invitrogen SuperScript IV第一链合成系统 Invitrogen SuperScript IV预混液

应用 RT-qPCR，克隆，cDNA文库构建，RACE，RNA测序

RT-PCR，RT-qPCR，克隆，cDNA文库构建，RACE，RNA测序

RT-qPCR

起始总RNA量 1 pg–5 μg 1 pg–5 μg 1 pg–2.5 μg

最佳反应温度 50–55°C 50–55°C 50°C

反应时间 10分钟 10分钟 10分钟

扩增有难度的降解RNA时的cDNA产量

高 高 高

您正在寻找......

方便优化反应组分和

实验条件的产品？包含所有cDNA合成反应所需

组分的完整试剂盒？

用于RT-qPCR，使用超便捷，

需要更少移液操作的产品？

如需进一步了解SuperScript™逆转录酶，请登录 thermofisher.com/superscript

SuperScript IV VILO预混液包含全新的dsDNA特异性Invitrogen™

ezDNase™酶。ezDNase酶可以最温和且最快速地从RNA样本中

去除gDNA，有助于确保获得更高可信度的RT-qPCR结果。更多

信息，请登录 thermofisher.com/4vilo

您知道吗

13

逆转

录

RT引物如何选择正确的逆转录反应引物是cDNA合成效率、稳定性和产量的关键。各种引物类型都具有各自的优缺点，

具体取决于不同的靶标RNA。

对于全长第一链cDNA合成，我们推荐使用oligo (dT)引物，因为其与mRNA的特异性，以及可以实现相同的

cDNA库中的多种不同靶点的研究。Oligo (dT)引物一般包含12–20个脱氧胸苷。

对于含有很强的转录停顿位点的目标mRNA，我们建议使用随机引物在目标分子内进行退火。它们还适用于非

多聚腺苷酸化RNA，如细菌RNA。

如需了解所有RT引物产品，请登录 thermofisher.com/primers

图2. 逆转录反应中的通用引物

• 为避免引发过程中的poly(A)滑移，可使用锚定oligo(dT)

引物在mRNA的poly(A)尾的5´末端退火，防止poly(A)尾内

的引发。如需了解有关RT引物选择的更多信息，请登录

thermofisher.com/rtprimers

实用信息

14

PC

R

厌倦了水浴？您可以同时孵育多至6种不同温度的样本，用于酶活性研究、

限制性酶切或测序文库制备。

实用技巧

信息

A

B

PCR聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学研究的核心技术。1983年Kerry Mullis发明了该

方法，它为基因研究带来了重大变革，在医学和生物技术领域开创了诸多新应用。

PCR应用包括克隆、基因表达分析、基因分型、测序和致突变实验，还包括传染

病、癌症研究及法医学鉴定。PCR也是农业生物技术的关键工具-适用于从开发

到应用的多个步骤，如植物病原体检测和质量控制。

Applied Biosystems PCR仪-系统创新自1987年推出第一台PCR仪以来，Thermo Fisher Scientific的工程师们始终致力于

新型PCR仪的设计、开发和支持，以推动您的研究。

我们的Applied Biosystems™ Veriti™和SimpliAmp™ PCR仪以及ProFlex™ PCR系

统配备了升级版的彩色触摸屏，可轻松实现编程并监控运行状态(图3A)。每款PCR

仪均采用VeriFlex™技术，可高度准确地设置最佳退火温度(图3B)。现在，ProFlex

PCR系统和SimpliAmp PCR仪已支持云存储，您可通过任意移动设备或台式计算机

及Thermo Fisher Cloud安全访问PCR仪，编辑、上传和共享程序文件。

• 优于传统梯度的VeriFlex加热模块温度控制(图2)可以

在金属加热模块上实现真正的线性温度斜率，能够设

置多达6种不同的温度。用户可以单独设置各个温度

区域，以实现精确控制。

• ProFlex、Veriti和SimpliAmp系统采用了VeriFlex加热模

块，提升了PCR功能。独立的Peltier加热模块确保您

获得最精确的梯度优化，提供了最高的通用性和灵

活性。

图3. Applied Biosystems PCR仪。(A) 彩色触摸屏可轻松实现编程。(B) VeriFlex技术可实现简

单且准确的梯度优化。

15

想要立即了解PCR仪？请登录 thermofisher.com/thermalcyclers，申请试用。

PC

R

SimpliAmp PCR仪精巧的设计，明智的选择

• 紧凑的设计-有助于节省实验台空间

• 易于操作-宽大的彩色LCD触摸屏简化了操作

• 三个独立的温度区域用于PCR优化-采用VeriFlex加

热模块实现精确的梯度温度控制

• 方便的远程登录-利用免费的手机app或Cloud，随

时随地登录仪器查看状态，获得E-mail提醒。

ProFlex PCR系统具有更高灵活性和控制能力的高性能PCR仪

• 多位用户使用-可利用三个独立的控制模块同时运

行三个实验

• 灵活的模块配置-可利用5种不同的加热模块进行优

化和通量选择，包括独立控制的3 x 32孔加热模块

• 方便的远程登录-利用免费的手机app或Cloud，随

时随地连接您的仪器，查看仪器状态，获得任务完

提醒。

Veriti PCR仪易于编程、性能稳定的热循环

• 6个温度区域用于PCR梯度优化-采用VeriFlex加热

模块实现精确的温度控制

• 操作简便-易于使用的图形界面，快速的实验程序

设置，利用U盘实现便捷的实验程序或文件传输

• Veriti Dx通过CFDA认证，可用于体外诊断应用。

Cloud-enabledCloud-enabled

自动化PCR仪兼容多种自动化平台

• 简洁设计-小体积帮助节省桌面空间

• 轻松整合-自动化热盖，兼容Halmiton等平台的自

动化液体处理系统或反应板堆叠。

2720 PCR仪日常使用的经济选择

• 设计小巧-21x36cm，后排风的设计允许并排放置

• 功能强大的软件-内置Tm值计算器，以确定引物的

退火温度。在断电的情况下，机器仍能保留这些实验

数据

• 精确的温度控制-热盖设计，减少蒸发。

16

少量样本的小规模实验 日常实验完整工作流程实验-适合自动化

高通量，自动化

单管、联排管、盖、

粘性封板膜和附件

MicroAmp光学

反应板

MicroAmp EnduraPlate光学反应板

EnduraPlate光学 GPLE反应板

规格 • 单管• 带盖单管• 带盖8联管• 12联管盖

• 48孔快速• 96孔• 96孔快速• 384孔

• 96孔• 96孔快速• 384孔

• 96孔(半裙边和全裙边)• 96孔快速• 384孔

不含DNA、RNA酶、PCR抑制剂 是 是 是 是

可用颜色 透明或混合色包装 (包含红色、橙色、蓝色和绿色)

透明 单色包装(红色、蓝色、绿色、黄色或透明)和5块混色反应板

(每种颜色各1块)

透明

条形码 无 有(1或2侧) 有(3侧) 有(3侧)

多个应用领域 否 否 是 是

光学兼容性 是(光学管和盖适用于qPCR应用) 是 是 是

PC

R

表3. PCR管、盖和附件。

PCR耗材Applied Biosystems™ MicroAmp™塑料耗材可提供出色的PCR和qPCR性能，能够

满足您的实验要求。我们所有的塑料制品均已经过验证，可与Applied Biosystems

仪器结合使用，获得最佳的性能。

我们可提供各种96孔板、384孔板、联排管、单管、管盖和密封产品。您可使用我

们的在线互动选择指南或下载兼容表，查找适合您的仪器使用的产品。

如需了解更多信息，请登录 thermofisher.com/plastics

所有的Applied Biosystems™塑料制品均可用于Applied

Biosystems PCR仪。这些塑料制品有助于防止样本蒸

发和交叉污染，从而获得一致的PCR结果。

您知道吗

了解在线互动PCR耗材选择指南，请登录 thermofisher.com/appliedbiosystemsplasticsselectionguide

17

时间(分钟)0 5 15

+

最常见的PCR疑难问题之一是存在不想要的条带或非特

异性扩增。要降低非特异性扩增，您需要：

1. 优化退火温度

2. 检查引物设计

3. 进行热启动PCR

4. 防止DNA交叉污染

5. 降低模板和/或引物浓度

6. 优化Mg2+浓度

实用技巧

PC

R

PCR试剂PCR是一种高效且特异的反应，可利用几个分子生成逾几百万拷贝的目的DNA。由于PCR过程极为灵敏且特

异，因此选择高品质的PCR产品是获得最佳结果的关键。作为PCR酶和试剂的早期创新者，我们始终致力于开

发性能且质量最佳的全新PCR酶和预混液。

简化的PCR流程

绿色缓冲液包括一种密度试剂和两种示踪染料，用于PCR产物的直接凝胶上样。绿色缓冲液的加入省去了繁琐

的步骤，可与下游应用相兼容，包括DNA测序、连接和限制性酶切(图4)。

图4. 简化的PCR工作流程。直接进行PCR产物凝胶上样可避免繁琐的染料添加步骤。左侧的凝胶泳道显示了电泳之前的PCR反应

混合物。右侧两条泳道显示了经过5分钟和15分钟电泳后凝胶染料的迁移。

更多信息请登录 thermofisher.com/pcreducation

使用不同的DNA聚合酶时，退火温度规则会有所变化。例如，

Platinum™ SuperFi™ DNA聚合酶的退火温度规则不同于基于Taq的

DNA聚合酶。为获得最佳结果，请登录 thermofisher.com/

tmcalculator，使用我们网站上的Tm计算器计算适合您实验的

Tm值。

您知道吗

18

PCR类型 标准PCR 热启动PCR 高保真PCR

推荐的DNA聚合酶 Invitrogen Taq DNA聚合酶 Invitrogen Platinum Taq DNA聚合酶 Invitrogen Platinum SuperFi DNA聚合酶

应用 常规PCR、基因分型、菌落PCR 常规PCR、高通量PCR、富含GC的模板、 菌落PCR、多重PCR

高保真PCR、克隆、定点突变、富含GC的模板、 生成用于测序的模板、高通量PCR、长片段PCR、

快速PCR、血液样本直接PCR，多重PCR

平末端或3'-A末端 3´-A 3´-A 平末端

靶点长度 多达5 kb 多达5 kb 多达20 kb**

热启动 否 是 是

保真度(与Taq酶相比) 1x 1x >100x

可用规格

独立包装的酶 无色 无色/绿色* 无色/绿色*

预混液 无色 无色/绿色* 无色/绿色*

* 采用绿色缓冲液直接进行凝胶上样。** 可以实现>20 kb (至多40 kb)片段大小的扩增，但可能需要进一步优化反应条件和引物设计。

您是否需要……

检测序列是否存在？ 以更高的特异性和灵敏度扩增靶基因，

或者检测稀有或复杂靶点？

在扩增过程中准确保存 DNA序列？

PC

R

选择符合您研究需要的PCR试剂我们提供了全面的PCR酶和预混液产品组合，可以满足您需要的高性能和一致性。标准Taq DNA聚合酶试剂提

供了可靠的扩增，可用于日常PCR应用。热启动PCR减少了非特异性扩增，提高了目的扩增片段的产量，可实

现便捷的室温反应设置。高保真PCR适用于需要序列准确性的应用领域。

您可利用下列选择指南，查找适配常见PCR应用的最佳酶。请登录 thermofisher.com/pcrenzymes，了解更

多方案。

19

如果您的引物Tm极低，尝试使用GC含量

更高的序列或者可以延长引物长度。

实用技巧

PC

R

PCR引物良好的引物设计(即良好的序列选择)和高质量引物是PCR反应的关键。一般而言，18–30个核苷酸的引物长度最

佳。引物的熔解温度(Tm)应在65°C和75°C之间(在5°C范围内)。

利用我们的基于Primer3、易于使用且高效的Invitrogen™ OligoPerfect™引物设计工具。

• 节省时间-可同时进行至多50个基因的引物设计

• 保存数据-能够保存您的项目

• 易于订购-与Invitrogen™订购门户无缝整合

如需了解引物设计的更多技巧，请登录 thermofisher.com/primerdesign

DNA寡核苷酸Thermo Fisher Scientific拥有逾20年的客户服务经验，定制DNA寡核苷酸在高度自动化、计算机控制的系统上合

成，经过严格的质量控制，如质谱用于短片段寡核苷酸，毛细管电泳(CE)用于长片段寡核苷酸，以确保过程和

最终产品的质量。

合成规模和纯化取决于下游应用的特性。选择适合您的应用的寡核苷酸和纯化方法：

应用 脱盐 HPLC PAGE

寡核苷酸 • 25 nmol–10 μmol

• 5–100 bp

• 50 nmol–10 μmol

• 7-55 bp

• >85%全长序列

• 50 nmol–10 μmol

• 7–100 bp

• >90%全长序列

标准PCR

特殊PCR

克隆

如需进一步了解订购信息、产量保证、设计工具、技术资源、实验方案和FAQ，请登录 thermofisher.com/oligos

我们提供高价值的oligos，有available 25 nmol

and 50 nmol两种规格可供选择。不论您需要

5聚体，40聚体或者任何之间的oligo，现在

都可以高效、快速的订购如需更多信息，

请登录 thermofisher.com/valueoligos

需要按照美国FDA标准生产的ASR/GMP

oligos吗？请登录 thermofisher.com/oligos

查看详情

改进的订购途径能使订单更加简单、快速

您知道吗

20

• 孵育洗脱缓冲液>1分钟，第二次洗脱DNA，可以提高纯化制备物的产量

达10–20%。

• 采用真空抽吸装置可以缩短实验方案时间。

实用技巧

PC

R

PCR纯化PCR产物需要纯化，以去除短引物、非特异性扩增片段、未结合的dNTP、酶、失败的PCR产物和盐，这些都可

能会影响下游应用。例如，未结合的引物、酶或非特异性退火的产物会破坏克隆。PCR产物可以直接纯化(如果

是特异性扩增)或电泳提取目标产物。

我们提供了Invitrogen™ PureLink™ PCR纯化试剂盒，可以快速高效地去除引物、dNTP、酶和盐。该试剂盒拥

有高结合能力(达40 μg)和便捷的实验方案，可以在10分钟内完成，无需调整pH值。

如需了解更多，请登录 thermofisher.com/pcrcleanup

图5. 基于Purelink柱纯化方法的PCR纯化过程。

样本制备

清洗

洗脱

DNA结合

21

核酸凝胶确定适合您需要的凝胶是核酸电泳中必不可少的一个步骤。确定凝胶类型和适当的凝胶浓度可简化核酸分离过程。我们可提供用于琼脂糖凝

胶电泳的方便试剂，包括便捷的预制Invitrogen™ E-Gel™琼脂糖凝胶和自制凝胶所用的Invitrogen™ UltraPure™琼脂糖试剂。

核酸

电泳

核酸电泳电泳是核酸片段鉴定、定量和纯化的实验室常用技术。样本上样至琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶，然

后带负电的核酸在电场力的作用下向正极移动。DNA片段越短，移动越快；而片段越长，移动越

慢，从而可以根据大小进行分离。

如需了解更多，请登录 thermofisher.com/electrophoresis

E-Gel预制琼脂糖电泳系统E-Gel预制琼脂糖凝胶的推出大幅缩短了进行核酸电泳所需的时间，减少了与DIY方法常用的有害化学试剂的接触。E-Gel预制琼脂

糖凝胶为即用型产品，在一次性暗盒内预装入琼脂糖和DNA染料(溴化乙锭或Invitrogen™ SYBR™ Safe DNA凝胶染料)。E-Gel琼脂

糖凝胶可在10分钟内达到极佳的分辨率和清晰度，适用于PCR产物、限制性酶切、质粒制备和新一代测序(NGS)文库制备的分析以

及高通量应用。

预制琼脂糖凝胶用于NGS，无需切胶，巧妙回收DNA条带在测序文库制备过程中保护DNA的完整性是获得可靠的测序数据的关键。E-Gel™ NGS、

E-Gel™ SizeSelect™和E-Gel™ CloneWell™预制凝胶是理想的分离工具，可稳定且可重复地

制备DNA片段文库用于NGS。利用该凝胶，研究人员可以快速高效地上样、电泳并回收特定

的DNA样本，无需凝胶纯化或额外的DNA分离步骤。上样 运行 回收目的条带

22

核酸

电泳

自制琼脂糖可根据现有实验室规程或特定需求利用粉状琼脂糖自行灌制凝胶。UltraPure琼脂糖

一款多用途琼脂糖，适用于500–23,000 bp范围内的DNA和RNA片段的常规分离分

析。UltraPure试剂不含核酸酶，提供标准和低熔点配方。

更多信息，请登录 thermofisher.com/ultrapure

凝胶提取凝胶提取是在分离后，从琼脂糖凝胶上分离和纯化目的DNA片段的技术。与PCR纯

化类似，凝胶提取可以去除影响下游应用的未结合引物、酶、盐和其他杂质。它常

用于在限制性酶切、PCR和片段化后分离目的DNA片段，用于克隆和测序。

更多信息，请登录 thermofisher.com/gelextraction

目标 通用目标 最快的溶解胶 高效克隆 NGS的DNA纯化 高通量

预制胶类型 E-Gel E-Gel EX E-Gel Clonewell E-Gel SizeSelect E-Gel NGS E-Gel 48 E-Gel 96

泳道数 单排12泳道或2排8样品和1个标准品

泳道

单排11泳道 2排8样品泳道和1个标准品泳道

2排8样品泳道和1个标准品泳道

单排11泳道 48样品泳道和4个标准品泳道

96样品泳道和8个标准品泳道

染料(详情请见表5) SYBR Safe DNA染料 或EB

专利 专利SYBR Safe DNA染料

专利 专利SYBR Safe DNA染料

EB SYBR Safe DNA染料或EB

凝胶浓度% 0.8,1.2, 2.0, 4.0% 1.0, 2.0% 0.8% 0.8, 2.0% 0.8% 1.0, 2.0, 4.0% 1.0, 2.0%

分离片断大小 20 bp–10 kb 50 bp–5 kb 100 bp–6 kb 50 bp–2 kb 800 bp–10 kb 10 bp–10 kb 100 bp–2 kb

电泳时间 30 min 10 min 14–36 min 8–20 min 20 min 20 min 12 min

加样体积 20 μL 20 µL 20–25 µL 20–25 µL 20 µL 15 µL 20 µL

更多信息，请登录 thermofisher.com/egel

表4. 预制Invitrogen™ E-Gel琼脂糖凝胶列表。

常规琼脂糖(浓度1.5%)的凝胶熔点约为36°C，

而低熔点(LMP)琼脂糖则为26°C。使用LMP凝

胶可提升凝胶回收的DNA的完整性和产量。

目前所有DNA分子量标准均可在常温下运

输，不影响质量和稳定性。

您知道吗

23

• 我们还提供可直接上样的Invitrogen TrackIt系列的各种

分子量标准。上样至凝胶前无需加热、混合或稀释。

• 现在部分DNA分子量标准可在常温下运输，不影响质

量和稳定性-请登录 thermofisher.com/ladders 了

解更多信息

您知道吗

核酸

电泳

DNA染料我们的荧光Invitrogen SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Safe染料是高度灵敏的试

剂，可用于电泳凝胶中的DNA染色(表3)。相比传统的EB凝胶染料，这些凝胶染料

灵敏度更高，背景荧光强度更低。

DNA分子量标准我们提供了独特的DNA分子量标准和标记物，可用于各种大小范围、应用领域和

形式。准确的分析条带的关键是使用适合您特定应用领域的标记物或标准品。使用

选择表帮助您选择最合适大小范围的分子量标准。我们的部分分子量标准还可以提

供经过优化用于便捷的E-Gel系统的产品。对于定量评估，我们推荐您选择我们的

DNA分子量标准。

图6. 使用SYBR Safe DNA凝胶染料染色并通过Invitrogen™ Safe Imager™蓝光透射仪观察，

DNA片段的克隆效率更高。在电泳过程中，使用SYBR Safe DNA凝胶染料或溴化乙锭(EtBr)染色

DNA片段(lacZ基因)，然后分别使用蓝光或紫外光进行指定时间的曝光。通过在X-Gal培养板上形

成的蓝色集落数检测凝胶纯化的lacZ片段的克隆效率，其表示功能(非突变)基因插入载体中。

双链核酸标记物

如需了解更多，请见 thermofisher.com/ladders

如需了解更多，请登录 thermofisher.com/stains

表5. 荧光核酸凝胶染料。

琼脂糖凝胶和CsCl梯度中的

核酸检测

更安全、更明智的EB替

代物

极高灵敏度，适于实时荧光定量PCR和毛

细管电泳

最高的DNA检测灵敏度

UltraPure溴化乙锭

SYBR Safe染料

SYBR Green I染料

SYBR Gold染料

灵敏度 (dsDNA) 灵敏 (1 ng) 灵敏 (1 ng)高度灵敏(>60 pg)

超灵敏(>25 pg)

无危害且环保

更高的克隆效率

曝光时间

(seconds)0

SYBR Safe + blue light

EtBr + UV light

10 20 30 45 60 90120

Double-stranded nucleic acid markers

0 10 bp 100 bp 500 bp 1,000 bp 5,000 bp 10,000 bp 50,000 bp

50 bp DNA Ladder 50–800 bp

100 bp DNA Ladder 100–1,500 bp

E-Gel Kb Plus DNA Ladder 100–12,000 bp

1 Kb Plus DNA Ladder 100–12,000 bp

1 Kb DNA Extension Ladder 500–40,000 bp

Low DNA Mass Ladder 100–2,000 bp

E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder 100–2,000 bp

E-Gel High Range DNA Ladder 400–10,000 bp

High DNA Mass Ladder 1,000-10,000 bp

24

克隆

和基

因合

成

我们可提供超过200种载体，用于从基础亚克隆

到诱导哺乳动物表达等应用领域。如需选择最适

合您的应用的载体，请登录thermofisher.com/

vectors。您还可通过Invitrogen GeneArt Elements

服务获得定制载体。

您知道吗克隆和基因合成25年来，Thermo Fisher Scientific始终致力于提供最新的DNA克隆工具-不断改进旧的技术，发

展新技术。从限制酶到基因合成，我们可提供各种工具和资源，帮助您获得高质量的克隆DNA，

实现您的下一个重大发现(表6)。

表6. DNA克隆工具及相关特性。

限制酶克隆 TOPO克隆 Gateway克隆 GeneAr无缝克隆GeneArt第二型限制酶组装试剂盒

GeneArt Strings DNA片段

GeneArt基因合成

主要优点 • 灵活且经济 • >95%效率，5分钟PCR克隆

• 适用于其他多种克隆系统

• 在多种表达系统中进行ORF穿梭

• ≤4个片段(共达40 kb)的无缝定向克隆

• ≤8个片段(共达20 kb)的无缝定向克隆

• 针对极小的重复序列十分高效

• 合成的线性DNA片段可用于克隆(采用您选择的方法)

• 经过序列验证

• 在载体中自定义克隆基因

• 经过序列验证

• 可以优化以实现最高的蛋白质表达

技术基础知识 • 限制性酶切和连接

• 基于拓补异构酶的克隆，无需连接酶

• 一步法，实现定向且位点特异性DNA重组

• 无需限制酶和连接酶

• 使用重叠序列进行末端同源性重组

• 在一个反应中完成第二型限制性酶切和连接

• 从合成寡核苷酸组装而成

• 150–3,000 bp，还可提供随机碱基的文库形式

• 目的DNA克隆至载体内

• 100%序列验证，且带有质量保证文件

需要DNA原材料

(质粒中的基因、文

库等)

使用自选载体 *

* 载体需要采用Gateway载体转换系统和One Shot ccdB Survival细胞进行转换。

了解更多请登录 thermofisher.com/cloningeducation

25

15 min 16 hr

L - 1 Kb Plus DNA LadderC1 – Undigested plasmid DNA1 – Anza 11 EcoRI enzyme2 – Anza 12 XbaI enzyme3 – Anza 1 NotI enzymeC2 – Undigested PCR fragment4 – Anza 11 EcoRI enzyme5 – Anza 12 XbaI enzyme6 – Anza 1 NotI enzyme

L C1 1 2 3 C2 4 5 6bp

500

5,000

1,000

12,000

2,000

300200100

L C1 1 2 3 C2 4 5 6bp

500

5,000

1,000

12,000

2,000

300200100

克隆

和基

因合

成

Invitrogen Anza入门套装包括5种或10种最常见的Anza限

制酶、Anza 10X缓冲液和部分Anza DNA修饰酶，从而简

化了克隆。

您知道吗

CloningBench移动应用程序包括Anza限制酶和修饰工

具。您可使用简单且单一的搜索功能查找适合您的研究

的Anza限制酶。

请登录 thermofisher.com/cloningbench 免费下载

实用技巧

限制酶克隆假如没有限制酶，现代分子生物学研究将何去何从？限制酶被发现天然存在于细

菌中，它可以识别并剪切特定的DNA序列，形成粘性末端(5'或3'突出末端)或平末

端，从而将DNA插入片段克隆至具有匹配末端的载体内。这种传统的DNA克隆方法

包括三个主要步骤：DNA酶切、修饰和连接。每一步都需要优质、可靠的酶，才能

确保实验成功。

当酶切时间过长时，一些限制酶表现出星号活性或者对酶切位点的识别特异性降

低。星号活性可导致DNA的非特异性剪切，当反应条件不佳时可能会出现，如高甘

油浓度或Mg2+存在。Invitrogen™ Anza™限制酶及Anza 10X缓冲液具有灵活的酶切

时间，无需担心星号活性(图7)。

Invitrogen Anza限制酶克隆系统包括128种限制酶和5种DNA修饰酶，实现完美兼

容，在Anza统一缓冲液中可发挥100%功能，实现完美的简单克隆。

该克隆系统提供：

• 所有限制性内切酶均使用统一缓冲液

• 对于不同DNA样本类型均使用统一的酶切方案

• 可在15 min内完全酶切

• 即使过夜酶切也无星号活性

了解更多请登录 thermofisher.com/anza

图7. Anza限制酶可在15分钟内实现完全酶切，过夜酶切后也无星

号活性。使用Anza 11 EcoRI、Anza 12 XbaI和Anza 1 NotI酶切质

粒DNA(6,215 bp)和纯化的PCR产物(1.6 kb)。按照推荐的实验方

案，反应混合物中包括1 μg DNA和1 μL限制酶，总体积为20 μL。37°C孵育15分钟或16小时。

26

克隆

和基

因合

成

图8. TOPO PCR克隆只需三个简单的步骤。只需将您的PCR产物和TOPO克隆载体加入提供的反

应缓冲液中，等待5分钟，然后转化至大肠杆菌。采用TOPO克隆，无需传统基于连接酶克隆所

需的额外时间、步骤和试剂。

TOPO克隆PCR克隆是将PCR产物直接插入质粒载体的技术。Invitrogen™ TOPO™克隆技术可

以快速、简单且高效地完成PCR克隆。TOPO克隆的关键是DNA拓扑异构酶 I，它具

有连接酶功能。我们提供了在每个末端的3'磷酸基团共价连接有拓扑异构酶 I 的线

性化TOPO克隆载体，使载体可以直接连接具有匹配末端的DNA序列，无需其他连

接步骤。

TOPO克隆技术：

• 高效-高达95%的克隆含有目标插入片段

• 快速-5分钟室温反应

• 简单-简单的3步操作

• 可靠-被超过20,000篇文献引证过

• 灵活-有含有或不含感受态细胞的形式及多种反应体积可供选择

不论是进行一般亚克隆、测序、TA克隆、平末端克隆、长片段克隆、表达载体克

隆、定向克隆还是使用Gateway™系统，您都可以选择一种TOPO克隆解决方案。

请登录 thermofisher.com/topo 了解更多信息

Invitrogen™ TOPO™ XL-2完整PCR克隆试剂盒提供了高效克隆超长PCR产物

(长达13 kb) 所需的全部组分。它包括：

• pCR™-XL-2-TOPO™ 载体-可更高效地克隆长达13 kb的PCR片段

• Platinum™ SuperFi™ Green PCR预混液-包含高保真校读DNA聚合

酶，可获得更准确的长PCR扩增片段

• PureLink™ 快速凝胶回收和PCR纯化两用试剂盒-使您选择的纯化方

法兼具速度和灵活性

• One Shot™ OmniMAX™ 2 T1R化学感受态大肠杆菌细胞-可获得更高的

转化效率

更多信息，请登录 thermofisher.com/topoxl2

您知道吗

可使用我们的TOPO亚克隆和测序载体

加入限制性酶切位点或通用引物位点

到任一个PCR产物末端

实验小技巧

27

Entry clone

Gene

att att

E. coli

Gene

att att

Your vector

Gene

att att

Mammalian

Gene

att att

Baculovirus

Gene

att att

Two-hybrid screening

vector

Gene

att att

Viral

Gene

att att

Enter the Gateway system via:TOPO cloningRestriction enzyme cloningBP Clonase™ enzyme reaction

DNA insert sources:PCRGeneArt Strings DNA FragmentsUltimate™ ORF Collection

可提供一步法BP/LR Clonase反应实

验方案。请登录thermofisher.com/

gateway，下载BioTechniques PDF

实用技巧

克隆

和基

因合

成

Gateway克隆可提供：

• 简单的解决方案-无需限制酶或连接即可保持方向及阅读框，提供可直接用于

表达的克隆

• 便捷的实验流程-无需重新测序；从靶点识别到验证均使用相同的克隆，保证

了一致性

• 通用技术-DNA插入片段可在载体之间轻松穿梭，并可从大肠杆菌、酵母、昆虫

或哺乳动物目的载体中获取

• 快速反应-室温下一小时即可完成克隆反应

• 准确的结果-克隆效率>95%，高效获取您所需的克隆

Gateway克隆Gateway克隆技术可以实现多个表达系统的克隆，使用方便。无需亚克隆或花费数

小时进行筛选，也不需要对不计其数的菌落进行重新测序。

图9. Gateway技术通过位点特异性重组将基因克隆至多个载体内。一旦基因克隆至入门克隆

后，您可以将DNA片段同时移至一个或多个目的载体内。

请登录 thermofisher.com/gateway 了解更多信息

28

GeneA

rt String

s DN

A Fragm

ents

8–32steps

3–4steps

与

12

3 3

4

45

6

7

8

1 2 3 4片段

限制性酶切

• 灭活酶• 反应纯化• DNA损失

• 灭活酶• 反应纯化• DNA损失

• 灭活酶• 反应纯化• DNA损失

末端修复

载体去磷酸化

连接

验证

孵育

片段+载体GeneArt酶/缓冲液混合物

验证

PCR扩增或测序

2

PCR

1 引物设计

GeneArt引物和重组体设计工具

传统克隆*2–3周多达4轮，每轮8个步骤，

组装1–4个片段+商品化载体

GeneArt无缝克隆与组装

4-5天多达4个步骤，可同时组装

1–4个片段 + 任意载体

* 传统克隆方法的克隆效率较低，这意味着需要筛选更多菌落，以寻找合适的克隆。

克隆

和基

因合

成

GeneArt无缝克隆与组装试剂盒具有：

• 灵活-可使用您选择的任何载体

• 精确-无额外序列；只在所需的位置克隆所需的片段

• 高效-克隆效率>90%

请登录 thermofisher.com/seamless 了解更多信息

GeneArt无缝克隆与组装试剂盒Invitrogen™ GeneArt™无缝克隆与组装试剂盒通常可在30分钟内将4个DNA片段同

时体外克隆至几乎任何线性化载体内，无需额外的DNA序列、限制性内切酶或连

接。我们的试剂盒可处理最大40 kb的重组体，因而研究人员能够灵活、方便地完

成基本、标准和高级克隆与组装实验。

29

• 使用免费的在线网络工具设计寡核苷酸并模拟组装DNA分子，用于两种类型

的GeneArt克隆与组装试剂盒：thermofisher.com/order/oligodesigner

• 还可提供Invitrogen GeneArt定点突变系统。

• 阅读我们研发团队的GEN文献：genengnews.com/gen-articles/one-step-

cloning/5002/

实用技巧

克隆

与基

因合

成

GeneArt第二型限制酶组装试剂盒需要组装4个以上的片段？Invitrogen GeneArt第二型限制酶组装试剂盒可以以任意

顺序同时组装多至8个片段；您可以组装Invitrogen GeneArt Strings DNA片段或文

库、GeneArt TAL、基因变体和重复序列或短序列。

使用GeneArt第二型限制酶组装试剂盒，您可以：

• 克隆同源或重复序列时，避免同源重组与重排

• 利用定制载体元件构建自己的克隆和表达载体

• 使用三种第二型限制酶(AarI、BsaI和BbsI)中的任意一种进行限制/连接反应；每

个试剂盒均包含足够10次反应使用的酶混合物、克隆载体和克隆对照品图10. 使用第二型限制酶组装试剂盒将3个DNA片段克隆至单一载体内。黑色箭头表示第二型限

制酶位点的方向，其指向剪切位点。

请登录 thermofisher.com/typeiis 了解更多信息

30

我们还提供定制GeneArt服务-从定制细胞系和蛋白质生成到克隆、突变、质粒制备和定向进化服务。

您知道吗

克隆

与基

因合

成

GeneArt基因合成

GeneArt基因合成提供了一种可靠且经济高效的方法，

可以获得100%序列准确的定制DNA重组体，其拥有：

• GeneArt门户，可轻松实现在线编辑和订购

• 出众的质量-ISO 9001:2008认证和项目管理响应

• GeneOptimizer™软件，可用于基因优化，实现高达

15X的蛋白质表达*

• GeneObserver界面，可24小时追踪订单状态

* Fath et al. (2011) A Standardized Tool to Assess and Enhance Autologous

Mammalian Gene Expression. PLoS ONE 6(3): e17doi:10.1371/journal.

pone.0017596

GeneArt Strings DNA片段

GeneArt Strings DNA片段较PCR更省时，片段长度可达

3 kb，适用于您选择的任何下游克隆方法，并可提供：

• 100%序列验证

• 使用您选择的方法获得可直接用于克隆的DNA片段

• 经济的解决方案，可保持基因合成的灵活性和性能

优势

• 订购简单-您可通过在线GeneArt门户直接输入、

编辑、优化并订购您的序列

GeneArt Strings DNA文库

GeneArt Strings DNA文库是定制的、合成的双链

GeneArt Strings DNA片段，包含随机核苷酸，可直接

用于克隆。它们较全套基因合成或组合文库更经济实

惠。GeneArt Strings DNA文库可提供：

• 200 bp至2 kb的线性dsDNA片段(≥500 ng，干粉)

• 混合、随机DNA核苷酸的全部IUPAC简并码

• 多达3个随机区组，每组多达30个混合碱基

如需进一步了解GeneArt基因合成产品和服务，请登录 tthermofisher.com/genesynthesis

GeneArt基因合成没有时间克隆您想要的基因？传统的PCR和克隆技术需要进行优化和疑难排除步

骤，这占用了宝贵的实验时间和资源。Invitrogen GeneArt基因合成可以为您合成与

经优化无误差PCR反应类似的基因。

31

常用感受态细胞株的应用和特性

• TOP10细胞(亚克隆和高通量克隆) • One Shot OmniMax 2 T1R细胞(最高效的亚克隆) • DH5α细胞(亚克隆，产量更高)

• Stbl3细胞(克隆不稳定的DNA) • Mach1 T1R细胞(生长迅速，亚克隆) • DH10B细胞(一般亚克隆)

• One Shot BL21 Star细胞(蛋白表达)

提示信息

克隆

和基

因合

成

Invitrogen化学感受态和电转感受态细胞具有如下特点：

• 创新-创新性菌株生长更迅速，可生成更多菌落，可以更好地保护其不受噬菌

体污染和DNA重组的影响

• 可靠-多年验证的可靠性能及批次间一致性

• 灵活-有多种包装形式和转化效率可供选择

转化将DNA片段克隆至载体后，在细菌培养物内进行转化，扩增足够量的克隆DNA用于下

游实验。转化是细菌细胞低频率摄取外来DNA的天然过程。在分子生物学应用中，该

过程被改进用于扩增感受态(可透过)细菌内的质粒，以实现更高效的DNA摄取。

我们提供了各种感受态细胞，您可以根据转化方法、质粒特性和目标应用进行选择

(表7)。

请登录 thermofisher.com/compcells 了解更多信息

表7. 感受态细胞选择指南。

常规克隆 高效克隆 蛋白表达 克隆不稳定DNA

One Shot OmniMAX 2 T1R化学感受态大肠杆菌 ElectroMAX DH10B T1R感受态细胞 One Shot BL21 (DE3)化学感受态大肠杆菌 ElectroMAX Stbl4感受态细胞

One Shot MAX Efficiency DH5α T1R大肠杆菌 MegaX DH10B T1R电转感受态细胞 One Shot BL21 (DE3) pLysS化学感受态大肠杆菌 MAX Efficiency Stbl2感受态细胞

One Shot MAX Efficiency DH10B T1R大肠杆菌 One Shot OmniMAX 2 T1R化学感受态大肠杆菌 One Shot BL21 Star (DE3)化学感受态大肠杆菌 单链DNA生成

One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌 高通量克隆 BL21-A1 One Shot化学感受态大肠杆菌 ElectroMAX DH12S细胞

Library Efficiency DH5α感受态细胞 MultiShot StripWell TOP10化学感受态大肠杆菌 扩增非甲基化DNA

Subcloning Efficiency DH5α感受态细胞 MultiShot TOP10化学感受态大肠杆菌 One Shot INV110化学感受态大肠杆菌

MultiShot StripWell Mach1 T1R化学感受态大肠杆菌

重组杆状病毒生成

MAX Efficiency DH10Bac感受态细胞

如需查看更全面的感受态细胞选择指南，请登录 thermofisher.com/compcells 或登录 thermofisher.com/cloningbench 下载 CloningBench 移动应用程序

32

纯度等级 高级转染 转染 分子

内毒素分类 无内毒素 低内毒素 标准

内毒素水平 <0.1 EU/μg 0.1–1 EU/μg 1–10 EU/μg

应用 敏感细胞系中的转染(即原代细胞) • 传统细胞系中的转染

• 体外转录

• 所有分子级的应用

• 克隆

• 核酸标记

• PCR

• 测序

• 转化

一旦质粒经过验证并准备好扩大规模用于转染实验后，应切记：

1. 哺乳动物细胞系的转染需要较大量的质粒，因此需要较大规模的提取

(midi-、maxi-、mega-或giga制备)

2. 应使用转染级或高级转染级质粒纯化试剂盒。

3. RNA污染会影响转染。

4. 可使用PureLink HiPure质粒纯化试剂盒解决上述所有问题。

实用技巧克隆

和基

因合

成

我们推荐使用分子级的质粒DNA进行克隆和载体验证(测序、酶切)，转染级的质粒

DNA作为最终的载体。分子级的质粒DNA中内毒素水平和RNA污染水平相对较高，

会降低细胞存活率和表达，因此不推荐用于转染。

使用硅胶膜小量离心柱(即Invitrogen™ PureLink™快速质粒小量提取试剂盒)可以纯

化足量的(<50 μg)分子级质粒DNA，用于分子生物学应用。载体验证后，可以使用

阴离子交换树脂(即Invitrogen PureLink HiPure中量或大量提取试剂盒)纯化较大量

(500 μg–1 mg)的转染级质粒DNA。

质粒DNA分离低质粒DNA回收率和诸如蛋白质、盐、RNA或基因组DNA等杂质都会对克隆和PCR

反应产生不良影响。采用不同的质粒DNA分离技术可以获得不同的纯度等级，适用

于不同的克隆流程。

如需进一步了解质粒提取试剂盒，请登录 thermofisher.com/plasmidprep

33

学习资源 其他资源

您可在需要时借助我们免费的学习资源，将研究提升到一个新的水平。不论是查看基础知识、更

深入地了解专业知识，还是探索最新的创新性技术，新手及经验丰富的分子生物学家均可在学习

园地找到丰富且可靠的技术内容。

观看在线和录制的网上研讨会，深入了解

分子和合成生物学技术及工具，提升您的

研究。

thermofisher.com/mbwebinars

利用我们的分子生物学技术、操作方法、

使用技巧等教学视频，获得生动有趣且形

象直观的学习体验。

thermofisher.com/mbvideos

阅读我们研发科学家撰写的有关产品创新

的白皮书和应用指南。

thermofisher.com/mbliterature

利用我们的多款在线互动工具，可用于计

算Tm、查找限制性酶信息、选择产品等。

thermofisher.com/mbtools 相关

资源

34

CloningBench移动应用程序随时随地掌控您的克隆流程，无论是在实验室还是在移动过程中。我们的CloningBench移动应用程序可为您提

供有用且必需的工具，帮助您进行克隆实验。

CloningBench移动应用程序具有如下功能：

• Anza限制酶和修饰酶查找工具

• 细菌生长计时器

• 感受态细胞选择指南

• 基因大小估算器

• 摩尔量计算器

• 核酸浓度计算器

• PCR预混液计算器

• 载体与插入片段的摩尔比计算器

请登录 thermofisher.com/cloningbench 立即下载

作为领先的分子生物学试剂供应商，我们提供可定制的生产解决方案，方便公司客户进行新一代分子检测产品

的开发。从最初想法到最终产品，我们的许可和商业供应团队可随时为您的特殊需要提供支持。我们的研发专

家可以帮助您鉴定并整合领先的技术和产品，满足您的特定需求。这些工具和解决方案不仅能帮助您提升工艺

性能，还有助于最大程度地降低开发和产品成本，减少风险并提高利润。

定制与OEM解决方案

我们的能力包括：

• 一流的质量，生产经过ISO 13485和ISO 9001认证

• 定制产品设计、配方、质量控制和包装

• 品种繁多的分子生物学试剂，包括业界领先品牌如SuperScript逆转录酶等

• 自有品牌塑料制品和PCR仪

相关

资源

35

常见

问题

常见问题克隆：thermofisher.com/cloningsupport

核酸纯化与分析：thermofisher.com/napsupport

PCR和cDNA合成：thermofisher.com/pcrsupport

我设置了RT反应，并尝试确定应当使用随机引物、oligo(dT)引物、基因特异性引

物还是oligo(dT)/随机混合引物。您有什么建议？

随机引物是降解RNA、具有二级结构的RNA、非多聚腺苷酸化RNA或原核RNA的

最佳选择。它只推荐用于两步法RT-PCR，尽管cDNA可能不是全长cDNA，但一般

可以提供最高的产量。当您从两步法RT-PCR中回收全长cDNA时，最好使用Oligo

(dT) 引物。反应受到二级结构和RNA质量的影响。基因特异性的引物应当用于特异

性极高的RT-PCR反应，主要是一步法RT-PCR反应。

我的PCR管在PCR反应后变形。这是怎么回事？

加热的PCR仪盖旨在确保在反应板上施加最佳压力，以实现高效PCR反应。当使用

PCR管时，加热盖施加在PCR管上的过高的压力会导致管变形。为了避免该情况，

我们推荐使用托盘/支座套组，如下所示：

• 货号：4381850，Applied Biosystems™ MicroAmp™ 96孔托盘/支座套组用于

Veriti™系统-该托盘可与MicroAmp联排管(或不带盖的MicroAmp反应管，0.2

mL)、Veriti PCR仪、SimpliAmp PCR仪和ProFlex PCR系统结合使用。

• 货号：403081，Applied Biosystems MicroAmp 96孔托盘/支座套组-该托盘可

与MicroAmp联排管(或不带盖的MicroAmp反应管，0.2 mL)、7000系统、2720

PCR仪和GeneAmp™ PCR 9700系统结合使用。

• 货号：4379983，Applied Biosystems MicroAmp 96孔托盘/支座套组用于Veriti加

热模块-该托盘可与MicroAmp联排管(或带盖的MicroAmp反应管，0.2 mL)、

Veriti PCR仪、Veriti Fast PCR仪、SimpliAmp PCR仪和ProFlex PCR系统结合

使用。

满足您所有支持需求的一站式资源。

敬请浏览我们的支持中心，了解有用的资源、开展实验的技巧或疑难解析帮助。

我们的支持中心的常见问题：

改进RNA分离的最佳途径有哪些？

下面是改进RNA分离结果的10大方法：

• 立即灭活内源性的细胞内RNA酶。

• 使用适当的细胞或组织保存条件。

• 彻底匀浆样本。

• 在RNA分离前，预处理匀浆，去除干扰性的化合物。

• 根据您的样本选择最佳RNA分离方法。

• 进行DNA酶处理。

• 减少样本暴露于环境RNA酶中。

• 适当沉淀后用于下游应用。

• 适当重悬RNA。

• 分离后适当保存RNA。

如何确定RNA样本中是否存在基因组DNA污染？A260/A280、A260/A230和28S/18S比

值表示RNA样本的什么信息？这些数值为何有用？

RNA和DNA吸光度为260 nm，而蛋白质的吸光度为280 nm。UV/可见光分光光

度法可以提供RNA/DNA吸光度比值，表示您的样本的纯度。对于RNA而言，A260/

A280比值应为2.0左右。如果比值降低，则表示您的样本存在蛋白质和/或DNA污

染。A260/A280比值是纯的核酸的衡量指标，预期范围为2.0至2.2。如果比值远低于

此值，则表示样本中存在污染物(一般为酚、胍或醇)。

28S和18S条带表示完整RNA。在凝胶中，28S和18S条带的比例应为2:1。

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常见

问题

您有什么小技巧可以使我的感受态细胞获得最高的转化效率？

获得最高转化效率的建议包括：

• 在冰上而不是室温下解冻感受态细胞；切勿涡旋混匀细胞。

• 解冻后，将DNA立即加入至感受态细胞。

• 针对您使用的菌株使用相应的感受态细胞实验方案，确保孵育时间遵照此方案要

求，改变时间长短会降低效率。

• 去除DNA样本中的盐和其他污染物；在转化前可使用离心柱、酚氯仿抽提或酒精

沉淀方法纯化DNA

我的离心柱质粒纯化的产量为零或极低。您有什么建议？

下面是一些建议：

• 确保质粒结合在室温下(RT)完成。温度会影响结合溶液的pH。确保其他所有溶液

均加热至RT。

• 确认变性步骤后的离心不是在4°C条件下完成的。如果是，则上清液必须加热至

RT方可进行柱结合。我们发现，如果裂解物处于室温状态，则DNA与离心柱基质

的结合效率更高。

• 可能使用了低拷贝数质粒。请检查质粒。

• 在细胞收集步骤并未去除所有培养基，从而影响后续步骤的pH。

• 在重悬步骤中，细胞沉淀并未完全重悬。

• 异丙醇沉淀和乙醇冲洗后，纯化DNA可能被过度干燥。仅风干沉淀。

• 在异丙醇沉淀和乙醇冲洗过程中，沉淀可能损失。在该步骤应特别注意，因为沉

淀容易滑落。最好吸去乙醇溶液，而不是倒掉。

• 尝试使用加热的洗脱缓冲液洗脱DNA。对于小于10 kb的质粒，无需加热。对于

10–30 kb的质粒，可以选择加热(65–70°C)，可提高洗脱效率~20%。对于>30 kb

的质粒，建议加热质粒，可提高洗脱效率~50%。额外的洗脱步骤可以提高产

量达10%。

• 如果洗脱DNA中含有一些不溶性材料，则可能是树脂颗粒(树脂粉末)。它们是惰

性的，室温12,000 x g离心1分钟可以去除。

我未从PCR产物中获得条带。这是什么原因？

下面是一些可能的原因：

• 模板质量或数量不佳：完整性不佳、纯度不佳和/或模板过少或过多

• 引物设计不当

• 热循环条件不佳：如退火温度、循环数

• 反应条件不佳：聚合酶、引物或Mg2+不足量；如果使用高保真DNA聚合酶，则受

到dUTP抑制

• 复杂模板：富含GC或长扩增片段需要更强效的酶

• 热启动聚合酶的活化步骤的温度不够高，或时间不够长

核酸凝胶电泳后，我如何才能实现更佳的条带分离？

首先检查您的琼脂糖凝胶的百分比。百分比越高，可以帮助您分辨更小的片段，百

分比越低，可以帮助您分辨更大的片段。

用于克隆的插入片段:载体的最佳比例是什么？是否有公式可以计算？

您可以尝试不同的片段：载体比，从1:1到15:1。

公式：

插入片段长度(bp)/载体长度(bp) x 载体ng = 插入片段与载体比例为1:1时插入片段的ng数

如需轻松计算，可利用我们的CloningBench移动应用程序

thermofisher.com/cloningbench

在Gateway克隆中，插入片段长度是否有限制？

没有理论上的大小限制。100 bp至11 kb的PCR产物均可方便地克隆至Gateway™

pDONR™载体中。其他带有att位点的150 kb的DNA片段均可与Gateway兼容的载

体重组。较大的插入片段推荐采用过夜孵育。

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订购

信息

规格 货号

核酸分离

PureLink快速质粒小量提取试剂盒 50次 K210010

PureLink HiPure质粒过滤中量提取试剂盒 25次 K210014

PureLink HiPure质粒大量提取试剂盒 10次 K210006

PureLink Pro Quick96质粒试剂盒 4 x 96次 K211004A

PureLink快速凝胶回收试剂盒 50次 K210012

TRIzol Plus RNA纯化试剂盒 50次 12183555

PureLink RNA小量提取试剂盒 10次 12183020

PureLink基因组DNA小量提取试剂盒 10次 K182000

PureLink Pro 96基因组DNA小量提取试剂盒 4 x 96次 K182104A

PureLink Pro 96病毒RNA/DNA纯化试剂盒 4块 12280096A

PureLink病毒RNA/DNA小量提取试剂盒 50次 12280050

PureLink植物基因组DNA纯化试剂盒 50次 K183001

MagMAX DNA Multi-Sample Ultra试剂盒 500次 A25597

Qubit 3荧光计 1 unit Q33216

Qubit 3定量起始套装 1 kit Q33217

Qubit 3 NGS起始套装 1 kit Q33218

逆转录

SuperScript IV逆转录酶2,000个单位 18090010

10,000个单位 18090050

SuperScript IV第一链合成系统50次反应 18091050

200次反应 18091200

SuperScript IV VILO预混液50次反应 11756050

500次反应 11756500

规格 货号

SuperScript III逆转录酶2,000个单位 18080093

10,000个单位 18080044

RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂 5,000个单位 10777019

核糖核酸酶H 30个单位 18021014

随机六聚物 (50 μM) 5 nmol N8080127

随机引物 9个A260单位 48190011

Oligo(dT)12–18引物 25 μg 18418012

Oligo(dT)20引物 15 μg 18418020

DNA酶 I，扩增级 100个单位 18068015

PCR

DNA寡核苷酸，脱盐，干粉 25 nmol A15612

DNA寡核苷酸，脱盐，干粉 25 nmol A15613

DNA寡核苷酸，脱盐，液体 25 nmol A15611

DNA寡核苷酸，脱盐，干粉 50 nmol A15610

DNA寡核苷酸，脱盐，液体 50 nmol A15609

DNA寡核苷酸，卡盒，干粉 50 nmol A15614

DNA寡核苷酸，卡盒，液体 50 nmol A15608

DNA寡核苷酸，HPLC，干粉 50 nmol A15607

DNA寡核苷酸，HPLC，液体 50 nmol A15606

DNA寡核苷酸，PAGE，干粉 50 nmol A15605

DNA寡核苷酸，PAGE，液体 50 nmol A15604

PureLink PCR纯化试剂盒 50次 K310001

PureLink快速胶回收和PCR纯化试剂盒 50次 K220001

Taq DNA聚合酶，重组500个单位 10342020

3 x 500个单位 10342046

订购信息

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订购

信息

规格 货号

PCR (续)

Platinum Taq热启动 DNA聚合酶120次反应 10966018

600次反应 10966034

Platinum Taq Green热启动DNA聚合酶120次反应 11966018

600次反应 11966034

Platinum热启动PCR 2X预混液200次反应 13000013

1,000次反应 13000014

Platinum Green热启动PCR 2X预混液200次反应 13001013

1,000次反应 13001014

Platinum SuperFi DNA聚合酶100个单位 12351010

500个单位 12351050

Platinum SuperFi Green DNA聚合酶100个单位 12357010

500个单位 12357050

Platinum SuperFi PCR预混液(2X)100次反应 12358010

500次反应 12358050

Platinum SuperFi Green PCR预混液(2X)100次反应 12359010

500次反应 12359050

dNTP set (100 mM)4 x 250 μL 10297018

8 x 1.25 mL 10297117

ProFlex 3 x 32孔PCR系统 1台 4484073

ProFlex 96孔PCR系统 1台 4484075

ProFlex 2 x 96 PCR系统 1台 4484076

ProFlex 2 x 384 PCR系统 1台 4484077

SimpliAmp PCR仪 1台 A24811

Veriti 96孔PCR 1台 4375786

订购信息(续)

Veriti 384孔PCR 1台 4388444

Veriti 96孔快速PCR仪 1台 4375305

Veriti 60孔PCR仪 1台 4384638

2720 PCR仪 1台 4359659

带有条形码的MicroAmp EnduraPlate光学96孔快速多色反应板

5块 4483493

MicroAmp光学封板膜 100块 4311971

MicroAmp光学96孔反应板 10块 N8010560

MicroAmp光学8联盖 300条 4323032

MicroAmp光学快速96孔反应板，0.1 mL 10块 4346907

MicroAmp有盖快速反应单管，0.1 mL 1,000管 4358297

带有条形码的MicroAmp EnduraPlate光学384孔多色反应板

5块 4483316

核酸分离与分析

UltraPure 10 mg/mLEB 10 mL 15585011

PureLink快速凝胶回收试剂盒 50次 K210012

SYBR Safe DNA凝胶染料 400 μL S33102

UltraPure琼脂糖 100 g 16500100

TrackIt 1 Kb Plus DNA分子量标准 100 applications 10488085

UltraPure TAE缓冲液，10X 4 L 15558026

E-Gel CloneWell琼脂糖凝胶，0.8%，含SYBR Safe 染料 18块凝胶 G661808

E-Gel琼脂糖凝胶，2%，含SYBR Safe DNA染料 18块凝胶 G521802

E-Gel EX琼脂糖凝胶，2% 10块凝胶 G401002

E-Gel 1 Kb Plus DNA分子量标准 100 applications 10488090

E-Gel上样缓冲液，1X 4 x 1.25 mL 10482055

E-Gel EX琼脂糖凝胶起始套装，2% 1套 G6512STCH

规格 货号

39

订购

信息

核酸分离与分析(续)

E-Gel CloneWell琼脂糖凝胶起始套装 1套 G6500STCH

E-Gel 48琼脂糖凝胶，2% 8块凝胶 G800802

E-Gel 96琼脂糖凝胶，2% 8块凝胶 G700802

Safe Imager 2.0蓝光透射仪 1台 G6600

克隆和基因合成

Anza 10-Pack入门套装 1套 IVGN3006

Anza 5-Pack入门套装 1套 IVGN3004

Anza 10X缓冲液 2,000次反应 IVGN2008

Anza T4 DNA连接酶预混液200次反应 IVGN2108

50次反应 IVGN2104

Anza碱性磷酸酶2,000次反应 IVGN2208

50次反应 IVGN2204

Anza T4 PNK试剂盒 IVGN2304

Anza DNA平端化试剂盒 IVGN2404

Anza DNA末端修复试剂盒 IVGN2504

TOPO TA克隆试剂盒，不含感受态细胞，用于亚克隆 450641

Zero Blunt TOPO平末端PCR克隆试剂盒，不含感受态细胞 450245

pENTR/D-TOPO克隆试剂盒，含One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌

K240020

pcDNA 6.2/V5-PL-DEST哺乳动物表达载体 12537162

LR Clonase II Plus酶 12538120

One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌 C404003

One Shot Stbl3化学感受态大肠杆菌 C737303

MAX Efficiency DH5感受态细胞 18258012

ElectroMAX DH10B细胞 18290015

订购信息(续)

MAX Efficiency Stbl2感受态细胞 10268019

GeneArt无缝克隆与组装酶混合物 A14606

GeneArt无缝克隆与组装试剂盒 A13288

GeneArt Seamless PLUS无缝克隆与组装试剂盒 A14603

GeneArt第二型限制酶组装试剂盒，AarI A15916

GeneArt第二型限制酶组装试剂盒，BsaI A15917

GeneArt第二型限制酶组装试剂盒，BbsI A15918

Gateway BP Clonase II 酶混合物 11789020

Gateway LR Clonase II 酶混合物 11791020

Gateway载体转换系统，含One Shot ccdB Survival细胞 11828029

采用Gateway技术的PCR克隆系统，含pDONR 221和OmniMAX 2感受态细胞

12535029

采用Gateway技术的PCR克隆系统，含pDONR/Zeo和OmniMAX 2感受态细胞

12535037

Gateway pDONR 221载体 12536017

pENTR/D-TOPO克隆试剂盒，含One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌

K240020

pCR 8/GW/TOPO TA克隆试剂盒，含One Shot TOP10大肠杆菌

K250020

规格 货号规格 货号

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