奈米微粒危害測試技術與生物毒性指標之探討 ·...

勞動及職業安全衛生研究季刊　民國105年9月　第24卷第3期　第330-342頁

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綜論

奈米微粒危害測試技術與生物毒性指標之探討

李宥萱1　方春詠

1　陳春萬

2　王應然

1

1　國立成功大學環境醫學研究所

2　勞動部勞動及職業安全衛生研究所

摘要

隨著奈米科技的精進發展，奈米材料已經被廣泛的應用在生活環境中。然而，奈米微粒對

生物體產生的毒性與危害，至今仍未十分瞭解。奈米微粒有許多獨特的物化特性，而這些特性

可能會影響其細胞毒性反應。雖然毒性測試的方法種類甚多，但是目前尚缺少合理且共通的生

物毒性指標、毒性測試系統與危害評估平台等，以作為奈米物質管理機制的參考。本研究選用

在生活上已廣泛被應用且可能具有生物毒性之奈米銀進行實驗。合成的奈米銀微粒會依照我們

所設定的測試流程，先分析其物化特性再以細胞株進行體外實驗。奈米銀經物化特性分析後，

皆符合我們進行實驗所需之材料要求。體外試驗中，我們使用人類支氣管上皮細胞（BEAS-2B

cell line）進行實驗，並利用MTS與Live/Dead cell viability分析方法進行細胞毒性分析。細胞毒

性測試結果顯示，奈米銀曝露細胞後會誘導活性氧物種（ROS）生成、血基質氧化酶（HO-1）

基因表現、細胞自體吞噬與細胞凋亡的產生。由於在細胞未產生顯著死亡毒性前，便可觀察到

一些生物指標的改變，因此我們建議可利用偵測ROS、HO-1之基因表現並藉由分析細胞自體吞

噬現象作為危害效應之初步指標。本研究依據過去經驗及文獻提供一個初步細胞毒性篩選流程

項目，經由奈米銀的測試結果，本研究所提出之流程可能也可以進一步應用於其它奈米物質的

危害效應測試。

關鍵字：奈米微粒、物化特性、細胞毒性、生物指標

民國 104 年 6 月 8 日投稿，民國 105 年 3 月 3 日修改，民國 105 年 5 月 2 日接受。通訊作者：王應然，國立成功大學環境醫學研究所，台南市北區勝利路 138 號，電子郵件信箱： [email protected]。

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前言

奈米科技是目前科技發展的趨勢，因為奈

米改變了許多以往我們對其原有的物理原理與

化學性質的認知。由於相同的物質在傳統大小

下或是變成奈米尺度之後，會產生截然不同的

效應，顛覆了其原有的特性，也讓奈米科技的

發展存在更多潛力，因而被視為第四波的工業

革命。在眾多的奈米材料中，因為奈米銀具有

良好的抗菌活性[1]，近年來廣泛地被應用於生物醫學各項產品，此外，許多的日常生活用

品（包括化妝品、紡織衣物）也都會添加奈米

銀以兼具抗菌的效果，雖然奈米科技是目前科

技發展的顯學，但對人類的健康與自然環境也

可能會有負面的衝擊，因此近幾年來各國（包

括英、美與歐盟等國）對奈米微粒的風險議

題，均採取因應措施（制定風險評估與管理規

範），以保護民眾與勞工的健康並維護國土環

境的安全。

由於奈米物質的曝露風險與日俱增，而且

目前尚未有標準的方法進行奈米材料的安全性

評估，目前科學界與相關管理機關皆提出在進

行任何的毒理學研究之前，都必須提供物化特

性數據[2]。近幾年的一些研究報導也提出在奈米毒性研究中，其它因奈米微粒的物化特性所

產生需要評估的影響，例如奈米微粒對分析平

台與偵測系統的干擾[3-5]，或者在細胞試驗中添加血清對奈米微粒於溶液中均散程度以及微

粒表面的吸附性影響[6]。當我們選擇進行奈米微粒毒性的評估模式

時，必須考慮其標的器官（如肺臟）以及參與

作用或受到影響的標的細胞（如上皮細胞、巨

噬細胞）。目前可使用體外（in vitro）或體內（in vivo）試驗來進行奈米毒性機制之評估。為了建立合適的評估標準，必須了解奈米微粒

種類、特性、曝露方式以及危害風險。目前針

對奈米微粒發展的毒性評估策略包括：1. 物化特性分析；2. 細胞外評估模式，如溶解度、活性氧物種產生能力、聚集程度、zeta potential等；3. 細胞培養模式，如腫瘤細胞株、初代細胞（primary cells）、或是co-cultures；4. 動物實驗[7]。為了得到正確且可重覆比較的結果，建立體外試驗模式評估奈米微粒毒性是有必要

的。肺臟上皮細胞是曝露奈米微粒的第一防

線，與奈米微粒直接接觸產生交互反應，肺臟

上皮細胞不只維持肺臟重要功能，也參與調節

呼吸道發炎反應，因此研究常使用肺臟上皮細

胞BEAS-2B及巨噬細胞作為呼吸道健康及奈米微粒毒性評估的細胞模式。

奈米微粒進入細胞後可能造成生物毒性

（toxicity），所謂毒性，意指對生物體結構造成破壞或功能紊亂的一種性質，因而當生物

體受到微粒曝露後，若未造成細胞或生物體死

亡，並非不具有毒性，需再進一步進行生物毒

性測試（biological toxicity test）[8]。生物體受到奈米微粒曝露後，會經由細胞內清除外來

物之機制，將微粒送至溶酶體（lysosome）進行水解，但水解過程亦可能造成微粒釋出本身

帶有之離子[9]；或經由微粒所具有之催化作用，於細胞內產生多餘之自由基，造成氧化壓

力（oxidative stress）上升[10]，此皆與微粒誘發之生物毒性有關。自體吞噬(Autophagy)是一個降解細胞蛋白及細胞質胞器的過程，由

於autophagy易受到微環境及外來物所誘導，比細胞死亡的現象提早發生，因此我們認為

autophagy可當作早期生物毒性之指標[11, 12]。奈米材料的改良與精進使得奈米商品遍

佈於我們的生活環境之中，然而，奈米微粒對

生物體的毒性與危害至今仍未十分瞭解。面對

迅速發展的奈米科技，及其可能衍生的各種問


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題，我們必須加緊腳步，利用新的實驗技術與

文獻整理來一一了解各種奈米微粒所可能造成

的生物體危害影響。為了能夠研擬奈米微粒細

胞毒性篩選平台之流程與項目，我們將依序進

行(1)奈米微粒物化特性分析之項目介紹與測定；(2)細胞毒性測試方法之選擇；(3)微粒造成細胞重要生物效應指標等結果之呈現，提供本

研究之建議流程與方法。

研究方法及步驟

1. 收集並追蹤「國際標準化組織（International Organization for Standardization, ISO）」、「歐盟（European Union, EU）」及「經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-Operation Development, OECD）」等國際組織所公佈之細胞株危害測試方法及相

關安全規範與管理策略。

2. 水合粒徑、分散性及表面電荷（Z e t a potential）

取適量濃度約1ml的奈米銀溶液放置於樣品槽（Cuvette）中，再放入Beckman Coulter Delsa Nano（Particle size analyzer）儀器中，分別根據動態光散射法以及相位

分析光散射法，分析奈米微粒在溶液狀態

（以水或培養基作為溶劑）下的粒徑平均

值與分佈以及粒子的表面電位。

3. UV-Vis藉由UV-Vis來進行奈米銀微粒的吸收

光譜測量，以確保所合成之奈米銀微粒的

長期穩定度，將空白試劑MQ water放入超微量分光光度計NanoDrop 2000c儀器中進行blank，再取適量濃度約1ml的奈米銀溶液放置於樣瓶槽（Cuvette）中，再放入儀器進行分析。

4. 奈米銀真實粒徑測量與元素分析

將合成後的奈米銀溶液取適當濃

度及體積，將其滴在銅網上，放置在鋪

有乾淨紙張的10cm dish中，再放入烘箱中使水分揮發，再以穿透式電子顯

微鏡（transmission electron microscope, TEM），觀察奈米微粒的型態以及真實的粒徑大小，再利用X射線能譜儀（Energy Dispersive X-ray, EDX）進行元素分析。

5. 奈米銀粒子在培養液中的溶離狀態

將100ppm奈米銀配置於DMEM培養液中，經過24小時，37℃靜置之後（模擬細胞暴露奈米銀的情況）進行樣品分析。

進行分析前須先將樣品以離心的方式過

濾未解離的奈米銀粒子（Amicon Ultra-4 centrifugal filters (3 KD)），然後收集離心液並以2%(v/v)硝酸水溶液在95˚C的溫度下進行消化動作兩次以分解離心溶液中干擾

物，最後再稀釋成合適的濃度後進行AAS（PerkinElmer AAnalyst 600）的分析。實驗結束後，須將含有銀離子的液體集中至

重金屬廢液回收桶，代日後交給專門公司

進行廢液處理工作。

6. 細胞培養（Cell culture）BEAS-2B是經過SV40 early-region

genes轉染所建立之不朽化正常人類支氣管上皮細胞株，培養於LHC-9培養液中，由於LHC-9培養液成分曾報導會促使奈米微粒聚集，影響細胞毒性及生物效應的評

估，因此曝露奈米微粒前，BEAS-2B則繼代培養到DMEM培養液中（含有5%胎牛血清及penicillin-streptomycin抗生素），並於奈米微粒溶液中添加BSA（0.1-1%）以減輕奈米微粒聚集的現象。

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7. 細胞存活率（Cell viability）[13,14]：依細胞培養步驟收集培養之細胞，離

心後去掉上清液，加入適量的medium，取適量的細胞液種於96 well中，每個孔盤中的細胞數量為1x104

，24小時後給予不同濃度的奈米銀，等作用時間結束後，將含

有奈米銀微粒的medium移除，以PBS清洗1~2次，之後加入MTS solution 200 μl，於37℃培養箱靜置1小時，混合均勻後，以ELISA Reader讀取490nm波長的吸光值分析細胞存活情況。

8. Live/Dead cell viability assayBelyanskaya等人的研究並認為，應

至少使用兩種細胞毒性分析方法來得到可

靠的實驗結果[14]。Live/Dead cell viability assay，此方法是利用方便快捷的雙色分析試劑盒，可用於測定細胞群中細胞的活

性。依細胞培養步驟收集培養之細胞，離

心後去掉上清液，加入適量的medium，取適量的細胞液種於6 well中，每個孔盤中的細胞數量為6x105

，24小時後給予不同濃度的奈米銀，等作用時間結束後，將含有奈

米銀微粒的medium移除，以PBS清洗1~2次，之後加入calcein acetoxymethyl （calcein AM）和ethidium homodimer（EthD-1），於37℃培養箱靜置20分鐘，以流式細胞儀分析細胞存活以及細胞攝入奈米銀情形。

9. 氧化壓力（Oxidative stress）分析[15]將BEAS-2B細胞曝露奈米銀微粒1、

3、6小時後，以1,500rpm進行離心，將細胞離心並除去medium，以PBS進行清洗1~2次，再次以1,500rpm離心，再以含有5 μM H2DCFDA 500ml之PBS進行回溶，染劑作用時間約15分鐘，再利用流式細胞儀進行分析。

10. 生物毒性指標分析利用高解析之精密儀器驗證奈米微粒

在特定曝露條件及濃度下是否會誘發不同

程度的細胞毒性。以Real-time PCR分析與抗氧化系統相關之HO-1基因之表現，此外也利用螢光顯微鏡觀察生物效應指標（自

體吞噬，AO）及特定的死亡模式（細胞凋亡，DAPI染色質濃縮）表現。由分析之結果中，篩選出適合作為奈米微粒毒性

之建議測試方法。

結果與討論

1. 國際組織與文獻對於奈米安全管理策略之

發展與建議探討

隨著各式各樣的奈米化產品在我們

日常生活中日趨普及化，國際間許多政府

單位與民間機構都開始注意到，奈米科技

發展對人類與自然環境可能產生的衝擊與

潛在危害效應，因而針對相關產業的發展

建立法規進行管理。經濟合作與發展組織

（Organization for Economic Co-operation and Development, 簡稱OECD）在2006年設立了工程奈米物質工作小組（Working Party on Manufactured Nanomaterials, 簡稱WPMN）。在2011年2月份，OECD發表了「奈米安全報告書」，整理了WPMN五年的重大成果，包括奈米材料資料庫建

立以及其對「環境（environment）、健康（health）、安全（safety）」的研究、奈米材料的安全性測試、奈米毒性測試方

法、奈米材料測試準則、自願性申報與法

規合作案、風險評估合作案、曝露測量

合作案、奈米科技環境永續性等。2013年二月份，OECD又發表了「各代表國於人造奈米材料安全的發展現況（Current


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Developments in Delegations on the Safety of Manufactured Nanomaterials）」整合了澳洲、奧地利、加拿大、丹麥、芬蘭、法

國、德國、義大利、日本、韓國、荷蘭、

南非、泰國、美國、歐盟等國的針對奈米

安全發展的回應。最近，美國環境保護協

會（Environmental Defense Fund）與杜邦公司（DuPont）間就共同提出一套奈米微粒風險管理的架構，以分析新發展出的奈

米材料對環境健康與安全（environment, health and safety, EHS）之風險，提高奈米科技產品的社會接受度。此架構包含

六個步驟： ( 1 )描述材料與它的應用性（Describe material and its applications）。(2)建立奈米材料的盛衰過程（life-cycle）（包括：原料來源、原料處理、製造合成、應用、廢棄處理）中它們的物化特性、危害與曝露影響的輪廓資料。(3)評估奈米材料的風險性。(4)製定風險管理方法。(5)組成跨領域決策小組建立相關法條。(6)建立審閱團隊確認相關資訊保持更新。（參考http://www.nano-riskframework.com）。國際標準組織（ Internat ional Organization for Standardization, 簡稱 ISO）制定了奈米技術的工作定義，並且發佈了奈米技術相關詞彙的標準。於

2005年，ISO成立了TC229技術委員會（Technical Committees），以負責奈米物質的標準制定，而在這個技術委員會下

又再設立了四個工作小組（Joint Working Groups），分別負責奈米物質的術語與命名（JWG 1）、奈米物質的量測與特性分析（JWG 2）、奈米物質的EHS效應（JWG 3）與奈米物質的規範（JWG 4），其中關於奈米的「環境、健康與安

全」效應部份又分成5個工作重點：(1)監控奈米物質職場曝露的標準方法，(2)決定奈米物質的相對毒性/潛在危害的標準方法，(3)奈米物質毒性篩選的標準方法，(4)判定奈米物質對環境的友善使用性的標準方法，以及(5)確保奈米產品安全性的標準方法。這個技術委員會公佈了37件奈米科技相關技術的標準指南，可上網路查

詢。

針對「奈米物質毒性篩選的標準方

法」，ISO在2014年時釋出最新公告的技術報告ISO/TR16197，其內容包含體外細胞和體內動物實驗的建議項目。體外細胞

實驗包括：(1)細胞毒性篩選方法；(2)細胞內氧化壓力篩選方法：(3)發炎及免疫反應篩選方法：(4)基因毒性篩選方法：(5)皮膚毒性測試；體內動物實驗則包括：(1)斑馬魚胚胎模式：(2)其他動物模式（如水蚤和大鼠）等的建議。目前毒性物質

（如化學品）的風險評估方式仍舊相當依

賴動物模式所提出的不良健康影響，然而

利用體外的試驗結果推估體內的結果已然

成為研究毒性效應的趨勢，許多細胞損傷

反應機制已可作為定量工具，進行工程

奈米材料危害特性的評估[16]。美國國家職業安全及健康研究院（National Institute of Occupational Safetyand Health, 簡稱NIOSH）於2004年設立奈米技術研究中心（Nanotechnology Research Center, 簡稱NTRC），以整合NIOSH內部對安全奈米技術的研究；NIOSH在2005年提出「奈米物質操作安全指引」，以針對職業奈米曝

露之毒性與危害風險，提出了跨領域的研

究計畫；在2012年6月份，NIOSH又發表另一份指南，名為「研究工程奈米材料之

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實驗室通用安全準則」，提出工程控管與

安全措施之建議，以供實驗室或小規模實

驗操作人員處理奈米材料之參考。美國職

業安全與健康管理局（Occupational Safety and Health Administration, 簡稱OSHA）近日發表「奈米物質安全使用概要

（Working Safety with Nanomaterials）」，希望藉此報告提供工作人員關於目前奈米

技術潛在危害的基本資訊與避免曝露風險

的安全管理方法。OSHA表示目前對工作場的曝露量限制是針對一般的塊材物質，

但可能不適用於同物質的奈米微粒，所

以雇主應善用OSHA所提出的曝露控制措施，以降低從事奈米技術的研發人員或奈

米物質生產的工人的奈米曝露量。目前針

對奈米物質的危害測試技術世界各國仍缺

乏一套較為可行之流程架構，雖然部份國

際組織已有提出相關內容，但仍缺乏實際

驗證與執行的方法，為此，本研究期望利

用下列之成果嘗試擬定奈米物質危害測試

分析流程。

2. 奈米微粒物化特性分析

奈米微粒的物化特性對於後續in vitro的毒性分析相當重要，因此實驗會先分析

自行合成之不同粒徑與表面修飾的奈米

銀微粒，其項目包含粒徑大小與分佈、外

形、化學組成、表面化學、表面電位、溶

解度、比表面積等特性。奈米銀微粒曝露

細胞時，需分散在細胞培養液中（含1% FBS），因而亦會測試奈米微粒分散於培養液中之物化特性。

本研究主要是以表面修飾檸檬酸鹽

（citrate）的奈米銀進行實驗，透過穿透式電子顯微鏡（TEM）的圖像分析奈米銀微粒。本實驗室製備之奈米銀微粒，其外

觀為球形，其晶形為六角晶格（hexagonal lacctice）排列（圖1）。

圖1　以TEM進行奈米銀微粒顯微觀察之結果(a)奈米銀的外形；(b)單顆奈米銀微粒經X-ray繞射之晶形（六角晶形）。

從TEM結果中計算奈米銀顆粒的實際大小，其平均值約為26.2±7.6nm（表1），此外奈米微粒分散於細胞培養液中（DMEM）之水合粒徑相較於在純水中均有明顯的增大，可能是因為培養液中的蛋

白質成分貼附在奈米銀微粒表面而造成粒

徑增加。

表1　奈米銀微粒之物化特性物化特性分析方法a 分析條件分析結果

實際粒徑大小 TEM 乾燥 26.2 ± 7.6 nm

外形 TEM 乾燥球形

水合粒徑大小 DLS 水分散液 45.7 ± 1.9 nm

聚散狀態（分散指數b） DLS 水分散液 0.363 ± 0.04

水合粒徑大小 DLS 細胞培養液(DMEM) 64.8 ± 1.8 nm

聚散狀態（分散指數） DLS 細胞培養液(DMEM) 0.360 ± 0.01

表面電位（Zeta電位c） PALS 水分散液 -28.4mV

表面電位（Zeta電位c） PALS 細胞培養液(DMEM) -18.2mV

化學組成與純度 EDX 乾燥 99.5%(Ag)

最大吸收波長（λmax） UV-Vis 水分散液 389 nm

最大吸收波長（λmax） UV-Vis 細胞培養液(DMEM) 398 nm

溶解度 AAS 細胞培養液(DMEM) 0.08%a 穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscopy, TEM）；動態光散射分析（Dynamic Light Scattering, DLS）；相位分析光散射（Phase Analysis of Light Scattering, PALS）；能量分散X光光譜（Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX）；紫外光可見光吸收光譜（UV-Visible light spectroscopy, UV-Vis）；原子吸收光譜分析（Atomic Absorption Spectrometry, AAS）

b 分散指數（polydispersity index）數值小於0.2為極佳分散性。c Zeta電位大於30mV或小於-30mV之懸浮液粒子進行布朗運動時彼此不易吸附聚集。


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分散指數（Polydisperisity Index, PI）可代表粒子在溶液中的聚散狀態，其值越

小代表分散程度越佳，如表1之統整結果可以發現我們合成的奈米銀雖然實際的粒

徑約為20奈米，但在水中仍會發生些微的附聚現象（agglomeration），而分散在含1% FBS的細胞培養液中時，可能因為吸附培養中的鹽類或蛋白質，讓測出來平均

粒徑變得較大（約60奈米）。分析其表面電位與聚散狀態時，我們

分成兩種條件進行討論：(1)水溶液與(2)含1% FBS之培養液。如圖2所示，此奈米銀分散在水中的最大吸收光值（λ max）為389nm，但分散在含1% FBS的培養液時，其最大吸收光值變為398nm，此結果顯示奈米銀在含1% FBS的培養液中，可能吸附培養液中的鹽類離子或者FBS的蛋白質成分，而使粒徑稍微變大，並改變

其光譜特性［奈米銀分散在含1% FBS培養液中之全波長（UV-Vis）光譜在600nm附近多了一由培養液所產生的吸收小波

峰］。在不含1% FBS的培養液中，可能因為奈米微粒在沒有1% FBS的均散作用下，與培養液中的蛋白形成不具有吸收光

的物質，而造成奈米銀的最大吸收波峰的

下降與位移。

由於以氮吸附法測定表面積，需要耗

掉大量的樣品，所以我們改以計算方法推

算奈米銀的比表面積。比表面積的公式為

表面積除以體積，因此奈米銀微粒的比表

面積即為微粒表面積除以其微粒的體積。

假設合成奈米銀微粒均為球體，先計算出

重量為一克之銀原子的總體積，再除以我

們所合成的奈米銀微粒之體積，便可以

推算出每克奈米銀微粒共含有多少顆奈米

銀微粒，並計算出每克中總顆數的奈米銀

粒子的總表面積，再除以其總體積，即可

得重量為一克之奈米銀粒子之比表面積，

本實驗室製備之奈米銀微粒比表面積為

0.114504 m2/g。

圖2　小粒徑奈米銀分散在純水與含1% FBS培養液與不含1% FBS培養液的UV-Vis吸收光譜。

3. 不同超音波震盪時間與不同分散條件之物化特性

奈米銀以不同時間之水浴超音波震

盪，或伴隨探針震盪為不同的測試條件

下，進行小粒徑奈米銀微粒的粒徑與聚散

狀態的分析（表2），自行合成之小粒徑奈米銀微粒在水中透過水浴的超音波震盪

時間的增加能夠降低其粒徑，在serum free的培養液中其粒徑有明顯放大了近10倍，可能是因為培養液中的蛋白質與奈米銀微

粒發生反應結合，而造成的影響，而再含

有1% FBS培養液的組別透過不同震盪條件下均沒有明顯的改變，代表合成的奈米

銀微粒穩定性高，後續以含1% FBS培養液水浴超音波震盪10分鐘的條件做為細胞毒性測試的條件。

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表2　不同震盪時間及方式下在不同介質中的奈米銀微粒水合粒徑及聚散狀態

Water bath 5min 10min 15min 20minIn water

水合粒徑大小

(nm)67.7±1.915 45.7±1.9 41.3±1.49 29.6±1.715

聚散狀態（分散指數）

0.382±0.005 0.363±0.04 0.344±0.028 0.355±0.016

In Serum free水合粒徑大小

(nm)609.3±53.82 501.3±78.21 613.2±58.0 729.0±31.12


0.246±0.017 0.232±0.023 0.25±0.021 0.282±006

In 1% FBS medium水合粒徑大小

(nm)64.5±2.02 64.8±1.82 70.2±2.35 68.3±2.5


0.34±0.02 0.36±0.015 0.35±0.02 0.34±0.0125

Water bath & probe

10minprobe 30s

10minprobe 5min

20minprobe 30s

20minprobe 5min

In 1% FBS medium水合粒徑大小

(nm)67.86±2.34 77.7±1.71 71.633±0.832 77.466±2.081


0.326±0.005 0.291±0.00288 0.2933±0.0076 0.2963±0.0098

4. 細胞存活率分析

圖3　以細胞毒性測試方法MTS assay分析BEAS-2B細胞存活率。不論是18小時或24小時曝露，合成奈米銀皆隨著劑量的上升而使得細胞毒性增加。（*,#p<0.05, control V.S合成奈米銀）

利用MTS assay分析BEAS-2B細胞之存活率，細胞曝露合成奈米銀18與24小時之後，為了降低奈米銀對MTS之干擾作用，我們經由離心1080×g，10分鐘後，

吸取培養盤內之細胞上清液，利用ELISA reader測定490nm之吸光值並加以計算細胞存活率。其結果呈現出明顯的劑量效

應關係，而其顯著的毒性反應開始於2μg/ml。以24小時曝露之條件而言，奈米銀對BEAS-2B細胞影響之IC50（concentration of 50% inhibition）介於2-7.5μg/ml（圖3）。

5. Live/Dead cell viability assay我們進一步使用Live&Dead細胞存

活率分析試劑來確認MTS assay之分析結果。以流式細胞儀分析細胞染色與細胞攝

入奈米微粒之情形。BEAS-2B細胞曝露合成奈米銀24小時之後，收集各組細胞並進行染色。其結果顯示奈米銀能造成顯著

的細胞死亡情形，並且在5μg/ml的劑量下便有58.95%的死亡率（圖4a）。此結果與MTS細胞存活率的數據雷同。分析流式細胞儀中FSC與SSC的圖形後可以發現，隨著細胞處理奈米銀的劑量上升，一部份

FSC向左位移而SSC則有向上位移之情形（圖4b），證實奈米銀曝露確時會因細胞攝入奈米銀而造成細胞內複雜度增加。

圖4　以流式細胞儀合併使用Live/Dead cell viability assay，分析細胞存活率及細胞攝入奈米顆粒之現象。BEAS-2B細胞曝露不同劑量之合成奈米銀，於24小時後以流式細胞儀分析(a)細胞死亡情形與(b)細胞攝入奈米微粒之情況。X軸：Calcein-AM表示活的細胞；Ethidium表示死的細胞。FSC表示細胞大小；SSC表示細胞內顆粒。


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6. 生物效應指標―氧化壓力

(1) 以流式細胞儀測量R O S之生成情形BEAS-2B細胞給予不同劑量奈米銀曝露之後，分別在1、3、6小時進行ROS生成之測量，其結果顯示隨著處理的劑

量增加，在不同時間點皆有濃度依賴效

應，此外在時間方面第1小時曝露即會顯著增加ROS含量，於第3小時達最高含量且持續到第6小時（圖5）。

圖5　 BEAS-2B細胞曝露不同劑量之合成奈米銀造成ROS上升。(a)曝露合成奈米銀1小時後之分析結果。(b)曝露合成奈米銀3小時後之分析結果。(c)曝露合成奈米銀6小時後之分析結果。*p<0.05 versus Control。

(2) 以Real-time PCR進行HO-1 mRNA表現量之分析

Real-time PCR是一種具有即時定量基因表現量的分析儀，將BEAS-2B細胞給予不同劑量奈米銀曝露之後，在12

小時收取細胞進行RNA的純化，純化後之細胞RNA先逆轉錄成cDNA，再進行HO-1基因表現量之分析。結果顯示隨著奈米銀之處理劑量的增加，HO-1的表現量也隨之上升，Control組之基因表現則未達最低偵測閥值（圖6）。

圖6　 BEAS-2B細胞曝露不同劑量之合成奈米銀誘發HO-1之基因表現。細胞於曝露合成奈米銀12小時後抽取細胞之mRNA進行Real-Time PCR之分析。N.D.:Not Determined，**p<0.01 vs. Control; ***p <0.001 vs. Control。

7. 生物效應指標―細胞自我吞噬與細胞凋亡

為了確認細胞自體吞噬與細胞凋亡之

現象存在，分別使用AO與DAPI兩種染劑對細胞進行染色。AO染劑於顯微鏡下觀察若產生橘紅色螢光，則表示細胞產生自

體吞噬之情形；此外DAPI是一種對細胞核進行染色的染劑，當細胞核有很明顯的

螢光產生時，可發現染色質濃縮的現象，

此現象可表示細胞凋亡之產生。本計畫之

研究結果發現處理小粒徑奈米銀微粒24小時後，皆可自螢光顯微鏡中觀察到細胞自

體吞噬與細胞凋亡之現象產生（圖7）。

339


圖7　 BEAS-2B細胞曝露奈米銀之後發生細胞自體吞噬與細胞凋亡的現象。(a)曝露10μg/ml奈米銀24小時後，細胞產生明顯之橘紅色亮點，表示酸性小泡之生成而有細胞自體吞噬的現象。(b)曝露15μg/ml奈米銀24小時後，細胞核產生明顯的螢光反應，且“箭頭＂所指的地方有染色質濃縮的現象產生。

奈米微粒具有獨特的物理化學性質而

潛在可能造成器官、組織、細胞、次細胞

及蛋白質層次的不良影響。過去已有文獻

指出奈米材料物化特性對細胞或動物活體

可能產生的各種生物效應（表3）[17]。因此評估奈米受試物之毒性與風險

之前，最重要的第一步必須了解其物化特

性。本研究參考ISO建議之奈米物化特性項目，提出較廣為使用之方法與測試結

果，其內容包含：1. 大小；2. 分布與均散情形；3. 形狀；4. 表面所帶電位（Zeta potential）；5. 元素成分；6. 比表面積；7. 表面化學；8. 溶解度等8大項目，這些資訊有助於日後針對奈米物質進行毒性分類

（Grouping）時的參考依據。

表3　奈米材料物化特性與可能的生物反應奈米材料的物化特性可能的生物效應

粒徑與分佈

穿過組織與細胞膜

細胞損傷

損壞吞噬作用，破壞防禦機轉

轉移到其他器官

高表面積／質量比增加活性

增加毒性

表面化學特性

產生活性氧自由基（ROS）

氧化壓力

發炎反應

誘導細胞激素（cytokine）

消耗穀胱甘肽（Glutathione）

粒腺體枯竭

細胞損傷

蛋白質與DNA受損

無法溶解或低水溶性累積在生物系統內，如人類細胞、組織和肺部

長期可能產生危害效應

聚集現象干擾細胞內的作用

細胞損傷

根據美國Nanotechnology Characterization Laboratory（NCL）所建議之奈米毒性測試方法中，已詳列出氧化壓力、細胞凋亡、

細胞自體吞噬與細胞壞死等的實驗測試

方法（圖8），其所提出之危害指標與我們所進行之測定項目吻合。此外為了評估

奈米材料的危害性，一些毒性機制已用

來建立初始奈米構造效能關係（structure-activity relationships, SARs）的毒性模式，透過細胞損傷反應機制即可連接到疾病的

發病機制與增加毒性測試效率，這些機制

反應包含：氧化壓力、毒性金屬離子釋放

與溶解、細胞膜表面和胞器的損傷、肺部

纖維化反應、發炎體活化的交互作用、光

活化作用與能量變化影響、斑馬魚胚胎孵

化干擾、溶血反應等的探討，皆可做為不

同系統之毒性指標[16]。


340

圖8　美國Nanotechnology Characterization Laboratory（NCL）所建議之奈米毒性測試方法（http: //ncl.cancer.gov/working_assay-cascade.asp）。

結論與建議

隨著奈米化物質在工業與商業上之應用

增加，奈米微粒之毒性效應已儼然成為一門新

興學問，然而針對各種不同奈米微粒的毒性測

試方法仍有許多問題尚待釐清與解決。本研究

透過不同種類的測試結果並經由文獻探討與整

理之後，提出初步的微粒細胞毒性篩選平台

之流程與項目（圖9），雖然測試內容仍不盡完善，然而此平台仍舊可以提供奈米材料快速

的初步毒性評估（依據早期的毒性指標作為判

斷），未來將持續針對其它奈米物質以及其它

毒性指標進行測試，以不同的系統毒性反應作

為分類，進一步應用於奈米微粒之危害評估，

並提供更完整的測試數據。

圖9　微粒細胞毒性篩選平台之初步流程

致謝

本研究承蒙勞動部勞動及職業安全衛生研究所101年度研究計畫(IOSH101-H308)經費支持，僅此敬表謝忱。

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Journal of Labor, Occupational Safety and Health 24: 330-342 (2016)

342

Commentary

A Study on the Approaches for Hazard Ranking and Identifying the Biomarkers of the Adverse Effects of

Nanoparticles

Yu-Hsuan Lee1　Chun-Yong Fang1

　Chun-Wan Chen2　Ying-Jan Wang1

1　 Department of Environmental and Occupational Health, College of Medicine, National Cheng Kung University

2　 Institute of Labor, Occupational Safety and Health, Ministry of Labor,

Abstract

Advancement and improvement of nanotechnology, nanomaterials (NMs) have been comprehensively applied in our modern society and greatly influenced our daily life. However, the toxicity and hazardous impacts of nano-scale particles on organisms is still unclear. The different physico-chemical characteristics are identified in the nanofied particles, which may contribute to their toxic effects on the target cells. Currently, there are numerous approaches to carry out toxicity tests but there is a lack of common and reasonable/sensible biomarkers and detection systems for toxicity evaluation as well as a risk management platform for offering the reference database. In this study, we determined to select silver nanoparticles (AgNPs), which have been commonly used in industry, as the candidate toxicants and tend to demonstrate in vitro toxicity to a certain extent. We characterized the physico-chemical properties of the synthetic nanoparticles. We used human bronchial epithelial cells (BEAS-2B cell line) to evaluate the cytotoxic effects by using MTS and Live/Dead cell viability assays. Our results found that AgNPs led to elicit of reactive oxygen species (ROS), up-regulated expression of the Heme oxygenase 1 (HO-1) gene and occurrence of autophagy, which could be the bio-indicators for nanotoxicity. Therefore, the results from the preliminary data shows that MTS and Live/Dead cell viability assays could be used for cell line -based nanotoxicity screening and assessment. To conclusion, the outcome of the present work on AgNPs adverse effects might be implicated to other nanomaterials.

Keywords: Nanoparticles, Physico-chemical characteristics, Cytotoxicity, Bio-adverse markers

Accepted 8 June, 2015 Correspondence to: Ying-Jan Wang, Occupational Health Medical College National Chen Kung University, No.1, University Rd., Tainan City 701, Taiwan(R.O.C), Email address: [email protected]

奈米微粒危害測試技術與生物毒性指標之探討 ·...

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