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STRATEGIE FAGICHE Il fago lambda un batteriofago che infetta E. coli. un fago temperato: ha la possibilit in particolari condizioni di avviare la via lisogena nella quale il genoma virale viene integrato nel cromosoma batterico. Il genoma integrato, detto profago, al variare delle condizioni ambientali in grado di excidersi per replicarsi portando alla successiva lisi del batterio ospite, prendendo la via litica (levento detto induzione). I battiofagi che non possiedono la capacit di intraprendere la via lisogena vengono detti fagi virulenti. Lambda possiede un doppio filamento di DNA mantenuto in forma lineare fintanto che si trova allinterno del capside; possiede tuttavia due estremit cos (cohesive) in grado di unirsi appena viene iniettato allinterno del batterio, in modo da formare una filamento circolare.

Linfezione fagica ha tre stadi di sviluppo: stadio precoce, stadio precoce ritardato, e stadio tardivo. Durante queste tre distinte fasi vengono espressi in maniera coordinata e ordinata geni differenti, attraverso un controllo positivo determinato da dei fattori di antiterminazione. Lorganizzazione della mappa genica di lambda riflette la successione di eventi propria del ciclo litico: il cromosoma fagico possiede infatti una regione regolatrice centrale con i primi promotori, allontanandosi dalla quale si incontrano man mano i geni espressi nelle fasi successive. Alcuni fattori proteici espressi in un determinato stadio determineranno una mancata terminazione e la conseguente espressione dei geni immediatamente adiacenti sul filamento, facendo entrare il fago nello stadio successivo.

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i geni che codificano componenti strutturali del fago sono raggruppati, e verranno espressi come trascritti policistronici. Appena entrato nella cellula ospite, il DNA fagico comincer subito a esprimere tramite la polimerasi dellospite due geni precoci: pN un fattore di antiterminazione che agisce a livello dei siti nut, permettendo lespressione dei geni precoci ritardati; cro produce un repressore che impedisce lespressione di cI, il cosiddetto repressore di

lambda. cI fondamentale per lavvio del ciclo lisogeno e inibisce lespressione dei geni precoci immediati. I geni precoci ritardati espressi grazie al fattore N sono: Due geni per la replicazione; Sette geni per la ricombinazione; La coppia di geni regolatori cII e cIII che inducono la sintesi del repressore di lambda; Il gene regolatore Q, produce un fattore di antiterminazione che porta allespressione dei geni tardivi e quindi al ciclo litico.

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Ciclo litico I primi promotori per i geni del ciclo litico sono PR e PL, forti e costitutivi, che permettono il legame della RNApol batterica dellospite. Da essi si dipartono ununit di trascrizione di destra e una di sinistra, secondo lo schema. La terminazione in prossimit dei due terminatori tR1 e tL1 pu essere impedita dalla proteina pN, che quindi porta allespressione dei geni precoci ritardati. Gli stessi due promotori PR e PL quindi regoleranno lintera fase litica precoce. I geni tardivi sono invece raggruppati sotto il controllo del promotore PR: esso trascrive un RNA piccolo (RNA 6S) che normalmente termina a tR, ma che pu essere allargato se presente lantiterminatore pQ, ultimo gene dellunit a destra ritardata. La lisogenia e il ciclo lisogenico I due promotori PR e PL si trovano sui due lati del gene cI, o repressore di lambda. Il prodotto di questo gene necessario al mantenimento del ciclo lisogenico1: un repressore in grado di bloccare i siti PR e PL legandosi a livello di due sequenze parzialmente sovrapposte ai due promotori, rispettivamente OR e OL; cos facendo non potranno essere espressi i geni per il ciclo litico. La presenza di questo meccanismo di repressione spiega il fenomeno dellimmunit di lambda: un fago che entra in un batterio gi infettato verr immediatamente bloccato dal repressore cI. Per questo motivo la regione comprendente cro, cI e gli operatori di destra e di sinistra, prende il nome di regione dellimmunit del fago. Un fago eserciter immunit contro tutti gli altri fagi con la stessa regione. Il repressore di lambda Il repressore di lambda cI un dimero formato da due polipeptidi, ciascuno composto da due domini distinti:

NTD: fornisce il sito di legame al DNA, mediante una regione HTH (Helix-Turn-Helix): lelica 2 garantisce ladesione allo scheletro di fosfati, la 3 (elica di riconoscimento) si lega alla sequenza specifica;

CTD: respondabile della dimerizzazione e della tetramerizzazione del repressore. 1 Mutanti per il gene cI saranno in grado di dare soltanto ciclo litico; una mutazione nel gene sar fenotipicamente rilevabile con la presenza delle cosiddette placche di lisi macchie chiare (Clear) allinterno delle colonie infettate.

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Ambedue i domini sono in grado di operare in maniera indipendente. Questo, insieme alla natura dimerica dellenzima, un fatto cruciale per la regolazione del suo funzionamento. Infatti, pur essendo troppo piccolo per subire una regolazione allosterica come quella di repressori pi complessi, cI sottoposto ad un meccanismo in grado di diminuirne laffinit per il promotore. Il taglio del connettore fra i due domini (che pu avvenire in condizioni di stress per il batterio come lesposizione a raggi UV2) lascia inalterata la capacit di dimerizzare del CTD ma sottraendo un NTD alla subunit ne diminuisce la possibilit di dimerizzare e ne riduce di conseguenza laffinit per il DNA, spostando lequilibrio. A parit di concentrazione quindi, il repressore in soluzione non sar pi sufficiente, e avverr linduzione del ciclo litico. Il legame alloperatore Il dimero repressore si appaia a sequenze simmetriche riconoscibili in triplice copia sia nelloperatore OR (OR1, OR2, OR3) che in quello OR (OR1, OR2, OR3). Per quanto tutte e tre le copie seguano una sequenza consenso non sono esattamente uguali, e mostrano laffinit decrescente.

Il legame del repressore per di tipo cooperativo: una volta che un dimero ha legato la sequenza OR1 in grado di alzare di molto laffinit di legame su OR2, in quanto i domini NTD delle subunit di un dimero sono in grado di legarsi a quelle dellaltro. Inoltre i repressori 2 infatti lirrangiamento scatena la risposta SOS che porta allespressione di Rec A, una proteasi che agisce sul repressore

In OL ci sono tre operatori: OL1 OL2 OL3

In OR ci sono tre operatori: OR1 OR2 OR3

Ogni operatore contiene tre siti di legame per il repressore

OL

OR

Induzione del

ciclo litico:taglio tra i residui 111 e 113

Le regioni N terminali

non sono capaci di dimerizzare

e legano male loperatore

Il repressore non funziona pi

efficacemente

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legati agli operatori di destra e di sinistra sono in grado di interagire chiudendo il DNA ad anello e aumentando ulteriormente leffetto cooperativo del legame. Questi meccanismi rendono possibile una sostanziale riduzione del repressore necessario per bloccare il ciclo litico, aumentando lefficienza di uneventuale induzione, per la quale si dovr eliminare una minore quantit di cI. La regolazione della trascrizione di cI Il gene che codifica per il repressore cI si trova sotto il controllo di due promotori, PRM (Repressor Maintenance) e PRE (Repressor Establishment). A ciclo lisogeno instaurato, quello che viene utilizzato PRM. E un promotore debole3 situato nelloperatore OR, e per essere trascritto ha bisogno che il suo prodotto proteico cI sia appaiato alla sequenza PRM2; mostra pertanto una regolazione a feedback positivo4. Ci nonostante una presenza eccessiva del repressore porter anche OR3 ad essere occupato e impedir alla polimerasi di legarsi a PRM, instaurando un meccanismo a feedback negativo che regola finemente il livello di cI espresso.

Il promotore PRE invece quello che porta allinstaurazione del ciclo lisogeno: poich lespressione del repressore a partire da PRM dipende dalla presenza del repressore stesso, c bisogno di un meccanismo che ne cominci la produzione. 3 inoltre il filamento di mRNA che produce manca della 5-UTR per il legame del ribosoma, il che rende la traduzione ancora meno efficiente. 4 il feedback positivo che porta una proteina ad aumentare la propria espressione prende il nome di circuito autogeno.

Formazione di un ottamero

che evita che venga prodotto troppo

repressore

Or3 viene occupato solo in caso di eccesso di CI, in questo caso occupa or3 e impedisce

alla pol di trascrivere altro C1 .

Regolazione autogena

RNApol

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Qui entrano in gioco i fattori cII e cIII: cII: un gene precoce tardivo di destra, ed in grado di legarsi a PRE; produce una proteina molto instabile che verrebbe velocemente degradata dalle proteasi HflA e

HflB (High frequency of lysogenization5) cIII un gene precoce tardivo di sinistra il cui prodotto in grado di proteggere cII dalla degradazione. La trascrizione a partire da PRE spinge verso la lisogenia sia attraverso la produzione del repressore (che avviene in maniera pi efficiente, in quanto il trascritto che parte da PRE possiede la sequenza 5-UTR) sia perch produce un RNA antisenso rispetto a cro e quindi ne rallenta lespressione. cII un promotore fondamentale per la lisogenia anche perch controlla lespressione di int, necessario per lintegrazione del genoma fagico nellospite.

5 Batteri mutanti per i geni di queste due proteine non degradano cII e hanno cos una probabilit molto maggiore di far andare il fago incontro a lisogenia.

Riassunto

via lisogenica

controllo

autogeno

CII aiuta la RNApol a trascrivere da PRE

CI viene tradotto

efficacemente

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Instaurazione del ciclo litico e scelta fra i due cicli La repressione del repressore cI, necessaria per luscita dal ciclo liso genico, mediata dal prodotto proteico del gene cro, un dimero che: blocca la trascrizione a partire da PRM6; blocca lespressione dei geni precoci partenti da PL e PR, permettendo a pQ di iniziare lespressione tardiva. Il momento cruciale per determinare la via che verr intrapresa quando, dopo linattivazione di PRE, deve cominciare lespressione del repressore a partire da PRM. In questo momento competeranno fra loro il repressore di lambda che si cerca di legare a OR1 e OR2 per stimolare la propria sintesi e Cro, che si lega a OR3 per bloccare la produzione di repressore e OR1 e OR2 per bloccare la produzione dei geni precoci e d conseguenza di cII e cIII. A determinare lequilibrio tra i circuiti la concentrazione di cII: essa in fatti, essendo sensibile alla quantit di proteasi presente nel batterio, in grado di dire al fago se la cellula sta crescendo in un terreno ricco adatto alla replicazione del fago (molta proteasi, cII degradato, ciclo litico) o povero (poca proteasi, cII integro, ciclo lisogeno).

6 possiede lo stesso motivo elica-giro-elica di cI, ma con una maggiore affinit per OR3.

Come avviene la scelta?

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Meccanismi di integrazione e di escissione Lintegrazione avviene in un preciso sito di attacco att specifico per , con un meccanismo verosimilmente sequenziale (vedi figura). Nella descrizione delle reazioni, chiameremo attB (Batterico) la sequenza sul batterio, attP (Phagic) quella di . attB presenta gli elementi BOB; attP invece POP:

O la sequenza centrale, in cui avviene levento di integrazione; B, B, P e P, le sequenze fiancheggianti, vengono chiamate bracci. Linserimento della sequenza fagica in quella batterica genera due nuovi siti att definiti attL e attR (Left e Right), composti dai nuovi elementi BOP e POB. Lescissione quindi avverr mediante il riconoscimento dei due nuovi siti, non pi di attB e attP, e questa differenza si riflette in una differenza negli enzimi che mediano gli eventi: attB X attP (integrazione) richiede il gene fagico int e una proteina batterica IHF (Integration Host Factor); attL X attR (escissione) richiede oltre a Int e IHF il gene fagico xis. La richiesta di condizioni diverse per integrazione (solo int) ed escissione (int e xis allo stesso livello) assicura che levento dintegrazione non sia immediatamente revertito dallescissione, e viceversa.

La regione del genoma di lambda che contiene i due geni int e xis collocata dopo cIII, nella parte sinistra partendo dalla regione dellimmunit, e i due siti si sovrappongono leggermente.

INT eXIS proteine fagiche

IHF proteina del batterioIntegration Host Factor

condizioni che regolano la

funzione dei due geni int e xis

1) integrazione

e lisogenia:

livello di espressione :

basso da PL

alto da PI

int > xis

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Entrambi possono essere espressi a partire dal promotore PL, in presenza del fattore di antiterminazione pN. In pi un secondo promotore Pint presente allinterno della sequenza di xis, ed attivo solo in presenza di cII; a fine sequenza localizzata la sequenza di integrazione attP seguita da un terminatore intrinseco (sib). I diversi eventi a cui pu andare incontro il genoma fagico sono determinati dallequilibrio tra xis e int, a sua volta regolato dagli altri eventi dellinfezione:

xis < int: In condizioni di elevato cII il fago sta andando verso il ciclo lisogenico; la trascrizione a partire da Pint porter ad un eccesso di int rispetto a xis, spingendo verso lintegrazione. xis = int:Una volta integrato il fago produce cI e non pi cII; esso sopprime lespressione tutti i geni, compresi xis e int. Quando per il fago viene indotto, riprende la trascrizione a partire da PL, che produce xis e int in pari concentrazione portando allexcisione del gene. xis > int: Una volta escisso, il fago presenter la sequenza sib al termine del trascritto per xis e int (cosa che non succedeva con la sequenza integrata, in quanto la presenza di attP tra int e sib faceva si che fossero separati nella sequenza linearizzata). sib suscettibile allattacco di una nucleasi7, che degrader il trascritto partendo dal lato di

int e si tradurr in una minore produzione di int rispetto a xis. In questa situazione non si osserver pi integrazione, e si proceder irreversibilmente verso la via litica.

7 pN aiuta la sequenza sib a farle assumere una conformazione attaccabile dalle nucleasi.