biologia celular - clase 12

REPLICACIÓN DEL DNAREPLICACIÓN DEL DNAGeneración de una copia exacta del Generación de una copia exacta del

genoma de una célulagenoma de una célula

Dogma Central de la Biología MolecularDogma Central de la Biología Molecular

DNA RNA ProDNA RNA ProteínateínaTranscripción TraducciónTranscripción Traducción

ReplicaciónReplicación

TranscripciónTranscripciónReversaReversa(Virus)(Virus)

El DNA Actúa como Molde para su propia SíntesisEl DNA Actúa como Molde para su propia Síntesis

El nucleótido A sólo se apareará con éxito con T y G con C, por lo que cada cadena de DNA puede especificar la secuencia de nucleótidos de su cadena

complementaria. Así, la doble hélice de DNA se puede copiar fielmente.

Modelos para la replicación del DNA

1) Modelo semi conservativo: Moleculas de DNA hijas contienenuna hebra paterna y una nueva

2)Modelo conservativo: las hebras paternas transfieren informacióna un intermediario, el cual luego es copiado. La helice paterna se conserva y la hija es completamente nueva

3) Modelo Dispersivo: la helice paterna se rompe en fragmentos, se dispersa, copia y se ensambla en dos nuevas helices. El DNA nuevoy paterno estan completamente dispersos

MODELOS DE REPLICACION DE DNA

(a) Hipotesis 1:Semi-conservative

replication

(b) Hipotesis 2:Conservative replication

Intermediate molecule

(c) Hipotesis 3:Dispersive replication

Meselson and Stahl Semi-conservative replication of DNA

Isotopes of nitrogen (non-radioactive) were used in this experiment

En cada ronda de replicación, cada una de las dos hebras es usadEn cada ronda de replicación, cada una de las dos hebras es usada a como templado (molde) para la formación de una hebra de DNA como templado (molde) para la formación de una hebra de DNA complementaria. Por lo tanto las hebras originales de DNA complementaria. Por lo tanto las hebras originales de DNA permanecen intactas durantes muchas duplicaciones celulares.permanecen intactas durantes muchas duplicaciones celulares.

La Replicación del DNA es La Replicación del DNA es SemiconservativaSemiconservativa

Doble hélice

parental

Dobles hélices de DNA hijas

No todas las polimerasas tienen igual función

Pol Polimerisa (5’-3’) Exonucleasa (3’-5’) Exonucleasa (5’-3’) Nº Copias

I Si Si Si 400

II Si Si No ?

III Si Si No 10-20

• Actividad exonucleasa 3’ to 5’ involucra la capacidad de remover nucleotidos desdeel extremo 3’ terminal.

•Importante para la capacidad de proofreading (corrección)

• Sin Proofreading la proporción de error (mutation rate) es 1 x 10-6

• Con proofreading la proporción de error es 1 x 10-9 (1000 veces menos)

• Actividad exonucleasa 5’ to 3’ en Replicación y Reparación del DNA.

Origen de replicación (procarionte):

Comienza con la denaturación de la doble helice (hebras simples).

Exposición de la burbuja de replicación desde la cual comienza la replicación en ambas direcciones.

~245 bp in E. coli

Primeracadenade DNAcopiada

Origen de ReplicaciónDNAPrimer RNA

Orquilla de replicaciónOrquilla de replicación

Progresión de orquillade replicación moviendose

en direcciones opuestas

PRINCIPALES ELEMENTOS INVOLUCRADOS EN LA INICIACIÓN:

Segmentos de ssDNA se denominan hebras templadas.

Girasa (una topoisomerasa) relaja el DNA sobrenrollado.

Proteinas Iniciadoras y la DNA helicasa se unen al DNA en la orquilla de replicación y desenrollan el DNA (Hidrolisis de ATP causa cambiosconformacionales en la DNA helicasa)

DNA primasa se une a la helicasa produciendo un complejo denominadoprimosoma

Primasa sintetiza un primer

RNA pequeño de 10-12 nt, al cual la DNA pol III adiciona nucleotidos.

Pol III adicionanucleotidos

5’ to 3’ sobre ambashebras.

El primer RNA esremovido y

reemplazado por DNA poracción de la DNA pol I. El

Gapes sellado por la DNA

ligasa.

Single-stranded DNA-binding

(SSB) proteins (>200) estabilizan el DNA templadomonohebra durante todo el

proceso de replicación.

3

DNA Pol III

5’ →3’

Hebra lider

Pares de bases

5’

5’

3’

3’

DNA Sobrenrollado es relajado por la Girasa:

Helicasa+

Proteinas Iniciadoras

ATP

SSB Proteins

RNA Primer

primasa

2DNA Pol III

Hebra Tardia

Fragmentos de Okazaki

1

Primer de RNA reemplazado por la DNA pol I y el gap es sellado por laDNA ligasa

Reacción Catalizada por la DNA Polimerasa Reacción Catalizada por la DNA Polimerasa

dNTPentrante

5’ TRIFOSFATO

Pirofosfato

hebra dehebra departidor partidor (RNA)(RNA)

hebra hebra templadotemplado Crecimiento de

la cadena en sentido 5’ 3’

La DNA polimerasa requiere de un La DNA polimerasa requiere de un partidorpartidor de RNA. La enzima adiciona de RNA. La enzima adiciona desoxirribonucleótidos al extremo 3’desoxirribonucleótidos al extremo 3’--OH de la hebra del partidor, la que está apareada a la OH de la hebra del partidor, la que está apareada a la hebra molde o templado. Por lo tanto, la nueva hebra crece en lahebra molde o templado. Por lo tanto, la nueva hebra crece en la dirección 5’ dirección 5’ 33’’. Como . Como cada cada desoxirribonucleósido trifosfato entrantedesoxirribonucleósido trifosfato entrante debe aparearse con la hebra templado para debe aparearse con la hebra templado para poder ser reconocido por la polimerasa, esta hebra determina cuápoder ser reconocido por la polimerasa, esta hebra determina cuál de los cuatro posibles l de los cuatro posibles desoxirribonucleótidosdesoxirribonucleótidos (A, C, G, o T) (A, C, G, o T) serán adicionadosserán adicionados. .

LA REPLICACIÓN DEL DNA ES CONTINUA EN LA HEBRA LIDER Y SEMICONTINUA EN LA HEBRA TARDIA:

El desenrollamiento de cada orquilla de replicación procede en unasola direción.

Las dos hebras de DNA tienen polaridad opuesta y la DNA pol solo sintetiza DNA en dirrección 5’ a 3’.

Solucion: DNA es copiado en dirección opuesta desde cada templado.

•Leading strand (lider) sintesis 5’ a 3’ en dirección del movimiento de la orquilla de replicación.

continuo

requiere un solo primer (RNA).

•Lagging strand (tardia) sintesis 5’ a 3’ en dirección opuesta.

semidiscontinuo

requiere muchos primer RNA

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA

Procariontes tienen un solo origen de replicaciónReplicación bidireccional con dos orquillas

Ambas hebras templadas son copiadas (orquilla de Replicación)

Hebra lider

Hebra tardía

Proteínas que Actúan en la Horquilla de ReplicaciónProteínas que Actúan en la Horquilla de Replicación

DNA polimerasa IIIDNA polimerasa IIIsobre hebra lídersobre hebra líderhebra líderhebra líder

templado de la hebra lídertemplado de la hebra líder

TopoisomerasaTopoisomerasa

DNA DNA parentalparentalproteínas de unión a proteínas de unión a DNA de hebra simpleDNA de hebra simple

fragmento de fragmento de OkazakiOkazaki

DNA polimerasa IIIDNA polimerasa IIIsobre hebra retrasadasobre hebra retrasada

primasaprimasahelicasahelicasa

partidor RNApartidor RNAtemplado de latemplado de lahebra retrasadahebra retrasada

Se muestran dos moléculas de DNA polimerasa, una sobre la hebra Se muestran dos moléculas de DNA polimerasa, una sobre la hebra líder y otra sobre líder y otra sobre la retrasada. La DNA la retrasada. La DNA helicasahelicasa va desenrollando y separando la doble hélice del DNA va desenrollando y separando la doble hélice del DNA paterno delante de la DNA polimerasa. Las proteínas de unión a Dpaterno delante de la DNA polimerasa. Las proteínas de unión a DNA de hebra simple NA de hebra simple mantienen las hebras separadas, permitiendo el acceso a la mantienen las hebras separadas, permitiendo el acceso a la primasaprimasa y la polimerasa. y la polimerasa.

sintesis del primer

Helicasa rompe los puentes de hidrogeno


DNA primasasintetiza un primer RNA

para iniciar la sintesis de DNAsobre la hebra tardia

Topoisomerasa desenrolla el DNA


REPRESENTACION DE LA DNA POL III

Structure resembles a human right hand

Template DNA thread through the palm;

Thumb and fingers wrapped around the DNA

DNA Pol contiene una subunidad con actividadProofreading

DNA pol cataliza la replicacion 5' 3'Extiende pero no puede iniciar la replicación


DNA pol III sintetiza la mayor parte del DNA

DNA pol I (rellena) los gaps de la hebra tardía

DNA ligasa sella los gaps


Hebra tardía

a) varios primer RNA

b) la elongación del DNA genera los fragmentos de Okazaki

c) primer RNA es removido porla DNA pol I

d) ligación del DNA


DNA ligasa sella los nicks de la hebra tardía

Origen de replicación E. coli Secuencias consensos repetidas (tandem)Sitios de unión de proteinas


Origen de Replicación en Origen de Replicación en ProcariontesProcariontes

iniciadoriniciador helicasahelicasapartidor de RNApartidor de RNA proteínas de proteínas de

unión a DNA unión a DNA de simple hebrade simple hebra

unión unión proteína proteína

iniciadorainiciadora

desenrollamientodesenrollamientodel DNA por del DNA por helicasahelicasa y y

proteínas de proteínas de unión a DNA de unión a DNA de

simple hebrasimple hebra

formación formación de dos horquillas de dos horquillas

de replicaciónde replicación

síntesis síntesis partidores partidores

RNARNA


Replicacion de DNA circular de E. coli (3.10):

1. Dos orquillas que resultan en forma de estructura θ.

2. La topoisomerasa permitendisminuir la tensión y permiten la separación del DNA

Modelo de circulo rotatorio:

1. Comienza con un nick en el Origen de Replicacion.

2. El extremo 5’ de la molecula esdesplazado

3. Actua como templado para la síntesis del primer



Enzimas de Eucarionte:

Existen cinco DNA polimerasas en mamíferos.

1. Pol α (alpha): nuclear, DNA replication, no proofreading

2. Pol β (beta): nuclear, DNA repair, no proofreading

3. Pol γ (gamma): mitochondria, DNA replication, proofreading

4. Pol δ (delta): nuclear, DNA replication, proofreading

5. Pol ε (epsilon): nuclear, DNA repair (?), proofreading

1. Si consideramos a cada cromosoma como una doble hebra lineal de DNA

2. Cada cromosomas tiene ~108 pares de bases de largo

3. Con replicación a razón de 2 kb/minuto, la replicación de un cromosomahumano tardaría ~35 dias.

4. Solucion ---> la replicación del DNA se inicia desde diferentes sitiossimultaneamente.

Distribución de los componentes proteicos en la orquilla de replicación

DNA primasa

SSBP

dsDNA parental

DnaB Helicasa

core

core

primer

Hebra tardía

Hebra líder

Actividad Correctora de Actividad Correctora de Pruebas de la DNA Pruebas de la DNA

Polimerasa Durante la Polimerasa Durante la Replicación del DNA Replicación del DNA

(“Proofreading”)(“Proofreading”)

Vista de la Orquilla de Replicación en “Tres Dimensiones”

•• La DNA La DNA polpol solo solo puedepuede sintetizarsintetizar DNA en DNA en direccidireccióónn 55’’ a 3a 3’’ y no y no puedepuedeiniciariniciar la la ssííntesisntesis del DNAdel DNA

•• ProblemasProblemas para el para el extremoextremo 33’’ de los de los cromosomascromosomas

ProblemaProblema en el en el extremoextremo de los de los cromosomascromosomas eucarionteseucariontes

•• SiSi el el problemaproblema no no eses solucionadosolucionado los los cromosomascromosomas se se acortaracortarííananexcesivamenteexcesivamente con con cadacada replicacireplicacióónn..

•• La La solucisolucióónn eses agregaragregar secuenciassecuencias de DNA a los de DNA a los extremosextremos de los de los cromosomacromosoma: : telomerostelomeros–– PequePequeññasas secuenciassecuencias repetidasrepetidas (100(100--10001000’’s)s)

•• La La ReacciReaccióónn eses catalizadacatalizada porpor la la telomerasatelomerasa

•• TelomerasaTelomerasa contienecontiene proteinaproteina yy RNARNA–– El RNA El RNA funcionafunciona comocomo templadotemplado complementariocomplementario a la a la secuenciasecuencia de de

DNA DNA presentepresente en el en el repetidorepetido del del teltelóómeromero

Reparación del DNAReparación del DNAPara corregir errores en la secuencia o MUTACIONESPara corregir errores en la secuencia o MUTACIONES

MUTACIÓN = cambio heredable en el material genético de una célula.

2 Tipos Generales:

- Mutaciones Cromosómicas (deleción o repetición de un trozo decromosoma)

- Mutaciones Puntuales - Inserciones o Deleciones (cambio de marco de lectura)

- Sustituciones- Formación de Dímeros de Pirimidina

DesapareamientosDesapareamientos en el DNA y su reparaciónen el DNA y su reparación

Mecanismo de reparación de los Mecanismo de reparación de los desapareamientosdesapareamientosdel DNA en células del DNA en células eucariotaseucariotas

DespurinaciónDespurinación y y desaminacióndesaminación

Las modificaciones químicas de los Las modificaciones químicas de los nucleotidosnucleotidosproducen mutacionesproducen mutaciones

Alteraciones en el DNA causadas por la radiación UVAlteraciones en el DNA causadas por la radiación UV

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS

C desaminada

pares de bases

Hélice de DNA con una base menos

URACILO DNAGLICOSILASA

ENDONUCLEASA Y FOSFODIESTERASA REMUEVEN EL

AZÚCAR-FOSFATO

Hélice de DNA con un nucleótido menos

DNA POLIMERASA ADICIONA NUEVOS NUCLEÓTIDOS, DNA LIGASA SELLA EL ESPACIO

DNA POLIMERASA + DNA LIGASA

Dímero de pirimidinas

pares de bases

NUCLEASA

DNA HELICASA

Hélice de DNA con un espacio de 12 nucleótidos

FINFIN

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