beatriz alvarez laboratorio de enzimologíaenzimologia.fcien.edu.uy/teoricos...
TRANSCRIPT
Introducción
Beatriz Alvarez
Laboratorio de Enzimología
Curso de Enzimología 2010
Coordinación: Beatriz Alvarez, [email protected]: Segundo semestre, del 7 de setiembre al 11 de noviembre. Teóricos: 2 teóricos semanales de 2 horas cada uno, los días martes y jueves de 10 a 12 horas, salón 107. Total de horas de teórico: 40 horas.Prácticos: 1 práctico por semana de 4 horas, los días martes o los días jueves, de 13 a 17 horas, en el salón 304 o en los Laboratorios de Enzimología y Fisicoquímica Biológica. Total de horas de práctico: 40 horas.Créditos: (40*2 + 40*1.5)/15 = 9.3Ganancia del curso: El curso se ganará por asistencia a los prácticos y aprobación de los correspondientes informes. Evaluación: Examen.Cupo: 40 estudiantes.
Apoya PEDECIBA Biología. Auspicia PEDECIBA Química.
Material para el curso, protocolos de práctico, repartidos de ejercicios:
Subespacio
http://enzimologia.fcien.edu.uy/
Temas
Introducción. Cinética enzimática.
Efectos del pH.
Efectos de la temperatura.
Inhibición.
Reacciones de dos sustratos.
Cinética preestacionaria.
Mecanismos.
Regulación y cooperatividad.
Sistemas multienzimáticos.
ObjetivosEstudio sistemático de diferentes temas de enzimología que permitan una aproximación a la pregunta: ¿cómo funcionan las enzimas?
Curso dirigido a estudiantes avanzados y de posgrado que provee de conceptos de cinética enzimática y mecanismos, así como de herramientas prácticas para el trabajo con enzimas.
BibliografíaTextos de BioquímicaLehninger, Stryer, Voet (Bioquímica), Mathews, Devlin, ZubaySegel, Biochemical calculations, John Wiley (1976)
Textos de EnzimologíaDixon and Webb, Enzymes, Longman (1979) SUBESPACIOFersht, Structure and mechanism in protein science, Freeman (1999)Cornish-Bowden, Fundamentals of enzyme kinetics, Portland (1995)Segel, Enzyme kinetics, Wiley (1993)Methods in Enzymology, volúmenes 63, 64, 87, 249, Academic Press.Price and Stevens, Fundamentals of enzymology, Oxford (1989)Frey and Hegeman, Enzymatic reaction mechanisms, Oxford (2007)Eisenthal and Danson, Enzyme Assays, A Practical Approach, Oxford (2002)Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover (1987). Incluye el capítulo de 1975 “The Circe Effect”.
RECURSOS DE RED
Brenda http://www.brenda.uni-koeln.de
Manual Worthingtonhttp://www.worthington-biochem.com/manual/manIndex.html
ExPASy Proteomics Server (DE TODO!) http://ca.expasy.org
ExPASy Enzyme Nomenclature Database http://ca.expasy.org/enzyme/
ExPASy Metabolic Pathways http://us.expasy.org/cgi-bin/search-biochem-index
Enzyme Structures Databasehttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/
Enzyme Nomenclaturehttp://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html
PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi
Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/
Las enzimas son catalizadores biológicos.
Un catalizador es una sustancia que acelera la velocidad de una reacción y se recupera incambiado.
La catálisis biológica tiene gran importancia:
El azúcar puede guardarse por años. Sin embargo, nos sirve como fuente de energía en segundos, gracias a la catálisis.
La especie humana no demoró mucho en aprender a aprovechar el poder catalítico de las enzimas, por ejemplo, para procesar alimentos (queso, pan, cerveza, vino).
La referencia más antigua acerca de la utilización de enzimas es la elaboración de vino en el Código de Hammurabi (2100 AC, Babilonia).
Reseña histórica
“I ♥ enzymes”
La historia de la enzimología es la historia de la bioquímica.
La comprensión de los mecanismos como actúan las enzimas evolucionó de estudios acerca de la fermentación alcohólica realizados en el siglo XIX.
Jöns Jakon Berzelius1837, Suecia
El concepto de catálisis
"Tenemos una nueva fuerza que pertenece a la Naturaleza orgánica e inorgánica, que provoca reactividad química ... reordenando los componentes de una sustancia hacia otras relaciones sin necesariamente cambiar sus propios componentes..."
Pasteur y Liebig
¿Están vivas las enzimas?
Justus von Liebigfamoso por inventar los laboratorios para estudiantes
Alemania, 1839Teoría química de la fermentación
"Los átomos de un cuerpo en putrefacción, el fermento, están en continuo movimiento; cambian sus posiciones y forman nuevas combinaciones. Estos átomos móviles están en contacto con los átomos del azúcar, que está unida solo por fuerzas débiles. El movimiento de los átomos del fermento no puede pasar sin efecto sobre los átomos del azúcar. O se anula el movimiento o el azúcar se moverátambién. Así el azúcar sufre un desplazamiento de sus átomos que se rearreglan para formar alcohol y dióxido de carbono."Liebig creía que la fermentación era causada por la trasmisión de vibración de los fermentos al material a fermentar.
Louis Pasteur Francia, 1858
Teoría de la "fuerza vital"
"Veo en el hecho de la fermentación un fenómeno relativo a la vida -un hecho fisiológico- que origina múltiples productos, todos los cuales son necesarios para la célula. Creo que no existe fermentación sin que haya, simultáneamente, la organización, el desarrollo y la multiplicación (es decir el crecimiento) de la levadura u otros glóbulos, o al menos la continuación de la vida de los glóbulos que ya estaban presentes. La totalidad de los resultados me parece en oposición a las opiniones de M. Liebig."Pasteur creía que la fermentación era inseparable de las células vivas.
¿De dónde sale el nombre ENZIMA?El nombre "enzima" fue acuñado en 1878 por Fredrich Wilhelm Kühne.
Proviene del griego:
en (dentro de) + zima (levadura).
Enfatiza que hay algo en la levadura, por oposición a la levadura misma, que cataliza los procesos, y distingue las enzimas de los organismos que las producen.
Hans y Eduard BüchnerAlemania, 1897
Las enzimas son moléculas
"Respecto a la teoría de la fermentación ahora podemos hacer la siguiente afirmación: NO es necesario tener un aparato tan complicado como la célula viviente de una levadura para que se lleve a cabo la fermentación. Más bien un fermento soluble, o enzima, se considera el portador de la actividad fermentativa del jugo de la prensa. Llamaremos a este agente subcelular de la fermentación zimasa."Los hermanos Buchner observaron que extractos libres de células son capaces de realizar la fermentación del azúcar a etanol y dióxido de carbono.
(Nobel 1907)
Emil FischerAlemania, 1894
Las enzimas son selectivasHipótesis llave-cerradura
“El efecto específico en los glucósidos puede ser explicado asumiendo que el contacto íntimo entre las moléculas, necesario para la liberación de la reacción química, es posible solo con configuraciones geométricas similares. Para ilustrarlo diré que la enzima y el glucósido encajan uno en el otro como una llave y una cerradura...”
Las enzimas puedenas distinguir entre diferentes estereoisómeros de azúcar. Las enzimas consisten en "moléculas construidas asimétricamente". Así, "la enzima y el sustrato encajan uno en el otro como una llave en una cerradura".
(Nobel 1902)
Las enzimas son proteínasJames Sumner (Estados Unidos)
1926. Cristaliza la ureasa y obtiene sólo aminoácidos cuando la hidroliza (Nobel 1946).
John Northrop (Nobel 1946) y Moses Kunitz
1926. Northrop cristaliza la pepsina. Cristalizan enzimas digestivas y comprueban que la actividad biológica no se puede separar de la proteína.
COENZIMAS Y COFACTORES
Las enzimas son proteínas. La actividad catalítica depende de la integridad de la estructura y de que la proteína no esté desnaturalizada.
Los grupos funcionales de los aminoácidos participan en la catálisis. Muchas enzimas no requieren nada más, pero algunas enzimas requieren un cofactor.
Los cofactores pueden ser iones metálicos o coenzimas orgánicas.
Si el cofactor está unido muy fuertemente o covalentemente se denomina grupo prostético.
apoenzima + cofactor = holoenzima
NOMENCLATURA
En general, las enzimas se nombran agregando el sufijo asa.
Ej: ureasa, lactato deshidrogenasa.
Este sufijo proviene del nombre del extracto de malta que hidrolizaba almidón en el siglo XIX, “diastasa”.
La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular propone clasificar y nombrar las enzimas de acuerdo a las reacciones químicas que catalizan.
Formación de enlaces acoplada a la hidrólisis de ATP
6. Ligasas
Isomerización5. Isomerasas
Eliminación de grupos para formar dobles enlaces
4. Liasas
Reacciones de hidrólisis3. Hidrolasas
Transferencia de grupos funcionales
2. Transferasas
Reacciones redox1. Oxidorreductasas
Tipo de reacción catalizadaClasificación
Cada enzima pasa a tener:Un nombre recomendado, generalmente el nombre trivial
histórico.Un nombre sistemático: nombre del sustrato seguido por el tipo
de reacción.Un número formado a su vez por 4 números: EC _._._._
carboxipeptidasa Apeptidil-L-aminoácido hidrolasaEC 3.4.17.1
EC indica “Enzyme Commission”El primer número indica la clase: hidrolasaEl segundo indica subclase: actúa en enlaces peptídicosEl tercero, la subsubclase: metalocarboxipeptidasa (Zn2+)El cuarto es un número arbitrario en la subsubclase
alcohol deshidrogenasaalcohol:NAD+ oxidorreductasaEC 1.1.1.1
A diferencia de otros catalizadores químicos, las enzimas se caracterizan
por:1. Altísimo poder catalítico.
2. Condiciones de reacción suaves.
3. Alta especificidad por el sustrato (reactivo) y por los productos de la reacción.
4. Su actividad puede ser regulada.
5. Pueden acoplar transformaciones de energía.
Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Aceleran las reacciones por factores de 105 a 1017. Consideremos 109 como promedio.
¿Cuánto es 109?
Por ejemplo, un estudiante tiene 21 años.
21 x 109 = 21 mil millones de años = 21,000,000,000 años.
Enzyme Nonenzyma-tic half-life
Uncatalyzedrate (kun, s-1)
Catalyzed rate (kcat, s-1)
Rate enhance-ment (kcat/kun)
OMP decarboxylase
78,000,000 years
2.8 × 10-16 39 1.4 × 1017
Staphylococcal nuclease
130,000 years
1.7 × 10-13 95 5.6 × 1014
AMP nucleosidase
69,000 years 1.0 × 10-11 60 6.0 × 1012
Carboxypepti-dase A
7.3 years 3.0 × 10-9 578 1.9 × 1011
Ketosteroidisomerase
7 weeks 1.7 × 10-7 66,000 3.9 × 1011
TPI isomerase 1.9 days 4.3 × 10-6 4,300 1.0 × 109
Chorismatemutase
7.4 hours 2.6 × 10-5 50 1.9 × 106
Carbonic anhydrase
5 seconds 1.3 × 10-1 1 × 106 7.7 × 106
Especificidad de la glucosa oxidasa por el sustrato
glucosa + O2 → ácido glucónico + H2O2
0glucosa-6-fosfato0sacarosa0D-fructosa
0.64α-D-glucosa0.98D-manosa1.856-metil-D-glucosa
36-desoxi-6-fluoro-D-glucosa252-desoxi-D-glucosa100β-D-glucosa
Velocidad relativaAzúcar
Sitio activoLos sustratos se unen a una región específica de la enzima denominada sitio activo para formar el complejo enzima-sustrato.La idea de complejo enzima-sustrato surge de experimentos con invertasa a fines del siglo XIX.
O’Sullivan y Thompson, en 1890, ven que la resistencia térmica de la invertasa aumenta cuando hay sacarosa.
Brown, en 1892, relaciona la cinética de saturación con la formación de un complejo enzima-sustrato, deduce que cuando se alcanza la velocidad máxima, toda la enzima está como ES.
Chance, en 1943, “ve” por primera vez un complejo enzima-sustrato. En este trabajo utiliza por primera vez espectrofotometría de flujo detenido y simulaciones numéricas.
¿Qué características tienen los sitios activos?
1. El sitio activo ocupa una porción pequeña de la proteína.
Unión de la quimotripsina a su sustrato
2. El sitio activo es una entidad tridimensional formada por grupos funcionales que provienen de diferentes partes de la secuencia proteica.
Lisozima y diferentes residuos de su sitio activo
3. Los sustratos se unen a las enzimas por múltiples uniones débiles.
- Interacciones de van der Waals.
- Interacciones electrostáticas
- Puentes de hidrógeno
- Interacciones hidrofóbicas
Las constantes de equilibrio de los complejos ES van de 10-2 a 10-8 M, lo cual corresponde a energías libres entre -3 y -12 kcal/mol, considerando que ΔGº' = -RT ln K'eq.
Interacciones entre la quimotripsina y el sustrato
3. Los sitios activos son ranuras o hendiduras. En general, tienen carácter no polar, excluyen el agua, y tienen ciertos residuos polares, de tal forma que constituyen un microambiente.
5. La unión del sustrato depende de una disposición definida de átomos en el sitio activo.
El sitio de unión al sustrato puede existir en ausencia de sustrato (hipótesis de llave-cerradura de Emil Fischer).
O puede formarse el sitio de unión al unirse el sustrato (hipótesis de encaje inducido de Daniel Koshland).
Encaje inducidoEstructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa
glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP
¿Cómo lo hacen?
La cuestión fundamental de la enzimología es comprender cómo hacen las enzimas para ser
catalizadores tan potentes y específicos
Las enzimas son catalizadores, aceleran la velocidad de la reacción pero no alteran la posición del equilibrio.
ΔGº' = -RT ln K'eq
Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)La teoría del estado de transición relaciona la velocidad de una reacción a la diferencia en energía libre entre el estado basal y el estado de transición.
La transformación de S en P ocurre a través de la formación de un estado de transición S*.
K* kS S* P⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯
La energía de activación de Gibbs ΔG* es la diferencia de energía entre el estado de transición y el sustrato.
La velocidad k es proporcional a [S*], la cual a su vez depende de K*.
[S*] = [S] e-ΔG*/RT (pues ΔGº' = -RT ln K'eq)
k = kBT/h e-ΔG*/RT
donde kB es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.
Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935)k = (kBT/h) e-ΔG*/RT
La velocidad de una reacción aumenta cuando la energía de activación, ΔG*, disminuye.
A su vez, ΔG* tiene un componente de entropía y un componente de entalpía: ΔG* = ΔH* -TΔS*
k = (kBT/h) e-ΔS*/R e-ΔH*/RT
La energía de activación puede ser grande y la reacción lenta cuando el estado de transición es demasiado energético u ordenado.
ΔH* es siempre positivo porque se requiere energía para reorganizar los enlaces. ΔS* puede ser negativo o positivo dependiendo si el estado de transición tiene más o menos grados de libertad.
Las enzimas aceleran las reacciones porque estabilizan el estado de transición y bajan la
barrera de activación.
La unión de la enzima al sustrato genera una nueva vía de reacción en la que la energía del estado de transición es menor que en ausencia de enzima
El poder de las enzimas deriva de la energía de unión entre la enzima y el sustrato. Esta energía surge de las múltiples interacciones débiles entre la enzima y el sustrato, y contribuye a la catálisis y a la especificidad.
Las interacciones débiles entre la enzima y el sustrato se optimizan en el estado de transición. Los sitios activos de las enzimas no son complementarios a los sustratos sino que son complementarios a los estados de transición.
Se establecen interacciones débiles entre la enzima y el sustrato, pero éstas son optimizadas en el estado de transición. La energía liberada en el establecimiento de estas interacciones débiles hace disminuir la barrera de activación.
sin enzima
con enzima complementaria al sustrato
con enzima complementaria al estado de transición
Los análogos del estado de transición son inhibidores competitivos de alta afinidad.Ejemplo: prolina racemasa bacteriana
El estado de transición es planar. Por lo tanto, análogos planos de la prolina actúan como inhibidores competitivos muy potentes.
Análogos de estado de transición
Proteasas de serina
Se unen preferentemente al intermediario tetraédrico.
Si una enzima acelera la velocidad de una reacción por un factor de 109, ¿cuánto debe bajar la barrera de activación?
Haciendo cuentas con la ecuación k = (kBT/h) e-ΔG*/RT
podemos concluir que para acelerar la reacción por un factor de 109, la barrera de activación debe disminuir 12 kcal/mol.
¿Cuánta energía se libera con una estas uniones?
- Interacciones de van der Waals.
- Interacciones electrostáticas
- Puentes de hidrógeno
- Interacciones hidrofóbicas
La energía que se libera al establecerse una de estas uniones débiles es de 1-7 kcal/mol. Por lo tanto, la formación de múltiples uniones débiles a nivel del estado de transición puede dar cuenta de las aceleraciones observadas.
La energía de unión entre la enzima y el sustrato puede utilizarse para bajar el componente entrópico de la barrera de activación (ΔG* = ΔH* -TΔS*)Uno de los aspectos más importantes de la catálisis enzimática es la entropía. Las reacciones en solución son lentas porque la aproximación de los reactivos implica una pérdida importante de entropía.
Las reacciones enzimáticas están confinadas al sitio activo. Los grupos que reaccionan forman parte de la misma "molécula", el sitio activo, por lo cual no hay pérdidas de entropía traslacionalo rotacional al formarse el estado de transición. La enzima, al unirse al sustrato, logra que los reactivos estén próximos, inmovilizados y alineados óptimamente para reaccionar.
Esta ventaja entrópica "se paga" con la energía de unión entre la enzima y el sustrato.
Además de los ya mencionados:
1. catálisis por efecto de proximidad y orientación
2. catálisis por unión preferencial de estado de transición
Determinados grupos funcionales alineados apropiadamente en el sitio activo contribuyen a la catálisis mediante los siguientes mecanismos:
3. catálisis general ácido-base
4. catálisis covalente
5. catálisis por iones metálicos
6. catálisis electrostática
Catálisis general ácido baseUn grupo de la enzima participa como aceptor o dador de protón, estabilizando intermediarios cargados inestables.
a) no catalizada
b) Catálisis general ácida
b) Catálisis general básica
Catálisis covalenteUn grupo del sitio activo de la enzima, generalmente un buen nucleófilo, reacciona covalentemente con el sustrato modificándose transitoriamente.
Catálisis por iones metálicos70 % de las enzimas necesitan metales!
Algunas formas por las cuales los metales participan en la catálisis:
1. Uniéndose a los sustratos para orientarlos correctamente.
2. Mediando reacciones redox a través de cambios en el estado de oxidación del metal.
3. Estabilizando cargas negativas.
Catálisis electrostáticaEn el sitio activo de las enzimas, las interacciones electrostáticas son muy fuertes porque el agua estáexcluida y las constantes dieléctricas son bajas.
La distribución de cargas en el sitio activo es tal que estabiliza los estados de transición.
¿Qué se preguntan hoy en día los enzimólogos?La revolución de la ingeniería genética y los datos de estructura cristalográfica han vuelto disponibles muchísimos datos.
Se ha avanzado mucho en la elucidación de mecanismos enzimáticos y en la base estructural de la catálisis.
Los ejemplos más estudiados ponen de manifiesto que es necesaria información estructural, cinética y mecanísticapara comprender un determinado sistema enzimático.
Pero, ¿qué queda por responder?Aún no se cuenta con explicaciones cuantitativas para los altos niveles de catálisis. Los efectos de estabilización del estado de transición, efectos de proximidad, catálisis ácido-base, etc., quedan cortos.
Repaso de cinética
REPASO DE CINÉTICA QUÍMICA
Una reacción ocurre en una serie de pasos individuales. Cada uno de estos pasos se denomina reacción elemental.
Una reacción de estequiometría A → P puede ocurrir a través de una secuencia de reacciones elementales A → Ia → Ib → P que describen el mecanismo.
En una reacción elemental, el número de especies que se combinan para formar el estado de transición se denomina molecularidad. En general las reacciones son unimoleculares o bimoleculares. Excepcionalmente, termoleculares.
A una temperatura determinada, la velocidad de una reacción elemental es proporcional a la concentración de especies que participan, pues depende de la frecuencia con que se encuentran las moléculas.
Convención de la IUPAC:
El orden de una reacción es la suma de los exponentes de los factores de concentración en la ley de velocidad. Debe ser determinado experimentalmente.
Para una reacción elemental, el orden es igual a la molecularidad.
A + B + .... P + Q + ....a b p q→
1 [A] 1 [B] 1 [P] 1 [Q] [A] [B] a bd d d dv = - = - = = = k a dt b dt p dt q dt
REACCIONES DE ORDEN UNO
A → P
[A] [P] [A]d dv = - = = k dt dt
Integrando entre t = 0 y t: o[A] = [A] exp (- )kt
oln [A] = ln [A] - kt
o[P] = [A] [1 - exp (- )]kt
En una reacción de orden uno, la vida media es constante e independiente de la concentración inicial, t1/2 = ln2/k
[Pro
duct
o]
Tiempo
REACCIONES DE ORDEN DOS, v = k [A]2
2 A → P
21 [A] [A] 2
dv = - = k dt
0
0
0[A][A] = 1 + [A] 2
1 1= + 2 [A] [A]
kt
kt
REACCIONES DE ORDEN DOS
A + B → P [A] [A][B]dv = - = k dt
00 0
0
[B][B]ln = ln + ([B] -[A] ) [A] [A]
k t
Ahora, si [B]0 >> [A]0 la reacción es de pseudo primer orden y la constante de velocidad aparente es k’ = k[B]0.
[Pro
duct
o]
Tiempo
obs 0
obso[P] = [A] [1 - exp (- )]k = k[B]
k t
k obs
[B]0
REACCIONES DE ORDEN CERO
0
[A]
[A] = [A] - t
dv = - = k dt
k
¿Cómo puede determinarse el orden de reacción?
Método integral: Se observa cómo varía la concentración de producto (o reactivo) a lo largo del tiempo, hasta completitud. Se ve cómo ajusta a la ecuación de velocidad integrada, por ejemplo, a una función exponencial.
Método de las velocidades iniciales: Se observa la formación de concentraciones muy pequeñas de producto, durante un período en el cual las concentraciones de reactivos se mantienen constantes.
DIMENSIONES
Concentraciones en MVelocidades en M s-1
Constantes de velocidad de primer orden en s-1
Constantes de velocidad de orden dos en M-1 s-1
PASO DETERMINANTE DE LA VELOCIDAD
En una reacción compleja, si un paso es mucho más lento que los otros, la velocidad del proceso será la del paso lento.
REACCIONES CATALIZADAS ENZIMÁTICAMENTE Las reacciones catalizadas enzimáticamente no tienen un orden de reacción simple. Sin embargo, los pasos individuales sí tienen órdenes simples. Unión de enzima a sustrato E + S ES⎯⎯→←⎯⎯ proceso bimolecular de orden dos
Transformación del complejo ES en producto ES E + P→ proceso unimolecular de orden uno
Cinética enzimática
HistoriaLas velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamentefueron estudiadas por primera vez a fines del Siglo XIX.
Estudios con invertasa: sacarosa + H2O → glucosa + fructosa
O’Sullivan y Thompson (1890) ven que la velocidad depende de la acidez y que es proporcional a la cantidad de enzima. La resistencia térmica aumenta en presencia del sustrato sacarosa.
Brown (1892) ve que la velocidad primero aumenta con la concentración de sacarosa y luego se vuelve independiente. Pone el concepto de complejo ES en términos cinéticos.
Problemas experimentales: control de pH y mutarrotación de la glucosa.
No se pudo progresar hasta que se controló el pH.
Concepto de amortiguadores y escala de pH: Sorensen, 1909.
Michaelis y Menten deciden hacer experimentos más prolijos
1. Fijan el pH con amortiguador acético.
2. Consideran la mutarrotación de la glucosa.
3. Miden velocidades iniciales
¿Hoy en dìa, cómo se determina la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente?
pH y temperatura constantes, amortiguador
se adiciona sustrato y enzima a una solución amortiguadora y se mide la desaparición de sustrato o la aparición de producto
se puede seguir una propiedad física que varíe en forma proporcional a la concentración
métodos continuos o discontinuos (de muestreo)
se determina la velocidad inicial, v0
v0 = d[P]/dt = -d[S]/dt a tiempo cero
VELOCIDAD INICIAL
Cuando se está en velocidad inicial, las gráficas de concentración de producto en función del tiempo son lineales.
En general, cuando se está en velocidad inicial, reaccionó menos de 10% del sustrato.
Los enzimólogos casi siempre determinan velocidad inicial, v0.
Esto es muy importante, pues se evita que la enzima se inactive,que se consuma sustrato, que cambie el grado de saturación de la enzima, que ocurra la reacción reversa, que haya inhibición por producto.
Experimentalmente, los primeros enzimólogosencuentran que:
- la velocidad inicial varía en forma lineal con la concentración de enzima
V 0
[sustrato]
V 0
[enzima]
- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la concentración de sustrato
Para empezar a derivar la ecuación de Michaelis y Menten
1 2
-1
k k
kE + S ES E + P⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯
2[S] [P] k [ES]d dv = - = = dt dt
Asumimos: • velocidades iniciales • [S]T = [S] + [ES] como [S]T >> [E]T entonces [S]T = [S] • [E]T = [E] + [ES]
Hipótesis de equilibrio(Michaelis y Menten, 1913)
ES está equilibrio con E y con S
Equilibrio de disociación: ES E + S⎯⎯→←⎯⎯
k1[E][S] = k-1[ES]
-1S
1
[E][S] k K[ES] k
= =
como [E] = [E]T – [ES]
TS
[E][S] ([E] - [ES]) [S]K = [ES] [ES]
=
despejando [ES]
T
S
[E] [S][ES] = K + [S]
entonces
maxT2 2
S S
V [S][E] [S]v = k [ES] = k = K + [S] K + [S]
donde Vmax = k2 [E]T y -1s
1
kK = k
Hipótesis de estado estacionario(Briggs y Haldane, 1925)
ES está en estado estacionario
1 -1 2
1 -1 2
-1 2M
1
[ES] = 0 = k [E][S] - k [ES] - k [ES]
k [E][S] = (k + k ) [ES]
[E][S] k + k = = K[ES] k
ddt
TM
[E][S] ([E] - [ES]) [S]K = [ES] [ES]
=
despejando [ES]:
T
M
[E] [S][ES] = K + [S]
entonces
maxT2 2
M M
V [S][E] [S]v = k [ES] = k = K + [S] K + [S]
donde Vmax = k2 [E]T y -1 2M
1
k + kK = k
⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯1 2
-1
k k
kE + S ES E + P
-1 2M
1
k + kK = k
max
M
V [S]v = K + [S]
[ ]max 2 T V = k E
En suma:
Del repartido de ejercicios
12. Para una enzima michaeliana, ¿cuánto debe aumentar la concentración de sustrato para que la velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? ¿Y si la enzima presenta cooperatividad positiva?
13. La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa con un KM de 0.13 mM.
glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP.
a. ¿Qué fracción de Vmax se observaría cuando la concentración de glucosa corresponde al valor fisiológico de 5 mM?
b. Cuando la glucosa se une a la enzima, ésta sufre un cambio conformacional. Recién entonces puede unirse el ATP a la enzima. ¿Qué sentido tiene este fenómeno?
¿Cómo se determinan los parámetros cinéticos (KM, Vmax y Vmax/KM) de una reacción catalizada
enzimáticamente?
Midiendo la velocidad inicial para concentraciones crecientes de sustrato.
Slope = KM/VMAX
1/VMAX
1/v 0
1/[Substrate]
KM/VMAX
Slope = 1/VMAX
[Sub
stra
te]/v
0
[Substrate]
Slope = VMAX/KM
KM
VMAX
error bars 5% VMAX
v 0
[Substrate]
¿Cómo determinamos KM, VMAXy VMAX/KM?
X
Lineweaver-Burk plot Hanes or Woolf plot
From Cornish-Bowden, 1995, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press.
¡Tratemos de no usar la linealización del doble recíproco de Lineweaver-Burk!
¿Qué significan KM, Vmax, kcat y kcat/KM?
KM• KM = [S] cuando v = ½ Vmax
• tiene unidades de concentración (M)
• -1 2M
1
k + kK = k
• Si k2 << k-1, KM = KS
• Ks representa la afinidad entre la enzima y el sustrato, pues es la constante de equilibrio de disociación • KM representa una constante aparente de disociación,
pues M[E][S]K = [ES]Σ
• cuanto más pequeño sea KM, hay menos enzima libre y más complejo enzima-sustrato
En suma:KM es una constante aparente de disociación que puede ser considerada como la constante de disociación global de todas las especies enzima-sustrato.
kcat• Vmax = kcat [E]T entonces kcat = Vmax / [E]T
• en un mecanismo simple, kcat = k2 y representa el proceso de primer orden de transformación de ES en P
• en un mecanismo complejo, representa el límite inferior de las constantes de velocidad de la transformación de ES en P • unidades de tiempo-1 (s-1)
• es el número de recambio (turnover number), máximo número de moléculas de S que se transforman en P por unidad de tiempo y por sitio activo.
En suma:kcat es una constante de primer orden que se relaciona con las propiedades del complejos enzima-sustrato (incluyendo enzima-intermediario y enzima-producto).
kcat/KM
• como M[E][S]K = [ES]
, la ecuación de Michaelis y Menten
puede escribirse catcat
M
kv = k [ES] = [E][S]K
• kcat/KM representa la constante aparente de orden dos para la reacción de la enzima y el sustrato • tiene unidades de M-1 s-1
• debe ser menor o igual que las constantes de orden dos en el mecanismo • da idea de la eficiencia catalítica, puede llegar a ser igual
a k1 y estar limitada por difusión
cat 2 1 2
-1 2M -1 2
1
k k k k = = k +kK k +kk
• da idea de la especificidad de la enzima por el sustrato ⎯⎯→
⎯⎯→
EA A cat cat M A
EB B cat cat M B
cat M AA
B cat M B
A P v = k [EA] = (k /K ) [E] [A]
B P v = k [EB] = (k /K ) [E] [B](k /K ) [A]v =
v (k /K ) [B]
En suma:kcat/KM es una constante aparente de orden dos que se relaciona con las propiedades de la enzima libre y el sustrato libre.
Enzima Sustrato KM (M) kcat(s-1)
kcat/KM(M-1 s-1)
Acetilcolines-terasa
Acetilcolina 9.5 x 10-5 1.4 x 104 1.5x106
Anhidrasacarbónica
CO2 0.012 1.0 x 106 8.3x107
Catalasa H2O2 0.025 1.0 x 107 4.0 x 108
Fumarasa Fumarato 5.0 x 10-6 800 1.6 x 108
Ureasa Urea 0.025 1.0 x 104 4.0 x 105
Algunos valores
Las enzimas que quieren maximizar la velocidad evolucionan de tal forma de maximizar kcat/KM y de que KM sea mayor que [S], la concentración fisiológica de sustrato, pues v = kcat/KM [E] [S].(Ideas desarrolladas por Alan Fersht)
20023PEPPiruvato quinasa
5951PyrLactato deshidrogenasa190220GPGlicerol fosfato deshidrogenasa
4603G3PTriosafosfato isomerasa703G3PGliceraldehído 3P deshidrogenasa
2PG
3PG3PG
FBPG6P
Sustrato
707Enolasa
500060Fosfoglicerato mutasa120060Fosfoglicerato quinasa
100032Aldolasa210130Glucosa 6-P isomerasa
KM (µM)[S] (µM)Enzima
Enzimas glicolíticas
Del repartido de ejercicios:14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. a) Una enzima participa en la reacción alterando la constante de equilibrio de la reacción, sin alterar la barrera de activación (Ea).b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por la enzima.c) Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.d) El número de recambio (kcat) es el número de moles de sustrato transformado por minuto por mol de centro activo. e) La catálisis puede ser explicada por una unión tipo llave y cerradura entre el sustrato y la enzima.f) La velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente esindependiente de la concentración de sustrato.g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentración de enzima.h) El KM equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la máxima.i) El KM varía con la concentración de enzima.
V 0
[enzima]
Experimentalmente, se encuentra que:
- la velocidad inicial varía en forma lineal con la concentración de enzima
- la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la concentración de sustrato
V 0
[sustrato]
⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯1 2
-1
k k
kE + S ES E + P
-1 2M
1
k + kK = k
max
M
V [S]v = K + [S]
[ ]max 2 TV = k E
⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯1 2
-1
k k
kE + S ES E + P
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
[Pro
duct
o]
Tiempo (s)
0 1000 2000 3000 4000 5000[P
rodu
cto]
Tiempo (s)
Preestacionario Curso total de reacción
0 20 40 60 80 100 120[P
rodu
cto]
Tiempo (s)
Velocidad inicial o de estado estacionario
Ecuación de Michaelis-Menten integrada
[Pro
duct
o]Tiempo
Velocidad inicial
Cuando el enlentecimiento en la formación de producto se debe solo a la depleción de sustrato, se puede encontrar KM y VMAX “con un solo tubo de ensayo”:
- Determinando v para diferentes [S] con las tangentes.
- Integrando la ecuación de Michaelis-Menten.
MAX
M
0
MAX 0
M 0
M 0MAX
0
V [S]d[P] d[S]v = = - = dt dt K + [S]
Balance de masa [S] = [S] + [P]V ([S] - [P])d[P] =
dt K + [S] - [P]d[P] (K + [S] - [P]) = V dt
[S] - [P]Condicion de frontera [P] = 0 a t = 0
(K
∫ ∫
M 0MAX
0 0
0MAX M
0
0MAX 0 M
+ [S] ) d[P] [P] d[P]- = V dt[S] - [P] [S] - [P]
[S]V t = [P] + K ln [S] - [P]
Analogamente:[S]V t = [S] - [S] + K ln [S]
∫ ∫ ∫
Integrando la ecuación de Michaelis-Menten
0MAX 0 M
0
0
[S]V t = [S] - [S] + K ln [S]
Rearreglando:
[S] - [S] t
[S]1 lnt [S]
VMAX/KM
VMAX
KM
MAX
M
M 0
MAX
MAX
V [S]d[P] d[S]v = = - = dt dt K + [S]
caso limite: K << [S]d[P] = Vdt
[P] = V t
MAX
M
M 0
MAX
M
MAX0
M
MAX0
M
V [S]d[P] d[S]v = = - = dt dt K + [S]
Caso limite: K >> [S]Vd[S] = [S]
dt K
V[S] = [S] exp tKVln [S] = ln [S] tK
−
⎛ ⎞−⎜ ⎟⎝ ⎠
−
VMAX
KM
Ln [S]
t
Sustratos con alta afinidadCuando [E]0 ~ [S]0, ya no se puede asumir que [E]0 << [S]0
Ya no se cumple:
No va a haber un buen ajuste a una hipérbola y las linealizaciones van a presentar desviaciones.
En cambio se puede demostrar:
{ }− −2maxT T S T T S T T
T
Vv = ([E] + [S] + K ) ([E] + [S] + K ) 4 [E] [S] 2 [E]
max
M
V [S]v = K + [S]
Sustratos con alta afinidad
Reacciones reversibles⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯ ←⎯⎯
1 2
-1 -2
k k
k kE + S ES E + P
f rmax max
S PM M
S PM M
V [S] V [P] - K Kv = [S] [P]1 + +
K K
fmax 2 Tdonde V = k [E] r
max -1 TV = k [E]
S -1 2M
1
k + kK = k
P -1 2M
-2
k + kK = k
En el equilibrio v = 0
Relación de Haldane
Los parámetros cinéticos de una reacción reversible están relacionados por la constante de equilibrio
( )( )
f PCAT Mmax M S
r Smax M CAT M P
k KV K[P]Keq = = = [S] V K k K
Del repartido de ejercicios18. La enzima fumarasa cataliza la hidratación del fumaratopara dar malato. Esta reacción tiene un ΔGº’ de –3.8 kJ/mol. Para la enzima de corazón de chancho, se han reportadovalores, para la reacción directa, de KM = 1.7 mM y VMAX = 0.25 mM-1 s-1; y, para la reacción reversa, de KM = 3.8 mM y VMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de unabacteria, se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX = 0.024 mM-1 s-1 para la reacción directa, y KM = 1.2 mM y VMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reacción reversa. Comente en la plausibilidad de estos reportes.
(PARÉNTESIS)UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato en producto en 1 min bajo
condiciones definidas.
(Comisión de Enzimas, Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, 1961)
U mL-1: concentración
U mg-1: actividad específica
Otra unidad es el katal. Un katal corresponde a la conversión de 1 mol de substrate por segundo.
En la mayoría de los casos, las unidades se refieren a concentraciones altas de sustrato (>KM), por lo que las unidades no dependen de la concentración de sustrato.
0 20 40 60 80 100
0
2
4
6
8
v 0 (uM
min
-1)
[Xanthine] (uM)0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mU mL-1
v 0 (µM
min
-1)
Entonces, para formar más producto, o descomponer más sustrato, o en un período más corto de tiempo, simplemente hay que añadir proporcionalmente más enzima.
Del repartido de ejercicios:
1. Se quiere medir la actividad de la enzima malato deshidrogenasa en un extracto bacteriano.oxalacetato + NADH → L-malato + NAD+Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH 7.6, oxalacetato 0.6 mM y NADH 0.1 mM en un volumen total de 3 mL. Se dispara la reacción agregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este extracto contiene 32 mg de proteína/mL. Se observa la disminución de absorbancia a 340 nm debido a la desaparición de NADH (ε = 6.22 mM-1 cm-1).a- ¿Cuál es la velocidad de reacción?b- Calcule la actividad de la enzima por mL de extracto.c- Calcule la actividad específica de la enzima.
0.3241600.3351400.3561200.3851000.433800.484600.536400.584200.6350
absorbanciatiempo (s)
Del repartido de ejercicios:
2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a la sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad siguiendo la desaparición de NADH acoplándola a la malato dehidrogenasa:
En una mexcla de reacción se coloca un exceso de aspartato (100 veces el Km), 0.1 mL de suero de un paciente, 0.3 µmoles de NADH y exceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 mL. La reacción se inicia agregando un exceso de α–cetoglutarato contenido en 0.1 mL. Luego de un período de latencia, se observa un decrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de absorbancia por minuto siendo la cubeta de reacción de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente.
⎯⎯⎯→TGOaspartato + α-cetoglutarato glutamato + oxalacetooxalaceto NADH malato NADMDH+ ⎯ →⎯⎯ + +
Del repartido de ejercicios:
3. Se quiere medir actividad β-galactosidasa en un extracto bacteriano que contiene 5 mg de proteína por mL de extracto. Para ello, se incuban 0.25 mL de extracto en amortiguador con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil β-galactósido en un volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos, se toman alícuotas de 0.1 mL y se agregan a 2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide la formación de p-nitrofenol a 400 nm, siendo ε = 18300 M-1 cm-1 en NaOH 0.1 M. a- ¿Cuál es la actividad de la enzima por mL de extracto? b- ¿Cuál es la actividad específica del extracto?c- ¿Qué controles deben realizarse?
0.270360 s
0.202270 s
0.135180 s
0.06890 s
A400tiempo
Del repartido de ejercicios:
8. Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades de una enzima. Estime la concentración intracelular de la enzima asumiendo que un gramo de músculo fresco contiene 0.8 mL de agua intracelular:
a) Sabiendo que el número de recambio de la enzima es de 6 x 104 min-1.
b) Sabiendo que la actividad específica de la enzima pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es 120.000.