ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------***----------

BÁO CÁO ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP VIỆN NĂM 2010

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo silic phân

lập ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định”

Mã số: 04

Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hoài Hà

Hà Nội, 2010

BÁO CÁO TÓM TẮT 1. Tên đề tài

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo silic phân lập ở rừng ngập mặn

Xuân Thủy, Nam Định

2. Các thành viên tham gia đề tài

Chủ trì đề tài

Họ và tên: Nguyễn Thị Hoài Hà

Đơn vị công tác: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Điện thoại: 04. 37547488

Email: nguyenhoaiha@yahoo.com

Chức vụ công tác hiện nay: Trƣởng phòng

Các thành viên

KS.Phạm Thị Bích Đào

3. Cơ quan chủ trì đề tài

Tên cơ quan: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN

Địa chỉ: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội

Điện thoại: 043 7547407 Fax: 043 7547407

Email: imbt@vnu.edu.vn

4. Khả năng sử dụng cơ sở vật chất, trang thiết bị trong và ngoài cơ quan để

thực hiện đề tài

Phòng thí nghiệm của Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia

Hà Nội

5. Tóm tắt tổng quan của đề tài

Việt Nam có một hệ thống đất ngập nƣớc cửa sông ven biển khá phong phú và đa

dạng. Đất ngập nƣớc và sự đa dạng sinh học của đất ngập nƣớc đã gắn liền với dân tộc

Việt Nam trong suốt hàng ngàn năm lịch sử. Đây cũng là vùng trọng điểm cho sự phát

triển kinh tế xã hội, mang lại nhiều sản phẩm phục vụ cho cuộc sống của ngƣời dân, cho

nhu cầu phát triển kinh tế và xuất khẩu.Trong thời gian gần đây, nƣớc ta đã có nhiều cố

gắng trong việc nghiên cứu, quản lý và bảo tồn các khu rừng ngập mặn ven biển, tuy

nhiên vẫn còn gặp nhiều khó khăn, bất cập, đặc biệt là việc chƣa hoàn thiện hệ thống

phân loại và nghiên cứu cơ bản về hệ thống sinh vật tại những vùng đó. Với việc nghiên

cứu cơ bản và hoàn thành việc phân loại thành phần loài tại những vùng cửa sông ngập

nƣớc sẽ là cơ sở để xác định các nguồn gen, các họ gen quý hiếm cần bảo tồn của các

vùng này cũng nhƣ sẽ có đƣợc các hƣớng mở ra cho các ngành kinh tế nông nghiệp phát

triển ngay tại những khu bảo tồn này.

Rừng ngập mặn là một hệ sinh thái có năng suất cao ở vùng cửa sông ven biển

nhiệt đới. Không chỉ là nguồn lợi lâm sản, chim thú, đây còn là nơi cung cấp hải sản có

giá trị kinh tế và tính đa dạng sinh học cao. Vƣờn quốc gia Xuân Thủy (còn gọi là Rừng

ngập mặn Xuân Thủy) là khu bảo tồn dự trữ sinh quyển đất rừng ngập mặn, đã có lịch sử

phát triển lâu đời. Sau khi gia nhập “Công ƣớc Ramsar” (01/1989), nơi đây trở thành Khu

Ramsar thứ 50 của thế giới, đầu tiên của khu vực Đông Nam Á và duy nhất của Việt Nam

trong suốt 16 năm. Tháng 10/2004, UNESCO công nhận Khu dự trữ sinh quyển liên tỉnh

đồng bằng ven biển châu thổ sông Hồng là Khu dự trữ sinh quyển thế giới (đây là khu

thứ 3, sau Cần Giờ và Cát Tiên). Trong đó, Vƣờn quốc gia Xuân Thủy là vùng lõi có tầm

quan trọng đặc biệt của Khu dự trữ sinh quyển thế giới này.

Thực vật phù du là mắt xích rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của sinh vật thủy

sinh. Chúng là mồi ăn của động vật phù du, các loại ấu trùng, các loại cá, các loại động

vật thân mềm ăn lọc… Tảo silic thƣờng chiếm khoảng 60 – 70% về số loài cũng nhƣ sinh

vật lƣợng. Nhất là ở những vùng biển ven bờ, vùng cửa sông ven biển, chúng luôn chiếm

ƣu thế tuyệt đối, có nơi trên 84% về số loài và tới 99% về sinh vật lƣợng. Tình hình phân

bố tảo silic thƣờng phản ánh khá đầy đủ xu thế chung của toàn bộ thực vật phù du. Có thể

nói thực vật phù du nói chung và tảo silic nói riêng có ảnh hƣởng rất lớn đến độ đa dạng

sinh học, tiềm năng hệ sinh thái thủy sinh của vùng.

6. Mục tiêu của đề tài

Lƣu giữ và bảo tồn nguồn gen đa dạng vi tảo silic.

7. Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi tảo silic trong rừng ngập mặn Xuân Thủy,

Nam Định.

- Xác định đặc điểm sinh học nhƣ hình thái tế bào, thành phần dinh dƣỡng và vị trí

trong phân loại của các chủng đã tuyển chọn đƣợc.

- Lƣu giữ nguồn gen các chủng vi tảo silic trong bộ sƣu tập giống của phòng Sinh

học tảo.

8. Kết quả chính của đề tài

- Từ các mẫu thu thập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định, phân lập và

tuyển chọn và lƣu giữ ba chủng vi tảo ký hiệu C2 thuộc chi Chaetoceros và N8, N9

thuộc chi Navicula. Dựa vào đặc điểm hình thái học quan sát đƣợc trên kính hiển vi

quang học và khả năng phát triển của vi tảo cần nghiên cứu trên môi trƣờng chuẩn

đoán, định danh sơ bộ ba chủng vi tảo Chaetoceros C2; Navicula N8; Navicula N9

thuộc các loài Chaetoceros muelleri; Navicula tuscula và Navicula radiosa.

- Môi trƣờng ASW là môi trƣờng dinh dƣỡng tốt nhất cho sự sinh trƣởng và phát

triển của vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9 với mật độ tế bào đạt cao nhất là

67.22 ×106/ml và 137.6×10

6/ml. Vi tảo chủng Navicula N8 sinh trƣởng tốt nhất trên

môi trƣờng ESM với mật độ tế bào cao nhất đạt 129×106/ml.

- Chủng vi tảo Chaetoceros C2 có chứa thành phần acid béo không no quan

trọng là EPA (chiếm đến 24.759%), AA (7.845%); chủng Navicula N8 và Navicula N9

đều có tỉ lệ acid palmitic lớn nhất chiếm 52.557% và 58.303%. Chủng Navicula N8 có

chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764%, chủng Navicula N9 có hàm lƣợng acid

oleic chiếm 1.188%. Sự đa dạng về thành phần các loại acid béo (từ 17- 19 loại acid

béo) cho thấy cả ba chủng vi tảo đều có thể ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản, làm tăng

chất lƣợng con giống.

9. Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài

- Kinh phí đƣợc cấp: 25.000.000 đồng

- Kinh phí thực hiện: 25.000.000 đồng

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

Chủ trì đề tài Thủ trƣởng đơn vị

(ký tên và đóng dấu)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY- NAM ĐỊNH .................... 3

1.2. GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC .................................................................................. 5

1.2.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 5

1.2.2. Đặc điểm phân bố và vai trò của tảo silic ......................................................... 6

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 7

2.1. NGUYÊN LIỆU....................................................................................................... 7

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................................... 7

2.1.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ..................................................... 7

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................ 7

2.1.4. Máy móc và dụng cụ ......................................................................................... 8

2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ................................................................................... 8

2.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI TẢO.............................................................. 9

2.3.1. Phƣơng pháp phân lập bằng micropipette ........................................................ 9

2.3.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên đĩa thạch ............................................... 9

2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA VI TẢO ..... 10

2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO ................................ 11

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 13

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO ................................... 13

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

CÁC CHỦNG VI TẢO SILIC ...................................................................................... 14

3.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 14

3.2.1.1. Chi Chaetoceros....................................................................................... 14

3.2.1.2. Chi Navicula ............................................................................................ 15

3.2.2. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi tảo silic .............. 16

3.2.3. Thành phần acid béo của ba chủng vi tảo silic ............................................... 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 24

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG

Danh mục hình

Hình 1.1. Bản đồ vệ tinh rừng ngập mặn Xuân Thủy ......................................................... 3

Hình 2.1. Các điểm lấy mẫu đƣợc định vị trên bản đồ ....................................................... 7

Hình 3.1. Phân lập vi tảo trên đĩa thạch ............................................................................ 13

Hình 3.2. Nuôi vi tảo trong các lọ Penicillin .................................................................... 13

Hình 3.3. Nuôi sinh khối tảo trong bình tam giác dung tích 100ml ................................. 13

Hình 3.4. Các chi tảo silic phân lập đƣợc ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định ....... 14

Hình 3.5. Chaetoceros C2 ................................................................................................. 15

Hình 3.7. Navicula N9 ...................................................................................................... 16

Hình 3.8. Động thái sinh trƣởng của ba chủng vi tảo silic ............................................... 18

trên các môi trƣờng khác nhau .......................................................................................... 18

Hình 3.9. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros C2 .............................. 21

.......................................................................................................................................... 22

Hình 3.10. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Navicula N8 .................................. 22

Hình 3.11. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Navicula N9 .................................. 22

Danh mục bảng

Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của ba chủng vi tảo silic trên các môi trƣờng khác nhau

........................................................................................................................................... 17

Bảng 3.2. Thành phần acid béo của ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8,

Navicula N9.......................................................................................................................19

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam có một hệ thống đất ngập nƣớc cửa sông ven biển khá phong phú và đa

dạng. Đất ngập nƣớc và sự đa dạng sinh học của đất ngập nƣớc đã gắn liền với dân tộc

Việt Nam trong suốt hàng ngàn năm lịch sử. Đây cũng là vùng trọng điểm cho sự phát

triển kinh tế xã hội, mang lại nhiều sản phẩm phục vụ cho cuộc sống của ngƣời dân, cho

nhu cầu phát triển kinh tế và xuất khẩu.Trong thời gian gần đây, nƣớc ta đã có nhiều cố

gắng trong việc nghiên cứu, quản lý và bảo tồn các khu rừng ngập mặn ven biển, tuy

nhiên vẫn còn gặp nhiều khó khăn, bất cập, đặc biệt là việc chƣa hoàn thiện hệ thống

phân loại và nghiên cứu cơ bản về hệ thống sinh vật tại những vùng đó. Với việc nghiên

cứu cơ bản và hoàn thành việc phân loại thành phần loài tại những vùng cửa sông ngập

nƣớc sẽ là cơ sở để xác định các nguồn gen, các họ gen quý hiếm cần bảo tồn của các

vùng này cũng nhƣ sẽ có đƣợc các hƣớng mở ra cho các ngành kinh tế nông nghiệp phát

triển ngay tại những khu bảo tồn này.

Rừng ngập mặn là một hệ sinh thái có năng suất cao ở vùng cửa sông ven biển

nhiệt đới. Không chỉ là nguồn lợi lâm sản, chim thú, đây còn là nơi cung cấp hải sản có

giá trị kinh tế và tính đa dạng sinh học cao. Vƣờn quốc gia Xuân Thủy (còn gọi là Rừng

ngập mặn Xuân Thủy) là khu bảo tồn dự trữ sinh quyển đất rừng ngập mặn, đã có lịch sử

phát triển lâu đời. Sau khi gia nhập “Công ƣớc Ramsar” (01/1989), nơi đây trở thành Khu

Ramsar thứ 50 của thế giới, đầu tiên của khu vực Đông Nam Á và duy nhất của Việt Nam

trong suốt 16 năm. Tháng 10/2004, UNESCO công nhận Khu dự trữ sinh quyển liên tỉnh

đồng bằng ven biển châu thổ sông Hồng là Khu dự trữ sinh quyển thế giới (đây là khu

thứ 3, sau Cần Giờ và Cát Tiên). Trong đó, Vƣờn quốc gia Xuân Thủy là vùng lõi có tầm

quan trọng đặc biệt của Khu dự trữ sinh quyển thế giới này.

Thực vật phù du là mắt xích rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của sinh vật thủy

sinh. Chúng là mồi ăn của động vật phù du, các loại ấu trùng, các loại cá, các loại động

vật thân mềm ăn lọc… Tảo silic thƣờng chiếm khoảng 60 – 70% về số loài cũng nhƣ sinh

vật lƣợng. Nhất là ở những vùng biển ven bờ, vùng cửa sông ven biển, chúng luôn chiếm

ƣu thế tuyệt đối, có nơi trên 84% về số loài và tới 99% về sinh vật lƣợng. Tình hình phân

bố tảo silic thƣờng phản ánh khá đầy đủ xu thế chung của toàn bộ thực vật phù du. Có thể

nói thực vật phù du nói chung và tảo silic nói riêng có ảnh hƣởng rất lớn đến độ đa dạng

sinh học, tiềm năng hệ sinh thái thủy sinh của vùng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành

thực hiện : “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo silic phân lập ở rừng

ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định”.

Với mục tiêu: Lƣu giữ và bảo tồn nguồn gen đa dạng vi tảo silic.

2

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi tảo silic trong rừng ngập mặn Xuân Thủy,

Nam Định.

- Xác định đặc điểm sinh học nhƣ hình thái tế bào, thành phần dinh dƣỡng và vị trí

trong phân loại của các chủng đã tuyển chọn đƣợc.

- Lƣu giữ nguồn gen các chủng vi tảo silic trong bộ sƣu tập giống của phòng Sinh

học tảo.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY- NAM ĐỊNH

Theo định nghĩa của công ƣớc Ramsar (công ƣớc về những vùng đất ngập nƣớc có

tầm quan trọng quốc tế): “Những vùng đầm lầy, than bùn hoặc vùng nƣớc, bất kể tự

nhiên hay nhân tạo, thƣờng xuyên hay tạm thời, nƣớc chảy hay nƣớc tù, là nƣớc ngọt,

nƣớc lợ hay nƣớc biển, kể cả những vùng nƣớc biển có độ sâu không quá 6m, khi thủy

triều thấp, đều là những vùng đất ngập nƣớc”, thì rừng ngập mặn là một hệ sinh thái đất

ngập nƣớc đặc trƣng ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới [3].

Hình 1.1. Bản đồ vệ tinh rừng ngập mặn Xuân Thủy

Rừng ngập mặn Xuân Thủy (RNMXT) thuộc địa giới huyện Giao thủy tỉnh Nam

Định với tổng diện tích tự nhiên là 7100 ha bao gồm một phần cồn Ngạn, toàn bộ cồn Lu

và cồn Xanh. Vùng đệm còn lại bao gồm một phần cồn Ngạn (ở trong vành lƣợc), toàn

bộ bãi trong và diện tích của năm xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân, Giao

Hải với tổng diện tích tự nhiên lên tới 8000 ha.

• Về địa hình: Địa hình tự nhiên của RNMXT đƣợc kiến tạo bởi quy luật bồi

lắng phù sa của vùng cửa sông ven biển. Các bãi bồi lớn xen kẽ với các dòng sông tạo

nên cảnh quan đặc thù của khu vực.

4

• Về khí hậu: RNMXT nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa chịu ảnh

hƣởng trực tiếp của biển. Do nằm trong vùng vĩ độ thấp nên khu vực này chịu sự chi phối

của chế độ nội chí tuyến, nhiệt độ của vùng khá cao.

• Về thổ nhƣỡng: RNMXT là vùng đất đƣợc bồi tụ bởi phù sa sông Hồng, đất

chƣa phân hóa rõ rệt còn giữ nguyên tính chất của lớp đất mới bồi tụ, có nhiều lớp xen

kẽ, nền đáy gồm bùn lẫn sét và cát mịn. Phía trong rừng nền đáy còn đƣợc phủ một lớp

xác thực vật tạo nên lớp mùn hữu cơ giàu dinh dƣỡng [5].

• Về sinh thái: RNMXT có vai trò cố định phù sa để tạo nên các cồn bãi mới,

tạo nguồn năng lƣợng sơ cấp, làm vƣờn ƣơm và cung cấp thức ăn dồi dào cho các loài

thủy sinh, đồng thời là nơi cƣ ngụ của nhiều loài động vật hoang dã, trong đó có nhiều

loài thú nƣớc quý hiếm: mèo biển, cáo biển, rái cá ...

RNMXT là nơi có đa dạng sinh học cao thể hiện qua số lƣợng lớn các loài động vật,

thực vật, vi sinh vật. Theo số liệu của Sở thủy sản Nam Định ở RNMXT có 104 loài thực

vật nổi, mùa khô 1996 có kết quả thu mẫu của 37 loài thuộc 4 ngành tảo:

+ Ngành tảo Silic (Bacillariophyta): 15 chi, 27 loài chiếm 73%

+ Ngành tảo Giáp (Pirophy): 2 chi, 4 loài, chiếm 10.8%

+ Ngành tảo Lam (Cyanophyta): 2 chi, 3 loài, chiếm 8%

+ Ngành tảo Lục (Chlorophyta): 3 chi, 3 loài, chiếm 8%

Hai chi có số loài cao thuộc ngành tảo Silic, các chi còn lại chiếm từ 1–2 loài.

Kết quả thu mẫu mùa mƣa (1996) đƣợc 40 loài theo tỷ lệ:

+ Ngành tảo Silic: 15 chi, 30 loài, chiếm 75%

+ Ngành tảo Giáp: 1 chi, 5 loài, chiếm 12.5%

+ Ngành tảo Lam: 2 chi, 2 loài, chiếm 2%

+ Ngành tảo Lục: 3 chi, 3 loài chiếm 7.5%

Số tảo Giáp, tảo Lục, tảo Lam không có giá trị làm thức ăn cho thủy hải sản chiếm 25%

tổng số loài. Mặc dù số loài phát hiện ở trên còn thấp nhƣng lại có mặt nhiều loài ƣu thế

ở vùng cửa sông ven biển, ngành tảo Silic chiếm tỷ lệ lớn tạo sinh khối lớn làm thức ăn

phong phú cho các loài động vật thủy sinh.

Giá trị bảo tồn đa dạng sinh học của vƣờn quốc gia thể hiện qua các mặt sau:

+ Là nơi dự trữ nguồn gen, là di sản thiên nhiên cho hậu thế

5

+ Là hiện trƣờng nghiên cứu khoa học trong nƣớc và quốc tế

+ Là cơ sở giáo dục môi trƣờng cho cộng đồng về bảo tồn thiên nhiên và

phát triển bền vững.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC

1.2.1. Đặc điểm hình thái

Tảo silic có cấu tạo đơn bào sống đơn độc hay thành tập đoàn dạng palmella,

dạng sợi, dạng chuỗi, dạng zic-zắc, dạng dải, dạng sao, dạng ống, dạng cây... Kích thƣớc

thay đổi từ vài μm đến 1 mm. Tế bào có nhân lƣỡng bội. Tế bào có cấu trúc màng độc

đáo gọi là vỏ giáp. Vỏ gồm hai lớp, lớp trong là pectin và lớp ngoài dioxyt silic (SiO2

.7H2O).

Tảo silic có nhiều hình dạng khác nhau: hình hộp tròn, hình trụ, hình trứng, hình

hộp nhọn hai đầu, hình que, … Hai mảnh vỏ nhƣ hai cái nắp của một cái hộp nhỏ lắp

khít vào nhau, bên trong chứa tế bào chất. Vỏ trên (epitheca) lớn, vỏ dƣới (hypotheca)

nhỏ. Bề mặt của mỗi mảnh vỏ gọi là mặt vỏ của tế bào, nhƣ vậy mỗi tế bào có 2 mặt vỏ

(valve). Phần vỏ thân của hộp là vòng vỏ (girdle), phần vỏ trên và vỏ dƣới lồng vào nhau

tạo thành đai nối (connesting band) hoặc đai vòng. Ngoài ra nắp vỏ còn có những phần

đặc biệt nhƣ: vân (stria) hay vạch đai song song, sƣờn (costa) là những vân dài xếp thành

hàng song song hay xuyên tâm [3]. Nhiều tảo silic có cấu trúc hoa văn trên mặt vỏ. Hoa

văn cấu tạo bởi các lỗ nhỏ hay các rãnh nhỏ. Có khi có các khe hở. Các hoa văn này nếu

xếp đối xứng theo trục dọc kiểu lông chim thì thuộc bộ tảo silic lông chim, những loài

thuộc loại này mặt vỏ không có hình tròn.

Ngoài cấu trúc vách tế bào, thể màu, chất dự trữ và bào tử ngủ cũng là đặc điểm

đặc trƣng cho một số phân loại. Thể màu thƣờng có dạng bản hay dạng hạt màu vàng

hoặc vàng nâu. Có thể có hoặc không có chất dự trữ. Nếu có, chúng thƣờng là các giọt

dầu hình cầu màu sang hơi vàng hoặc xanh lam. Bào tử ngủ là hình thức thích nghi với

các điều kiện môi trƣờng không thuận lợi của một số loài thuộc các chi Chaetoceros và

Melosira. Bào tử ngủ hình thành bên trong tế bào dinh dƣỡng, nó cũng có hai mảnh vỏ

lắp lại với nhau thành hình cấu hay hơi dẹt, trên bề mặt có gai hay nhẵn. Hình dạng và gai

của bào tử ngủ là các đặc điểm đặc trƣng cho loài.

Tế bào chất trong suốt, tạo thành lớp mỏng nằm bên dƣới thành tế bào hay tạo

thành khối nhỏ ở trung tâm với nhiều sợi sinh chất nối với vách tế bào, còn lại của

khoang tế bào là không bào. Tảo silic có màu vàng lục hay vàng nâu. Thành phần sắc tố

có diệp lục a, c, caroteen và xanhthophin. Loại tảo silic trung tâm có sắc lạp hình hạt,

hình đĩa nhỏ, gồm nhiều đĩa. Loại tảo silic lông chim có sắc lạp lớn hình phiến chữ H hay

6

hình sao, có 1-2 cái. Một số ít có nhiều đĩa nhỏ. Không có hạt pyrenoid, một số ít có hạt

pyrenoid trần, không có bao tinh bột. Sản phẩm đồng hóa từ CO2 là lipid và

chrysolaminaran, thƣờng tụ lại thành các giọt chất dự trữ màu da cam. Ngoài ra còn có

các giọt volutin màu xanh da trời. Trong tế bào tảo silic còn thấy có ty thể, bộ máy Golgi,

các tấm thylakoid quang hợp, lục lạp (chloroplast)...[2].

1.2.2. Đặc điểm phân bố và vai trò của tảo silic

Tảo silic có số loài nhiều thứ hai sau tảo lục. Chúng phân phân bố hết sức rộng rãi

trên trái đất: trên thân cây ở đỉnh núi cao, trên đất, đá ẩm, mọi thủy vực nƣớc ngọt, nƣớc

lợ, nƣớc mặn. Có thể gặp tảo silic ở đáy biển sâu hàng nghìn mét. Trong nƣớc tảo silic

phân bố phong phú nhất ở độ sâu 5-30m nhƣng sinh khối lại thƣờng đạt mức cao nhất ở

độ sâu 20-50m. Trong thực vật phù du tảo silic chiếm 60-70% có khi lên tới 84% về số

loài cũng nhƣ sinh vật lƣợng. Tuy tảo silic không phải là những đối tƣợng có giá trị kinh

tế có thể khai thác phục vụ ngay cho đời sống con ngƣời nhƣng nếu thiếu chúng sẽ không

có nguồn thức ăn hữu cơ ban đầu, mọi nguồn lợi hải sản đều không có cơ sở để tồn tại.

Nhƣ vậy có thể nói tảo silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp, hàng năm thực vật

phù du (chủ yếu là tảo silic ) tạo ra 19 tỷ tấn chất hữu cơ nuôi sống 5 tỷ tấn động vật

không xƣơng sống [1].

Trong nuôi trồng thủy sản nói chung, màu nƣớc có vai trò rất quan trọng trong

việc tham gia hình thành chuỗi thức ăn tự nhiên, hệ lọc sinh học, ổn định các thông số

môi trƣờng…Tảo silic góp phần tạo màu nƣớc tốt (Chaetoceros, Skeletonema tạo màu

nƣớc vàng vỏ đậu xanh). Sự hiện diện các loài vi tảo này trong các ao - hồ nuôi thủy sản,

thể hiện môi trƣờng rất nhiều thức ăn tự nhiên và phong phú về chủng loại, cân bằng các

yếu tố môi trƣờng và các phƣơng trình sinh hóa - sinh lý, ít các loài tảo độc rong độc,

giàu dƣỡng chất. Trong công nghiệp nuôi tôm sú, tảo silic là một trong những loài tảo

phù hợp về kích thƣớc và chất lƣợng dinh dƣỡng cho ấu trùng tôm. Tảo có tốc độ tăng

trƣởng nhanh, có thể nuôi trong điều kiện nhân tạo, trong các trại sản xuất giống. Có rất

nhiều loại thức ăn để ƣơng nuôi ấu trùng tôm sú, riêng tảo silic và tảo lục đã có tới hơn

15 loài [10].

Qua nhiều năm xác của tảo silic tạo nên các mỏ diatomid lớn do cấu trúc silic của

nắp vỏ không bị phân hủy. Diatomid có tính chất nhẹ, xốp, trơ với axít nên đƣợc ứng

dụng rộng rãi để chế tạo các sản phẩm cách điện, cách nhiệt, chất đệm trong thuốc nhuộm

… các tầng diatomid còn là cơ sở để xác định tuổi của các địa tầng và lịch sử của vỏ trái

đất từ cuối kỉ Jura cho đến nay. Tảo silic cũng góp phần tạo nên hiện tƣợng “nƣớc nở

hoa” làm hƣ hỏng nguồn nƣớc sạch [6].

7

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Vi tảo đƣợc phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định thuộc các chi

Chaetoceros và Navicula.

2.1.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm thu mẫu: rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định.

Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 01/2010 tới tháng 12/2010

Hình 2.1. Các điểm lấy mẫu đƣợc định vị trên bản đồ

2.1.3. Hóa chất

Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ

NaNO3 TQ n-Hexan Scharlau

NaH2PO4 TQ CuSO4.5H2O TQ

Na2H PO4 TQ ZnSO4.7H2O TQ

Na2SiO3 TQ KH2PO4 TQ

Na2EDTA.2H2O Merk K2HPO4 TQ

FeCl3.6H2O TQ Na2MoO4.2H2O TQ

Iso propanol Merk MnCl2.4H2O TQ

NaCl Merk CaCl2.2H20 TQ

n-Butanol Merk Methanol Merk

8

2.1.4. Máy móc và dụng cụ

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các máy móc, dụng cụ có tại phòng

Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng khác thuộc Viện Vi sinh vật

và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội: kính hiển vi quang học (Olympus,

Zeiss); kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus); máy sắc ký lỏng cao áp (High

Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, Đức); máy ly tâm Sigma, Mỹ; máy

đo pH (Osi, Pháp), máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ); bé ®iÖn di n»m

(Bio-Rad, Mü) ; Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., (Anh).

2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY

Trong nghiên cứu việc chọn lựa môi trƣờng nuôi vi tảo, chúng tôi sử dụng các

môi trƣờng nuôi tảo nhƣ F/2, ESM, ASW [9].

Môi trường F/2

NaNO3 7.5 mg

NaH2PO4 0.6mg

Vitamin B12 0.05g

Vitamin H 0.05g

Vitamin B1 10g

Na2SiO3 1mg

F/2 metal 0.1ml

Nƣớc biển 99.5ml

F/2 Metal

Na2EDTA.2H2O 440mg

FeCl3.6H2O 316mg

CoSO4.7H2O 1.2mg

ZnSO4.7H2O 2.1mg

MnCl2.4H2O 18mg

CuSO4.5H2O 0.7mg

Na2MoO4.2H2O 0.7mg

Môi trường ASW ( pH =7.5)

KNO3 0,5 g

MgCl2 0,9g

MgSO4 0,125g

CaCl2 0,44g

K2HPO4 0,025g

Fe-EDTA 0,003g

NaHCO3 2,1g

TE 1ml

NaCl( 30%) 300ml

Nƣớc cất 700ml

Môi trường ESM

NaNO3 12 mg

K2HPO4 0,5mg

B12 0,1g

B1 10g

Fe-EDTA 10g

Mn-EDTA 25,9g

Nƣớc biển 95 ml

Nƣớc chiết đất 5ml.

9

2.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI TẢO

2.3.1. Phƣơng pháp phân lập bằng micropipette

Mục đích của việc phân lập bằng micropipet [11] là hút một tế bào từ mẫu, đặt tế

bào vào một giọt vô trùng mà không làm tổn thƣơng tế bào, lấy lại tế bào và chuyển nó

vào giọt vô trùng thứ hai. Quá trình này đƣợc lặp lại cho tới khi tế bào tảo đơn đƣợc giải

phóng khỏi các vi sinh vật nguyên sinh khác và cho vào môi trƣờng nuôi cấy thích hợp.

Quá trình này làm cân bằng giữa hai nhân tố: tế bào bị tổn thƣơng quá mức do sai sót khi

thao tác và phân lập hoàn toàn một tế bào đơn. Với những tế bào khỏe thì việc thao tác

lặp đi lặp lại có thể không gây tổn thƣơng đến tế bào, tuy nhiên, đối với những tế bào

nhạy cảm tổn thƣơng tế bào là một vấn đề quan trọng.

Sự phân lập bằng micropipette thƣờng đƣợc hiện với pipette Pasteur hay kính

mao dẫn. Pipette Pasteur có thể làm nóng trong lửa, giãn và nở. Pipette đƣợc giữ trong

một tay, tay còn lại giữ kẹp để hỗ trợ phần đầu mút. Xoay pipette để đảm bảo pipette

đƣợc làm mềm và nóng lên tại điểm nóng chảy. Khi vùng nóng chảy đƣợc làm nóng đều,

dùng kẹp kéo giãn đầu mút để đƣợc ống mảnh. Nếu ta kéo quá nhanh hoặc kéo ở bên

ngoài ngọn lửa thì phần kéo giãn có thể bị gãy và cháy, kết quả thu đƣợc sẽ không nhƣ

mong muốn. Đầu mút có thể thẳng hay cong, đầu cong thì thƣờng có lợi khi thu tế bào từ

các đĩa sâu nhƣng pipette đầu thẳng thƣờng dễ dàng sử dụng khi tế bào bị bắt giữ nhỏ vào

giọt vô trùng. Sau đó sử dụng kẹp cắt đi một chút đầu mút cho bằng, nếu đầu mút mà bị

vỡ hay mép lởm chởm thì pipette đó bị loại bỏ vì nó không thể hút tế bào đích một cách

chính xác.

Kính hiển vi là dụng cụ cần thiết cho việc quan sát và phân lập tế bào. Mẫu chứa các loài

đích đƣợc đặt trên tiêu bản lõm, các giọt vô trùng đƣợc nhỏ lần lƣợt vào các ô lõm kế tiếp

của tiêu bản trƣớc khi quá trình phân lập đƣợc tiến hành. Một quả bóp cao su nhỏ mềm

linh hoạt đƣợc gắn vào đầu trên của pipette, đầu micropipette hút nột lƣợng nhỏ nƣớc vô

trùng có tác dụng nhƣ một dung dịch đệm. Đặt đầu của micropipette gần với sinh vật

đích, bóp nhẹ quả bóp để cho hoạt động mao dẫn kéo tế bào lên và vào trong đầu

micropipette. Sau khi bắt giữ tế bào thành công, đầu của micropipette đƣợc di chuyển

khỏi mẫu và đƣợc ngâm vào một giọt vô trùng kế tiếp, sau đó nhẹ nhàng di chuyển vào

miệng ống, tiếp tục chuyển nó vào giọt vô trùng khác khi quan sát thu hoàn toàn đƣợc tế

bào đơn và sạch thì chuyển vào các lọ Penicillin chứa môi trƣờng nuôi cấy trong điều

kiện thích hợp.

2.3.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên đĩa thạch

10

Quá trình phân lập đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến [12].

Nhỏ 100 dịch mẫu vi tảo trên đĩa thạch chứa môi trƣờng thích hợp cho vi tảo có bổ sung

khoáng và vitamin. Sau 5 - 7 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng với cƣờng độ ánh sáng từ 10

000 - 20 000 Lux theo quang chu kỳ là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối. Sau đó các khuẩn

lạc đƣợc tách riêng rẽ và quan sát dƣới kính lúp Olympus. Các khuẩn lạc thuần khiết

đƣợc cấy truyền sang ống thạch nghiêng và bảo quản ở 4oC đƣợc dùng trong những

nghiên cứu tiếp theo.

2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA VI TẢO

Để xác định khả năng sinh trƣởng của tảo chúng tôi tiến hành nuôi trực tiếp tảo

trên các môi trƣờng nuôi cấy, cách xác định có thể dùng các phƣơng pháp nhƣ đếm tế

bào, xác định độ đục (OD), xác định trọng lơƣợng khô, xác định hàm lơƣợng

chlorophyll... Trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện có chúng tôi đã sử dụng phƣơng

pháp đếm tế bào.

Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer

Cấu tạo buồng đếm Neubauer

Buồng đếm Neubauer là một tấm thuỷ tinh dày khoảng 3mm, đơƣợc chia làm ba phần.

Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc. Phần giữa đƣợc chia đôi do một

rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0,1mm, tạo ra hai ngăn đếm giống nhau. Mỗi ngăn

đếm hình vuông, đơƣợc chia thành 16 ô lớn. Mỗi ô lớn lại đƣợc chia làm 16 ô nhỏ. Mỗi 1

ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều cao 1/10 mm.

Mật độ tế bào đƣợc tính theo công thức:

D = (a / 64).106

Trong đó:

D: Mật độ tế bào (số tế bào/ml).

a: Số tế bào trung bình trong một buồng đếm.

Thao tác đếm và lập đƣờng cong sinh trƣởng:

Buồng đếm và lamen đƣợc lau sạch bằng cồn, thấm khô trƣớc khi cho dịch tảo vào.

Lamen đƣợc đặt trên buồng đếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng

ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Sau đó, dùng pipet Pasteur hút một ít dịch tảo

đã đƣợc lắc đều trƣớc và chấm vào cạnh của lamen. Dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng đếm.

11

Buồng đếm có chứa tảo đƣợc đƣơa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kích 40, thị kính

10. Đối với những mẫu đếm quá đặc không thể đếm chính xác đƣợc thì pha loãng trơƣớc

khi đếm và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả.

Đối với những loài tảo có khả năng chuyển động thì cần phải đơƣợc cố định bằng hoá

chất (lugol) hay làm yếu tế bào bằng máy lắc Vortex.

Trên cơ sở số liệu thu đƣợc qua các ngày đếm, lập đƣờng cong sinh trƣởng bằng cách đặt

trên trục tung chỉ số mật độ tế bào, đặt trên trục hoành chỉ số thời gian (ngày) nuôi tảo.

2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO

Xác định thành phần acid béo [13]

Lấy 50mg mẫu cho vào ống thuỷ tinh nút vặn (cỡ 13mm x 100mm). Alkal hoá

bằng 1,0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml

methanol và 50ml Milli- Q). Tế bào đƣợc thuỷ phân ở 100oC tại nồi nhiệt khô trong 5

phút. Sau đó làm huyền phù bằng Vortex trong 5 giây rồi tiếp tục cho thuỷ phân trong

25phút. Dịch thuỷ phân đƣợc làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Methyl hoá dung dịch alkal với

0,2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid và 55ml methanol). Sau khi methyl

hóa, giữ ở 80oC trong nồi cách thuỷ khoảng 10 phút. Dung dịch methyl hoá đƣợc bổ sung

1,25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n-hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và đƣợc trộn

đều bằng máy lắc 2000rpm trong 10 phút. Dịch nhớt phía trên đƣợc loại bỏ. Dung dịch

đƣợc bổ sung 3ml thuốc thử 4 (1,2g sodium hydroxyde trong 100ml Milli-Q) và đƣợc

trộn đều bằng tay trong 5 phút. Ly tâm ở 2,500 rpm trong 10 phút. Dịch trên cùng đƣợc

chuyển sang ống thuỷ tinh mới có nút vặn và cho bay hơi bằng khí nitrogen thông thƣờng

tới khi khô. Cuối cùng, toàn bộ dịch mẫu đƣợc làm tan với 50?l của diethyl ether 300

(hoặc acetone - 300, n-hexane). Toàn bộ mẫu đƣợc chấm vào sắc ký bản mỏng (TLC) rồi

đƣợc đặt trong bồn thuỷ tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1, v/v) trong 30 – 45

phút. Thành phần acid béo đƣợc hiện vệt bằng iot (I2) trong 30 – 45 phút. Acid béo có

cực và không cực xuất hiện nhƣ nhữngvệt xanh. Những vệt đƣợc cạo và đƣợc rửa giải hai

lần bằng diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trên máy lắc 2000 rpm trong 10

phút và ly tâm 2500 rpm trong 5 hoặc 10 phút. Dung dịch đƣợc bay hơi bằng khí nitrogen

thông thƣờng tới khi khô. Mẫu đƣợc hoà tan trở lại với 50 µl chất phản ứng 3. Dùng pipet

nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy. Sau đó đem phân tích trên máy sắc ký khí (gas

chromatography).

Công thức tính kết quả:

12

[As ] 1[ ]

[As ]

pC x Cst x

t R

Trong đó : C : là nồng độ acid béo có trong mẫu

[Cst] : chất chuẩn

R : Độ thu hồi của phƣơng pháp

[Asp ] : là diện tích trung bình cấu tử có trong mẫu

[Ast] : Là diện tích trung bình của cấu tử có trong chất chuẩn

13

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO

Các mẫu nƣớc đƣợc lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - Nam Định. Vi tảo đƣợc

nuôi cấy làm giàu trên môi trƣờng dịch thể F/2 trong các bình tam giác 50ml. Sau đó, tiến

hành cấy trải trên đĩa thạch và phân lập bằng pipette Pasteur. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng,

với cƣờng độ ánh sáng 10000 – 20000 Lux, soi và kiểm tra mẫu. Sau 8 - 12 ngày, trên đĩa

thạch xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ màu vàng nâu, tách riêng từng khuẩn lạc cho vào

các lọ Penicillin dung tích 20 ml. Với mỗi tế bào đích phân lập bằng phƣơng pháp

micropipet, nuôi cấy trong lọ Penicillin sau 15-20 ngày thấy dịch nuôi cấy trong lọ xuất

hiện màu vàng nâu.

Sau đó, tiến hành quan sát độ tinh sạch của vi tảo. Lặp lại qui trình trên cho tới

khi thu đƣợc các chủng vi tảo thuần khiết. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.1, 3.2.

Hình 3.1. Phân lập vi tảo trên đĩa thạch

Hình 3.2. Nuôi vi tảo trong các lọ

Penicillin

Sau quá trình phân lập và tuyển chọn thu đƣợc 14 chủng vi tảo silic. Các chủng

này đƣợc giữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản ở 40C để dùng cho các nghiên cứu

tiếp theo. Tiếp tục nuôi giữ giống tảo trong các bình tam giác dung tích 100 ml.

Hình 3.3. Nuôi sinh khối tảo trong bình tam giác dung tích 100ml

14

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

CÁC CHỦNG VI TẢO SILIC

Để mô tả và xác định tên của các chủng vi tảo, chúng tôi đã dựa vào một số đặc

điểm hình thái của chúng. Các hình thái này đƣợc phát hiện căn cứ vào khả năng phát

triển của vi tảo cần nghiên cứu trên môi trƣờng chuẩn đoán đã đƣợc thừa nhận hiện nay

và sử dụng các phƣơng pháp soi kính hiển vi quang học và đo kích thƣớc tế bào.

Kết quả: qua việc so sánh hình thái quan sát đƣợc trên kính hiển vi quang học với

khóa phân loại “Tảo silic phù du biển Việt Nam” [6] và “The plankton of south Viet Nam

Fresh Water and Marine Plankton” [8], chúng tôi đ ịnh danh sơ bô các ch ủng vi tảo silic

phân lập đƣợc ở rừng ngập mặn Xuân Thủy gồm có 7 chi va 10 loài. Kêt qua đƣơc thê

hiên trên biêu đô hinh 3.4

7.69%

7.69%

7.69%15.38%

23.08%

7.69%

7.69% 23.08% Chaetoceros

Gyrosigma

Amphiprora

Navicula

Nitzschia

Melosira

Skeletonema

Chưa định danh

Hình 3.4. Các chi tảo silic phân lập đƣợc ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định

Hiện nay hai chi tảo silic Chaetoceros và Navicula đƣợc ứng dụng rộng rãi làm thức ăn

chính cho ƣơng nuôi ấu trùng của các loài thủy sản có giá trị kinh tế cao nhƣ: hầu, tu hài,

ngao, vẹm, bào ngƣ, cá măng…. Các chi vi tảo trên có thể đƣợc nuôi trên môi trƣờng

nhân tạo tinh khiết hoặc nuôi trên các môi trƣờng tự nhiên có bổ sung thêm các thành

phần khoáng. Đặc biệt, chúng sinh trƣởng trong môi trƣờng sinh thái ngập mặn nên khả

năng thích ứng với sự thay đổi của môi trƣờng là rất cao. Chính vì vậy, tiến hành nghiên

cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và chi Navicula để xác

định tiềm năng ứng dụng cho nuôi trồng thủy hải sản và bảo tồn nguồn gen vi tảo này.

3.2.1. Đặc điểm hình thái

3.2.1.1. Chi Chaetoceros

15

Ngành: Heterokontophyta

Lớp: Bacillariophyceae

Bộ: Centrales

Họ: Chaetocerotaceae

Chi: Chaetoceros

Chaetoceros C2

Tế bào nhỏ thƣờng sống riêng lẻ, đôi

khi cũng nối thành chuỗi 2, 3 tế bào. Mặt

vỏ tế bào hình bầu dục gần tròn hơi lồi

lên. Mặt vòng vỏ rộng hình chữ nhật hoặc

gần vuông, không thấy đai nổi. Lông gai

nhỏ, dài và thẳng mọc ngay mép mặt vỏ

và vƣơn ra gần song song với mặt phẳng

vỏ. Mỗi tế bào có một thể sắc tố hình hạt

hoặc hình bản. Chiều dài tế bào 8-12 μm,

bề rộng 5-7 μm.

Chủng này mang đặc điểm của chi

Chaetoceros, nên bƣớc đầu định danh sơ

bộ chủng C2 thuộc loài Chaetoceros

muelleri [8].

Hình 3.5. Chaetoceros C2

3.2.1.2. Chi Navicula

Ngành: Hetorokontophyta

Lơp: Bacillariophyceae

Bô: Naviculales

Họ: Naviculaceae

Chi: Navicula

16

Chủng Navicula N8

Tế bào nhỏ, vỏ tƣơng đối dày,

sống riêng lẻ. Mặt vỏ tế bào hình bầu dục,

tế bào không có cấu tạo hình xƣơng

thuyền mà có dạng đối xứng hai bên theo

các trục, hai đầu thắt nhỏ lại rồi lồi ra, đầu

hình núm tròn. Rãnh dài hẹp, thẳng, hai

đầu ở chính giữa mặt vỏ, hơi phình to và

cách nhau tƣơng đối xa.

Mỗi tế bào có hai thể sắc tố dạng

bản bầu dục hoặc gần tròn. Chiều dài tế

bào 20 - 25 μm và bề rộng 9 -16 μm.

Chủng này mang đặc điểm của chi

Navicula (chi tảo hình thuyền), loài

Navicula tuscula [8]. Do vậy, ta sơ bộ xác

định chủng N8 là loài Navicula tuscula.

Hình 3.6. Navicula N8

Chủng Navicula N9

Các cá thể có tế bào tƣơng đối lớn

, vỏ dày, sống đơn độc. Mặt vỏ tế bào hình

thoi dài, hai đầu tròn. Hai đầu ở giữa mặt

vỏ phình to rõ ràng và cách nhau khá xa,

hai mặt vỏ có cấu trúc giống nhau. Chiều

dài tế bào 40-44 μm, bề rộng 8-10 μm.

Chủng này mang đặc điểm của chi

Navicula, loài Navicula radiosa [6]. Qua

những đặc điểm trên, sơ bộ xác định

chủng N9 là loài Navicula radiosa.

Hình 3.7. Navicula N9

3.2.2. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi tảo silic

Đối với mỗi chủng tảo khác nhau thƣờng có những môi trƣờng dinh dƣỡng cho sự

sinh trƣởng tối ƣu khác nhau. Sự khác nhau ở đây có thể là về số loại chất hay cũng có

thể là hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng và đối với việc nuôi cấy một chủng nào đó thì cả

hai vấn đề này đều phải đƣợc quan tâm. Một nghiên cứu khởi đầu cho một chủng tảo mới

17

đƣợc phân lập, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn ba môi trƣờng là ASW, F/2,

ESM nuôi tĩnh chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 để tìm hiểu tác

động của môi trƣờng dinh dƣỡng lên sinh trƣởng của chủng. Các điều kiện nuôi dƣỡng là

đồng đều nhau. Cứ sau hai ngày tiến hành lấy mẫu để kiểm tra một lần. Kết quả thu đƣợc

trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.8.

Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của ba chủng vi tảo silic trên các môi trƣờng khác nhau

Chủng Môi

trƣờng

Mật độ tế bào (x 106/ml)

Ngày

cấy

mẫu

Ngày

thứ 2

ngày

thứ 4

Ngày

thứ 6

Ngày

thứ 8

Ngày

thứ 10

Ngày

thứ 12

Chaetoceros

C2

ASW 0.31 1.18 9.42 19.31 43.5 67.22 31.88

F/2 0.31 0.66 4.08 11 20.71 18.36 16.21

ESM 0.31 1.12 6.66 17.31 36.48 25.37 19.97

Navicula

N8

ASW 2.5 3.5 9.2 20.2 50 32 26

F/2 2.5 4.8 13.5 31 78 48 37

ESM 2.5 5.2 15.6 43 129 98 78

Navicula

N9

ASW 3.2 8 35.2 49.6 137.6 107.2 98.2

F/2 3.2 4.8 32.8 60.8 88 43.2 33.1

ESM 3.2 8 35.2 44.8 128 68.8 53.2

Qua kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.8 và bảng 3.1 nhận thấy cả ba chủng vi tảo

Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 đều sinh trƣởng trên cả ba môi trƣờng nuôi

cấy. Trong 2 ngày đầu, chƣa thấy sự phát triển mạnh của vi tảo. Mật độ tế bào trong các

môi trƣờng tăng nhanh dần bắt đầu từ những ngày nuôi cấy thứ 4. Mật độ tế bào đạt cao

nhất trong khoảng ngày nuôi cấy thứ 8 đến thứ 10 của quá trình thí nghiệm.

Có thể nhận thấy vi tảo chủng Chaetoceros C2 sinh trƣởng tốt nhất trên môi

trƣờng ASW. Ở ngày nuôi cấy thứ 10, mật độ tế bào đạt mức cao nhất là 67.22 ×106/ml.

Ngay sau khi đạt mật độ cao nhất, mật độ tế bào giảm mạnh ở các ngày tiếp theo. Ở ngày

nuôi cấy thứ 12, mật độ tế bào trong môi trƣờng ASW chỉ còn đạt mức 31.88×106/ml,

giảm một nửa so với mật độ tế bào cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 10. Ngày nuôi cấy thứ 8,

mật độ tế bào đã đạt mức cao nhất ở môi trƣờng F/2 va ESM là 20.71×106/ml và

36.48×106/ml, mặc dù điểm sinh trƣởng cao nhất ở môi trƣờng F/2 va ESM đạt đƣợc ở

18

ngày thứ 8 nhanh hơn ở môi trƣờng F/2 nhƣng mật độ tế bào cao nhất cũng chỉ bằng một

nửa so với điểm sinh trƣởng cao nhất ở môi trƣờng ASW ở ngày thứ 10.

Chủng vi tảo Navicula N8, tại ngày nuôi cấy thứ 8, mật độ tế bào đạt mức cao

nhất ở cả ba môi trƣờng. Vi tảo Navicula N8 sinh trƣởng tốt nhất trong môi trƣờng ESM

(mật độ tế bào cao nhất đạt 129×106/ml), sau đó là môi trƣờng F/2 (mật độ tế bào cao

nhất đạt 78×106/ml)và cuối cùng là môi trƣờng ASW (mật độ tế bào cao nhất đạt

50×106/ml). Sau khi đạt mật độ cao nhất, mật độ tế bào liên tục giảm ở các ngày nuôi cấy

thứ 10 và 12.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10 12

Navicula N8

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 10 12

Navicula N9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2 4 6 8 10 12

ASW

F2

ESM

Hình 3.8. Động thái sinh trƣởng của ba chủng vi tảo silic

trên các môi trƣờng khác nhau

Chủng vi tảo Navicula N9, sinh trƣởng tƣơng đối đồng đều trong hai môi trƣờng

ASW và ESM, sinh trƣởng kém nhất trong môi trƣờng F/2. Mật độ tế bào đạt mức cao

nhất ở cả ba môi trƣờng ASW, F/2 và ESM tại ngày nuôi cấy thứ 8 lần lƣợt là

137.6×106/ml; 88×10

6/ml; 128×10

6/ml. Trên đồ thị hình 3.8 dễ dàng nhận thấy sự chệnh

lệch tại mật độ tế bào đạt mức cao nhất của hai môi trƣờng ASW và ESM là không đáng

kể, nhƣng sau khi đạt mật độ cao nhất tại ngày nuôi cấy thứ 10, ở môi trƣờng ESM, mật

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Thời gian nuôi cấy (ngày) Thời gian nuôi cấy (ngày)

Chaetoceros C2

Mật

độ

tế

bào

(x

10

6/m

l)

Mật

độ

tế

bào

(x

10

6/m

l)

Mật

độ

tế

bào

(x

10

6/m

l)

19

độ tế bào giảm nhanh chỉ còn 68.8×106/ml, giảm gần một nửa so với ngày thứ 8. Trong

khi đó, mật độ tế bào tại ngày nuôi cấy thứ 12 kết thúc quá trình thí nghiệm trên môi

trƣờng ASW vẫn đạt mật độ tế bào là 98.2×106/ml.

Môi trƣờng ASW đƣợc chọn là môi trƣờng dinh dƣỡng tốt nhất cho sự sinh trƣởng và

phát triển của vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9. Do ASW là môi trƣờng nƣớc

biển nhân tạo (nƣớc muối), hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng trong muối không đầy đủ

bằng nƣớc biển tự nhiên nhƣng điều đó lại hoàn toàn thích ứng với sự thay đổi của khu

hệ rừng ngập mặn dƣới các điều kiện khác nhau. Môi trƣờng dinh dƣỡng tốt nhất cho vi

tảo chủng Navicula N8 là môi trƣờng ESM, thay vì bổ sung các thành phần vi lƣợng môi

trƣờng ESM sử dụng nƣớc chiết đất. Chứng tỏ cả ba chủng vi tảo có sự thích nghi cao khi

các điều kiện thay đổi, điều đó mở ra tiềm năng trong ứng dụng nuôi sinh khối lớn làm

thức ăn cho nuôi trồng thủy sản.

3.2.3. Thành phần acid béo của ba chủng vi tảo silic

Bảng 3.2. Thành phần acid béo của ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8,

Navicula N9

STT Acid béo Tên thƣờng gọi

Tỷ lệ % (% tổng số acid béo)

Chaetoceros

C2

Navicula

N8

Navicula

N9

1 C4:0 Butyric acid 0.171 0.122

2 C10:0 Capric acid 0.325 0.110

3 C12:0 Lauric acid 0.642 0.197

4 C14:0 Myristic acid 1.910 9.691 3.123

5 C14:1n-5 Myristolenic acid 18.086 0.798 0.217

6 C15:0 Convolvulinolic acid 0.745

7 C15:1n-5 Hormelic acid 0.096 0.703 0.352

8 C16:0 Palmitic acid 5.532 52.557 58.303

9 C16:1n-7 Palmitoleic acid 15.232 13.694 25.290

10 C16:1n-9 Ambrettolic acid 2.200

11 C17:0 Margric acid 9.519 1.200 0.178

12 C17:1n-7 Heptadecenoic acid 1.493 0.230

20

13 C18:0 Stearic acid 1.462 3.773 1.259

14 C18:1n-7 Asclepic acid 3.744 8.623 1.934

15 C18:1n-9 Oleic acid 1.188

16 C18:2n-6 Linoleic acid 2.703 1.271

17 C18:3n-3 α-Linolenic acid 0.483

18 C18:3n-6 γ-Linolenic acid 1.122 0.351 0.109

19 C18:4n-3 Moroctic acid 0.216

20 C18:5n-3 Octadecapentaenoic acid 1.559

21 C20:0 Arachidic acid 1.048 0.797

22 C20:1n-9 Gondoic acid 0.256

23 C20:1n-7 Paullinic acid 0.099

24 C20:4n-3 Eicosatetraenoic acid 4.028

25 C20:4n-6 Arachidonic acid (AA) 7.845 0.764

26 C20:5n-3 Eicosapentaenoic acid (EPA) 24.759

27 C22:0 Behenic acid 1.044 2.077

28 C22:4n-6 Adrenic acid 0.341

29 C24:0 Lignoceric acid 0.121

Kết quả phân tích thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8,

Navicula N9 đƣợc thể hiện ở bảng 3.2, nhận thấy tỉ lệ acid béo trong cả ba chủng vi tảo

khá đa dạng.

Vi tảo Chaetoceros C2 chứa 19 loại acid béo, bao gồm 7 loại acid béo no và 12

loại acid béo không no. Trong đó, tỉ lệ acid béo không no rất cao, chiếm 76.358% tổng số

acid béo trong vi tảo Chaetoceros C2. Tỉ lệ EPA và AA cao, EPA chiếm 24.759% còn

AA chiếm 7.845% tổng số acid béo thể hiện đặc tính phổ biến của tảo silic [7,8]. Tỉ lệ

eicosapentaenoic acid (20:5n-3) trong vi tảo Chaetoceros C2 cao nhất trong tổng số các

loại acid béo: eicosapentaenoic acid chiếm 24.759% tổng số acid béo; tiếp đó đến

myristolenic acid (14:1n-5) với tỉ lệ là 18.086% và palmitoleic (16:1n-7) là 15.232%. Các

acid béo đạt tỉ lệ cao tiếp theo lần lƣợt là margric (17:0), arachidonic acid (20:4n-6) và

asclepic (18:1n-7) với tỉ lệ lần lƣợt là 9.519%, 7.845% và 3.744% tổng số acid béo trong

21

vi tảo Chaetoceros C2. Tỉ lệ EPA và AA khá cao (EPA chiếm 24.759%, AA chiếm

7.845%) có trong vi tảo Chaetoceros C2 có ảnh hƣởng rất lớn tới hoạt tính của chủng.

Cả hai chủng Navicula N8, Navicula N9 trong thành phần đều có 17 loại acid béo

không no thuộc dạng C4, C10, C12, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C22. Tuy nhiên

thành phần từng loại acid béo ở mỗi loài là khác nhau. Chủng Navicula N8 có tỉ lệ acid

palmitic (C16:0) lớn nhất chiếm 52.557%, sau đó tới acid palmitoleic chiếm 13.694%,

trong chủng Navicula N8 có chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764%.. Chủng

Navicula N9 cũng có tỉ lệ acid palmitic (C16:0) lớn nhất chiếm 58.303%, acid

Palmitoleic chiếm 25.290% và có hàm lƣợng acid oleic chiếm 1.188%. Có thể nhận thấy

trên sắc ký đồ của cả ba chủng sự xuất hiện của acid béo quan trọng là DHA nhƣng có tỉ

lệ rất thấp.

Kết quả thành phần các acid béo đƣợc thể hiện rõ hơn trên sắc ký đồ sau:

Hình 3.9. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros C2

22

Hình 3.10. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Navicula N8

Hình 3.11. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Navicula N9

Với sự đa dạng về thành phần các loại acid béo trong ba chủng vi tảo Chaetoceros C2,

Navicula N8, Navicula N9 và đặc biệt với hàm lƣợng các acid béo không no, sự có mặt

của AA, EPA và DHA đây là tiền chất trong sinh tổng hợp các chất nhƣ các hormone bao

gồm: prostaglandin, thrombosane, và leukotriene. Cả ba chủng vi tảo đều có thể ứng

dụng cho nuôi trồng thủy sản, làm tăng chất lƣợng con giống.

23

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Từ các mẫu thu thập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định, phân lập và

tuyển chọn và lƣu giữ ba chủng vi tảo ký hiệu C2 thuộc chi Chaetoceros và N8,

N9 thuộc chi Navicula. Dựa vào đặc điểm hình thái học quan sát đƣợc trên kính

hiển vi quang học và khả năng phát triển của vi tảo cần nghiên cứu trên môi

trƣờng chuẩn đoán, định danh sơ bộ ba chủng vi tảo Chaetoceros C2; Navicula

N8; Navicula N9 thuộc các loài Chaetoceros muelleri; Navicula tuscula và

Navicula radiosa.

2. Môi trƣờng ASW là môi trƣờng dinh dƣỡng tốt nhất cho sự sinh trƣởng và phát

triển của vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9 với mật độ tế bào đạt cao

nhất là 67.22 ×106/ml và 137.6×10

6/ml. Vi tảo chủng Navicula N8 sinh trƣởng tốt

nhất trên môi trƣờng ESM với mật độ tế bào cao nhất đạt 129×106/ml.

3. Chủng vi tảo Chaetoceros C2 có chứa thành phần acid béo không no quan trọng

là EPA (chiếm đến 24.759%), AA (7.845%); chủng Navicula N8 và Navicula N9

đều có tỉ lệ acid palmitic lớn nhất chiếm 52.557% và 58.303%. Chủng Navicula

N8 có chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764%, chủng Navicula N9 có

hàm lƣợng acid oleic chiếm 1.188%. Sự đa dạng về thành phần các loại acid béo

(từ 17- 19 loại acid béo) cho thấy cả ba chủng vi tảo đều có thể ứng dụng cho nuôi

trồng thủy sản, làm tăng chất lƣợng con giống.

KIẾN NGHỊ

1. Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá tác động của các chủng vi tảo silic tới sự sinh

trƣởng, phát triển của thủy sản để có thể sớm đƣa vào nuôi trồng thủy sản, nhằm

tăng chất lƣợng, tăng năng suất và giảm giá thành trong nuôi trồng thủy sản.

2. Đẩy mạnh công tác bảo tồn và lƣu giữ các nguồn gen vi tảo silic quý hiếm ở các

hệ thống rừng ngập mặn.

24

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền. 1999. Công nghệ sinh học vi tảo.

NXB Nông nghiệp.

2. Dƣơng Đức Tiến, Võ Văn Chi. 1978. Phân loại học thực vật bậc thấp. NXB Đại

học Quốc gia Hà Nội, 2:tr 109-114.

3. Lê Trọng Cúc. 2002. Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên. NXB Đại học

quốc gia Hà Nội, 2:tr 109-114.

4. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy. Hệ thống học thực vật. NXB Đại Học Quốc

Gia Hà Nội, 2002.

5. Trung tâm Bảo tồn sinh vật biển và phát triển cộng đồng (MCD), trung tâm

nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập mặn (MERC) và Cục tài nguyên nƣớc và môi

trƣờng thuộc chính phủ Autralia. Báo cáo đa dạng sinh học ở vườn quốc gia Xuân

Thủy, tr 16.

6. Trƣơng Ngọc An. 1993. Phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam. NXB Khoa học

kĩ thuật.

Tài liệu Tiếng Anh

7. A.S Carlsson, J.B van Beilen, R. Moller and D. Clayton. 2007. Micro-and Macro-

algae: Utility for industrial applications. Output from the EPOBIO project, CPL

Press, UK.

8. A.Shirora. 1966. The plankton of south Viet Nam Fresh Water and Marine

Plankton. Overseas Technical Cooperation Agency Japan

9. Fumie Kasai, Masanobu Kawachi, Mayumi Erata and Makoto

M.Wantanabe,(2004), “NIES - Collection, list of strains”, National Institute for

Environmental Studies, Japan, No. 182, pp 54 – 58.

10. Hargraves P.E. (1979). “Studies on marine plankton Diatoms. IV. Morphology of

Chaetoceros resting spores”. Nova Hedwigia Beiheft 64: 99-120.

11. L. K. Medline and I. Kaczmarska. Evolution of the diatoms (2004),.

“Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic

revision”. Phycologia, Vol. 43 (3), pp. 245-270.

25

12. Makoto shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika Takamura,

Tokujiro Adia and Masayasu Nakano (1989), “Development of a Solid medium

for Growth and Isolation of Axenic Microcystis Strains (Cyanobacteria) ”, Appl

Environ Microbiol. 55(10): pp. 2569-2571.

13. Miller L.T (1982), "Single derivatization method for routine analasyis of

bacterial whole cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids". J. Clin.

Microbiol.,16. 584-586