1

Autoantitestek vizsgáló módszerei, HLA tipizálás

22

Autoantitestek

• Természetes– IgM> IgG, IgA

– Alacsony affinitás

– Magas szérum koncentrációt is elérhet

– • Polireaktív

– • CD5 + B1 sejtek

• Patológiás– IgG, IgA v. IgM

– Nagy affinitás

– Magas szérum cc. (mg/ml)

– Specifikusabb

– B2 sejtek

33Natural autoantibodies reactive with glycosaminoglycans in rheumatoid arthritis. György B et al. Arthritis Res Ther. 2008;10(5):R110.

Természetes autoantitestek RA-ban

4

Hősokk fehérjék hsp65, hsp70, hsp90, ubiquitinEnzimek aldoláz, citokróm- c, SOD, NAPDHSejt membrán komponensek β2-microglobulin, β2 spectrin,

acetilkolin receptorCitoplazma komponensei , citoszkeletális elemek aktin, miozin, tubulin, mioglobin,

myelin bázikus proteinSejtmag komponensek DNS, hisztonokPlazma fehérjék albumin, IgG, transzferrinCitokinek IL-1, TNF, IFNHormonok thyreoglobin, inzulin

Természetes autoantitestek által felismert antigének („immunológiai homunculus”)

5

Autoantitestek kimutatásának szerepe lehet

1. A betegségek patomechanizmusának jobb megértésében2. A diagnózisban3. Prognózisban, rizikócsoportok megjelölésében4. A betegség aktivitásának megítélésében5. Terápia eredményességének megítélésében6. Több kórkép együttes előfordulásának (overlap) megítélésében

6

Autoimmun betegségek

Szisztémás

SLERASclerodermaSjögren szindrómaDermato/polymyositisKevert kötőszöveti betegség

Szerv specifikus

Myasthenia gravisHashimoto thyreoiditisBasedow-kórCoeliakiaIDDMAddison-kórPrimer biliáris cirrózisGoodpasture-szindróma

7

Az autoimmun betegségek kivizsgálásának menete

Feltételezett autoimmun betegség klinikai tünetek alapján

SLE szerű tünetek pl.:„pillangószerű” arcpírPleuritisNephritisIzületi fájdalmakSzív panaszokNeurológiai tünetek

Antinukleáris antitest (ANA)Anti-dsDNS, anti-Smith antitest, kromatin ellenes antitest, anti-C1q antitest +

SLE

Estére fokozódó izomgyengeség, kettőslátás, nyelészavar

Acetil-kolin receptor ellenes antitest +

Myasthenia gravis

Szemszárazság. szájszárazság

Anti-SSA illetve anti-SSB ellenes antitest +

Sjögren szindróma

Reggel tapasztalt izületi merevség, fájdalom, duzzanat, mozgáskorlátozottság

Emelkedett süllyedés, C-reaktiv protein, ANA, RF pozitivitás, anti-ciklikus citrullinált peptid (CCP) ellenes antitest+

Rheumatoid arthritis

8

Horváth-L: Clin Exp Rheumatol 2001, 667

Szisztémás lupus erythematosusImmunkomplex betegségek prototípusa

Prevalencia nők körében 1:800-1:1000

Utóbbi években az ismert SLE-s betegek száma nőtt világszerte

9

Szisztémás lupus erythematosusImmunkomplex betegségek prototípusa

Autoantitestek:Anti DNS (kettős szálú DNS) Rheumatoid faktor (RF)Vvt elleni Thrombocita elleni Beta 2 glikoprotein I elleni Anti C1q

Gyakori a cryoglobulinaemia: azaz olyan általában immunglobulinokból álló komplexek, melyek alacsony hőmérsékleten kicsapódnak a szérumból

Számos különböző autoantitestSzínes klinikai képPl: vese, kp. Idegrendszer, bőr, ízület,hematológiai érintettség, Raynaud sz.

10

Ideális laboratóriumi aktivációs marker a betegség aktivitásának megítélésére

Anti-DNS AAT és komplement szint együttes változása:

Prognosztikus faktor

Terápia hatékonyságának követésére alkalmas

C3, C4, CH50

anti-dsDNS

rosszabbodás javulás

kezelés Prognózis!

11

• Screening tesztek:

– Direkt immunfluoreszcencia a betegből vett szövetmintán

– Indirekt immunfluoreszcencia: humán Hep2 sejttenyészetenpl. antinukleáris antitest (ANA) pozitivitás meghatározására(az autoantitest specifikus mintázatot ad a sejten belül (nukleáris, nukleoláris, centromer, citoplazmatikus, mitokondriális stb mintázat)

• Antigén specifikus vizsgálatok:

A screening teszt eredménye és a klinikai kép alapján antigénspecifikus ELISA, Western blot, vagy radiális immundiffúziómódszerével.

Cryoglobulinok kimutatása

Autoantitestek kimutatására használt főbb módszerek SLE-ben

1212

Homogén magfestődésPl.Anti- dsDNS vagy anti-hisztonPl:SLE

Indirekt immunfluoreszcencia szerepe a diagnózisban (Hep2 sejtekben)

Foltos magfestődésAnti- RNP(nukleáris riboprotein)pl. SLE, Sjögren, vagy normál is!

Perifériás „Rimmed „ magfestődésPl.anti-hiszton Pl. SLE

Nukleoláris magfestődésPl. anti-Topoizomeráz IPl. Scleroderma

13

Milyen módszerekkel lehet az egyes autoantitesteket kimutatni?

14

ELISA elve: minden antigén specifikus AAT mérése külön kit-ben

Menete:1. Antigénnel fedett ELISA lemez2. Blokkolás3. Szérum 100x hígításban4. Mosás

StandardMinták

5. anti-humán IgG / IgM- HRP6. Mosás7. Színreakció mérése

15

Western-blot

Az anti-nukleáris antitest egy összefoglaló név, amennyiben az ANA pozitív specifikálni kell, hogy melyik antitest

16

Radiális immundiffúzió (Mancini)

17

Cryoglobulin kimutatása

1. Keringö immunoglobulin, mely 37 fok alatti hömérsékleten precipitálódik, felmelegítve ismét feloldódik

2. Autoimmunbetegségeken kívül malignus haematológiai betegségekben illetve fertözésekben pl. hepatitis C is jelen lehet. Alcsoportjai: I. monoclonalis IgG, II polyclonalis IgG és monoclonalis IgM, III polyclonalis IgM rheumafaktor

3. Meghatározás régen: 37 °C-on serumot szeparáljuk, majd 4 °C 2–7 napig tartjuk, ha precipitátum képzödik, 4 °C-on centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk és fiziológiás só oldattal pótoljuk. Ha 37 °C-on a precipitátum feloldódik, cryoglobulin volt

Ma: immunelektroforézis vagy immunfixáció, mellyel a cryoglobulin alosztályát is meg lehet határozni

18

Rheumatoid faktor (RF)

SLE: a betegek 30%-a szeropozitív, sz autoimmun betegségek közül rheumatoid arthritisben fordul elő leggyakrabban, a betegek 80%-ában

19

Reumatoid faktor kimutatása I.

1. Latex agglutinációs teszt

Latex gyöngy

+ beteg szérumában RF

Agglutináció

20

Reumatoid faktor kimutatása II.

2. Nephelometria

21

Az autoantitestek prediktív ereje SLE-ben

1. Bizonyos antinukleáris és anti-Ro (SSA) antitestek akár 10 évvel az első tünetek előtt

2. Anti-natív vagy dsDNA antitestek: átlag 2.5 évvel a tünetek előtt, a betegek 55%-ában

3. Anti-ribonukleoprotein és anti-Smith (röviden anti-Sm): néhány hónappal a tünetek előtt

The Lancet 2004;363:1544-46.

Prognózis!

2222

Rheumatoid arthritis

Felnőtt lakosság körében 1:100 prevalencia

Az izület destrukciójával járó autoimmun betegség

Szinoviális membrán gyulladása

Autoantitestek: ANA, anti-ciklikus citrullinált peptid, rheumatoid faktor (RF)

2323

Nincs citrullin tRNS, polipeptidekben arginin alakulhat citrullinná

Peptidilarginin deimináz (PAD) enzimek segítségével

Citrullinálódhat pl: fibrin, vimentin, enoláz stb.

Citrullináció

2424

Anti- ciklikus citrullinált peptid (anti-CCP)

Az anti-CCP kimutatása különösen korai RA-ban hasznos:

Diagnosztikus és prognosztikus faktor

A betegség során többnyire szintje nem változik

Nem korrelál a betegség aktivitásával

25

Szervspecifikus autoimmun betegségek

Basedow- kór

TSH receptor elleni

AT

Pemphigus

desmoglein elleni

AT

Myasthenia gravis:

ACh receptor ,

MuSK, ryanodin receptor, titin AT

26

Radio-receptor immunoassay (RRA)

Pl. anti-AChR AAT, anti-MuSK AATv. anti-TSH AATkimutatása (pmol vagy annál kevesebb)

Gamma-számláló

Az immunkomplexek centrifugálva a cső aljára kerülnek, ezt mérjük

27

HLA tipizálás

28

MHC I

MHC I minden magvas

sejt felszínén expresszálódik

MHC I fiziológiás funkció: az APC

felszínén „mutat be” endogén antigént

CD8 T sejteknek (beta 2

mikroglobulinnal együtt)

gyulladás során expressziója

fokozódik (pl. interferonok hatására)

29

MHC II

MHC II antigén prezentáló

sejtek felszínén expresszálódik

MHC II fiziológiás funkció: az APC

felszínén „mutat be” extracelluláris antigént

Pl. interferonok hatására nő az expressziója

30

• Poligénes

• Polimorf

• Kodomináns

Öröklődés

31

HLA gének terméke kodominánsan expresszálódik, haplotípusok öröklődnek

HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-B HLA-C HLA-A

Apai 6-os kromoszóma

HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-B HLA-C HLA-A

Anyai 6-os kromoszóma

15-öskromoszóma

MHC II MHC I

β2 mikroglobulin

32

HLA rendszer nomenklatúrája

Régi nomenklatúra: szerológia alapú –HLA után egy vagy több betű a lókusz megjelölésére pl. HLA-B, HLA-DR. Allél megjelölés még egy szám pl. HLA-B27, HLA-B7.

2 évente megújuló, nevezéktan, mely genetikai vizsgáló módszerekre épülve sokkal precízebb megjelölést tesz lehetővé: az adott HLA lókuszon az adott allél: HLA+ betű+*+4 jegyű számHLA-B*0801

33

• HLA polimorfizmus variánsok (allotípusok) meghatározása.

• Transzplantáció esetén donor-recipiens hisztokompatibilitási viszonyainak egyeztetése.

• Hisztokompatibilitási antigénekkel szembeni szenzitizáció fokának nyomon követése.

• Autoimmun betegségekre predisponáló haplotípusok kimutatása.

A HLA tipizálás felhasználása

34

• Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki) tipizáló savók + lymphocyták

• Panel reaktív antitest (HLA szenzitizáció fokának meghatározása)

• Keresztreakció (donor sejtjei + recipiens savó)

HLA tipizálás 1. – Szerológiai módszerek

35

HLA tipizálás Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki)

36

HLA tipizálásKevert limfocita kultúra (MLC)

Csak II. osztályú antigének kimutatására

HTC: human T cellTranszplantáció előtt negatívnak kell lennie a donor és recipiens T-sejtjeinek vizsgálata során!

37

HLA tipizálás Molekuláris biológiai módszerek

• Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP)

• Szekvencia specifikus oligonukleotid szonda (PCR-SSOP)

• Szekvencia specifikus primerek alkalmazása PCR vizsgálathoz

• Szekvencia alapú tipizálás (SBT)-PCR majd szekvenálás

lsd. jövő félév Genetika gyakorlatok

3838

Szövet és szerv transzplantáció

Vese transzplantáció esetén: mind HLAI, mind HLA II antigének fontosak, az utóbbiból HLA-DR antigén elsőrendű szerep

Csontvelő transzplantáció:fő hisztokompatibilitási antigének egyezése a legfontosabb

1. kérdés: Csontvelő transzplantáció esetén a vércsoportantigének egy része is fontos , de a fő vércsoport különbség ebben az esetben nem akadály. MIÉRT?

2. kérdés: Gyakran az ideális donor a HLA azonos testvér. Miért lehet, hogy a testvér sokszor jó donor lehet?

39

HLA-rendszer és a betegségek kapcsolatának rendszere

Klinikai állapot Laboratóriumi teszt Megjegyzés

Bechterew-kór HLA-B27 A betegek közel 98%-ban jelen van, a betegségmentes kaukázusi populáció 7%-ában is.

Narcolepsia HLADR2 (HLA-DQB1*0602) Közel az összes betegben, normál kaukázusiak 25%-ában is. Hiánya a betegséget valószínű kizárja

IDDM HLA-DQ2 Szoros asszociáció kb 80%

Rheumatoid arthritis HLA-DRB1 HLA-DR4 70%-ban betegekben-prognosztikus

Apasági vizsgálatok HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP, -C4, -C2

Polimorfizmus vizsgálatokkal kiegészítve

Erdei Anna: Immunológiai módszerek

4040

Súlyos Graft-versus host betegség kialakulásának valószínűsége különböző számú HLA mismatch-ek esetén vese transzplantációt

követően

Petersdorf EW. Et al Curr. Opinion Immun (1999) 11: 121

41

Bechterew kór klinikai és radiológiai kép

42

Gyulladásos derékfájdalom

Többnyire 40 év alatt fokozatosan kezdődő

Reggel fokozott

Gyakran nyugalomban fokozott

Fizikai aktivitás csökkenti

Leggyakoribb panaszok, labor leletek

Süllyedés, CRP, RF negatív

Autoantitest termelés nem jellemző!

43

A betegség progressziója

4444

Eset 1.

-20 éves férfi, korábban betegsége nem volt-ügyeletbe jön, hirtelen kialakult jo. térdfájdalom, ami mozgatásra fokozódik, a térde duzzadt-trauma nem történt-labor: magas süllyedés, serum RF, anti-CCP norm.-folyadékot a térdéből leszívják, NSAID-ot kap-1 év mulva jobb szem iritis miatt jelentkezik. Elpanaszolja, hogy bár már a térde nem fáj, erős derékfájdalma szokott lenni, gerince merev-HLAB27 pozitív

Mi lehet a diagnózisa?

4545

Labor: anti ds DNS: emelkedett RF:emelkedettanti-cardiolipin AT emelkedett

27 éves nő keresi fel a nőgyógyászati szakrendelést:graviditás 4. hónap, spontán abortusz

ízületei fájnak, szájában fekélyek alakultak ki mindkét oldalon lábszárközépig ujjbenyomatot tartó ödéma

arcon pillangóalakú bőrpír

Eset 2.

Diagnózis?

4646

Eset 3

35 éves nő keresi fel a reumatológiai ambulanciát: fő panasza: kezek, lábak, vállak hónapok óta tartó

fájdalma MCP, PIP sor és MTP ízületek érzékenyek, duzzadtak Labor: We:110; CRP:40; anti- CCP:1200; RF:580 Kéz és láb RTG: foltos osteoporosis, erosiok

Diagnózis?

4747

Immunológiai vizsgálat kérőlap