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Engenharia Bioquímica

Prof. Marília Magalhães Gonçalves

Universidade Federal de São João Del Rei

Enzimas e Cinética Enzimática

Enzimas

• As enzimas são proteínas globulares que

funcionam como catalisadores biológicos

• Encontradas em animais, vegetais e nos

microrganismos

• Viabilizam as atividades das células,

quebrando moléculas e juntando-as para

formar novos compostos

Enzimas

• Apresentam elevado grau de especificidade

com o subtrato sobre o qual atuam

• Algumas enzimas são específicas para

determinado tipo de ligação química, outras

para um tipo particular de isômero óptico

• “Toda enzima é uma proteína, mas nem toda

proteína é uma enzima”

Enzimas

• As enzimas possibilitam que as indústrias utilizem

processos mais econômicos e menos

poluentes, além de serem extremamente

eficientes

• Atualmente, podem substituir muitos produtos

químicos nocivos ou até perigosos e permitem

uma produção segura e ambientalmente

correta, decorrente de uma tecnologia limpa

Enzimas

• O uso de enzimas para fins tecnológicos consiste

em fazer destes catalisadores biológicos,

catalisadores de processo, capazes de transformar

matérias-primas em produtos com valor agregado

• Entretanto, esse é um grande desafio tecnológico

devido à instabilidade da estrutura proteica da

enzima

• Ainda são poucos os processos enzimáticos

operados em escala industrial

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CARACTERÍSTICA ENZIMAS CATALISADORESQUÍMICOS

1 – Especificidade ao substrato Alta Baixa

2 – Natureza da estrutura Complexa Simples

3 – Sensibilidade à temperatura Alta Baixa

4 – Condições de reação (T, P e pH) Suaves Drásticas (geralmente)

5 – Custo de obtenção (isolamento epurificação)

Alto Moderado

6 – Natureza do processo Batelada/contínuo Batelada/contínuo

7 – Consumo de energia Baixo Alto

8 – Formação de subprodutos Baixa Alta

9 – Reutilização do catalisador Simples/cara Simples

10 – Atividade catalítica (temperaturaAmbiente)

Alta Baixa

11- Presença de cofatores Sim Não

12 – Energia de ativação Baixa Alta

13 – Velocidade de reação Alta Baixa

Enzimas

• São divididas em seis classes conforme a

reação que catalizam

• Oxirredutases, transferases, hidrolases, liases,

isomerases, ligases

EnzimasClasse da Enzima Tipo de reação catalizada

Oxirredutases Catalisam reações deoxirredução. Transferênciade H, O ou elétrons

Transferases Catalisam a transferência de grupos entre moléculas

Hidrolases Catalisam reações de hidrólise

Liases Catalisam a adição de grupos a ligações duplas e vice- versa

Isomerases Catalisam reações de isomerização

Ligases Catalisam a união de duas moléculas, associadas à ruptura da ligação trifosfato do ATP

Enzimas

• Após os antibióticos, as enzimas são os produtos

mais explorados na indústria biotecnológica

• Muitas das enzimas obtidas de vários tipos de

microrganismos podem ter um uso comercial

• Atualmente comercializam-se em todo o mundo

mais de 1500 toneladas de enzimas por ano,

correspondendo a um mercado mundial estimado

emmais de US$ 2 bilhões

Enzimas

• A obtenção de enzimas comerciais pode ser feita

a partir de fontes animais, vegetais e microbianas

• Sua produção pode ser aumentada pela

transferência das informações genéticas para um

microrganismo hospedeiro

• Esses microrganismos geneticamente modificados

(OGMs) podem, então, ser cultivados sob as

melhores condições

EnzimasMercado

• Enzimas Técnicas: formulação de detergentes,

produção de papel e celulose, manufatura de couros e

produção de fármacos (50% do mercado de enzimas)

• Alimentos: xarope de açúcar invertido (frutose),

aromas, produção de pães, processamento de carnes

e embutidos, queijos, cerveja, sucos e lipídeos

estruturados isentos de isômeros trans

• Ração animal: engorda de animais (celulases, xilanases,

fitase desdobramento do ácido fosfórico do inositol em

fosfato livre para ser absorvido)

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Enzimas• Em 2008 haviam cerca de 3000 enzimas

identificadas e integrantes da lista de

Comissão Internacional de Enzimas (E.C.)

• Apenas 60 dessas enzimas com aplicação

industrial, devido ao alto custo de

produção

• Mais de 75% das enzimas comerciais são

hidrolases

Enzimas

• Proteases constituem quase 40% das vendas

de enzimas, seu uso em detergentes é o seu

principal mercado

• Principais mercados: detergentes (37%),

setor têxtil (12%), amido (11%), panificação

(8%), ração animal (6%)

EnzimasObtenção Industrial

Fonte Origens Método de Obtenção

Vegetais SementesSucosPolpasRaízes

Trituração de tecidos

Animais MucosasPâncreasFígadoSangue

Trituração de tecidos

Microrganismos BactériasFungosLeveduras

Cultura submersa ousemi-sólida

Aplicação das Enzimas• 90% são extracelulares e de origem microbiana

• Proteases: 50% do mercado de enzimas

microbianas

– Protease alcalina de Bacillus licheniformis em

detergentes

– Coalho de Mucor miehei (enzima quimosina) na

produção de queijos

– Utilização em massa de pães e biscoitos

• Amilases: conversão de amido em xaropes,

produção de açúcares fermentáveis (cerveja)

Aplicação das Enzimas• Pectinases de Aspergillus niger: processos de

extração de suco e elaboração de vinhos

aumentam o rendimento, reduzem a

viscosidade e melhoram a extração da cor das

cascas de frutas e vegetais macerados

• Celulases: processamento de alimentos,

indústria têxtil, tratamento de despejos

• Glicose isomerase: conversão de glicose em

frutose

Aplicação das Enzimas• Papaína (extraída do látex de mamão):

cervejaria e processamento de alimentos

• Quimosina (ou renina): extraída do 4º

estômago de novilhos em aleitamento -

produção de queijo

• Atualmente a quimosina animal foi

substituída por enzimas microbianas

(bactérias geneticamente modificadas)

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Características das Enzimas• Moléculas de proteínas com função de

reconhecer e se ligar a reagentes específicos,

catalisando sua conversão em produtos

• Responsáveis pelo aumento da velocidade de

todas as reações que ocorrem no interior das

células

• Sua atividade catalítica depende da

integridade da sua conformação proteica

nativa

Características das Enzimas

• Combinam-se temporariamente com os

substratos (ou reagentes) durante a reação

• São liberadas sem alteração em sua

estrutura

• Específicas em sua atividade (um único tipo

de molécula ou grupo de moléculas

relacionadas)

Características das Enzimas

• Saturadas por altas concentrações de

substrato

• Podem conter grupos não-protéicos

(Cofatores) que contribuem para sua atividade

- inorgânicos: íons metálicos (Mg, Zn, Mn, Fe)

- orgânicos (coenzimas): grupos complexos

derivados de vitaminas (NAD, FAD, coenzima A

ou algumas vitaminas)

Características das Enzimas

• Apoenzima: estado inativo da enzima na

ausência de cofator

Mecanismo de catálise

• Enzimas aumentam a velocidade de reações

espontâneas por redução da energia de

ativação

• Energia de ativação – barreira de energia

entre subtratos e produtos que deve ser

transposta pelas moléculas para que a reação

ocorra

• Não são consumidas nem alteradas no

processo e não afetam o equilíbrio da reação

Energia de Ativação

Figura 1: Gráfico de energia de ativação de uma reação química e a mesmareação catalisada por uma enzima.

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Mecanismo de catálise

• Sítio ativo: cavidade com forma definida,

aberta na superfície da molécula globular da

enzima, constituída por grupos R de

aminoácidos

• Para ser reconhecida como substrato, uma

molécula deve ter a forma adequada para

acomodar-se no sítio ativo e os grupos

químicos capazes de se ligar com os grupos R

• Enzimas podem possuir mais de um sítio ativo

Sítio ativo

Figura 2: Esquema representativo da atuação de uma enzima num processo bioquímico

Regulação da atividade enzimática

• Alguns compostos do metabolismo têm a

propriedade de se ligarem com alta

especificidade a uma região de determinadas

enzimas chamada sítio alostérico

• Este é diferente do sítio ativo

• Modificação da estrutura terciária da enzima

• Nova conformação pode auxiliar ou prejudicar

a ação catalítica

• Enzima chamada alostéricaFigura 3: Ativação (a) e inibição alostérica (b) de uma enzima

Regulação da atividade enzimática

• Tipo de regulação largamente empregada

pelas células, praticamente em todas as

vias metabólicas

• Normalmente a inibição da atividade

alostérica é feita por produtos finais da via

• Mecanismo de feedback

Medida da atividade enzimática

• Para enzimas, mais importante do que a

quantificação em massa é a medida de sua

atividade

• Atividade da enzima é avaliada pela

velocidade da reação que a enzima catalisa

• Para essa medida uma amostra de solução

contendo a enzima é incubada com

concentrações altas de substratos

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Medida da atividade enzimática

• A velocidade da reação é medida e

expressa em Unidades Internacionais

• Uma Unidade Internacional (U) é a

quantidade de enzima capaz de formar um

µmol de produto por minuto em condições

ótimas de medida

• Medida da atividade da enzima é

importante em processos de purificação

Fatores que afetam a atividade enzimática

Temperatura

• De maneira geral, aumento da temperatura

leva a aumento da atividade enzimática

(maior número de colisões entre enzima e

subtrato)

• Entretanto, acima de determinado valor de

temperatura, ocorre desnaturação da enzima

com declínio rápido de sua atividade

Fatores que afetam a atividade enzimática

pH

• Cada enzima tem uma faixa de pH ótima, na

qual mantém sua configuração normal no

meio em que atua

• Variação no pH pode alterar a ionização de

cadeias de aminoácidos no sítio ativo da

enzima, causando mudança de configuração

e ou desnaturação, impedindo – a de se

combinar com o substrato

Fatores que afetam a atividade enzimática

pH

• A alteração do pH tem efeitos na atividade

enzimática e, como consequência, é

necessário selecionar e controlar o pH do

meio

Efeitos do pH

Aumento do pH

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Efeitos do pHCinética das reações

enzimáticasObjetivos

• Medir a velocidade das transformações

• Verificar influência das condições de trabalho

• Correlacionar (equações ou modelos

matemáticos) as velocidades das reações com os

fatores que as afetam

• Otimizar processo

• Estabelecer parâmetros para controle de processo

• Projeto de reator

Cinética das reações enzimáticas

• A velocidade de consumo do subtrato ou

formação do produto varia com o tempo

• Com o desenvolvimento da reação as condições

em que se encontra o sistema variam

• A concentração de substrato decresce e da

enzima pode diminuir também (instabilidade),

alguns produtos podem inibir ação catalítica da

enzima

• Instante inicial – condições experimentais são

conhecidas

Cinética de Michaelis-Menten

• Baseado no conceito de formação do complexo

Enzima - Substrato (ES) como intermediário no

mecanismo de formação de produtos

• Primeiro a enzima combina-se com o substrato,

formando o complexo ES, em um passo reversível e

rápido

• A seguir, num passo mais lento, o complexo se

desfaz, com reaparecimento da enzima livre e

formação do produto

Efeito da concentração inicial da enzima

[E]

Efeito da concentração de substrato

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Curvas cinéticas para os componentes dareação enzimática: Estado Estacionário Equilíbrio químico

k1

k2

A velocidade de reação entre A e B é proporcional às

concentrações de A e B, logo:

No equilíbrio:

Reação catalisada por enzima

(k4 é muito baixo)

(após a mistura de E e S,ES permanece constante)

Reação catalisada por enzima

Isolando as constantes:

k3 < k2

Como k3 < k2 e k1, ES → P éa etapa limitante do processo

Definindo a velocidade relativa v/vMax:

Reação catalisada por enzima

• O valor máximo de velocidade será obtido quando

toda a enzima se encontrar na forma de complexo

enzima – substrato

• A equação de Michaelis – Menten expressa a relação

quantitativa entre a velocidade inicial, a velocidade

máxima e a concentração de substrato, por meio de Km

• Km é a constante de de Michaelis da enzima (ou do

substrato, ou do complexo) – concentração de

substrato à qual corresponde uma velocidade igual à

metade da máxima

Efeito da concentração de substrato

V = Vmax

- Parte A: v depende da [S]- Parte B: v não aumenta proporcionalmente com aumento de [S]- Parte C: v não depende da [S], tendendo a um valor máximo (Vmax)

Cinética de ordem variável

Cinética de 1ª ordem (Km >> [S]) V = Vmax [S]/km = K[S]

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Efeito da concentração de substrato

• A velocidade é proporcional à

concentração de substrato (primeira

ordem) para baixos valores de S (Km >> S)

• Para valores maiores de S (S >> Km ), a

velocidade torna-se constante, de ordem

zero e igual a Vmax

• Quanto menor o valor de Km maior será a

afinidade da enzima pelo substrato

Método Lineweaver - Burk

• A determinação de V e Km a partir de valores

experimentais pode ser feita pela linearização da

equação de Michaelis – Menten

• O método Lineweaver – Burk é bastante utilizado e

consiste em inverter ambos os membros da

equação

Método Lineweaver - Burk• Percebemos que 1/V varia linearmente com 1/S

• Os coeficientes angular e linear dessa reta são Km/Vmax e

1/Vmax

• Com os valores experimentais de S e correspondentes valores

de V, os coeficientes são determinados por regressão linear

Exemplo• Determine os valores de Km e Vmax para os

resultados da seguinte reação enzimática

catalisada por uma protease

Glicilglicina + H2O → 2 Glicina

[S] (mmol L-1) Velocidade (µmol L-1 s-1)

1,5 0,21

2 0,24

3 0,28

4 0,3

8 0,40

16 0,45

Exemplo

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 5 10 15 20

0

1

2

3

4

5

6

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Isoenzimas:apresentam atividade sobre um mesmo substrato, porém apresentamcaracterísticas como sequência de aminoácidos, massa molecular, KM, VMax diferentes

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Inibição da atividade enzimática

• Processos pelos quais a atividade normal da

enzima é reduzida ou eliminada

completamente

• Compostos que reduzem a velocidade da

reação, por qualquer mecanismo, são

chamados inibidores e podem se combinar

com a enzima alterando sua atividade

catalítica

Inibição da atividade enzimática

• As enzimas estão sujeitas a inibições reversíveis ou

irreversíveis

• Inibidores irreversíveis se ligam a um grupo funcional

na molécula de enzima para formar ligações

covalentes e cineticamente estáveis, podendo

levar a destruição desse grupo

• Inibidores reversíveis se ligam à enzima por ligações

fracas, de forma reversível

Inibição da atividade enzimática

• O inibidor pode ser uma das substâncias que

participa da reação (substrato ou produto)

- Inibição da invertase por concentrações elevadas

de sacarose

- Inibição da alfaamilase por dextrinas e pela

maltose

• A inibição reversível é que apresenta interesse

prático e os dois tipos mais importantes são a

inibição competitiva e não - competitiva

Inibição competitiva

• Inibidor competitivo tem grande semelhança

estrutural com o substrato e ambos competem

pelo mesmo sítio ativo da enzima

• A formação do complexo enzima – inibidor

reduz a quantidade de enzima disponível para

interação com o substrato com redução da

velocidade da reação

Inibição competitiva Inibição competitiva

• Como o inibidor se liga à enzima de forma

reversível, a competição pode se tornar

favorável ao substrato se for adicionado mais

substrato ao meio

• Com altas concentrações de substrato no

meio, será mínima a probabilidade de uma

molécula de inibidor se ligar à enzima e a

reação terá velocidademáxima normal

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Inibição competitiva

• Entretanto, a concentração de substrato na

qual v = vmax/2 ( valor de Km) estará

aumentada na presença do inibidor

• O efeito no valor de Kme a ausência de um

efeito em vmax são indicadores da inibição

competitiva

Inibição competitiva

KM aumenta → menorafinidade da enzimapelo substrato

Inibição não - competitiva

• O inibidor não – competitivo interage com a

enzima, ligando-se a um sítio ativo diferente

daquele no qual se liga o substrato e não

altera a conformação deste

• Todas as formações de complexos são

possíveis: enzima – substrato, enzima - inibidor,

enzima – substrato - inibidor

Inibição não - competitiva

Inibição não - competitiva

• A enzima é inativada quando o inibidor está

ligado, estando o substrato presente ou não

• Em qualquer caso, o complexo resultante é

inativo, não formando produto

• O inibidor reduz efetivamente a concentração

da enzima ativa e, consequentemente, diminui

vmax

• O efeito sobre kM é pequeno ou nenhum

Inibição não - competitiva

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Inibição Não-Competitiva:Recíprocos de Lineweaver-Burk

Vmax diminuiKM inalterado

Inibição Irreversível

• Ligação covalente ou não covalente

particularmente estável

• Não há modelo cinético

• Destruição de um grupo funcional essencial ao

funcionamento da enzima

• Enzima não pode ser regenerada

• Inibidores irreversíveis podem ser úteis para

preparações enzimáticas comerciais

Inibição Irreversível

Exemplo: Presença de íons Fe2+ em caldo de cana – Inibição da invertase(Complexos estáveis com íons S2- da cisteína e metionina)

Exercício

• Uma enzima com KM de 2,6 x 10-5 mol L-1 foi

testada para uma concentração inicial de

substrato de 0,3 mol L-1. A velocidade

observada foi de 5,9 x 10-5mol L-1 min-1. Se a

concentração inicial de substrato fosse 2 x 10-5

mol L-1,e admitindo-se estequiometria 1:1, qual

seria o tempo necessário para a concentração

do produto atingir 1,1 x 10-5mol L-1.

Exercício

• A reação de conversão do citrato → oxaloacetato + acetato por

uma enzima exige a presença de íons Mg2+. Os seguintes dados de

velocidade enzimática foram obtidos onde se investigou o efeito do

inibidor Ca2+. Determine KM, Vmax, KI e o tipo de inibição

[Mg2+] mmol L-1 V sem Ca2+

(mmol L-1 s-1)V com Ca2+

(2,5 mmol L-1s-1)V com Ca2+

(5 mmol L-1s-1)

8,35 11,75 9,65 7,25

2,99 8,5 5,6 4

0,96 4,8 2,33 1,58

0,32 2,8 1,04 0,62

Referências Bibliográficas

• GALLO, L. A. BASSO, L. C. Fundamentos de Bioquímicapara Ciências

Biológicas, Ciências dos Alimentos, Agronômicas e Florestais (apostila)

ESALQ USP, 2012

• LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. - Princípios de Bioquímica.

São Paulo, Sarvier, 2006

• SERPA, G.; PORTO, L. Introdução à Engenharia Genômica (apostila).

UniversidadeFederal de Santa Catarina, 2005

• Schmidell, W. et al. Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blucher,

vol. 1 Engenharia Bioquímica, 2001.

• Tortora, G.R. Microbiologia. 8ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.

• Notas de aula do professor André Aguiar. Engenharia Bioquímica, UFSJ

CAP