attività di ido1 (l’enzima indoleamina 2,3-diossigenasi-1) nella … · 2015. 1. 7. · roma,...

Roma 08022013

Relazione finale progetto

Dottssa Silvia Bosello

Attivitagrave di IDO1 (lrsquoenzima indoleamina 23-diossigenasi-1) nella sclerosi sistemica

possibile link tra infiammazione cellule B e T e fibrosi

Background

La sclerosi sistemica (SSc) egrave una patologia sistemica autoimmune caratterizzata da unrsquoimportante

disfunzione endoteliale da alterazioni immunologiche e da unrsquoabnorme deposizione di matrice

extracellulare che provoca unrsquoeccessiva fibrosi della cute e degli organi interni

In letteratura sono state riportate numerose alterazioni immunologiche in corso di SSc quali

modificazioni della frequenza delle sottopopolazioni B cellulari ipergammaglobulinemia

produzione di autoanticorpi modificazione nei livelli di citochine infiammatorie alterazione dei

linfociti T tra i quali un aumento delle cellule T regolatorie (1) La SSc egrave inoltre caratterizzata da

aumentati livelli di citochine proangiogenetiche quali VEGF PDGF and FGF-2 e in alcuni

sottogruppi di pazienti sono stati riportati aumentati livelli di fattori anti- e pro-angiogenetici

quali CXCL4 hepatocyte growth factor (HGF) (2) trombospondina ed IL-4 (1)

Lrsquoenzima indoleamina 23-diossigenasi (IDO1) catabolizza la scissione del triptofano in chinurenine

(KYN) una famiglia di molecole con importanti effetti sulle cellule del sistema immunitario Ersquo

stato riportato che questo enzima contribuisca alla tolleranza immunologica in corso di neoplasie e

recentemente egrave stato suggerito un ruolo di IDO1 nelle patologie autoimmuni infiammatorie (34)

IDO1 contribuisce alla formazione di autoanticorpi da parte delle cellule B come suggeriscono gli

studi effettuati su modelli murini KBxN di artrite indotta da collagene (5) Inoltre la

somministrazione di DL-1MT un inibitore chimico di ID01 induce una riduzione della

infiammazione articolare indipendentemente dalle modifiche della frequenza delle cellule T

regolatorie (Treg) o dal profilo delle citochine secrete dalle cellule T Infine la somministrazione

dellrsquoinibitore dellrsquoattivitagrave di IDO diminuisce la risposta delle cellule B autoreattive suggerendo che

IDO possa avere un ruolo nelle patologie autoimmuni non solo riducendo lrsquoattivitagrave delle cellule T

regolatorie ma anche attraverso modifiche del compartimento B cellulare che determinano una

modulazione del microambiente infiammatorio

LrsquoHGF egrave una citochina prodotta dalle cellule mesenchimali quali i fibroblasti dai macrofagi e da

cellule della filiera B linfocitariaplasmacellulare che attraverso la sua attivitagrave sulle cellule

endoteliali sulle cellule dendritiche e sulle cellule T riduce lrsquoinfiammazione cronica immuno-

mediata e induce un miglioramento della fibrosi Recentemente egrave stato riportato che lrsquoHGF egrave in

grado di indurre lrsquoespressione di IDO1 nelle cellule dendritiche umane di derivazione monocitaria

(6) Inoltre lrsquoHGF egrave in grado di migliorare in modelli murini di SSc la sclerosi dermica (7)

suggerendo che lrsquoHGF possa rappresentare un fattore essenziale nella risposta di feed-back

allrsquoinfiammazione

Obiettivi

Gli obiettivi del nostro progetto sono stati quelli di valutare

Le sottopopolazioni delle cellule B nei pazienti con sclerosi sistemica

lrsquoattivitagrave di IDO1 e i livelli di chinurenina in relazione ai diversi subset di SSc (attivitagrave di

malattia caratteristiche autoanticorpali infiammazione)

i livelli di HGF e VEGF nel siero e nel wound fluid prelevato dalle ulcere di pazienti

sclerodermici in accordo con le caratteristiche cliniche di malattia

lrsquoespressione di mRNA di IDO1 nelle cellule B di pazienti sclerodermici dopo purificazione

dal sangue periferico

visto il ruolo di IDO1 nella conversione delle cellule T naive in cellule T regolatorie valutare

la frequenza delle cellule T regolatorie

Pazienti e metodi

Sono stati arruolati 100 pazienti con diverse caratteristiche di malattia afferenti al Divisione di

Reumatologia dellrsquoUniversitagrave Cattolica

80 pazienti soddisfacevano i seguenti criteri drsquoinclusione etagrave compresa tra i 18 e i 75 anni e

soddisfacevano i criteri dellrsquoACR per la sclerodermia (11) 20 pazienti invece avevano unrsquo etagrave

compresa tra i 18 e i 75 anni ma soddisfacevano i criteri per la early sclerodermia proposti da

LeRoy (12) Sono stati esclusi tutti i pazienti che presentavano una connettivite da overlap e i

pazienti che erano in trattamento con farmaci immunosoppressori (ciclofosfamide azatioprina

Rituximab antiTNF Methotrexate e Leflunomide)

Commento [sr1] HGF non egrave classificata tra le chemochine pur inducendo migrazione cellulare Cfr Immunity 2000 Feb12(2)121-7

Tutti i pazienti erano in trattamento con farmaci di supporto quali prostacicline di sintesi acido

acetilsalicilico calcio antagonisti e inibitori della pompa protonica Lrsquoetagrave media dei pazienti era di

539plusmn135 anni con durata media di malattia di 158plusmn58 anni Trentatre pazienti presentavano

ulcere mentre 29 avevano una malattia polmonare restrittiva Le caratteristiche demografiche e

cliniche della coorte in esame sono riportate in tabella 1

Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche

100 pazienti con SSC

Etagrave (anni mediaplusmnDS) 539plusmn135

Durata di malattia (anni mediaplusmnDS) 158plusmn58

Malattia early n () 20 (20)

Donne n () 82 (820)

Skin score (mediaplusmnDS) 85plusmn63

Malattia diffusa n () 42 (420)

Positivitagrave per lrsquoantiScl70 n () 41 (410)

Positivtagrave per lrsquoanticentromero n () 38 (380)

Positivitagrave per antinulceolo n () 6 (60)

Positivitagrave ANA senza specificitagrave n () 15 (150)

FVC (mediaplusmnDS) 986plusmn199

TLCO (mediaplusmnDS) 653plusmn154

Malattia polmonare restrittiva n () 29 (290)

Riscontro di alveolite al BAL 35 (35)

PASP (mmHg mediaplusmnDS) 230plusmn55

Ipertensione polmonare n () 6 (109)

Ulcere cutanee n () 33 (330)

Smokers n () 13 (130)

Sono stati inoltre arruolati 40 soggetti sani paragonabili per etagrave e sesso e sono state raccolti

campioni di plasma siero e PBMC

Sottopopolazioni B cellulari

I campioni di sangue periferico sono stati analizzati poche ore dopo il prelievo Le sottopopolazioni

B cellulari di tutti i pazienti sono state studiate mediante citofluorimetria attraverso lo staining con

i seguenti marcatori di superficie CD45 CD19 CD3 CD56 CD38 CD27 CD5 CD23 e IgD e il

marcatore intracellulare ZAP-70 Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando

IntraPrep kit (Beckman Coulter France) secondo le indicazioni della casa costruttrice e incubate

con ldquoantindashZAP70-PE monoclonal antibodyrdquo per 30 minuti (clone SBZAP Beckman Coulter

Fullerton CA USA) Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il citofluorimetro ad otto colori

Navios flow cytometer

Citochine VEGF HGF

Nel plasma e nel wound fluid sono stati inoltre analizzati i livelli delle seguenti citochine HGF

utilizzando la metodica ELISA (RampD Systems United Kingdom) VEGF and VEGF-D IL-6 utilizzando

un ldquobead-based plex assayrdquo (Bender MedSystems GmbH Vienna Austria) I livelli quantitativi delle

citochine sono stati determinati utilizzando come confronto delle curve standard e riportati come

picogrammi per millilitro (pgmL) Il limite delle metodiche era 12 pgmL per IL-6 400 pgml per lrsquo

HGF 72 pgml per il VEGF 250 pgml per VEGF-D I livelli plasmatici sono stati espressi in pgml

mentre nel WF in pgml1gr di albumina per normalizzare i valori

Determinazione triptofano e chinurenine nel siero

I livelli di triptofano e chinurenine sono stati determinate con metodica di proteomica in Reverse

phase - high performance liquid cromotography (RP-HPLC)

Determinazione dellrsquoespressione di mRNA di IDO

Le cellule mononucleate (PBMC) del sangue sono state isolate mediante centrifugazione con

gradiente densitagrave Ficoll-Hypaque Le cellule B sono state isolate dalle cellule PBMC usando biglie

immunomagnetiche Dalle cellule B purificate egrave stato estratto lrsquomRNA per la determinazione

dellrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO mediante qPCR

Frequenza delle cellule T regolatorie

Le cellule T regolatorie sono state analizzate in citofluorimetria Le cellule T regolatorie sono state

identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e

permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T

CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)

Analisi Statistica

Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS

Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in

base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione

delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di

Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la

correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005

Risultati

Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia

I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave

bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule

CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001

eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)

Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4

(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)

Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti

CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani

(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di

cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule

Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045

plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie

Variables SSc Controls P

N 74 30

WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036

Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005

CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064

Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001

Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000

Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004

eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000

Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000

ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+

Bm5

56 plusmn 51 17 plusmn 09 000

CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006

CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001

CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000

CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000

CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000

CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004

CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043



IL6 pgml 53 plusmn 10

Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra

le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-

(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con

malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea

limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)

Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor

percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di

cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+

Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule

Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di

cellule CD19+CD23+

Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza

nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari

Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B

circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i

pazienti senza queste specificitagrave

Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con

la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e

inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+

(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+

(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)

p=001

plt0001

plt0001

plt0001

I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici

I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici

(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)

(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con

malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70

anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei

pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A

differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e

nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001

Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici

Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T

regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T

reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani

indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e

cutaneo e dallo stato autoanticorpale

Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70

+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)

Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+

Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s

Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc

Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici

In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i

livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono

mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se

confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule

B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3

Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)

Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+

La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli

di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione

delle cellule T in cellule T regolatorie

B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)

I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici

Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici

presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino

con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto

autoanticorpale

Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di

PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i

livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano

correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di

chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di

induzione dellrsquoenzima IDO

B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)

I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid

I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei

soggetti sani

Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano

ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali

(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la

significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel

wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette

Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono

stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave

alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn

9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)

Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di

follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi

presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non

guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF

plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid

sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non

guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina

p=005)

SSc patients with ulcer

WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A

IL-6 (pgml) 282 plusmn 532

HGF (pgml) 343520 plusmn 487366

VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899

VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473

IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646

VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968

Conclusioni

I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei

linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le

modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a

modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune

Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della

memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di

malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano

Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata

aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli

di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e

lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di

cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per

capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata

attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le

alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T

Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle

ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di

comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia

IDO possa avere un ruolo nelle patologie autoimmuni non solo riducendo lrsquoattivitagrave delle cellule T

regolatorie ma anche attraverso modifiche del compartimento B cellulare che determinano una

modulazione del microambiente infiammatorio

LrsquoHGF egrave una citochina prodotta dalle cellule mesenchimali quali i fibroblasti dai macrofagi e da

cellule della filiera B linfocitariaplasmacellulare che attraverso la sua attivitagrave sulle cellule

endoteliali sulle cellule dendritiche e sulle cellule T riduce lrsquoinfiammazione cronica immuno-

mediata e induce un miglioramento della fibrosi Recentemente egrave stato riportato che lrsquoHGF egrave in

grado di indurre lrsquoespressione di IDO1 nelle cellule dendritiche umane di derivazione monocitaria

(6) Inoltre lrsquoHGF egrave in grado di migliorare in modelli murini di SSc la sclerosi dermica (7)

suggerendo che lrsquoHGF possa rappresentare un fattore essenziale nella risposta di feed-back

allrsquoinfiammazione

Obiettivi

Gli obiettivi del nostro progetto sono stati quelli di valutare

Le sottopopolazioni delle cellule B nei pazienti con sclerosi sistemica

lrsquoattivitagrave di IDO1 e i livelli di chinurenina in relazione ai diversi subset di SSc (attivitagrave di

malattia caratteristiche autoanticorpali infiammazione)

i livelli di HGF e VEGF nel siero e nel wound fluid prelevato dalle ulcere di pazienti

sclerodermici in accordo con le caratteristiche cliniche di malattia

lrsquoespressione di mRNA di IDO1 nelle cellule B di pazienti sclerodermici dopo purificazione

dal sangue periferico

visto il ruolo di IDO1 nella conversione delle cellule T naive in cellule T regolatorie valutare

la frequenza delle cellule T regolatorie

Pazienti e metodi

Sono stati arruolati 100 pazienti con diverse caratteristiche di malattia afferenti al Divisione di

Reumatologia dellrsquoUniversitagrave Cattolica

80 pazienti soddisfacevano i seguenti criteri drsquoinclusione etagrave compresa tra i 18 e i 75 anni e

soddisfacevano i criteri dellrsquoACR per la sclerodermia (11) 20 pazienti invece avevano unrsquo etagrave

compresa tra i 18 e i 75 anni ma soddisfacevano i criteri per la early sclerodermia proposti da

LeRoy (12) Sono stati esclusi tutti i pazienti che presentavano una connettivite da overlap e i

pazienti che erano in trattamento con farmaci immunosoppressori (ciclofosfamide azatioprina

Rituximab antiTNF Methotrexate e Leflunomide)

Commento [sr1] HGF non egrave classificata tra le chemochine pur inducendo migrazione cellulare Cfr Immunity 2000 Feb12(2)121-7











Donne n () 82 (820)














Smokers n () 13 (130)












Citochine VEGF HGF





















Analisi Statistica







Risultati















N 74 30




Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001






Bm5






















cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni





























Donne n () 82 (820)














Smokers n () 13 (130)












Citochine VEGF HGF





















Analisi Statistica







Risultati















N 74 30




Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001






Bm5






















cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni




























Citochine VEGF HGF





















Analisi Statistica







Risultati















N 74 30




Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001






Bm5






















cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni






















Analisi Statistica







Risultati















N 74 30




Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001






Bm5






















cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni




















N 74 30




Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001






Bm5






















cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni
























cellule CD19+CD23+











p=001

plt0001

plt0001

plt0001









nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni



























nei controlli sani

r=031

p=001

r=024

p=004

r=-038

p=0001

r=045

plt0001








+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni


























+

0

2

4

6

8 lt 00001

Se

rum

ky

nu

ren

ine

(

M)


Scl70-

0

20

40

60

80

100

Se

rum

try

pto

ph

an

(

M)


+

0

5

10

1500060

CD

4+F

ox

P3

+ T

reg

s







B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni

























B

81

88

95

CD4

FoxP3

Pt 1

Pt 2

Pt 3






B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni
























B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

)

0 2 4 6 8 10

0

5

10

15 06084

00358

IDO mRNA (B cells)

CR

P (

mg

dl)





autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni























autoanticorpale







B cells MNC

0

2

4

6

8

10

IDO

-1 m

RN

A (

qP

CR

) 63

78

624 936

FoxP3

FIG 4c


+

0

1000

2000

300000001

Se

rum

HG

F (

pg

mL

)



soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni





















soggetti sani









9899 pgml)(plt005)

2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

04495

00187

KYNTRP ratio

CR

P (

mg

dl)

300 1300 2300 3300

1

2

3

4

5

6

7

00617

02033

HGF (pgml)

Ky

nu

ren

ine

(m

M)








p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni


























p=005)


WO

UN

D F

LU

ID

P

LA

SM

A





IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587

HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675

TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585

VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646


Conclusioni



















attività di ido1 (l’enzima indoleamina 2,3-diossigenasi-1) nella … · 2015. 1. 7. · roma,...

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