目的

蛋白质混合物的靶向定量分析需要将蛋白

质酶解与准确定量蛋白质的策略相结合，

以获得特异性高、灵敏度高、动态范围宽、

重现性和稳定性出色的结果。Xevo® TQ-S系

统在仪器性能方面表现卓越，能够使用稳

定同位素肽作为内标实现高准确和高灵敏

的蛋白质定量。

背景

蛋白质生物标志物验证/确认的初期和后

期阶段，基于多反应监测(MRM)/单反应监

测(SRM)的定量分析方法比基于生物化学

的蛋白质定量方法(例如ELISA)具有更快的

分析速度和更低的成本优势，因而被认为

是更具有吸引力的替代方法。此类研究对

LC/MS系统有着极高的性能要求，即必须需

要最高的灵敏度、特异性、分析速度，以

及稳定性，能够对样品中的目标蛋白质进

行定量的分析。正因如此，技术改进不可

或缺。本文介绍了Xevo TQ-S和TRIZAIC UPLC®

系统的应用，还介绍了定量分析福尔马林

固定石蜡包埋的胎盘样本中与子痫前症相

关的calcyclin定量的结果。�

利用Xevo TQ-S以最高特异性和灵敏度检测和

定量潜在的蛋白质生物标志物。

利用AQUA稳定同位素和化学等价内标实现生物标志物的MRM绝对定量

解决方案

本文研究了使用AQUA稳定同位素和化学等价内标对溶液、合成基质和

福尔马林固定石蜡包埋组织样品中的蛋白质进行定量分析的适用性。

本文还通过实验研究了检测限(LOD)，所用的样品是向合成基质中加标

氨基酸序列中间额外插入了一个甘氨酸的钙周期素肽。利用AQUA稳定

同位素肽作为内标测定了MRM分析的线性和蛋白质浓度。基于Waters®

TRIZAIC UPLC系统，nanoTile™技术与Xevo TQ-S质谱仪进行肽段的分离和定量。

采集数据时采用时间设定的MRM采集模式并由TargetLynx™应用软件进行

定量分析。

技术简报

图1.LQDAEIAR、插入了甘氨酸的化学等价LQDAGEIAR和AQUA标准品LQDAEIAR-13C6,15N4的碎片离子谱图。

*MRM定量的候选碎片离子。

图1展示了MRM定量的候选Calcyclin肽段碎片例

子之一以及两种可能的内标等价物的碎片离

子谱图。插入了甘氨酸的化学合成等价物表

现出与目标内源性肽相似的电离、碎裂和色

谱特性。我们将内源性肽段标准品加入至合

成基质中，用以评价MRM分析的检测限，结果

表明可实现低至埃摩尔级的柱上定量，如图2

所示。

图3展示了其中一条AQUA稳定同位素肽段的MRM定量曲线，其线性定量

动态范围覆盖了四个以上数量级。为测定Calcyclin的水平，将两种稳定

同位素AQUA肽段加入至约300个显微切割的滋养细胞和基质细胞的酶解

物中。图3显示了内源性肽及对应的AQUA稳定同位素重标肽的MRM通道。

含量测定结果为每个滋养细胞和基质细胞分别含约0.3埃摩尔和7.0埃摩

尔，证实了此前报道的结果1。

总结

本文展示了使用AQUA稳定同位素和化学等价肽段对凝聚素分子进行的

绝对定量的方法(凝聚素是检测福尔马林固定石蜡包埋子痫前症胎盘样

本的一种潜在生物标志物)。由于灵敏度更高，Xevo TQ-S能够对数量更

少的显微切割胎盘细胞中的calcyclin肽段进行检测和定量1。目前，采用

大规模患者实验组对血浆凝聚素分子进行MRM验证的研究正在进行中。

参考文献

1. Güzel C, Ursem NT, Dekker LJ, Derkx P, Joore J, van Dijk E, Ligtvoet G, Steegers EA, Luider TM. Multiple reaction monitoring assay for pre-eclampsia related calcyclin peptides in formalin fixed paraffin embedded placenta. J Proteome Res. 2011;10(7):3274-82.

图2. 分析合成基质和空白基质中加标2.5埃摩尔LQDAEIAR的样品所得的三个MRM通道(458.2 > 559.3，458.2 > 674.3和458.2 > 802.4)的总离子流谱图。

图3. LQDAEIAR-13C6 ,15N4的MRM校准曲线和回归曲线指标，柱上进样量为0.5埃摩尔至5.0埃摩尔。插图展示了分析大约300个滋养细胞的酶解物时，LQDAEIAR和LQDAEIAR-13C6 ,15N4的当前transition的总离子流图。

技术简报

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