apostila técnicas de extração de rna, dna e proteínas.revisada

UFT UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

PROCEDIMENTOS EM TÉCNICAS LABORATORIAIS VEGETAIS

Mauren C.A.Silveira1

1.Biomédica,Graduanda do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia na Universidade Federal do Tocantins.

Gurupi, 2010

.1

UFT UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS


SUMÁRIO

PRECAUÇÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

PREPARO DE SOLUÇÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

FÓRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

MOLARIDADE (M – G/L) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

PERCENTUAL (% - G/ML) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

OUTRAS RELAÇÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

DILUIÇÕES DE SOLUÇÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

ÁGUA DEPC 0,1% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

ÁGUA LIVRE DE RNASE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

EDTA 0,5M PH 8.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

EDTA 500 MM; PH 8.0.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO(25:24:1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

NACL 5M –DEPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

NACL 5M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

RNAse A 10MG/ML . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

SDS 20% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

TAMPÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

TRIS HCL LIVRE DE RNASE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

TRIS HCL 1M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

SOLUÇÃO TAMPÃO (WASH BUFFER) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

TAE 50X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

TBE 10X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

TE PH 8.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 1M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

STE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Gurupi/2010

2

UFT

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

TAMPÃO DE AMOSTRA PARA ELETROFORESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

TAMPÃO FOSFATO SALINA- PBS 10X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS .... . . .. . . . . . . . . . . . . 17

MACERAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

CENTRIFUGAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

TIPOS DE CENTRÍFUGAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

VELOCIDADES DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

CENTRIFUGAÇÃO X SOLVENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

ESPECTROFOTOMETRIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

ELETROFORESE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

ELETROFORESE EM GEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Gel de Agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Gel de Poliacrilamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

SENTIDO 5’- 3’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

PROTEÍNAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

SÍNTESE DO RNAm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Diferenças entre transcrição e replicação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

AÇÃO DA RNA POLIMERASE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

TRADUÇÃO EM BACTÉRIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

NUCLEASES E RIBONUCLEAES .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

NUCLEASES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Enzimas de restrição tipo II. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Nuclease Bal 31 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Nuclease S1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Desoxirribonuclease I (DNAse I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Nuclease Microcócica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Exonuclease III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

RIBONUCLEASES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Gurupi/2010

3

UFT


Ribonuclease A (RNAse A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Ribonuclease H (RNAse H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Ribonuclease T1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

DNA POLIMERASES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

DNA Polimerases DNA – Dependentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Fragmento Klenow.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

T4 DNA Polimerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

T7 DNA Polimerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Taq DNA Polimerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

DNA POLIMERASES RNA – DEPENDENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

AMV Transcriptase Reversa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

DNA Polimerase - Independente de Molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

RNA POLIMERASES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

RNA Polimerases DNA – Dependentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

RNA Polimerases DNA – Independentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Polinucleotídeo Fosforilase .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

LIGASES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

T4 DNA Ligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

T4 RNA Ligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

FOSFATASES E QUINASES... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Fosfatases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Quinases .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

SOLUÇÃO TAMPÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

TAMPÃO DE CORRIDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

TAE (TRIS-ACETATO-EDTA).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

CTAB 2% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

NACL 5M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

Gurupi/2010

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UFT


-MERCAPTOETANOL 0,2% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

PVP (POLIVINILPIRROLIDONA) .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

BROMETO DE ETÍDEO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

DPEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

TRIS- HCL; pH 7,4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

PROTEÍNA K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

ETANOL OU ISOPROPANOL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

ACETATO DE SÓDIO (SAIS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E DOYLE . . . . . . . . . . . . .63

MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS. . . . . . . . . . . . . . 66

ESTIMATIVA DE CONCENTRAÇÃO DE DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

QUANTIFICAÇÃO DE DNA (E RNA) ATRAVÉS DE ESPECTROFOTOMETRIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

ESPECTROFOTOMETRIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71

ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

QUANTIFICAÇÃO E EXPECTATIVA DE RENDIMENTO DE DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DE ENDONUCLEASE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Guia de Solução de Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77

VISUALIZAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

GEL DE ELETROFORESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

MULTIPLICAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

PRINCÍPIOS DO MÉTODO REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

VARIAÇÃO DO PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84

EXTRAÇÃO DE RNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Guia de Solução de Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O MÉTODO TRIZOL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

Gurupi/2010

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UFT


Guia de Solução de Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

GEL PARA ELETROFORESE DE PROTEÍNAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS PARA PROTEÍNAS .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

MÉTODO COLORIMÉTRICO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA . . 100

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Gurupi/2010

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UFT


PRECAUÇÕES

As precauções a serem seguidas objetivam tanto a biossegurança quanto a

eficiência dos métodos utilizados.

Sempre usar luvas para manipulação de reagentes.

Durante extrações de RNA as luvas devem ser trocadas se houver contato com

superfícies ou material não tratado com DEPC.

A vidraria deve ser aquecida a 180ºC por no mínimo 8 horas, ou 2 horas a 210ºC.

Pode-se tratar vidraria e material de plástico com DEPC 0,1%, lavando com água

previamente tratada com DEPC e esterilizando-os em autoclave por 20 minutos a

121ºC.

O DEPC é altamente tóxico devendo ser manipulado em capela de exaustão com

luvas, jaleco e óculos de proteção.

Folhas coletadas para análises devem ser rapidamente congeladas a fim de inibir

ação de RNAses endógenas.

Fenol, clorofórmio, formaldeído e -mercaptoetanol são tóxicos e devem ser

manipulados em capela de exaustão com EPIs.

O brometo de etídeo é mutagênico e moderadamente tóxico. Usar luvas e tomar

cuidado ao retirá-las ou quando for enxaguar as mãos com luvas as luvas ainda

(nunca com os dedos para cima).

A pipetagem deve ser feita com exatidão, tomando o cuidado com excessos do

lado de fora da ponteira.

As ponteiras devem ser autoclavadas antes do uso.

O pó do SDS é irritante. Recomenda-se o uso de máscara.

O tampão CTAB não dissolve antes de o pH atingir o nível ótimo pedido na

técnica.

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A solução-tampão do meio para eletroforese de proteínas deve ser

meticulosamente testada quanto ao pH, pois as proteínas são substâncias

anfóteras, isto é, variam a sua carga, positiva ou negativa, em função do pH. Com

um pH alterado a eletroforese pode revelar resultados falsos.

A luz UV é mutagênica. Usar óculos de proteção e luvas.

Qualquer substância ou solução deve ser acondicionada com identificação

necessária (nome do composto, pH, molaridade), data e validade.

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PREPARO DE SOLUÇÕES

FÓRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS

Molaridade (M – g/L)

Molaridade é a concentração de uma SOLUÇÃO em molar.

1 molar = 1 mol de soluto em 1L de solução final.

1 mol de soluto = soma de todas massas moleculares que compõem o soluto.

Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g)

NaCl 1M = 58,5G de NACl em 1L de água

58,5g/mol = 58,5MM

MM = massa molar

OBS. 1M de NaCl é muito concentrado, quase saturado, mas a concentração

depende da massa molecular dos compostos da solução.

Percentual (% - g/mL)

Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m

(massa/massa).

Ex. NaCl 2% = 2g de NaCl em 100mL de solução final.

Para solutos líquidos: ex. Glicerol 10% = 10 mL de glicerol em 100 mL de solução

final ( 10 mL de glicerol + 90 mL de água).

Outras Relações

mg/mL,g/mL

Ex. qualquer solução de 100mL em concentração 10 mg/mL =

1g de soluto em 100 mL de solução final =

1000mg/100mL = 10mg/1mL

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0,001g = 1 mg

100g = 0,1 Kg

ppm (partes por milhão)

Usado para soluções muito diluídas:

massa de soluto (mg) = 1 = 10 ppm

massa de solução (Kg) 0,1

d = massa do soluto (g)

volume da solução (L)

c = massa do soluto (g)

volume da solução (L)

Diluições de Soluções

Para se obter diluições de soluções tem que acrescentar solvente.

Para calcular a relação entre as quantidades de soluto e solvente após a diluição:

Antes da Diluição:

Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

Volume de solução (L)

Após a Diluição:

Massa de soluto (g) x volume de solução (L)

Volume de solução (L)

Ou:

C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e

M (mol/L)1 x V (L)1 = M (mol/L)2 x V (L)2

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Exemplo:

Obter álcool etílico 70% a partir de álcool etílico 95%:

Álcool 70% = 700 mL de álcool + 300 mL de água



Para 1L:

315,78 mL de álcool 95% + 684,22 mL de água = 1 L de álcool 30%

95% x V1 = 30% x 1 L

V1 = 0,31578 L = 315,78 mL

1 L – 315,78 mL = 684,22 mL

SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL

ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N

Água destilada 400 mL em béquer

HCL 37% 104,2 mL

Completar o volume até 500 mL com água destilada em proveta

ÁGUA DEPC 0,1%

DEPC 0,5 mL

Água destilada autoclavada por 2 horas 500 mL

Água destilada autoclavada por 2 horas = U.P.A

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ÁGUA LIVRE DE RNASE

Água UPA 500 mL

DEPC 0,5 mL

Reagir por 1 hora

Autoclavar por 30 minutos

CLORETO DE LÍTIO (LICl) 5M

Cloreto de Lítio 2,12 g

Água destilada 10 mL

EDTA 0,5M PH 8.0

EDTA 18,612 g

Água DEPC 70 mL

Ajustar o pH para 8.0 com NaOH

Completar o volume para 100mL com água DEPEC.

EDTA 500 MM; PH 8.0

Na2EDTA.2H2O 186,1 g


Agitar com agitador magnético

Ajustar pH para 8.0 com NaOH (aproximadamente) 20g em pastilhas.

Completar o volume para 1L após atingir o pH 8.0.

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FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)

Clorofórmio 480 mL

Álcool isoamílico 20 mL

Fenol equilibrado 500 mL

GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO)

Agarose 2 g

TAE ou TBE 1X 200 mL

Fundir em microondas. Deixar esfriar até 70ºC aproximadamente.

Adicionar brometo de etídio 1% 1 L

Misturar suavemente.

HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N

NaOH 400 g

Água destilada 1 L

NACl 5M -DEPC

NaCl 146 g

Água DEPC q.s.p. 500 mL

NACl 5M

NaCl 292,2 g

Água destilada q.s.p. 1 L

Esterilizar em autoclave

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RNAse A 10mg/ml

RNAse pancreática (RNAse A) 100 mg

Acetato de sódio 10mM; pH 5.2

Ferver por 15 minutos.Esfriar.

Ajustar pH com 0,1 volume de Tris-HCl 1M; pH 7.4

Dividir em 1 mL

Armazenar a -20ºC.

SDS 20%

SDS 200 g


Banho-maria a 50ºC, no mínimo.


TAMPÕES

Tris HCl Livre de RNAse

Estoque

Tris HCl 1,5 M ; pH 8,0 18,1 g

Água DEPC 0,1% 70 mL

Ajustar o pH para 8.0 com HCl

Completar o volume para 100 mL com água DEPC autoclavada após adição de

DEPC 0,1% reagindo por 1hora (validade: 3 meses 4ºC)

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Tris HCl 1M

Tris base 121,1 g

Água destilada (sem DEPC) 800mL

Ajustar o pH desejado com HCl concentrado nas quantidades:

Para pH 7.5 – 70 mL; para pH 7.6 – 60 mL; para pH 8.0 – 42 mL

Obs: 60,55g de tris - 400 mL de água destilada.

30,25g de tris – 200 mL de água destilada.

Solução Tampão (Wash Buffer)

Tris HCl 1,5M 3,33 mL

EDTA 0,5M 1 mL

NaCl 2M 200 mL

BSA 0,25g

Completar o volume com água UPA com DEPC (re-autoclavar a água UPA após

adicionar DEPC 0,1% reagindo por 1 hora) até 500mL.

TAE 50X

Tris base 242g

Ácido acético glacial 57,1 mL

EDTA 0,5 M; pH 8.0 100 mL

Água destilada q.s.p. 1000 mL

Ajustar o pH da solução de EDTA com NaOH.

Concentração de uso 1X. Estocar à temperatura ambiente.

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TBE 10X

Tris base 108 g

Ácido bórico 55 g

EDTA 500 mM; pH 8.0 40 mL

Água destilada q.s.p. 1L

TE pH 8.0

Tris HCl 1M; pH 8.0 1 mL

EDTA 500 mM; pH 8.0 200 L


Tampão Fosfato de Sódio 1M

NaH2PO4.H2O 1M 13,8g + água destilada q.s.p. 100 mL

Na2HPO4 1M 14,2g + água destilada q.s.p. 100 mL

Diluir nas seguintes proporções de acordo com o pH desejado:

NaH2PO4.H2O 1M Na2HPO4 1M pH

53,7 mL 46,3 mL 6.8

42,3 mL 57,7 mL 7.0

22,6 mL 77,4 mL 7.4

15,5 mL 84,5 mL 7.6

10,4 mL 89,6 mL 7.8

STE

NaCl 5M 2 mL

Tris-HCl 1M 1 mL

EDTA 500mM; pH 8.0 200 L

Água destilada q.s.p. 100 Ml

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Tampão de Amostra para Eletroforese

Ficoll tipo 400 ou Glicerol 3 g

EDTA 500 mM; pH 8.0 20 L

Azul de bromofenol 25 mg

Xilene Cianol FF 25 mg


*Usar água DPEC 0,1% para géis de RNA

Tampão Fosfato Salina- PBS 10X

Na2HPO4 14,4 g

KH2PO4 2,4 g

NaCl 80 g

KCl 2 g


Ajustar o pH para 7.4. Esterilizar em autoclave

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FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS

MACERAÇÃO

Em cadinhos com nitrogênio líquido: as paredes celulares devem ser rompidas com

o objetivo de liberar os constituintes celulares.

CENTRIFUGAÇÃO

Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. A desproteinização é

obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes

orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação,

permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os ácidos

nucléicos e a fase orgânica (inferior).

A centrifugação depende do raio do rotor em cm, do ângulo fixo (tubo inclinado) ou

ângulo variável ou swingout (tubo pêndulo). A força centrífuga relativa (RCF) ou xg

significa quantas vezes uma amostra é acelerada em relação à gravidade na

superfície da Terra (9,8 N/s2 ou 1xg).

A centrifugação é baseada no fato de um movimento circular a uma dada velocidade

angular, resultar uma força(F) que atua sobre a amostra. F é diretamente

proporcional ao raio ® do rotor (em cm) e ao quadrado da velocidade angular (w)

em radianos:

F= 2r ou RCF= 2r ou w= (rpm)

980 30

Daí RCF= 1,119.10-5 rpm2r

Como r é diretamente proporcional à RCF, quando o raio aumenta, o RCF aumenta.

No RPM a RFC varia de acordo com o raio que pode variar de acordo com o rotor

usado. Por isso usa-se mais o xg do que o RPM.

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No caso de rotores de ângulo fixo, a distância do raio do centro do rotor ao topo ou

ao fundo do tubo com a amostra é distinta. A RCF, então, é maior no fundo do tubo.

No caso de rotores de ângulos pendulares, há um único RCF.

Tipos de centrífugas

MICROCENTRÍFUGAS

0,5 a 1,5 mL de capacidade e até 14000 rpm em segundos.

Centrífugas de média velocidade

São geralmente preparativas. Apresenta vários volumes, aceleração máxima até

20000 rpm e vários tipos de rotores. Pode ser feita a separação de bactérias ou

outras células do meio de cultura até o fracionamento celular.

ULTRACENTRÍFUGAS

A primeira foi da marca Svedberg e hoje existem as que atingem 60000xg. Podem

ser preparativas para separação de moléculas e/ou partículas ou técnicas analítica

para medir as propriedades físicas de macromoléculas.

Apresenta o rotor em câmara blindada, sistema de alto vácuo para eliminar o atrito

com o ar e o superaquecimento. Possui sistema de refrigeração. Os rotores são em

liga de titânio e o disco na parte inferior do rotor possui uma superfície clara e outra

escura para a leitura óptica por fotocélula que capta o sinal quando o rotor gira e

pode desligar a centrífuga, caso haja desbalanceamento dos tubos ou caso a

velocidade máxima seja alterada.

A unidade S de peso para compostos microssomais foi devido à marca Svedberg

que proporcionou tal medida.

É tecnicamente chamado de coeficiente de sedimentação (s): velocidade por

unidade de força. S de uma partícula é a sua velocidade de sedimentação por

unidade de campo de força F.

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As unidades Svedberg (S) são expressas em 10-13segundos porque grande parte

das moléculas biológicas sedimenta a velocidades iguais ou superiores a essa.

Ex: albumina sérica: coeficiente de sedimente de 4,5S

Vírus da poliomielite: 150S

Mitocôndria: 15000- 65000S

Ribossomos: 80S

DNA de bacteriófago: T5 50S

tRNA de E. coli: 15 S

tRNA de levedura: 4S

Velocidades de separação de componentes

Tecido homogeneizado e filtrado.

A 2000 xg/10min: fração nuclear.

O sobrenadante fica com a fração pós nuclear.

Fração pós nuclear a 15000 xg/10min: fração mitocondrial.

O sobrenadante fica com a fração pós mitocondrial.

Fração pós mitocondrial a 100000xg/60min: fração microssomal.

O sobrenadante fica com a fração pós microssomal.

Fração pós microssomal a 300000xg/120min: polirribossomos e subunidade de

ribossomos.

O sobrenadante fica com o citossol.

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Centrifugação X Solventes

Na centrifugação diferencial usa-se meio aquoso de densidade baixa que separa o

solúvel no sobrenadante.

Na ultra-centrifugação pode ser usado gradiente de densidade para ultra

centrifugação zonal e ultra centrifugação em gradiente de equilíbrio de densidade

(isopínica).

Na ultra-centrifugação zonal usa-se um gradiente leve (como a sacarose) preparado

com uma concentração compatível com a do material a ser separado (entre 15% e

50%).

A densidade máxima do meio deve ser inferior á menos densidade das macro-

moléculas de interesse.

Ocorre uma migração das partículas em função de sua massa molecular. A taxa de

migração é fortemente definida pelo coeficiente de sedimentação (s). Ao fim do

procedimento há zonas ou faixas de material separado ao longo do gradiente.

Na ultra-centrifugação zonal uma centrifugação por longo período de tempo pode

levar à sedimentação não diferenciada.

Na ultra-centrifugação isopínica as espécies analisadas movem-se em um gradiente

até encontrarem um ponto em que sua densidade é equivalente à do meio, sem que

se desloque, pois ela flutua num colchão formado pelo gradiente. Diz-se então que a

partícula/molécula atingiu sua densidade de flutuação (densidade boiante). Mesmo

em uma centrifugação prolongada não há sedimentação por que a concentração do

gradiente é superior à maior densidade das partículas mais pesadas. Por isso para

o solvente é utilizado sal de alta massa molecular, como o cloreto de césio. Para

separação de moléculas como ácidos nucléicos (DNA e diferentes espécies de

RNA), ribossomos e lisossomos.

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ESPECTROFOTOMETRIA

Espectrofotômetro é o aparelho utilizado para quantificação do comprimento de luz

absorvido ou refletido por uma substância.

A cor é a luz resultante de vários comprimentos de onda que foram refletidos, assim,

uma substância que tem a cor vermelha sendo refletida, é por que absorveu a cor

azul.

No espectrofotômetro há um prisma que decompõe a luz em vários comprimentos

de onda. Uma fenda deixa passar apenas o comprimento de onde se quer analisar.

Através dessa fenda a luz atinge a substância colocada dentro de uma cubeta de

vidro ou quartzo. A luz que é refletida do outro lado da cubeta é medida por sua

intensidade.

Toda substância tem um padrão de absorção de energia característico. Cada

substância tem um espectro de absorção específico e um comprimento de onda

específico com o qual ocorre um máximo de absorção de luz.

Com esses dados um pesquisador pode saber, por exemplo, se uma amostra de

DNA está ou não contaminada com proteínas, e vice-versa.

Alguns dados relevantes são apresentados a seguir:

dsDNA - 1,0 A260 = g/mL = 0,15 mM/ número de pares de bases

ssDNA – 1,0 A260 = g/mL = 0,10 mM/ número de pares de bases

ssRNA - 1,0 A260 = g/mL = 0,11 mM/ número de pares de bases

Por exemplo: um fragmento de DNA com 100pb com leitura de A260 = 1,0 – 0,15

mM/100 = 0,0015 = 1,5 nM

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1g de um fragmento de DNA com 1000pb = 1,52 pmol = 9,1 x 1011 moléculas

1g do plasmídeo pUC19 (2686pb) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 moléculas

1g do plasmídeo pBR 322(4361pb) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 moléculas

1g de DNA do bacteriófago M13mp19 (fita dupla com 7249pb na forma) = 0,21

pmol = 1,3 x 1011 moléculas

1g de DNA do bacteriófago (48502pb) = 0,03 pmol = 1,8 x 1011 moléculas

1 pmol de um fragmento de DNA com 1000pb = 0,66 g

1 pmol de plasmídeo pUC19 (2686pb) = 1,77 g

1 pmol do plasmídeo pBR322(4361pb)= 2,88 g

1pmol de DNA do bacteriófago M13mp19(fita dupla com 7249pb) = 4,78 g

1pmol de DNA do bacteriófago(48502pb) = 32,01

1 Kbp de dNA pode codificar 333 aminoácidos = uma proteína de 37000 Da

10000 Da de proteína = 270 pb

50000 Da de proteína = 1350 pb

ELETROFORESE

A eletroforese é usada para separar partículas moleculares pequenas e visualizá-las

com coloração posterior.

O princípio da eletroforese consiste na separação das partículas por carga elétrica,

através de corrente elétrica imposta em superfície aquosa salina (o sal permite o

transporte de carga elétrica) que está em contato com um meio onde estão

depositadas as partículas. As mais leves chegam ao polo com carga contrária à sua

primeiro que as partículas com cargas mais pesadas. Lembrando que DNA e RNA

possuem carga negativa e, portanto, migram para o lado positivo, sempre.

Essas partículas podem ser de DNA, RNA ou proteínas que já foram clivadas em

várias partes. O meio ao qual serão depositadas deve ser sólido ou semi-sólido e

não pode interferir na estrutura da partícula e deve permitir o “deslizamento” para o

pólo com carga contrária à sua. Esse meio pode ser um papel de filtro, sílica em gel,

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UFT


membrana de acetato de celulose, gel de agarose, gel de amido ou gel de

poliacrilamida.

A solução salina também não pode interferir na composição das partículas, por isso

é usado solução-tampão como meio de transporte de elétrons.

Para a visualização das estruturas separadas é necessário recorrer a posterior

coloração do meio, que pode ser revelado a olho nu ou por fluorescência com ajuda

de luz ultravioleta ou quimiluminescência. Dá-se o nome de “banda” às estruturas já

separadas.

A direção do pulso elétrico pode ser em sentido único (negativo para positivo) ou em

orientação ortogonal, onde o sentido é alterado para zigue-zague para o caso de

separação de partículas muito grandes. Essa técnica é chamada de eletroforese em

gel de campo pulsado, pois o pulso elétrico é interrompido para mudança de

sentido.

Para o sucesso da técnica em sentido único, que é o mais comum, há dois fatores

prioritários a serem seguidos: a voltagem, corrente e potência devem ser constantes

e a temperatura sob a qual se realiza a eletroforese deve ser monitorada,

principalmente no caso de separação de moléculas de proteínas.

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UFT


Eletroforese em Gel

Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre, ed.Artmed, 2002.

No caso dos meios em gel as partículas se movimentam dentro dele. Antes da

semisolidificação é preciso colocar um pente no lugar onde serão depositadas as

partículas a serem separadas, pois no lugar dos dentes do pente formam poços

para o depósito das partículas.

A eletroforese em gel pode ser feita em posição vertical ou horizontal, com um tipo

de gel ou com dois tipos de gel.

O gel é preparado como a gelatina comum, a partir da agarose ou amido ou

poliacrilamida que semi-solidificam em temperaturas mais baixas que 50ºC.

A estrutura do gel depende da sua composição e cada estrutura apresenta uma

porosidade por onde vão transitar as partículas. Alguns géis apresentam uma malha

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UFT


mais estreita que outros. O que determina que as estruturas de cargas mais leves e

pesadas sejam mais bem separadas. Partículas mais pesadas indicam que os seus

tamanhos são maiores que as partículas de cargas mais leves.

Para ter um parâmetro são usados marcadores moleculares com pesos conhecidos

que migram ao lado das partículas analisadas. Eles devem ter a mesma natureza

das partículas.

O processo de eletroforese pode ser contínuo ou descontínuo. Na composição do

gel é utilizada uma solução tampão que pode ser a mesma que cobrirá o gel para

fazer a condução elétrica (sistema contínuo) ou pode ser diferente (sistema

descontínuo).

No sistema descontínuo há dois tipos de géis: o gel concentrador e o gel separador,

que é usado na técnica para separação de proteínas (gel de poliacrilamida).

A malha do gel de agarose é mais larga que a malha do gel de poliacrilamida,

assim, o gel de agarose permite a passagem, por exemplo, de DNAs com dezenas

e até mesmo centenas de quilobases, mas não diferem no peso de pares de bases

específicos. Já o gel de poliacrilamida pode separar um único par de bases, mas

apenas em moléculas com tamanhos de até algumas centenas de pares de bases.

Por isso são usadas as enzimas de restrição anteriormente à técnica de separação

em eletroforese, pois quebram as partículas em pedaços conhecidos.

Gel de Agarose

A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) linear extraído de algas

marinhas que dissolve em água fervente e gelifica quando resfria, formando redes

minúsculas.

O diâmetro dos poros da matriz formada é diretamente proporcional à concentração

do polímero utilizado.

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UFT


Poder de resolução do gel de agarose

Intervalo de tamanho de moléculas de DNA separadas em géis contendo diferentes concentrações

de agarose*

Concentração de agarose no gel

(% [m/v])

Faixa de tamanho de DNA dupla fita e

linear (Kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-3

2,0 0,1-2

*Adaptado de Sambrook e Russel, 2001.

Para a visualização do DNA a técnica pode ser acrescentada de brometo de etídeo

que é um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite

fluorescência violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução

de velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.

A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear

(III). A forma I migra mais rápido que a forma III em géis comuns. A forma II é a mais

lenta de todas.

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UFT


Gel de Poliacrilamida

Usado para técnica de separação de proteínas.

Pode ser usado o SDS (dodecil sulfato de sódio) na composição do gel.

A proteína deve ser previamente desnaturada por aquecimento na presença de -

mercaptoetanol para romperem as pontes de dissulfeto e os polipeptídeos

adquirirem a carga negativa do SDS.

A migração do complexo SDS-proteína não depende da conformação protéica, mas

do seu tamanho. Na saturação, cerca de 1,4g de SDS é ligado por grama de

proteína, o que corresponde a uma molécula de SDS para cada dois resíduos de

aminoácidos.

O sistema SDS-Page é formado por dois géis diferentes: o gel concentrador e o gel

separador.

O gel concentrador é formado por uma malha de grande porosidade (gel de

poliacrilamida 5%). Tem função de compactar a amostra em um pequeno volume,

depositando-a sobre a superfície - limite do gel separador como uma banda estreita.

O gel separador tem uma malha mais estreita (poliacrilamida a 8-20%) que tem a

função de separar os complexos SDS-proteína em função de suas massas

moleculares. O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita

entre os dois géis é a diferença de pH entre a constituição do gel e o tampão de

corrida utilizado. O tamanho dos poros diminui com o aumento da relação molar

bisacrilamida/acrilamida.

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UFT


Faixa efetiva de separação de proteínas no sistema SDS-PAGE

Concentração do Gel de Poliacrilamida*

(%)

Faixa Linear de Separação de Proteínas

(kDa)

15

12-43

10

16-68

7,5

36-94

5,0 57-212

* A relação molar acrilamida/bisacrilamida é de 29;1.Adaptado de sambrook&Russel,2001.

Para visualização das bandas de proteínas mergulha-se o gel, após a migração, em

corante comassie-blue ou sais de prata.

DNA


Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar: Quantidade de (T +C) é

sempre igual à de (A+G).

A quantidade de T é sempre igual à de A e C é sempre igual à de G, mas (A+T) não

precisa ser igual à de G+C).

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UFT


Essa proporção varia em indivíduos de espécies diferentes, mas é a mesma em

tecidos diferentes do mesmo organismo.

G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C é

mais estável que DNA com muito A-T.

Há um padrão na configuração do DNA:

Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar. Timina e Citosina são

moléculas menores ligadas ao açúcar.


Cada molécula de açúcar liga-se a um fosfato que se liga a outra molécula de

açúcar.

O tamanho da ligação entre açúcar –fosfato – açúcar é de 3.4 A.

O tamanho da ligação entre aproximadamente 10 grupos de ligações de pares de

bases é de 34 A.

Isso muda para aprox. 11 pares de bases em alta concentração de sal ou

desidratando o DNA. “In vivo “ou “in vitro” essa situação pode ocorrer se houver

formação de heterodúplices como DNA-RNAc ou dúplices RNA-RNA.

O giro da fita é pela direita, mas certas sequencias giram para esquerda (zDNA-

DNA zigue-zague).

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UFT


Segmentos específicos no DNA podem sofrer mudanças de sentido.


Uma mesma molécula de DNA pode se apresentar sob três formas ou topoisômeros

distintos.

A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear

(III).

Uma bactéria como a E.coli contém aproximadamente 4 milhões de pares de bases

em seu genoma. O genoma humano é composto por aproximadamente 3 bilhões de

pares de bases. A salamandra africana contém cerca de 50 bilhões de pares de

bases e o lírio tem cerca de 250 bilhões de pares de bases.

Em procariotos a maior parte do DNA parece ser codificante, já em eucariotos,

grande parte são sequencias repetidas ao longo de todo o genoma (DNA - não

codificante).

Gurupi/2010

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UFT


Sentido 5’- 3’


O fósforo diéster liga o carbono 5’ ao carbono 3’ do outro açúcar na fita. Quem se

liga à T, G, A ou C é o açúcar, sempre pelo carbono 1’.

A ligação do fósforo diéster e o açúcar se dá no sentido 5’-3’, o que faz com que a

torção da fita fique para a direita.

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UFT



PROTEÍNAS

As proteínas são sintetizadas a partir do código genético. “In vivo”, a ação da

síntese de proteínas ocorre nos ribossomos.

Para isso, as enzimas celulares sintetizam uma cópia funcional de um gene para

levar seu código genético até os ribossomos. Essa cópia funcional é chamada RNA

mensageiro, que é uma molécula muito parecida com o DNA.

Em uma segunda etapa os códons do RNAm são associados aos aminoácidos

corretos pelo RNA transportador.

Na terceira etapa, os aminoácidos são ligados para formar uma cadeia protéica. O

ribossomo que é formado de proteínas e RNA executa essa função.

Quando a cadeia protéica termina um sinal de terminação é adicionado à cadeia

fazendo com que o ribossomo não tenha mais como ligar aminoácidos e libere a

cadeia formada.

Existem 20 aminoácidos que se combinam para formar milhares de proteínas.

Uma proteína de tamanho médio requer cerca de 1200 bases de sequencias

codificantes.

Além da combinação entre aminoácidos, as proteínas podem se enovelar tendo

uma característica tridimensional, expondo ligações onde se encaixarão aos

receptores com estrutura química compatível.

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RNA

O RNA é formado por nucleotídeos compostos por açúcar, fosfatos e uma das

quatro diferentes bases orgânicas.

O RNA difere química e estruturalmente do DNA.

Diferença química: no lugar do açúcar desoxirribose, o RNA contém ribose e no

lugar da Timina, o RNA contém Uracila.

Gurupi/2010

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Diferença estrutural: apesar das bases do RNA também poderem formar pares

complementares, o RNA geralmente é formado por apenas uma única fita de

esqueleto açúcar-fosfato e bases. Embora seja capaz de parear com fitas simples

não forma dupla hélice, exceto em vírus.

SÍNTESE DO RNAm

Assemelha-se à replicação do DNA.


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A dupla hélice de DNA é desenrolada e as bases são expostas. Nucleotídeos que

estão no meio separados se pareiam com os nucleotídeos complementares da fita.

A Uracila se pareia com a Adenina. Ligações fosfodiésteres são formadas entre os

nucleotídeos e o RNAm recém sintetizado possui uma sequencia de bases que é

exatamente completar à fita molde de DNA.

O processo de usar uma fita molde de DNA para criar uma molécula de RNAm

complementar é chamado de transcrição.

Os RNA transportadores e ribossomais não são traduzidos em proteínas.

Diferenças entre transcrição e replicação

Na replicação do DNA ambas as fitas são usadas como molde para geração de

duas novas fitas para duas novas hélices.

Na transcrição, apenas uma fita simples de RNA é produzida e a nova molécula de

RNAm é liberada do molde conforme é sintetizada e a dupla hélice de DNA volta a

enrolar-se à medida que “solta” a fita de RNAm sintetizada.

Essa síntese só é possível através das RNA polimerases.


Gurupi/2010

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UFT


AÇÃO DA RNA POLIMERASE

A hélice do DNA contém milhões de pares de bases. A RNA polimerase reconhece

o início e o término dos pares de bases que são os constituintes de um gene, e a

partir daí liga os códons complementares e para de ligá-los quando há uma

sequencia no DNA que indica o término do gene.

Essa sequencia de pares de bases no DNA que indica o começo de genes é

chamada de promotor e a que indica o término de genes é o terminador.


RNAt

O ribossomo reconhece o RNAm e o prende na posição adequada para que seus

códons sejam “lidos” corretamente. A tarefa é traduzir o código que o RNAm traz do

DNA em aminoácidos e estes serão agrupados e determinarão a proteína formada.

No RNAt há um anticódon que é o complementar do RNAm que só se liga a uma

sequencia específica de três bases. Na outra extremidade do RNAt está um

aminoácido que é ligado a esse RNAt através de uma enzima, a aminoacil sintetase.

Assim, o aminoácido correto correspondente ao códon do RNAm é trazido ao

ribossomo e pode ser ligado à cadeia de aminoácidos em uma sequencia específica

que determinará a proteína. Esse processo é a tradução.

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TRADUÇÃO EM BACTÉRIAS

No RNAm há sinais, sequencias específicas de bases que têm complemento no

ribossomo de bactérias que fica a 8 e 13 nucleotídeos antes do códon de iniciação

(geralmente esse códon de iniciação em bactérias é o AUG). Essas sequencias são

formadas por 5’GAGG-3’ ou 5’-AGGA-3’. No RNAm também há uma sequencia de

terminação. Não existe um RNAt que se pareie com uma sequencia de terminação.

Uma proteína é a responsável pela terminação da tradução.

Como os sinais de começo e término de uma proteína estão no RNAm, estão

também no DNA. Por isso é importante saber reconhecer os sinais de comando das

bactérias que são os vetores de estudo em Biotecnologia.

Avanços da Biologia Celular e da Genética Molecular.São Paulo, ed. UNESP, 2009.

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ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Enzimas purificadas a partir dos organismos nos quais foram inicialmente

identificadas.

A nomenclatura é feita pelas iniciais desse organismo, incluindo a sua linhagem, e

por algarismos romanos que indicam a ordem em que foi encontrada a cepa.

Exemplo:

EcoR I, primeira enzima isolada de Escherichia coli, cepa R.

Para evitar a desnaturação das enzimas numa reação, a concentração de proteína

nunca deve ser inferior a 0,1 mg/mL. A fração V da albumina bovina (BSA) é uma

fonte de proteína neutra para estabilizar a enzima.

Geralmente são classificadas de acordo com os tipos de reações que elas

catalisam.

As mais utilizadas são: Nucleases e Ribonucleases, DNA polimerases, RNA

polimerases, Ligases, Fosfatases e quinases.

NUCLEASES E RIBONUCLEAES

Nucleases são responsáveis pela quebra enzimática da ligação fosfodiéster do DNA

e às vezes do RNA também e as ribonucleases são responsáveis pela quebra

enzimática da ligação fosfodiéster do RNA.

As nucleases têm atividade exonucleásicas ou endonucleásica, as ribonucleases

têm atividade endorribonucleásica.


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Além de reconhecer diferentes sítios-alvo, as diferentes endonucleases também

clivam em diferentes posições dentro desses sítios. Assim, são produzidas

moléculas com extremidades cegas ou com extremidades 5’ ou 3’coesivas.


EcoRI cliva as duas fitas do seu sítio de reconhecimento, originando extremidades

5’coesivas. Essas são chamadas de extremidades coesivas uma vez que aderem

rapidamente a outras moléculas clivadas com a mesma fita, que apresentam

extremidades de fita simples complementares, unindo-se por pareamento de bases.

NUCLEASES

Dentre outras, estão incluídas as endonucleases de restrição ou enzimas de

restrição.

Reconhecem pequenas regiões de 4 a 8 pb específicas do DNA, chamadas de sítio

de restrição, e clivam estas regiões em ambas as fitas de DNA.

Levam o termo “restrição” porque algumas enzimas específicas clivam o DNA

exógeno que o bacteriófago implanta na célula bacteriana. Para que essa enzima

não clive o próprio DNA, existem enzimas modificadoras que metilam o DNA

endógeno, modificando o sítio de restrição, impedindo ligação de enzimas

clivadoras.

Há enzimas de restrição que clivam o mesmo sítio no DNA, mas que foram isoladas

de microrganismos diferentes, estas são chamadas de isosquizômeros.

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As endonucleases de restrição I e III clivam o DNA fora do sítio de especificidade,

enquanto as do tipo II clivam dentro do próprio sítio.

Enzimas de restrição tipo II


Nuclease Bal 31, Nuclease S1, Desoxirribonuclease I (DNAse I), Nuclease

Microcócica, Exonuclease III.

As enzimas de restrição tipo II têm um padrão de clivagem previsível se for

conhecida a sequencia de DNA analisada. Funcionam reconhecendo uma

sequencia palindrômica, isto é, que possui um duplo eixo rotacional, tendo a mesma

seqüência quando lida no entido 5’- 3’ em ambas as fitas. Por exemplo:

5’- GAATTCC-3’, que é o sítio de restrição da EcoR I. Atua melhor em fita dupla de

DNA do que em fita simples.

São aplicadas em digestão total ou parcial de DNA para serem clonadas ou em

análise de restrição.

Nuclease Bal 31

São exonucleases 3’- 5’ que remove progressivamente nucleotídeos da extremidade

3’-OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas têm alta especificidade para DNA

fita simples. São aplicadas na deleção controlada a partir das extremidades de DNA

fita dupla e geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento.

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Nuclease S1

São endonucleases de fita simples que atuam melhor em DNA de fita simples do

que em RNA de fita simples.

São aplicadas para análise de híbridos de DNA-RNA para identificação de íntrons,

na identificação da seqüência terminal dos transcritos (S1 Nuclease Mapping) e na

remoção de bases salientes para produção de bases abruptas (a diferença está na

forma como as extremidades foram clivadas).

A ação dessa nuclease é interrompida com a adição de EDTA.

Desoxirribonuclease I (DNAse I)

São endonucleases que degradam DNA fita simples ou dupla.

São aplicadas para cortar moléculas de DNA antes de fazer marcação isotópica;

identificam regiões do DNA onde se ligam proteínas; removem DNA em

preparações de RNA; removem moldes de DNA após transcrição in vitro; detecta

regiões transcricionalmente ativas na cromatina.

Nuclease Microcócica

Têm atividade nucleásica não específica sobre DNA e RNA fita simples ou dupla.

São aplicadas para remoção de ácidos nucléicos de extratos celulares e para

estudos em cromatina.

Exonuclease III

São específicas para DNA fita dupla com terminal 3’-OH, atuando como

exonuclease 3’- 5’; removem grupos fosfatos da região 3’ terminal de DNA fita

simples e DNA fita dupla através da ação da parte 3’ fosfatase que apresenta e

funciona como endonuclease atuando assim especificamente para RNA e híbridos

DNA-RNA.

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São aplicadas como End-labelling de DNA fita dupla que têm extremidades

abruptas; geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento; fazem

deleção controlada de sequencias a partir de extremidades de DNA fita simples ( em

conjunto com uma endonuclease específica para fita simples, como a Nuclease S1)

e em técnicas de mutagênese.

RIBONUCLEASES

Ribonuclease A (RNAse A), Ribonuclease H (RNAse H), Ribonuclease T1.

São usadas para eliminar RNA, ou quando se mapeia, quantifica ou sequencia um

RNA.

Para o sequenciamento de RNA é preciso usar uma combinação de RNAses que

clivam em seqüências específicas, como as RNAses T1, U2 e CL3.

Ribonuclease A (RNAse A)

São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres na posição 3’ de uma

pirimidina.

São aplicadas na remoção de preparações de DNA.

Antes de usar essa enzima pela primeira vez, deve-se ferver a solução a 100ºC por

quinze minutos a fim de inativar eventuais contaminações com DNAse.

Ribonuclease H (RNAse H)

São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA em híbridos

DNA/RNA.

Atenção: estas não degradam RNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita simples

nem DNA fita dupla.

São aplicadas para eliminar de fita de RNAm após a síntese da primeira fita do

DNAc (é a fita de DNA sintetizada a partir de um molde de RNA – DNA

complementar), para facilitar a síntese da segunda fita de DNAc.

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Ribonuclease T1

São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA após um

resíduo G.

São usadas para sequenciamento de RNA, mapeamento e quantificação de

moléculas de RNA por proteção pela nuclease em conjunto com a RNAse A e

quantificação de transcritos feitos por transcrição in vitro a partir de um molde de

DNA sem G.

Dependendo da concentração de NaCl ela atua diferente. Em concentrações de

NaCl entre 0 e 100mM, a ribonuclease T1 cliva RNA de fita dupla, fita simples e a

fita de RNA em heteroduplex DNA:RNA.

Na concentração de NaCl 0,3M ou acima, atua somente sobre RNA fita simples.

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DNA POLIMERASES

Fazem a duplicação e reparo do DNA nas células vivas.

São agrupadas em três grupos de acordo com o molde (template) que utilizam:

DNA polimerase DNA – dependentes;

DNA polimerases RNA – dependentes;

DNA polimerases independentes de molde.


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DNA Polimerases DNA – Dependentes

DNA polimerases I, fragmentos Klenow, T4 DNA polimerase, T7 DNA polimerase,

Taq DNA polimerase.

Adicionam desoxirribonucleotídeos (dNTP) a uma extremidade 3’-OH de um

fragmento de DNA (ou RNA) que esteja pareado com uma molécula complementar

de DNA que serve como molde. A direção de síntese é sempre no sentido 5’- 3’, a

partir da extremidade 3’-OH do DNA iniciador (primer).

Os fragmentos Klenow

Algumas DNA polimerases tiram nucleotídeos da extremidade 5’ (exonuclease) ou

3’(exonuclease também). Quando ela corta a partir da extremidade 5’, pode ser

aproveitada junto com a DNAse I que corta o DNA de fita dupla para marcar a

molécula pela técnica de nick translation.

Quando a atividade de retirar nucleotídeos a partir da extremidade 5’ é indesejada,

trata-se a DNA polimerase I com uma protease que elimina a porção N- terminal da

molécula que tem atividade de retirada de nucleotídeos.

Por engenharia genética é possível obter o gene de DNA polimerase I truncada

(quebrada) na porção N-terminal. Quando o gene é transcrito, resulta uma

polimerase sem a porção N-terminal que recebe o nome de fragmento grande da

DNA polimerase de E. coli (por ser obtido através deste vetor) ou fragmento Klenow.

Quando a polimerase não se dissocia do DNA molde e adiciona nucleotídeos

continuamente a partir de um primer, diz-se que esse processo é a processividade

da polimerase. A maioria das polimerases tem baixa processividade, sendo uma das

exceções a T7 DNA polimerase que é usada para incorporar milhares de

nucleotídeos em reações de sequenciamento de DNA.

DNA Polimerase I

Geralmente age adicionando açúcar à ponta 3’ de uma cadeia de nucleotídeos.

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Tendo formas de trifosfato de desoxirribonucleotídeos como substrato e energia. A

energia para a ligação vem da própria quebra da ligação do trifosfato, sobrando

bifosfato e sendo adicionado um fosfato.


Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase), para isso, requer molde de DNA fita

simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.

Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’(ação exonucleásica), degradando

DNA fita dupla ou híbridos DNA-RNA a partir da extremidade 5’-PO4, liberando

nucleotídeos 5’ fosfatos ou pequenos oligonucleotídeos de até 10 nucleotídeos de

tamanho. Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica)

degradando a fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH, o que

remove os pareamentos errados de bases.

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É aplicada na marcação de DNA por nick translation e na síntese da segunda fita de

cDNA (em combinação com a RNAse H).

“In vivo” a reação para replicação do DNA pela polimerase I é muito lenta (

aproximadamente 20 nucleotídeos/ seg.) e muito abundante( aprox. 400 moléculas/

célula) e a polimerase I se dissocia do DNA após a incorporação de 20 a 50

nucleotídeos. Por isso os pesquisadores desconfiaram que a polimerase I não

poderia ser a única responsável pela maioria das sínteses de DNA.

Foi descoberto mais tarde que a polimerase III catalisa a síntese de DNA na

forquilha da replicação.

Fragmento Klenow

Age no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples,

iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH livre.

Pode agir retirando nucleotídeos (ação exonucleásica) no sentido 3’-5’, degradando

o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.

É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente;

na marcação de DNA por random priming; no sequenciamento de DNA pelo método

de terminação de cadeia; na síntese de segunda fita de cDNA; na mutação sítio-

dirigida, na síntese da segunda fita e na produção de sondas de DNA fita simples

por primer extension.

T4 DNA Polimerase

Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples e

iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.

Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica), degradando

ativamente o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.

Não age retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’.

É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente;

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na marcação de DNA fita dupla pela técnica de replacement synthesis; na geração

de subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento e em gap-filling na

manutenção sítio-dirigida.

T7 DNA Polimerase

Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples

iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.

Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’(ação exonucleásica) degradando o

DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.

Não retira nucleotídeos no sentido 5’-3’.

É aplicado no sequenciamento de DNA pelo método da terminação em cadeia e na

síntese da segunda fita de DNA.

Esta enzima substitui a Polimerase Klenow quando se deseja mais rapidez e

afinidade pelo molde de DNA.

Há uma versão dessa enzima (Sequenase) que não possui a capacidade de retirada

de nucleotídeos da extremidade 3’-5’, sendo ideal pra o sequenciamento de DNA,

pois é altamente processiva.

Taq DNA Polimerase

Foi isolada de bactéria termófilas.

Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo um molde de DNA fita

simples iniciador de DNA ou RNA cm extremidade 3’-OH.

Pode agir retirando nucleotídeos na extremidade 3’-5’(ação exonucleásica)

degradando DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 5’-PO4.

È aplicado em PCR; sequenciamento da DNA a altas temperaturas e em DNA

footprinting.

Existem outras polimerases termoestáveis no mercado: Bst Polimerase, rTth

Polimerase, Vente Polimerase, Pirostase, Hot Tub.

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DNA Polimerases RNA – Dependentes

AMV Transcriptase Reversa

Duplicam genomas baseados em RNA, como o dos retrovírus. Essas enzimas são

empregadas por esses organismos para sintetizar uma cópia de DNA a partir de

seus genomas de RNA. Esta é a chamada transcrição reversa, as enzimas que as

promovem são as Transcriptases Reversas.

Essas enzimas são multifuncionais, mas é mais empregada na síntese de DNA a

partir de um molde de RNAm, tendo como iniciador um oligo (dT).

A fita de DNA que é sintetizada a partir do RNA é chamada cDNA (DNA

complementar).

Também podem polimerizar uma molécula de DNA a partir de um molde de DNA.

Age como DNA polimerase 5’-3’requerendo molde de RNA fita simples ou fita dupla

e um iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.

Não possui atividade exonucleásica.


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Pode agir no sentido 5’-3’ e 3’-5’ como exorribonuclease degradando

especificamente o componente de RNA dos híbridos DNA-RNA. Essa atividade é

denominada “atividade tipo RNAse H”.

É aplicada para síntese da primeira fita de cDNA; no sequenciamento de DNA pelo

método da terminação de cadeia (sobretudo em moldes ricos em G e C), pois não

possui atividade exonucleásica 3’-5’; identificação de estruturas secundárias do

RNA e marcação da extremidade 3’ do DNA.

DNA Polimerase - Independente de Molde

Terminal Transferase

Enzima isolada de timo de novilho que catalisa a incorporação de dNTP

(ribonucleotídeo) a uma extremidade 3’-OH de DNA sem necessidade de molde.

Essa capacidade foi utilizada para tornar compatíveis as extremidades de insertos e

vetores de clonagem através da construção de extremidades homopoliméricas

complementares.

Terminal Deoxinucleotidil Transferase (Terminal Transferase)

Adiciona dNTP(ribonucleotídeo) à extremidade 3’-OH de DNA fita simples ou DNA

fita dupla, mas a reação ocorre com mais eficiência em fita simples. Para aumentar

a eficiência em fita dupla tem que adicionar Co++.

È aplicada na adição de cauda homopolimérica e na marcação de extremidade

3’-OH como 3’- dNTP(ribonucleotídeo), 3’NTP ou ddNTP marcados radioativamente.

RNA POLIMERASES

São as principais enzimas responsáveis pela transcrição do DNA em RNA.

Catalisam a adição de ribonucleotídeos a uma extremidade 3’-OH sem a

necessidade de um iniciador anelado.

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As RNA polimerases são divididas em três classes: DNA - dependentes; DNA –

independentes e RNA – dependentes RNA – dependentes (Replicases).

Responsáveis pela duplicação de certos genomas virais de RNA.


DNA– dependentes

Podem ter origem bacteriana ou viral.

Bacteriana:

RNA polimerase DNA - dependentes

RNA polimerase de E. coli responsável pelo reconhecimento das regiões -10 e -35

do promotor bacteriano. Têm baixa processividade “in vitro”, portanto são preferíveis

as RNA polimerases dos vírus SP6, T7 e T3.

RNA polimerases DNA – independentes

Poli (A) polimerase isolada de E. coli que não requer molde de DNA e que adiciona

resíduos de AMP a uma extremidade 3’-OH de RNA a partir de ATP.

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Polinucleotídeo fosforilase foi a enzima chave para a síntese das moléculas de RNA

que permitiu a elucidação do código genético. Age como a Poli (A) polimerase, mas

a partir de precursores de NDP.

RNA Polimerases DNA – Dependentes

RNA polimerase de E. coli

Transcreve a partir de promotores que possuem a sequencia consenso de

promotores de E. coli.

É aplicada em transcrição in vitro e na síntese de RNA marcado radiotivamente.

RNA polimerase de fagos (SP6, T3 e T7)

Têm transcrição altamente específica a partir de promotores dos fagos SP6, T3, T7.

É aplicada em produção de RNA anti-sense; na síntese de RNA marcado

radioativamente; na síntese de RNAm para tradução in vitro e no sequenciamento

de RNA.

RNA Polimerases DNA – Independentes

Poli (A) polimerase

Adicionam cauda poli (A) à extremidade 3’-OH de RNA fita simples.

É aplicada na marcação radioativa de RNA e na adição de cauda poli (A) para servir

de molde para oligo (dT) durante síntese de cDNA.

Polinucleotídeo Fosforilase

Adiciona ribonucleotídeo a uma extremidade 3’-OH de um RNA aceptor.

É aplicada na síntese artificial de moléculas de RNA.

LIGASES

As ligases catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos

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justapostos 3’-OH e 5’-PO4.

A reação ocorre entre moléculas de DNA fita dupla com extremidades abruptas ou

coesivas.


Podem ser de origem bacteriana ou viral.

A DNA ligase de E. coli de origem bacteriana usa como fonte de energia o NADH.

A T4 DNA ligase de origem viral usa como fonte de energia o ATP, por isso são

preferenciais em clonagens moleculares para ligar extremidades abruptas.

A RNA ligase une moléculas de RNA ou DNA fita simples na presença de ATP.

Há evidências de que a T4 RNA ligase estimula a atividade da T4 DNA ligase na

ligação de extremidades abruptas.

T4 DNA Ligase

Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades adjacentes 3’-OH e

5’- PO4 intramolecularmente em regiões de corte (nicks) ou entre extremidades

coesivas ou abruptas.

É aplicada entre moléculas de DNA para clonagem de fragmentos.

T4 RNA Ligase

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Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades 3’-OH e 5’-PO4 de

DNA fita simples e RNA fita simples.

È aplicada na união de moléculas de DNA fita simples ou RNA fita simples; no

aumento de eficiência da T4 DNA ligase em ligações de extremidades abruptas e na

marcação da extremidade 3’-OH de RNA.

FOSFATASES E QUINASES

Fosfatases são empregadas para desfosforilar extremidades 5’-PO4 de vetores de

clonagem para evitar o religamento dos mesmos após a adição da DNA ligase na

presença de insertos, assim aumenta o número de clones transformantes contendo

insertos clonados no vetor.

Podem agir em associação com as Quinases, pois a Polinucleotídeo Quinase

transfere um grupo fosfato terminal do ATP (y fosfato) à extremidade 5’-OH das

extremidades defosforiladas. Esse grupo terminal pode ser marcado radiotivamente.

As quinases também podem trocar o grupo 5’-PO4 do DNA para o ADP, mas essa

reação é menos eficiente que a atividade de transferência do grupo fosfato do ATP

ao 5’-OH.

Fosfatases

Fosfatase alcalina bacteriana (Bacterial Alkaline Phosphatase – BAP);

Fosfatase alcalina de intestino de novilho (Calf Intestinal Phosphatase – CIP);

Fosfatase alcalina de camarão (Shrimp Alkaline Phosphatase – SAP).

Removem grupos fosfato de extremidade 5’de rNA fita simples, DNA fita simples,

RNA fita dupla, DNA fita dupla, dNTP e NTP.

São aplicadas em defosforilação de DNA fita dupla para evitar autoligação de

vetores de clonagem; na defosforilação de DNA e RNA para posterior marcação da

extremidade 5’ com Polinucleotídeo Quinase e como componente de conjugado de

anticorpo para imunodecção.

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Quinases

T4 Polinucleotídeo Quinase

5’quinase: transfere y- fosfato de ATP para uma extremidade 5’-OH de DNA fita

simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.

3’fosfatase: remove grupos fosfato da extremidade 3’ de DNA fita simples, DNA fita

dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.

São usadas na marcação de extremidade 5’ de DNA ou RNA para sequenciamento

de DNA pela técnica de Maxam-Gilbert; no sequenciamento de RNA e na remoção

de 3’-PO4.

Cuidados quanto ao uso de enzimas de restrição:

Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos etc.) interferem na atividade das

enzimas, reduzindo a eficiência. A contaminação por polissacarídeos consiste na

principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses

carboidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações

biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases, e enzimas de restrição.

A contaminação por fenóis, e a consequente oxidação do DNA, pode ser evitada

agregando PVP, -mercaptoetanol ao tampão de extração. Em casos extremos, o

composto dietilditiocarbamato (0,1 M) pode ser adicionado.

SOLUÇÃO TAMPÃO

Soluções capazes de manter o pH constante mesmo que pequena quantidade de

ácido ou base seja a ela adicionada.

Para a escolha do tampão:

a) escolher um sistema ácido/base conjugado com pKa (da base ou do ácido ) mais

próximo possível do pH desejado.

pKa: ponto de inflexão da curva de neutralização de um grupamento ácido ou

básico.

A capacidade tamponante será maior em um pH próximo ao

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pKa, pois nessa faixa é

mais fácil absorver radicais OH- e H+ gerados nessa solução.

b) permitir o preparo de solução tampão de menor concentração depende da

capacidade tamponante do par ácido /base.

c) não alterar outras variáveis como a força iônica.

Deve-se evitar a ação de DNAses (nucleases), que podem degradar o DNA. Por

esse motivo os tampões de extração de DNA possuem pH por volta de 8,0

(enquanto o pH ótimo para ação de DNAses endógenas fica por volta de 7,0) .

TAMPÃO DE CORRIDA

A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na

qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica, a migração é

muito lenta, e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica, que

gera calor e pode levar à desnaturação das partículas analisadas.

Os tampões mais utilizados são: TAE e TBE.

TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)

Tem baixo custo, mas capacidade tamponante menor que o TBE.

Não deve ser utilizado em corridas longas nem em altas voltagens. Caso seja

necessário seu uso nesses casos, deve-se trocar o tampão no meio da corrida.

O TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA apresenta-se

sob a forma linear ou supernoveladas.

CTAB 2%

As membranas celulares devem ser rompidas para liberação do DNA: detergente

catiônico CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide – Brometo de

etiltrimetilamônio).

Os ácidos nucléicos devem ser separados de polissacarídeos, porque inibem a

ação de enzimas de restrição e torna a amostra de DNA excessivamente viscosa,

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interferindo na migração do DNA em corridas eletroforéticas. Polissacarídeos e

ácidos nucléicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente.

Os ácidos nucléicos são poliânions solúveis em água. Os sais de sódio e potássio

de ácidos nucléicos são insolúveis na maioria dos solventes orgânicos, incluindo

numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por solventes

orgânicos. O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e

dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo com o

DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.

NACL 5M

Precipitação do DNA

Neutralizante

EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0

Também para evitar ação de DNAses.

Este agente quelante imobiliza cations de Mg, que são cofatores para várias

endonucleases.

CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL)

Os ácidos nucléicos devem ser separados das proteínas. Desnaturam as

proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa.

A utilização de solução fenol/clorofórmio seguida de clorofórmio /álcool isoamílico

é usada para remover qualquer traço de fenol remanescente. Nesse processo as

proteínas desnaturadas ficam na interface das fases fenólica e aquosa.

INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA

Hidrólise do RNA

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-MERCAPTOETANOL 0,2%

Antioxidante: O DNA deve ser protegido da ação de compostos fenólicos, como

peroxidades e polifenoloxidades que oxidam o DNA (a contaminação por compostos

fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA marrom).

Ação: quebra parte do dissulfeto para a molécula ficar linear, eliminando a

contaminação por fenóis.

PVP (POLIVINILPIRROLIDONA)

Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis, eliminando a contaminação

por fenóis.

BROMETO DE ETÍDEO

É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência

violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de

velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.


BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)

Também antioxidante. Evita a oxidação de polifenóis.

Proteína neutra que estabiliza enzimas de restrição.

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DPEC

Inibidor de RNA. Para extração de RNA, é comum tratar as soluções com dietil

pirocarbonato (DEPC) de forma a desnaturar RNAses. Entretanto, em certos casos

e situações, apenas a esterilização em autoclave já é suficiente para inativar

ribonucleases. Não é necessário tratar o tampão de extração. Todos os tubos de

centrífugas, cadinhos, almofariz, pipetas (plásticas ou de vidro) devem ser

autoclavadas e secadas antes do uso, ou tratados com DEPC.

Não misturar DEPC e TRIS. Caso o protocolo necessite de TRIS livre de RNAse,

usar água livre de RNAse.

TRIS- HCl; pH 7,4

Solução neutralizante.

PROTEÍNA K

Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separação

do DNA das proteínas da cromatina.

ETANOL OU ISOPROPANOL

Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou

isopropanol).

ACETATO DE SÓDIO (SAIS)

Eliminação do RNA por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por

solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (Ex.

7,5 M de Acetato de Sódio), DNA e os RNA pequenos (principalmente RNA)

permanecem em solução, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.

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TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS

INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS

Tampão USO:

7,0 ml tampão fosfato monobásico

12,0 ml tampão fosfato dibásico

181 ml água destilada

Por último: 12 g bissulfito

Macerar alíquota de aprox.20g de folha positiva para vírus em 20 ml de tampão uso.

Usar Carburundum 400 mesh para esfoliar a folha de mudas novas em estágio de

até 3 folhas (folhas cotiledonares expandidas) e esfregar o macerado nas folhas.

Transplantar as mudas após 3 dias de inoculação.

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB

Tampão CTAB para extração de DNA vegetal de folhas cotiledonares

expandidas.

Estoque Concentração Final Volume Final 15 mL

CTAB 5% 2% 6 mL

NaCl 5M 1,4 M 4,2 mL

EDTA 0,5 M 20 mM 0,6 mL

Tris-HCl (pH8)1,0M 100 mM 1,5 mL

PVP* sólido 2% 0,3 g

-Mercaptoetanol** 0,2% 30 L

H2O completar o volume para 15 mL

PVP - polivinilpirrolidona; **Colocar imediatamente antes do uso e sob capela.

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PROCEDIMENTO:

Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.

Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido a

65ºC.

Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 minutos por 30 minutos suavemente.

A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.

Adicionar 1 volume de clorofórmio( álcool isoamílico) ou trisol e agitar o tubo

manualmente ou com agitador por 10 min.

Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm).

Transferir o sobrenadante para outro tubo.

Repetir a extração com clorofórmio ou trisol e agitar o tubo manualmente ou com

agitador por 10 minutos.

Centrifugar por 10 minutos a 5000g (8000rpm).

Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.

Opcionalmente, adicionar RNAse a uma concentração final de 100mg/ml e incubar

a 37ºC por 30 min.

Adicionar 0,6 volumes de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto

gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo.

Se o complexo DNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse

DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o DNA não aparecer ou ficar

floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 minutos e descartar o

sobrenadante.

Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de DNA

e polissacarídeos.

Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado

se soltar do fundo, centrifugar por 3 minutos a 10000g (12.000 rpm) para “grudar” o

precipitado no fundo do tubo.

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Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar.

O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que

pode dificultar a ressuspensão do DNA.

Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4ºC por uma hora ou

mais.

Para uma purificação posterior, seguir para a etapa de acetato de amônio ou fazer

purificação por gradiente de CsCl.

Maceração 15 ml de tampão CTAB + um volume de Clorofórmio Centrifugado

Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio Centrifugado

Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio:

Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes e RNAse:

Misturar por inversão de tubo suavemente:

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Filamento de DNA Lavar precipitado de DNA Inverter tubo para secar

com etanol 70%

Dissolver o precipitado em 200 a 500 L de TE

Sem RNAse, nem desproteinização, os compostos celulares apresentam-se assim, após

centrifugação:

1ºProteína, 2°DNA, ºR

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E

DOYLE

O DNA de plantas será extraído de acordo com protocolo modificado de Doyle e

Doyle (l990). Esse método foi adaptado de um método proposto por Saghai-Maroof

et al. (1984). Ler considerações em Ferreira e Grattapaglia (1995) (pg 121 a 139).

1. Coletar as amostras de folhas jovens e saudáveis das plantas, evitando áreas

atacadas por pragas e doenças. De modo geral devem-se lavar as folhas em água

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corrente, usando, sempre que necessária água sanitária e/ou sabão. Enxaguar, e

em seguida rinsar em água destilada, e secar com papel toalha. Esse material pode

ser congelado, liofilizado, seco em estufa a aproximadamente 4oC, ou usado

diretamente.

2. Utilizar cerca de 150 mg de lâminas de folha frescas ou 50 mg de folhas

liofilizadas ou secas. As amostras serão trituradas em almofariz na presença de

nitrogênio líquido.

Uma possibilidade é utilizar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos

Eppendorf de 1,5 ml. O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o

tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo.

3. O material será transferido para um tubo de centrífuga, e 650 1 do tampão de

extração será adicionado:

10 ml______________________________

2% CTAB 0,2 g do produto

1.4 M NaCl 2,8 ml do estoque 5 M NaCl

100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH 8,0

20 mM EDTA, pH 8,0 400 l do estoque 0,5 M EDTA, pH 8,0

1% polivinilpirrolidona MW10,000 0,1 g do produto

4. Adicionar a uma alíquota do tampão a ser usado, pouco antes do uso:

0,2 % -mercaptoethanol

50g ml-l de proteinase K

5. Misturar os tubos em vórtex, e colocá-los em banho-maria a 55oC por 60 minutos.

6. Adicionar 650 l de clorofórmio: álcool isoamil (24:1) e misturar até formar uma

emulsão.

7. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.

8. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para

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não pipetar a interfase. Caso o volume da fase superior não for superior à fase

intermediária com fragmentos de tecido, adicionar mais tampão e misturar

vigorosamente e re-centrifugue.

9. Adicionar 200 l.tubo-1 do tampão de extração sem proteinase K e -

mercaptoetanol e adicionar 650 l de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), misturando

até formar uma emulsão.

10. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.

11. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para

não pipetar a interfase.

12. Repetir esses três passos anteriores mais uma vez.

13. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um

volume igual de isopropanol.

14. Centrifugar o DNA por 5 minutos a 12000 rpm.

15. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e

secar ao ar ou sob vácuo num dessecador.

16. Ressuspender o DNA em 20 l de tampão TE contendo ribonuclease [RNAse]

(10g.ml-l). A RNAse deve ser fervida dependendo da origem comercial. Várias

preparações são contaminadas por DNAses, que são inativadas pela fervura,

enquanto que as RNAses não são (demonstrando a resistência dessas enzimas).

Em geral prepara-se estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris-HCl

(pH 7,5) e 15 mM NaCl; aquecer em água fervente por 15 minutos e resfriar

lentamente a temperatura ambiente. Fazer alíquotas de 1 ml e armazenar a –20oC.

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MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS

EUCARIÓTICAS

Preparação de DNA de células eucarióticas (Sambrook&Russel, 2001). Método

adequado para Southern Blot e para construção de banco genômico por obter um

DNA genômico de alta qualidade de elevada massa molecular.

Soluções e material

TBS

Tris-HCl 20mM; pH7.4

NaCl 150mM

Proteinase K

Tampão de extração

Tris HCl 10 mM ; pH 8.0

EDTA 0,1M

SDS 0,5%

RNAse a 20 g/mL

Dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria

por vinte minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em

eppendorf de 1,5 mL a -20ºC.

Fenol equilibrado

1 volume de fenol

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1 volume de Tris 1M

B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v)

B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)

Solução equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl 200mM

Etanol absoluto

Etanol 70% (v/v)

TE

Tris-HCl 10mM; pH8.0

EDTA 1mM; pH 8.0

Solução de ácido cítrico / glicose

Ácido cítrico 0,48 g

Citrato de sódio 1,32 g

Glicose 1,47 g


Materiais: Incubadora com agitação, tubos de vidro e plástico, centrífuga, bastão de

vidro em forma de gancho.

Método

1. Usar 0,5 mL de TBS para raspar as células da placa de cultura

2. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga e colocar no gelo

3. Lavar a placa 1x com 1 mL de TBS e juntar a primeira suspensão (pode ser

utilizado 0,5 g de tecido mole).

4. Centrifugar a 1500xg/10 minutos a 4ºC. Ressuspender as células em 5 a 10

volumes de TBS gelado e repetir a centrifugação.

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5. Transferir a solução para um enlermeyer (para uma suspensão de 1 mL de

células, usar frasco de 50 mL) e adicionar 10 mL de tampão de extração para cada

1 mL de suspensão de células

6. Incubar a 37ºC por 1 hora

7. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 g/mL. Misturar

lentamente com um bastão de vidro.

8. Incubar a 50ºC por 3 horas

9. Resfriar a temperatura ambiente

10. Transferir as células para um tubo de centrífuga e adicionar igual volume de

fenol equilibrado. Misturar lentamente.

11. Centrifugar a 5000xg/15 minutos à temperatura ambiente

12. Transferir a fase aquosa para um tubo limpo e repetir a extração mais duas

vezes.

13. Para se obter DNA de alta massa molecular (= 200Kb), depois da 3ª extração

com fenol, dialisar a fase aquosa a 4ºC contra 4 litros de uma solução de Tris-HCl

50mM; pH8.0; EDTA 10mM até que a A270 do dialisado esteja menor que 0,05.

14. Para isolar DNA com tamanho entre 100 e 150 Kb, transferir a fase aquosa final

para um tubo de centrífuga novo e adicionar 0,2 volumes de etanol e, usando um

bastão de vidro, enrolar o DNA. Se o DNA precipitado tornar-se fragmentado,

coletar por centrifugação a 5000 xg/5min à temperatura ambiente. Lavar o DNA com

etanol 70%.

15. Secar e ressuspender o DNA em 1 mL de TE para cada 5x106 células. Deixar o

DNA dissolvendo na geladeira (4ºC) durante a noite.

16. Estimar a concentração por espectrofotometria a 260nm ou usar 1/10 do volume

final para análise em gel de agarose.

17. Preparação de DNA de tecidos

Mesmo protocolo a partir do item 7. Congelar o tecido em nitrogênio líquido e

pulverizar usando cadinho. Deixar o nitrogênio evaporar e adicionar ao tecido

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aproximadamente 10 volumes de tampão de extração e transferir a suspensão para

um tubo de centrífuga. Em seguida iniciar passo 7.

Obs: Ao trabalhar com DNA cromossomal usar pipetas de grosso calibre ou cortar

as pontas das pequenas, pois o pequeno diâmetro pode causar quebra mecânica do

DNA.

Estimativa de Concentração de DNA, Após Sua Extração

Quantificação de DNA (e RNA) Através de Espectrofotometria

O DNA de fita simples absorve mais que o DNA de fita dupla helicoidal por que as

bases estão encontradas no interior das hélices. Essa informação permite monitorar

por espectrofotometria o momento da desnaturação da fita dupla, que é de rápida

transição,

que é caracterizada por aumento da absorbância da mistura analisada (efeito

hipercrômico).

Ao contrário dos peptídeos, as bases aminadas nos ácidos nucléicos são

cromóforos fortes. As 5 bases encontradas no DNA ou RNA absorvem entre 250 e

280nm. O padrão de absorção típico de proteínas é a 280nm. O padrão de absorção

típico de DNA é à 260nm.

*Razão ótima entre A260/ A280

DNA 1,8 - 1,9

RNA 1,9 – 2,0

Quando há proteínas, esses valores são diminuídos.

Campos aromáticos (fenóis) também interferem e eles são usados na purificação de

DNA e RNA.

Espectrofotometria para avaliação de pureza, e quantificar a partir do passo 8.

1. Diluir a amostra de DNA 1:500 em 1mM Tris-HCL; pH 7.5

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2. Preparar o TE: (10mM tris-HCL; pH 8.0; 1mM EDTA)

3. Adicionar 1mL de TE à cubeta de quartzo e zerar a 260 nm com o branco

(branco=TE).

Não usar cubeta de vidro que é opaca á radiação ultravioleta.

4. Adicionar 1mL da diluição na cubeta (sem o TE)

5. Ler a 260nm

6. Repetir as leituras em 230, 280 e 320 nm

Se o aparelho não for de feixe duplo, zerar com o branco em cada comprimento de

onda.

7. *Avaliar a pureza: A260 /A280 >ou igual 1,8

A320< 0,1 . A260

8. Calcular a [DNA] ou [RNA] conforme a fórmula mais conveniente

A estimativa da concentração de DNA depende do tipo e quantidade de amostra

disponível. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nível de

contaminação por proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou outros ácidos

nucléicos, a estimativa por espectrofotômetro, medida pela absorbância das bases a

260 nm consiste num método simples, rápido e com certa precisão.

Para quantificação de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm até 320 nm. A

leitura a A260nm permite o cálculo da concentração de ácidos nucléicos na amostra.

Uma DO (Densidade óptica) de l corresponde aproximadamente a 50 g ml-1 para

DNA dupla fita, 40 g ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 g ml-1 para

oligonucleotídeos.

*A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da pureza dos

ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem valores de DO260/DO280

entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminação com fenol ou proteínas, a

relação DO260/DO280 será muito menor, e a precisão nas quantidades de ácidos

nucléicos será baixa.

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Espectrofotometria Para Quantificação de DNA

Nessa prática utilizaremos o espectrofotômetro, gel de agarose, fluorômetro e placa

de Petri com padrão.

Para leitura a 320nm:

Ligar o espectrofotômetro 15 minutos antes.

1 . Colocar o comprimento de onda para 320 nm.

2. Fazer uma solução diluída em água da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou até

1: 1000).

3. Zerar o instrumento com água em Abs320nm.

4. Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm

5. Estimar a concentração de DNA pela fórmula

(Abs260nm – Abs320nm) x 50 x fator de diluição = [DNA] em g ml-1

Obs. Existe um superestimativa da concentração por espectrofotômetro devido a

impurezas na solução.

6. Fazer um estoque de trabalho com a concentração de 5 ng l-1

Para leitura a 260nm:

Para quantificação: Diluir a 1:1000 ou 1:500 em água ou solução tamponada com

Tris 1 mM, pH 8.0. ler a 260 nm da amostra e do branco

Fita dupla [ds DNA (/mL)] = 50 . A260 . diluição

Fita simples [ss DNA (/mL)] = 33 . A260 . diluição

RNA [RNA (g/mL)] = 40 . A260 . diluição

Oligonucleotídeos sintéticos [DNA (pmol/L)] =_ 100 . A260 . diluição___________

1,5 Na + 0,71 Nc + 0,2 Ng + 0,84 Nt

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Porque a diferença dos sintéticos: como a estrutura molecular modifica a absorção,

tem que adaptar a fórmula, pois os sintéticos de DNA só são obtidos na forma Cis e

os normais são Trans.

O uso de protocolos de extração de DNA simplificados, que utilizam pouco material

de origem, ou possuem poucos passos de purificação, tendem a produzir ácidos

nucleicos com maior contaminação.

Em plantas tropicais, existe um grande problema de contaminação com polifenóis e

polissacarídeos. Nesses casos, a estimativa por espectrofotometria não permitem

uma determinação acurada da concentração de DNA.

Nesse caso, o método de escolha consiste na fluorometria. A amostra de DNA a

ser estimada é tratada com um corante específico para DNA dupla fita (ex. Hoechst

33258), e esse corante é excitado a um comprimento de onda (365 nm) e com

emissão a 460 nm proporcional a concentração de DNA. RNA, proteínas e

nucleotídeos não afetam as leituras. (ver descrição na página 124-125 de Ferreira e

Grattapaglia, 1995).

Outros métodos empregados utilizam a característica da fluorescência em

ultravioleta induzida pela intercalação de brometo de etídeo na dupla fita de DNA.

A fluorescência é proporcional à concentração de DNA, e pode-se determinar a

quantidade de DNA numa amostra por comparação com padrões conhecidos. A

comparação de fluorescência pode ser feita num mini-gel, que permite também a

separação de DNA do RNA. Uma outra possibilidade é aplicar a amostra numa

placa de petri com 1% agarose contendo brometo de etídeo (0,5 mg ml-1), e

comparar com padrões. Manter a placa a 37'C por cerca de 30 minutos e observar

no transiluminador. (usar 0,5 g de agarose 1% em 50 ml de tampão TAE, adicionar

5 l de brometo de etídeo 10 mg/ml e analisar alíquotas de 2 L).

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ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL

Depois de completada a remoção da fase aquosa, como descrito no protocolo de

isolamento de RNA, o DNA pode ser isolado na interfase e fase fenólica a partir do

homogeneizado inicial.

Seguindo precipitação e uma série de banhos, o DNA é solubilizado em 8mM

NaOH.

O DNA recuperado a partir de tecidos e culturas celulares permite o uso de reagente

Trizol para a determinação do DNA contido na análise de amostras.

Simultâneas extrações de DNA genômico permitem normalização de resultados de

Northern Blot por DNA genômico em vez de maior variação de peso de RNA total ou

tecido. (Dependendo da fonte, o pellet de DNA obtido pode requerer purificação -

ex. extração por fenol - primeiramente para outras aplicações).

Reagentes requeridos:

Etanol

Citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol

Etanol 75%

NaOH 8 mM

Exceto sob outros aspectos, o experimento é transcorrido entre 15 a 30ºC.

1. PRECIPITAÇÃO DE DNA

Remover a fase aquosa remanescente demasiadamente a interfase e precipitar o

DNA da fase orgânica e da interfase com etanol.

Adicionar 0,3 mL de 100% de etanol por 1 mL de reagente Trizol. Reagente usado

pela homogeneização inicial, e misturar amostras por inversão. Depois estocar as

amostras entre 15 a 30ºC por 2 a 3 minutos e sedimentar o DNA por centrifugação

por não mais de 2.000 xg por 5 min entre 2 e 8ºC.

Remover cuidadosamente. A fase aquosa é crítica para a qualidade do isolado de

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DNA.

2. LAVAGEM DO DNA

Remover o sobrenadante etano-fenol e se desejar, salvar este para precipitação de

proteínas.

Lavar o pellet de DNA duas vezes numa solução contendo 0,1 M de citrato de sódio

em 10% de etanol. Usar 1 mL da solução por 1 mL de reagente Trizol usado na

homogeneização inicial.

Para cada lavagem, estocar o pellet de DNA em solução de lavagem por 30 minutos

entre 15 a 30ºC (com mistura periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre

2 e 8ºC.

Seguindo estas duas lavagens, suspender o pellet de DNA em 75% de etanol (1,5-2

mL de etanol 75% por 1 mL de reagente Trizol), estocar por 10-20 minutos entre 15

e 30ºC (com agitação periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 a

8ºC.

Uma lavagem adicional em solução de citrato de sódio a 0,1 M (em etanol 10%) é

requerida para grandes pellets contendo 200g de DNA ou grandes quantidades

de material que não DNA.

3. REDISSOLVENDO O DNA

Secar o DNA ao ar de 5 a 15 minutos em tubo aberto. (Não secar em centrífuga;

isso fará ficar mais difícil para dissolver).

Dissolver o DNA em NaOH 8 mM de modo que esta concentração de DNA seja 0,2-

0,3 g/L.

Tipicamente, adicionar 300-600 L de NaOH 8 mM para DNA isolado de 107 células

ou 50-70 mg de tecido.

Ressuspendendo em base fraca é ALTAMENTE recomendável desde que o isolado

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de DNA não ressuspenda bem em água ou em Tris.

O pH de NaOH 8 mM é apenas 9 e deveria ser facilmente ajustado com TE ou

HEPES, uma vez que o DNA está na solução. Para este estágio, a preparação de

DNA (especialmente de tecidos) pode conter material gel insolúvel (fragmentos de

membranas, etc.). Remover o material insolúvel por centrifugação de >12.000 xg por

10 minutos.

Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo.

O DNA solubilizado em NaOH 8 mM pode ser estocado toda noite a 4ºC; para

períodos prolongados, amostras podem ser ajustadas com HEPES para pH 7-8 e

suplementados com 1 mM de EDTA. Uma vez que o DNA é ajustado, pode ser

estocado a 4º C ou -20ºC.

Quantificação e Expectativa de Rendimento de DNA

Uma alíquota da preparação de DNA solubilizada em NaOH 8 mM homogeneizada

com água e a solução final medir a A260.

Calcular o teor de DNA usando o valor A260 por duplo traçado de DNA.

Uma unidade A260 equivale a 50 g de duplo traçado de DNA/mL.

Para calcular o número de células em amostras analisadas, admitir que uma porção

de DNA por 1 x 106 células humanas diplóides (e de ratos e camundongos) originais

equivalem a 7,1 g, 6,5 g e 5,8g respectivamente.

Aplicações:

Amplificação de DNA por PCR

Depois de redissolvido o DNA em NaOH 8 mM, ajustar o pH para 8.4 com HEPES

0,1M. Adicionar entre 0,1 e 1,0 g de amostra de DNA para sua reação de PCR,

misturar e aplicar o protocolo de PCR padrão.

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Reação de Restrição de Endonuclease

Ajustar o pH do DNA para um valor requerido usando HEPES. Alternativamente,

amostras podem ser dualizadas em preparação para 1 mM de EDTA; pH 8.0. Usar

3-5 unidades de enzimas por micrograma de DNA. Usar as condições

recomendadas pela fábrica das enzimas em particular, e permitir fazer o processo

da reação entre 3 a 24 horas. Num ensaio típico, 80-90% do DNA é digerido.

Ajustamento de pH de amostra de DNA em NaOH 8 mM:

pH Final HEPES 0,1 M pH Final HEPES 1 M (L)

8.4 86 7.2 23

8.2 93 7.0 32

8.0 101

7.8 117

7.5 159

Notas para isolamento de DNA:

1. A fase fenólica e interfase podem ser estocadas entre 2 e 8ºC durante a noite.

2. Amostras suspensas em etanol 75% podem ser estocadas entre 2 e 8ºC por

meses.

3. Amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser estocadas toda a noite entre 2 e

8ºC. Para estocagem de longos períodos ajustar o pH para 7-8 e ajustar a

concentração de EDTA para 1 mM.

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Guia de Solução de Problemas

ISOLAMENTO DE DNA

* Expectativas de rendimento de DNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura

celular

Fígado e rim, 3-4 g

Músculo esquelético e cérebro e placenta, 2-3 g

Células humanas, ratos e camundongos (1 x 106 cultura celular), 5-7 g

Fibroblastos, (1 x 106 cultura celular) 5-7 g

* Baixo rendimento

Homogeneização incompleta ou lise de amostra.

Pellet de DNA final não dissolvido completamente.

* Razão A260/280 < 1.70

Amostra de DNA foi diluída em água ao invés de TE primariamente para analise

espectrofotômetra.

O fenol não foi suficientemente removido da preparação de DNA. Lavar o pellet de

DNA uma vez adicional com citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol.

* Degradação do DNA

Tecidos não forma imediatamente processados ou refrigerados depois de remover

do animal.

Amostras usadas para isolamento ou a preparação isolada de RNA são estocadas

entre -5 e -20ºC ao invés de entre -60 e -70ºC.

Amostras foram homogeneizadas com uma Polytron ou outra homogeneização de

alta velocidade.

* Contaminação por RNA

Incompleta remoção de fase aquosa.

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Pellets de DNA insuficientemente lavados com citrato de sódio 0,1 M em 10% de

etanol.

* Outras aplicações:

Primariamente usar para amplificação em PCR, ajustando o pH para 8.4.

Para digestão do DNA com restrição de endonucleases, ajustar o pH para o valor

desejado, usar 3-5 unidades de enzima por micrograma de DNA e permitir que a

reação seja feita até 3-24 horas dentro das condições ótimas da enzima em

particular.

Tipicamente 80-90% do DNA é digerido.

VISUALIZAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO

Gel de Eletroforese

A eletroforese em gel permite o fracionamento eficiente de ácidos nucléicos, e

possui um importante papel analítico, e às vezes um papel preparativo. A matriz de

separação usada é normalmente agarose e seus derivativos. Outra possibilidade

empregada é o gel de poliacrilamida, usada normalmente para o fracionamento de

moléculas de baixo peso molecular (i.e. < 1 kilopares de base). O poder de

resolução da poliacrilamida permite a detecção de diferenças de tamanho de até um

par de bases, comumente usada em géis de sequenciarnento e microssatélites. Os

géis podem ser nativos (sem tratamento) ou desnaturantes (com a adição de uréia,

formamida etc.) para evitar a formação de estruturas secundárias, evitando a

interferência na mobilidade através do gel.

Os ácidos nucléicos migram com base nas diferenças de peso molecular. De modo

geral, todos ácidos nucléicos possuem aproximadamente uma densidade de carga

por base, e a conformação da molécula em geral é semelhante. Portanto, a

dificuldade de penetração no gel é proporcional ao peso molecular. A mobilidade é

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aproximadamente inversamente proporcional ao logaritmo do peso molecular.

Parâmetros que afetam a mobilidade do DNA em gel eletroforese:

1. Concentração de agarose: com a maior concentração de agarose, a separação

de fragmentos maiores é reduzida. Menores concentrações facilitam a separação de

fragmentos de maior peso molecular. A faixa de trabalho encontra-se entre 0,5% até

2% de agarose.

2. Gradiente de voltagem: expressa em V/cm. Consiste no ponto crítico na

separação de fragmentos de DNA. Correndo um gel sob alto gradiente, reduz

tremendamente a separação de fragmentos de alto peso molecular, apesar de ser

aceitável usá-lo para checar a qualidade de digestão (teste mais rápido). Entretanto,

a separação típica de digestões usando enzimas de restrição é mais bem conduzida

a baixos gradientes (l a 2 V/cm) por toda a noite. O problema consiste na difusão

dos fragmentos de baixo peso molecular (<1 kpb) e resultam em bandas menos

distintas. Esses fatores devem ser considerados dependendo do uso e análise.

Como aproximação, a distância de migração de um fragmento de DNA é

proporcional ao log do seu tamanho. Ao plotar migração por peso num papel semi-

log (antigamente!), obtinha-se uma curva padrão com o peso dos fragmentos e peso

desconhecido. É sempre recomendável incluir padrões de peso molecular em todos

os géis.

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Preparação de Gel de Agarose:


Preparar gel de 0,7 a l % para analisar qualidade e quantidade do DNA

1. Pesar l g de agarose por 100 ml de tampão de corrida l x TAE (estoque 50x) num

erlenmeyer e cobrir com vidro ou plástico e nunca papel alumínio.

2. Aquecer por cerca de 2 minutos em forno de microondas até ferver.

3. Misturar com cuidado, pois a solução ferve para fora do frasco.

4. Esperar a solução esfriar até cerca de 50ºC (ponto que tolere encostar na sua

pele), para evitar danos à forma do gel.

5. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com o pente em posição.

6. Esperar esfriar e remover bolhas com ponteiras.

7. Remover o pente com cuidado (levantar um lado primeiro com cuidado!).

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8. Colocar o gel na cuba e completar o volume do tampão até cobrir o gel

9. Enquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel

10. Adicionar o volume necessário de amostra num tubo (1 a 5 l), e acrescentar o

tampão de amostra (1 l) contendo azul de bromofenol. A função do tampão da

amostra é aumentar a densidade (com glicerol ou sucrose), e o azul de bromo fenol

corre no gel com tamanho equivalente a 300 pares de base.

11. Transferir as amostras para os poços do gel

12. Conectar os eletrodos à fonte e ligar. Os ácidos nucléicos encontram-se no pH

do tampão TAE carregados negativamente e migram para o positivo - correm para o

vermelho!

13. Após a corrida, transferir o gel para uma bandeja contendo brometo de etídeo

em água (10 l de uma solução 10 mg/ml de brometo de etídeo em 500 ml de água)

e agitar com cuidado por 20 minutos - BROMETO DE ETÍDEO É CARCINOGÊNICO

E MUTAGÊNICO - USE LUVAS SEMPRE QUANDO MANIPULÁ-LO.

14. Observar sob luz ultravioleta no transiluminador. Observar a presença de rastros

indicadores de RNA; formação de banda simples de DNA; comparar a intensidade

das bandas das amostras; detectar a presença de degradação e/ou contaminação

nas amostras.


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MULTIPLICAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO

Princípios do Método Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Copia e amplifica as sequencias específicas de DNA de até 1 KB de comprimento.

A enzima DNA polimerase I foi isolada de bactérias termoestáveis (Termus

aquaticus, por isso o nome Taq. Polimerase), portanto, não sofre desnaturação pelo

calor alcançado com o termociclador.

São comumente empregados 20 ciclos para amplificação de DNA, o que dá mais ou

menos 1 milhão de cópias do DNA original.

O primer pode ser específico para uma parte do DNA, excluindo assim os exons, ou

para a fita completa.

Para utilizar o PCR é preciso conhecer a sequencia de uma região curta do DNA em

cada extremidade da sequencia maior que se deseja copiar. Essas sequencias

curtas são usadas para especificar os primers de oligonucleotídeos.

O método consiste em ciclos repetidos de desnaturação, anelamento e síntese de

DNA.

O DNA de dupla hélice contendo a sequencia a ser copiada e amplificada é

adicionado com excesso de molar de dois oligonucleotídeos de DNA de hélice única

(os primers).

O primeiro primer é idêntico à extremidade 5’ da fita de DNA a ser copiada e o

segundo primer é idêntico à fita de DNA de sentido inverso na extremidade 3’.

* Como o DNA de dupla hélice é antiparalelo, o segundo primer também é o

complemento invertido da hélice de sentido normal.

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Início:

Desnaturação do DNA de dupla hélice em altas temperaturas e resfriamento para se

reanelar.

No reanelamento o primeiro primer (em excesso molar) irá hibridizar com a

extremidade 3’ da hélice de sentido inverso e o segundo primer (também em

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excesso molar) irá hibridizar com a extremidade 3’ do sentido certo.

A mistura reanelada é incubada com DNA polimerase I e com todos os quatro

trifosfatos de desoxinucleotídeos (A, T, G, C) (a-substratos) para permitir que novo

DNA seja sintetizado.

A DNA polimerase I irá estender a extremidade 3’ de cada primer ligado para

sintetizar o complemento dos moldes de DNA de hélice única (a).

O segundo ciclo é idêntico ao primeiro.

O produto do PCR pode ser lido em gel de agarose (b), por exemplo.

Variação do PCR

PCR-Transcriptase reversa ou RT-PCR

Usa o RNA extraído da amostra e dele se faz cópia do DNA.

O DNA é replicado como no PCR normal.

O RT-PCR é usado para análises de translocações cromossômicas.

EXTRAÇÃO DE RNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB

PROCEDIMENTO:

Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.

Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido a

65ºC.

Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 minutos por 30 minutos suavemente.

A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o RNA.

Adicionar 1 volume de trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por

10 minutos.

Centrifugar por 10 minutos a 5000g (8000 rpm)

Transferir o sobrenadante para outro tubo.

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Repetir a extração com trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por

10 minutos.

Centrifugar por 10 minutos a 5000g (8000rpm)

Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.

Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto

gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo.

Se o complexo RNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar o DNA

com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o RNA não aparecer ou ficar

floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 minutos e descartar o

sobrenadante.

Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de RNA

e polissacarídeos.

Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado

se soltar do fundo, centrifugar por 3 minutos a 10000g (12.000 rpm) para “grudar” o

precipitado no fundo do tubo.

Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar.

O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que

pode dificultar a ressuspensão do RNA.

Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4ºC por uma hora ou

mais.

Maceração 15 ml de tampão CTAB + um volume de Trisol

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Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com Trisol

Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com Trisol:

Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes

Misturar por inversão de tubo suavemente

Filamento de RNA lavar precipitado de RNA com etanol 70%

Inverter tubo para secar Dissolver o precipitado em 200 a 500 L de TE

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ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL

Reagente para isolamento de RNA de células e tecidos.

É composto por uma solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato.

Foi desenvolvido por Chomezynski e Sacchi.

Durante a homogeneização da amostra ou lise, o reagente Trizol mantém a

integridade do RNA durante a ruptura celular e dissolvimento dos componentes

celulares.

A adição de clorofórmio seguido de centrifugação separa a solução em duas fases:

aquosa e orgânica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.

Após a transferência da fase aquosa, o RNA é recuperado por precipitação com

álcool isopropílico.

Depois de removida a fase aquosa, o DNA e proteínas na amostra podem ser

recuperados por precipitação sequencial.

A precipitação com álcool etanol resulta DNA a partir da interfase, e uma

precipitação adicional com álcool isopropílico resulta proteínas a partir da fase

orgânica.

Co-purificação do DNA pode ser útil na normalização de RNAs produzidos de

amostra para amostra.

Essa técnica bem executada com pequenas quantidades de tecido (50 - 100 mg) e

células (5x106), e abundantes quantidades de tecido (> 1 g) e célula (> 107), de

humanos, animais, plantas ou origem bacteriana.

Todo processo pode ser completado em uma hora.

O RNA total isolado por Trizol é livre de contaminação protéica e DNA. Isto pode ser

útil para ser usado em análise por Northem blot, hibridização Dot blot, seleção poli

(A), translação in vitro, teste de proteção de RNAse e clone molecular.

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Para uso no PCR, o tratamento do isolado de RNA com amplificação gradual de

DNAse I é recomendado quando os dois primers posicionam-se dentro de um só

exon.

O reagente Trizol facilita isolamento de uma variedade de espécies de RNA de

grande ou pequeno tamanho molecular. Por exemplo, o RNA isolado de fígado de

rato, eletroforesado no gel de agarose, e corado com brometo de etídeo, mostra

discreta banda de alto peso molecular de RNA entre 7 Kb e 15 Kb no tamanho,

(composto de RNAm e RNAhn) duas bandas predominantes de RNA ribossomal de

aproximadamente 5 Kb (28 S) e de aproximadamente 2 Kb (18 S), e RNA de baixo

peso molecular entre 0,1 e 0,3 Kb (RNAt, 5 S). O isolado de RNA tinha na A260/A280

razão de > 1.8 quando diluído em TE.

PRECAUÇÕES PARA PREVENIR CONTAMINAÇÃO POR RNASE

RNAses podem ser introduzidas acidentalmente dentro da preparação em qualquer

ponto no processo de isolamento através de técnica inadequada.

Pela dificuldade para inibir a atividade da RNAse, é essencial prevenir esta

introdução.

As seguintes pautas devem ser observadas quando se trabalha com RNA:

Sempre usar luvas descartáveis. A pele muitas vezes contém bactérias e fungos

que podem contaminar uma preparação de RNA e ser uma fonte de RNAses.

Usar esterilização, plásticos descartáveis e pipetas automáticas reservadas para

trabalho com RNA para prevenir cross-contaminação com RNAses de

equipamentos compartilhados. Por exemplo, um laboratório que está usando

investigação de RNA provavelmente estará usando RNAse A ou T1 para reduzir

formação no fundo de filtro, e muitos itens não disponíveis (como uma pipeta

automática) podem ser ricas fontes de RNAses.

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Vidros devem ser esterilizados a 150ºC por 4 horas e plásticos devem ser

embebidos em 0,5 M de NaOH por 10 minutos, lavado cuidadosamente com água e

autoclavado.

Reagentes para a técnica:

Clorofórmio

Álcool Isopropílico

Água livre de RNAse ou solução SDS 0,5% ( Para preparar água livre de RNAse,

extrair água em garrafas de vidro livre de RNAse. Adicionar DEPC 0,01% (v/v).

Deixar parado durante a noite e autoclavar. A solução de SDS pode ser preparada

usando DEPC tratado e água autoclavada).

1. HOMOGENEIZAÇÃO

a) Tecidos

Homogeneizar amostras de tecido em 1 mL de reagente Trizol por 50-100 mg de

tecido usando um vidro- Teflon ou forte homogeneização (Polytron, ou Tissumizer

ou equivalente). O volume da amostra não pode exceder 10% do volume de

reagente Trizol usada para homogeneização.

b) Células de cultivo em meios de crescimento

Lisar as células diretamente no disco de cultura adicionando 1 mL de reagente

Trizol para 3,5 cm de diâmetro do disco, passando as células lisadas diretamente

para uma pipeta. A porção de reagente Trizol adicionado é baseado na área do

disco de cultura (1 mL por 10 cm2) e não no número de células presentes. Uma

porção insuficiente de reagente

Trizol pode resultar em contaminação do isolado de RNA com DNA.

c) Células de cultivo em suspensão

Fazer um pellet celular por centrifugação. Lise celular no Trizol por repetidas

pipetagens. Usar 1 mL do reagente por 5 – 10 x 106 células animais , vegetais ou

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leveduras, ou por 1 x 107 células bacterianas. Lavando as células antes de adicionar

Trizol poderia ser evitado, todavia isto aumenta de possibilidade de degradação de

RNAm. Ruptura de algumas células fúngicas e bactérias podem requerer o uso de

homogeneizador.

Opcional:

Um passo do isolamento adicional pode ser preciso para amostras com alto

conteúdo de proteínas, gordura, polissacarídeos ou material extracelular tal como

músculos, tecido gorduroso, e partes tuberosas de vegetais.

Seguindo a homogeneização, remover material insolúvel do homogeneizado por

centrifugação de 12.000xg por 10 minutos entre 2 a 8ºC. O resultado é um pellet

contendo membrana extracelular, polissacarídeos, e grandes moléculas de alto

peso molecular de DNA, enquanto o sobrenadante contém RNA. Em amostras de

tecidos gordurosos um excesso de gordura coletada assim como uma camada

colocada que pode ser removida.

Em cada caso, transferir a solução homogeneizada limpa para um tubo novo e

proceder com adição de clorofórmio e separação de fase descrita.

2. FASE DE SEPARAÇÃO

Incubar a amostra homogeneizada por 5 minutos entre 15 a 30ºC para permitir

completa dissociação do complexo núcleo-protéico.

Adicionar 0,2 mL de clorofórmio para 1 mL de reagente Trizol.

Tampar os tubos de amostras com segurança.

Misturar vigorosamente manualmente por 15 segundos e incubá-los entre 15 a 30ºC

entre 2 e 3 minutos.

Centrifugar as amostras por não mais de 12.000 xg por 15 minutos entre 2 e 8ºC.

Seguindo a centrifugação, a mistura isolada dentro do pouco vermelho, fase

enolclorofórmio, na interfase, e uma descolorida fase aquosa superior.

O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.

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O volume de fase aquosa é por volta de 60% do volume de reagente Trizol usado

para homogeneização.

3. PRECIPITAÇÃO DE RNA

Transferir a fase aquosa para um tubo novo, e salvar a fase orgânica se desejar

isolar DNA ou proteína.

Precipitar o RNA da fase aquosa por mistura com álcool isopropílico.

Usar 0,5 mL de álcool isopropílico por 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a

homogeneização.

Incubar amostras entre 15 a 30º C por 10 minutos e centrifugar por não mais de

12.000 xg por 10 minutos entre 2 e 8ºC. O precipitado de RNA muitas vezes

invisível antes da centrifugação forma um gel como um pellet no lado e no fundo do

tubo.

4. LAVAGEM DE RNA

Remover o sobrenadante.

Lavar o pellet de RNA uma vez com 75% de etanol, adicionando o mínimo de 1 mL

dos 75% de etanol por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização

inicial.

Misturar a amostra em vórtex e centrifugar por não mais que 7.500 xg por 5 minutos

entre 2 e 8ºC.

5. REDISSOLVENDO O RNA

No final do procedimento, secar brevemente o pellet de RNA (ao ar ou em câmara

de vácuo por 5-10 minutos). Não secar o RNA por centrifugação a baixo vácuo. É

importante não permitir que o pellet de RNA seque completamente, visto que isto

diminui grandemente sua solubilidade.

Parcialmente dissolvida, a amostra de RNA tem uma razão A260/280 < 1.6.

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Dissolver RNA em água livre de RNASe ou 0,5% de solução SDS por passagem

solução uns pouco de tempo através de uma ponta de pipeta e incubando por 10

minutos entre 55 e 60ºC. (evitar SDS quando o RNA for usado em reações

enzimáticas subsequentes)

O RNA pode também ser redissolvido em 100% de formamida (deionizada) e

estocar a -70ºC.

Notas para o isolamento de RNA:

1. Isolamento de RNA de pequenas quantidades de tecido (1 a 10 mg) ou amostras

celulares (102 a 104): Adicionar 800 L de reagente Trizol para o tecido ou células.

Seguindo a lise da amostra, adicionar clorofórmio e proceder com a separação de

fase como descrito no item 2.

Prévia precipitação de RNA com álcool isopropílico, adicionar 5-10 g de glycogen

livre de RNAse conduzindo assim para a fase aquosa.

Para reduzir a viscosidade, cortar o DNA genômico com 2 passagens através de

uma agulha de 26 calibre primariamente para posterior adição de clorofórmio.

O glycogen sobra na fase aquosa e é co-precipitado com o RNA. Isto não inibe a

síntese first-strand para concentrações acima de 4 mg/mL e não inibe PCR.

2. Depois da homogeneização e antes da adição de clorofórmio, amostras podem

ser estocadas entre -60 e -70ºC por no máximo um mês.

3. Centrífugas de mesa que podem atingir um máximo de 2.600 xg são adequadas

para uso nestes protocolos se o tempo de centrifugação for aumentado para 30-

60 minutos nos itens 2 e 3.

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ISOLAMENTO DE RNA

Expectativa de rendimento de RNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura de células

Fígado e baço, 6-10 g; Rim, 3-4 g; Músculo esquelético e cérebro, 1-1,5 g;

Placenta, 1-4g; Células epiteliais (1 x 106 cultura celular), 8-15 g; Fibroblastos, (1

x 106 cultura celular) 5-7 g.

* Baixo rendimento


Pellet de RNA final não dissolvido completamente.

* Razão A260/A280 <1.65

Amostra de RNA foi diluída em água em vez de TE primariamente para análise

espectrofotômetra. Baixa resistência iônica e baixo pH de soluções aumenta

absorbância para 280 nm.

Amostras homogeneizadas em pouco volume de reagente.

Seguidamente a homogeneização, amostras não são estocadas ao espaço de

temperatura por 5 minutos.

A fase aquosa foi contaminada com a fase fenólica.

Incompleta dissolução final de pellet de RNA.

* Degradação de RNA

Tecidos não foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removidos

do animal.

Amostras usadas para isolamento ou o preparado isolado de RNA estavam entre -5

e -20ºC, ao invés de entre -60 e -70ºC.

Células forma desfeitas por digestão de tripsina.

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Soluções aquosas ou tubos não estavam livres de RNAse.

Formaldeído usado para eletroforese em gel de agarose estava com pH abaixo de

3.5.

* Contaminação de DNA

Amostras homogeneizadas em pequeno volume de reagente.

Amostras usadas para o isolamento continham solventes orgânicos (ex: etanol,

DMSO), fortes tampões ou solução alcalina.

*Contaminação de Proteoglicanos e Polissacarídeos

A conseguinte modificação da precipitação de RNA (item 3) remove estes

compostos contaminantes do isolado de RNA.

Adicionar para a fase aquosa 0,25 mL de isopropanol seguido de 0,25 mL de uma

solução com alta salinidade (Citrato de Sódio 0,8 M e NaCl 1,2 M) por 1 mL de

reagente Trizol usado para a homogeneização. Misturar a solução resultante,

centrifugar e proceder com o isolamento descrito no protocolo. A precipitação

alterada efetivamente precipita RNA enquanto conserva polissacarídeos e

proteoglicanos na forma solúvel. Uma combinação do precipitado modificado com

uma adicional centrifugação do homogeneizado inicial (nota 2 do protocolo de

isolamento de RNA) é requerido para isolar RNA puro de material vegetal contendo

um alto nível de polissacarídeos.

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ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O MÉTODO TRIZOL


Proteínas são isoladas a partir do sobrenadante fenol-etanol obtido depois da

precipitação de DNA com etanol (item 1, Precipitação de DNA). A preparação

resultante pode ser analisada pela presença de proteínas específicas por Western

Blotting.

Reagentes para a técnica:

Álcool isopropílico

Cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol

SDS 1%.

1. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNA

Precipitar proteínas a partir do sobrenadante etanol-fenol (aproximadamente 0,8 mL

por 1 mL de reagente Trizol) com álcool isopropílico.

Adicionar 1,5 mL de isopropanol para 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a

homogeneização. Estocar amostras por 10 minutos entre 15 e 30ºC e sedimentar as

proteínas precipitadas a 12.000 xg por 10 minutos entre 2 e 8ºC.

2. LAVAGEM DE PROTEÍNAS

Remover o sobrenadante e lavar o pellet de proteína 3 vezes em solução contendo

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0,3 M de cloreto de Guanidina em 95% de etanol.

Adicionar 2 mL de solução de lavagem por 1 mL de reagente Trizol usado para a

homogeneização inicial.

Durante cada ciclo de lavagem estocar os pellets de proteína na solução de

lavagem por 20 minutos entre 15 e 30ºC e centrifugar a 7.500 xg por 5 minutos

entre 2 e 8ºC. Depois da lavagem final, misturar 2 mL de etanol ao pellet de proteína

em vórtex.

Estocar o pellet de proteína em etanol por 20 minutos entre 15 e 30ºC e centrifugar

a 7.500 xg por 5 minutos entre 2 e 8ºC.

3. REDISSOLVENDO O PELLET DE PROTEÍNA

Secar o pellet de proteína a vácuo por 5-10 minutos.

Dissolver isto em SDS 1% com pipetagem.

Completar a dissolução do pellet de proteína pode requerer incubação da amostra a

50ºC.

Sedimentar qualquer material insolúvel por centrifugação a 10.000 xg por 10

minutos entre 2 e 8ºC e transferir o sobrenadante para um tubo novo.

A amostra é lida usando Western Blotting ou pode ser estocada entre -5 e -20ºC

para uso futuro.

Notas para isolamento de proteínas:

1. Os pellets de proteína suspensos em cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de

etanol ou em etanol podem ser estocadas por no máximo um mês entre 2 e 8ºC ou

por no máximo um ano entre -5 e -20ºC.

2. O seguinte protocolo é uma alternativa aproximada que permite uma mais

eficiente recuperação de proteínas.

Dialisar o sobrenadante fenol-etanol contra três trocas de SDS1% entre 2 e 8ºC.

Centrifugar o material dialisado a 10.000 xg por 10 minutos.

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Usar o sobrenadante limpo para Western Blotting.

3. Proteínas podem ser quantificadas pelo método Bradford já que a concentração

de SDS é o suficientemente baixa (<0,1%), então isto não irá interferir. Métodos que

não têm problemas de detergente-interfase e que não são confiados em leituras a

A260/A280 podem ser usados (traços de fenol podem causar superestimação na

concentração de proteínas).


ISOLAMENTO DE PROTEÍNA

* Rendimento baixo


Pellet de DNA final não dissolvido completamente.

* Degradação de proteína

Tecidos não foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removido

do animal.

* Deformação de banda em PAGE

Pellet de proteína insuficientemente lavada.

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GEL PARA ELETROFORESE DE PROTEÍNAS

Gel separador 12% volume total de 10 mL

Acrilamida/bis acrilamida 4,0 mL (2 º)

Tris HCL 1,5 M pH 8.8 2, 5 mL (3º)

SDS 10% 100L (4º)

Persulfato de amônio 10% 100L (5º)

TEMED 4,0 L (6º)

Água destilada 3,3 mL (1º)

Gel Concentrador volume final de 10 mL

Acrilamida/bis acrilamida 0,83 mL (2º)

Tris HCl 0,5 M pH 6,8 0,63 mL (3º)

SDS 10% 50 L (4º)

Persulfato de amônio 10% 50L (5º)

TEMED 5 L (6º)

Água destilada 3,4 mL (1º)

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Ligações peptídicas absorvem a A215.

Resíduos aromáticos (Tyr, Phe, Trp) absorvem em torno de 280nm, portanto, na

região ultravioleta.

A absortividade das proteínas é muito baixa.

A absortividade da proteína depende do conteúdo de resíduos aromáticos. Portanto,

cada proteína requer um cálculo individual.

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Absorvidade a A280 para BSA - 0,7 (em sol. a 1 mg/mL)

IgG - 1,35 (em sol. a 1 mg/mL)

IgM - 1,2 (em sol. a 1 mg/mL)

Prot. A estafilocóccica - 0,14 (em sol. a 1 mg/mL)

Extrato proteico - 1,0 (em sol. a 1 mg/mL)

Como as ligações peptídicas absorvem a 215nm, a concentração de proteínas pode

ser monitorada nesse comprimento de onda.

A absorvidade em 215nm é quinze vezes maior que a 280 nm e não depende,

contudo de aminoácidos aromáticos. 1mg/mL de proteínas: A280 = 1 e A215 = 15.

Mas a leitura a 215nm sofre influência da interferência de nucleotídeos livres ou

ácidos nucléicos presentes na amostra.

Por isso, pode ser “descontada” essa presença possível, considerando o

componente de absorção a 260nm:

Concentração de proteína (mg/mL) = 1,55 . A280 – 0,76. A260.

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS PARA PROTEÍNAS

Soluções diluídas de proteínas podem ser quantificadas por diversos métodos

colorimétricos eficientes e reprodutíveis. A escolha do método depende de possíveis

substâncias interferentes na solução testada.

Métodos mais comuns: Lowry, Bradford, BCA (otimização do método Lowry).

Dependendo do método, a sensibilidade de detecção de proteínas aumenta.

Ex: Biureto 1000 - 5000 g é detectável

Absorção no U.V 200 - 2000 g é detectável

Lowry (BCA) 5 - 40 g é detectável

Bradford 1 - 10 g é detectável

Fluorescamina 0,1 - 2 g é detectável

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MÉTODO COLORIMÉTRICO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO

DE PROTEÍNA

O corante Coomassie Blue reage com a cadeia polipeptídica.

Há poucos agentes interferentes.

Não funciona bem com proteínas básicas e sofre interferência de detergentes como

o Triton X-100, SDS e NP-40 quando estes estão em concentração acima de 0,2%.

Reagente de Bradford:

100 mg de Coomassie Blue G 250.

Dissolver em 50 mL de etanol a 95%.

Adicionar 100 mL de ácido fosfórico (H3PO=17M)

Completar com água para volume final de 200 mL. Estável a 4º por até 6 meses.

Tampão PBS

NaCl 150 mM

NaHPO4 10mM pH 7,2

Solução padrão de: Albumina Bovina (BSA) 1mg/mL em tampão PBS

Imunoglobulina G (IgG) 1mg/mL em tampão PBS

Método:

1. Montar curva padrão de diluição da solução-padrão de proteína em um volume

final de 100 L. Cobrir a faixa de 0 a 150 g de proteína. Fazer cada tubo em

triplicata.

2. Preparar as amostras em volume final de 100 L para teste diluindo as em PBS,

de modo que a concentração final caia na faixa até 150 g. Fazer dois ou três

pontos diferentes caso não tenha ideia da concentração da amostra. Testar

diluições de 1:100,1:500 e 1:1000 é um começo.

3. Diluir a solução de Bradford cinco vezes em água destilada (ex; 10 mL de

reagente de Bradford misturados a 40 mL de água para cerca de 50 tubos). Se

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houver precipitado, filtrar em papel de filtro.

4. Misturar 900 L de solução de Bradford diluída em cada um dos tubos da curva

padrão e das amostras

TUBOS

REAGENTES 1 2 3 4 5 6 7 8

SOL. PADRÃO

DE PROTEÍNA 0 10 20 40 80 100 - -

(L)

AMOSTRA (L) - - - - - - 10 100

ÀGUA (L) 100 90 80 60 20 - 90 -

Reagente Bradford 900 900 900 900 900 900 900 900

(L)

5. Deixar a cor estabilizar por 5’ não mais que 30’.

6. Determinar a A595 para cada um dos pontos experimentais.

7. Calcular a curva padrão com papel gráfico linear. Quotar cada ponto da curva de

calibração, determinar a melhor reta e calcular a concentração protéica da amostra.

8. Para uma maior precisão, calcular a melhor reta matematicamente por regressão

linear.

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Referências bibliográficas

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São Paulo, ed. UNESP, 2009.

Kreuzer, H.; Massey, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre, ed.

Artmed, 2002.

Michel, A.; Cesaro, T. Contribuições da Biotecnologia para a Agricultura.

Azevedo, O. M.; Felipe, S. M.; Brígido, M.M.; Maranhão, Q. A.; Souza, T. M.

Técnicas Básicas em Biologia Molecular. Brasília, ed. Brasília, 2003.

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apostila técnicas de extração de rna, dna e proteínas.revisada

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