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MAPFRE MEDICINA, 2007 · VOL.18 · Nº 3 · 180-189 ORIGINAL

RESUMENIntroducción: La insuficiencia arterial crónica de las ex-tremidades inferiores es una enfermedad extremadamenteincapacitante y que afecta un 3,5% de los varones mayo-res de 60 años. En el momento actual, la terapia celulares una alternativa de reciente aplicación que presentagrandes perspectivas en el tratamiento de las isquemiasperiféricas. El objetivo del presente estudio fue analizar laseguridad y eficacia de las células AC133+ autólogas enpromover la revascularización de MMII en pacientes conisquemia crítica de las EEII.

Material y Métodos: Se han incluido 3 pacientes con is-quemia crítica de las extremidades inferiores que fueronsometidos a movilización de células hematopoyéticas des-de la médula osea a la sangre periferica (SP) a través delG-CSF. Posteriormente, los progenitores endoteliales autó-logos AC133+, extraídos y seleccionados desde SP me-diante el sistema CliniMACS® (Miltenyi Biotec), fueron in-yectados intramuscularmente. Se hizo un seguimiento delos pacientes durante 6 meses según el protocolo del es-tudio, valorándose variables clínicas, funcionales, hemodi-námicas, anatómicas y de calidad de vida.

ABSTRACTIntroduction: Chronical arterial disease (CAD) is an extre-mely incapacitating illness which affects 3-5% of the malepopulation above 60 years-old. Actually, cell therapy is analternative that causes great expectation for the treatmentof the peripheral ischemias. The aim of the present studywas to analyze the efficiency and security of autologousAC133+ cells on promoting limb revascularization in pa-tients with critical CAD.

Material and Methods: Three patients with critical CADwere included and followed up to date. The patients weresubjected to mobilization of hematopoietic precursors fromthe bone marrow to peripheral blood with G-CSF. Later, theautologous endothelial stem cells AC133+, extracted andselected from blood through the CliniMACS® (MiltenyiBiotec) system, were injected intramuscularly. The patientswere followed for 6 months as the study’s protocol and cli-nical, functional, hemodynamic, anatomical and quality oflife variables were evaluated.

Results: The process of mobilization, collection and infu-sion of the endothelial stem cells was well tolerated. Th-rough the follow-up there were no amputations and there

Angiogénesis terapéutica en pacientes con isquemiacrítica crónica de las extremidades inferiores.

Estudio fase II mediante inyección de células AC133+ obtenidas de sangre

periférica movilizadas con G-CSF. Seguimiento de tres primeros casos

Therapeutical angiogenesis in patients with crit ical leg ischemia.Phase II study with injection of AC133+ cel ls mobilized with G-CSF from peripheral blood. Follow-up of three f irst cases

Barros M. B. 1 , González Porras J . R.2 ,Sánchez-Guijo F. M.2 , del Cañizo M. C.2 ,Lozano F. S. 1

1 Servicio de Angiología y Cirugía Vascular2 Servicio de Hematología y Unidad de Terapia

Celular Hospital Clínico Universitario de SalamancaUniversidad de Salamanca

Correspondencia:M. B. Barros. Dpto. de Cirugía. Facultad de MedicinaAvda Alfonso X El Sabio s/n. 37007 Salamanca. [email protected]

Beca Larramendi (FUNDACIÓN MAPFRE y Fundación Españolade Hematología y Hemoterapia (FEHH)

Angiogenesis.qxd 27/7/07 08:50 Página 180

INTRODUCCIÓN

La isquemia o insuficiencia arterial crónica, es elproducto de una progresiva disminución de aportesanguíneo (flujo arterial), en el presente caso a lasextremidades inferiores (EEII), producido por el de-sarrollo y evolución de lesiones estenosantes u obli-terantes a nivel de sus arterias y que, según el gradode afectación, se expresa por diferentes manifesta-ciones clínicas de gravedad progresiva (estadios).

En los estudios más amplios y fiables, la prevalen-cia de claudicación intermitente (CI) en varones de60 años es del 3,6%. En nuestro país, el recién fina-lizado estudio ESTIME indica cifras aún más eleva-das. Según los datos del TransAtlantic Inter-SocietyConsensus (1) un 5% de los pacientes con CI nece-sitaran cirugía de revascularización y un 2% ampu-tación de la extremidad. La progresión de una CI aisquemia crítica oscila entre el 3,8-25% (seguimien-to a 5 años) y un 41% (seguimiento a 8 años), conuna tasa de amputaciones de aproximadamente un10% (seguimiento a 10 años) (2).

No existe tratamiento etiológico de la arterioscle-rosis. Los objetivos terapéuticos en la isquemia crí-tica de las EEII serán aliviar los síntomas (dolor) ymejorar la calidad de vida (mejorando la función yevitando en lo posible la pérdida de la extremidad).

El continuo desarrollo de la cirugía vascular hapermitido grandes avances en relación a las con-ductas de salvamento de EEII y mejora de la cali-

dad de vida de los pacientes afectos de isquemiaarterial periférica. Este hecho, ha permitido laaparición de casos cada vez más difíciles de solu-cionar, los cuales antiguamente se destinaban auna amputación primaria. Afortunadamente nue-vas aportaciones provenientes del campo de la te-rapia génica han surgido; estas contribuyen a laaparición de terapias emergentes competitivas oalternativas a las existentes.

A partir de los estudios de Risau, nuevas eviden-cias mostraron que dentro de la médula ósea(MO) existe un progenitor común para las célulashematopoyéticas y endoteliales: el hemangioblasto(3-5), identificado por la expresión del antígeno desuperficie AC133. Estas, coexpresan también elantígeno CD34, aunque existe un pequeño por-centaje que son CD34 negativas (6). Puesto que,recientemente, Tateishi-Yuyama y cols. publicaronque la inyección de células mononucleadas de MOmejora la isquemia en miembros inferiores en hu-manos debido al aporte de células progenitorasendoteliales y la secreción de factores angiogénicosy/o citocinas (7), la evidencia de que la inducciónde nuevos vasos en tejidos in vivo, a partir de célu-las madre de la MO, es posible, puede ser debidaa los hemangioblastos.

En 1997 el grupo de Asahara y cols. (8) logródemostrar la existencia de células progenitoras en-doteliales, CPE (CD34+), en la sangre periférica(SP), capaces de diferenciarse in vitro a células en-

Resultados: El proceso de movilización, recolección y in-fusión de los progenitores endoteliales fue bien tolerado.A lo largo del seguimiento no se ha producido ningunaamputación y hubo mejoría objetiva y subjetiva de algunasde las variables estudiadas.

Conclusión: Hasta el momento y con tres enfermos inclui-dos en el estudio el proceso de administración de las célu-las AC133+ se ha mostrado seguro y sin complicaciones,entretanto hemos de ser prudentes en correlacionar la te-rapia celular y mejoría clínica. Con la inclusión de nuevospacientes y su seguimiento a medio plazo seguramente senos aclarará el efecto clínico de las células AC133+.

Palabras clave:Isquemia crónica de extremidades, angiogénesis,AC133+, progenitores endoteliales.

was objective as well as subjective improvement of somestudied variables.

Conclusion: So far and with three included patients, theprocess of administration of the AC133+ cells has shownsecurity and lack of complication, although we have to becautious on correlating cell therapy with clinical improve-ment. With the inclusion of new patients and their midterm follow-up we shall clarify the clinical effect of theAC133+ cells.

Key words:Chronical limb ischemia; angiogénesis; AC133+; endot-helial stem cell.

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Barros M. B., González Porras J. R., Sánchez-Guijo F. M., et al.

Angiogénesis Terapéutica Mediante AC133+

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doteliales maduras, en respuesta a los factores decrecimiento (VEGF, Fibroblast Growing Factor[FGF] y angiopoietinas), y que, in vivo, son capa-ces de contribuir a la angiogénesis. En un trabajoposterior (9), probaron que estas CPE, que se en-contraban circulando en la sangre periférica deadultos provenían de la MO y contribuían tanto ala neovascularización endógena de los tumores endesarrollo como a la cicatrización de heridas, ó a laneovascularización fisiológica que se produce du-rante el ciclo ovulatorio.

El antígeno AC133, por tanto, identifica una po-blación celular inmadura que co-expresa el antíge-no CD34 en gran de parte de sus células y diversosautores han demostrado su capacidad de diferen-ciación a células endoteliales in vitro e in vivo (10,11). Dicha población se puede encontrar en la MO,como ya hemos expuesto, y también en la SP de in-dividuos adultos.

El presente trabajo tiene como objetivo prin-cipal analizar la seguridad y eficacia de las célu-

las AC133+, obtenidas de sangre periférica, enel tratamiento de pacientes con isquemia críticade las EEII, así como determinar la seguridadde la administración Intra-Muscular de las célu-las AC133+ movilizadas a Sangre Periférica ysu capacidad de aumentar la revascularizaciónde MMII en pacientes con isquemia crítica delas EEII.

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente ensayo ha sido aprobado por el Co-mité Ético de Investigación Clínica del HospitalUniversitario de Salamanca y cumple con la De-claración de Helsinki de 1975, enmendada en1983, 1989, 1996, 2000.

De junio de 2004 a noviembre de 2005 se hanincluido 3 pacientes varones con enfermedad arte-rial, procedentes de la consulta de cirugía vascu-lar. Los mismos cumplían con todos los criteriosde inclusión y ninguno de exclusión (Tabla 1). To-

TABLA 1. Criterios de inclusión, exclusión y retirada

INCLUSIÓN

• Diagnóstico de isquemia crítica

crónica de las extremidades

inferiores;

• Estadios III o IV: dolor reposo, úlcera

o gangrena menor, sin amputación

mayor;

• Índice T/B <0.60;

• Arteriosclerosis o tromboangeítis

obliterante (enfermedad de

Buerger);

• Contraindicación general (ASA 3-4 y

4) o inoperabilidad local

(arteriografía);

• Edad entre 18 y 75 años;

• Serología VIH, VHB y VHC negativa;

• En caso de mujer en edad fértil, test

de embarazo negativo;

• Firma del consentimiento informado

por escrito ante testigo.

EXCLUSIÓN

• Diabetes mellitas;

• Tratamiento concomitante con

prostaglandinas;

• Estimulación medular eléctrica o

simpatectomía concomitante;

• Cirugía arterial o angioplastia

concomitante;

• Enfermedad maligna concomitante o

previamente tratada con

quimioterapia;

• Enfermedad grave concomitante no

bien controlada;

• No consentimiento informado.

RETIRADA

• Presencia de acontecimiento

adverso grave;

• No obtención del mínimo de células

AC133+ necesarias para la

realización del estudio (0,5 x108

células AC133+);

• Condiciones clínicas del paciente

que impiden su continuidad:

o Necesidad de medicación

concomitante excluyente del ensayo;

o Necesidad de procedimiento

excluyente del ensayo;

o Dolor rebelde que precisa

amputación;

• Otras violaciones del protocolo;

• Decisión facultativa;

• Renuncia del enfermo a continuar

en el estudio;

• Pérdida de seguimiento.


dos los pacientes han firmado un consentimientoinformado con explicaciones detalladas de la téc-nica (en dos fases), sus ventajas (alternativa a laamputación) e inconvenientes (problemas técnicosy posibles complicaciones).

Paciente 1

Varón de 74 años, con antecedente de enfer-medad pulmonar obstructiva crónica, carcino-ma epidermoide de laringe tratado con microci-rugía laringea e hipertensión arterial. Fuesometido a tromboendarecteromía carotídea.Ex-fumador y ex-bebedor. Desde hace 9 años(1996) presenta en la extremidad inferior dere-cha una claudicación intermitente a 250 metros.En mayo/2002 (6 años después), progresa la en-fermedad vascular periférica, presentando dolora 50 metros y dos úlceras maleolares, que moti-van la realización de un bypass axilo-femoralderecho. A los 9 meses (febrero/2003) dicho by-pass se trombosa, practicándose entonces unatrombectomía de la prótesis axilo-femoral yasociando un bypass femoro-poplíteo. Tres me-ses después reingresa (mayo/2003), por obstruc-ción del bypass axilo-femoral y femoro-poplí-teo. En dicho momento, el paciente refiere doloren reposo de la extremidad inferior derecha, decaracterística urente, que se exacerba con la ele-vación del miembro. En la exploración física dela pierna derecha destaca la presencia de dos úl-ceras, en tercio distal de la cara interna, de 6.2x 2.8 cm (superficie = 11.6 cm2) y 5.2 x 3.8 cm(15.8 cm2) y otra úlcera en maléolo externo de 1x 1 cm (0.8 cm2), todas ellas con signos de malacicatrización (sin tejido de granulación). Asímismo presenta gangrena digital menor de lostres primeros dedos del pie derecho. No existeninguna lesión trófica en extremidad inferior iz-quierda. En dicho momento se constata la au-sencia de pulsos palpables a nivel femoral, po-plíteo, tibial posterior o pedio de ambasextremidades. Indices tobillo/brazo: 0.23 (dere-cho), 0.46 (izquierdo). Claudicometría con dis-tancia absoluta de 37metros. En una escala deldolor de 0-10 puntos, en donde el 10 correspon-de al máximo dolor soportable por el enfermo,el mismo se auto puntuaba en 5pts para miem-bro inferior derecho. Angiografía: enfermedad

aorto-iliaco-femoral bilateral con oclusión deiliaca común y externa derechas, femoral super-ficial derecha, con mala recanalización en femo-ral profunda derecha, oclusión poplítea recana-lizando tardíamente en arteria tibial anteriorderecha. En el miembro inferior izquierdo seaprecia estenosis segmentarias en ilíaca externay oclusión de la arteria femoral superficial conabundante colateralización desde la arteria fe-moral profunda que recanaliza a la arteria po-plítea izquierda, tibial anterior, tronco tibio-pe-roneo y arteria peronea. Arteria tibial posteriorocluida. Angio-RM: similar resultado a la arte-riografía.

Diagnóstico: isquemia crítica en extremidadinferior derecha (estadio IV de Fontaine) en pa-ciente con enfermedad oclusiva aorto-iliaca y fe-moro-poplítea combinada. El paciente rechazanueva cirugía arterial directa. Se le proponen di-versas alternativas.

Paciente 2

Varón de 67 años, fumador de 14 cigarros pordía, con antecedentes de nefrectomía por tuber-culosis renal en 10/2002 y orquiectomía por tu-moración en 1993. HTA controlada. Hipercoles-terolémico. Acude por claudicación intermitentepara 100m desde el año 2002 negándose a ope-rarse de antemano. Ha seguido tratamiento con-servador desde entonces con mejorías y empeora-mientos de su claudicación nunca habiendodejado de fumar.

En el examen físico no presenta lesiones enEEII. Presencia de atrofia muscular (pantorri-llas), distrofia de uñas y reducción del vello. Au-sencia de pulsos en las dos extremidades a todoslos niveles excepto en arteria femoral derecha(muy débil). ITB en reposo de 0.61/0.27. Clau-dicometría con distancia absoluta de 136 me-tros. En una escala del dolor de 0-10 puntos, endonde el 10 corresponde al máximo dolor so-portable por el enfermo, el mismo se auto pun-tuaba en 8pts para miembro inferior izquierdoal caminar. La arteriografía demuestra oclusiónde la arteria ilíaca común izquierda y recanali-zación en femoral común izquierda, con el restodel árbol arterial del referido miembro sin alte-raciones.

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Diagnóstico: Isquemia crónica de las extremi-dades inferiores, mayor a la izquierda (estadioIIb de Fontaine). Se le propone bypass femoro-femoral cruzado que es rechazado por el enfer-mo diversas veces.

Paciente 3

Varón de 71 años, ex-fumador, hipertenso, hi-perlipémico, cardiópata, con antecedentes deEPOC e prostatectomía por CA de próstata ope-rado en 2002. Ya había sido operado con un by-pass femoro-popliteo a la derecha (2004) y unstent coronario en el 2003 por IAM antero-sep-tal. Acude por claudicación intermitente para100 metros.

En el examen físico no presenta ulceracionesni heridas en EEII, presenta disminución del ve-llo y onicodistrofia. Ausencia de pulsos en losdos miembros inferiores excepto en femoral iz-quierdo muy débilmente. ITB 0.72/0.81. Claudi-cometría con distancia absoluta de 133 metros.En una escala del dolor de 0-10 puntos, en don-de el 10 corresponde al máximo dolor soporta-ble por el enfermo, el mismo se auto puntuabaen 8pts para miembro inferior derecho.

La arteriografía y angio-RM demuestran en-fermedad arterial obstructiva con oclusión de lasalida de la femoral superficial derecha recanali-zando por colaterales y ocluyéndose nuevamen-te en el tercio distal. Poplítea y trifurcación ti-bio-peronea recanalizan por colateralidad.

Diagnostico: Isquemia crónica de las extremi-dades inferiores, más sintomática a la derecha(estadio IIb de Fontaine). La extremidad iz-

quierda presenta el mismo patrón. Elegida la ex-tremidad derecha para el tratamiento.

VARIABLES ESTUDIADAS Y CRITERIOSDE VALORACIÓN

Clínicas: Se valoraron pruebas analíticas varias(Figura 1), el éxito técnico (sí/no), la morbi/mor-talidad (sí/no), el dolor en reposo (mejoría/empe-oramiento), la preservación de la extremidad(sí/no) y la cicatrización de lesiones (sí/no); He-modinámicas y Funcionales: Índice tobillo/Brazo(ITB) y Claudicometría – Se consideraron signifi-cativos incrementos a partir de 0,15 para el ITB.Para la claudicometría se midió la distancia declaudicación inicial y absoluta (en metros). Se va-loró el porcentaje de caída de presiones (%) y eltiempo de recuperación (hasta el basal) en minu-tos); Anatómicas (colateralidad): Angio-RM yArteriografía. Se valoraron por pares (RadiólogoVascular y Cirujano Vascular) el estado de los va-sos colaterales: 0 (sin desarrollo colateral), +1(pequeño), +2 (moderado) o +3 (abundante); Ca-lidad de Vida: Intermitent Claudication Ques-tionnaire (ICQ) – Puntuación según el protocoloICQ (12). Se comparó con la puntuación basalantes de iniciar el estudio (valor máximo de la es-cala: 100) (Tabla 2).

Cada paciente ha sido acompañado a lo largode seis meses conforme el protocolo del estudio(Figura 1). Se utilizó el miembro contralateralcomo control para la valoración clínica, hemo-dinámica, funcional y anatómica. Todas las va-riables han sido recogidas en cuadernillos de re-cogida de datos individualizados.

TABLA 2. Calendario de exploraciones

PRE – TRANSPLANTE POST – TRANSPLANTE24H 4S 12S 24S

Exploración X X X X X

ITB X X X X

Claudicometría X X

Arteriografía X X

Angio RM X X X X

Calidad de Vida X X

Obs: 24H – 24 horas; 4s, 12s, 24s – 4 semanas, 12 semanas y 24 semanas.


MOVILIZACIÓN Y RECOLECCIÓN DECÉLULAS AC133 DE SANGRE PERIFÉRICA

Para la movilización de las células hematopoyé-ticas a la SP desde la MO se utilizó un tratamien-to estándar con Granulocite-Colony StimulatingFactor (G-CSF) y para su recolección un procedi-miento de aféresis de la siguiente forma: ◗ Administración de G-CSF 5 µg/Kg/12 horas, los

días -4, -3, -2 y -1 (el día 0 recibió sólo una do-sis al menos 2 horas antes de iniciar la leucoa-féresis).

◗ De forma previa a la administración de la 9ªdosis de G-CSF se obtuvo una muestra de san-gre periférica para determinar el porcentaje y elnúmero total de células AC133 por µL.

◗ Recolección de células de sangre periférica utili-zando el protocolo estándar de recolección deprogenitores hematopoyéticos mediante el se-parador CobeSpectra (COBE BCT Inc). Se pro-cesaron un total de 2-3 volemias por paciente.

◗ Selección de células AC133 positivas: una vezfinalizado el proceso de leucoaféresis se deter-minó el número total de células AC133 y se

procedió a realizar una selección utilizando elsistema CliniMACS® (Miltenyi Biotec). El ob-jetivo es obtener un mínimo de 0,5 x 108 célu-las AC133 positivas.

◗ Las células se dividieron en dos alícuotas. Unasfueron criopreservadas y las otras se utilizaronpara la inyección inicial en la extremidad conmayor isquemia. Las células se criopreservaronen un volumen aproximado de 50 mL con plas-ma autólogo y dimetil-sulfóxido (DMSO, al10% del volumen final).

ADMINISTRACIÓN DE LAS CÉLULASA LOS PACIENTES

Se procedió en todos los casos a la administra-ción de las células AC133+ antes de que se cum-pliera 24 horas desde la aféresis y selección. Elprocedimiento se llevó a cabo en quirófano, conlos cuidados de asepsia y antisepsia requeridospara una intervención quirúrgica, y anestesia lo-co-regional (peridural o raquidiana).

La administración se dio por medio de inyec-ciones intramusculares, en número de 10, en

Fig. 1. Diseño del Estudio.

Evaluación Pre-Estudio 24 semanas12 semanas4 semanas24 horaspost-infusión

TransplanteAC133Día 0

Movilizacióny Aféresis-4 a 10

Analítica(2)

Anam + EFAnalítica (3)

Anam + EFAnalítica (3)Índice T/BAngio-RM

Anam + EFAnalítica (3)Índice T/BAngio-RM

Anam + EFAnalítica (1)Índice T/B

ClaudicometríaArteriografíaAngio-RM

Calidad de vida

Anam + EFAnalítica (1)Índice T/B

ClaudicometríaArteriografíaAngio-RM

Calidad de vida

(1) Recuentos hematológicos (recuento sanguíneo completo, fórmula, plaquetas), Bioquímica sérica (bilirrubina, creatinina, AST, ALT, fosfatasa alcalina,LDH, albúmina), Prueba de embarazo en suero en mujeres en edad fértil en los 7 días previos al registro. Serologías virales: VIH, VHB, VHC; AC133+,CD34+, CD45.

(2) Hemograma y citometría de flujo (día 0), Citometría del producto de aféresis.(3) Recuentos hematológicos (recuento sanguíneo completo, fórmula, plaquetas), Bioquímica sérica (bilirrubina, creatinina, AST, ALT, fosfatasa alcalina,

LDH, albumina); AC133+, CD34+, CD45.

Abreviaturas. Anam: Anamnesis; EF: Exploración física.

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puntos previamente marcados con un rotuladoren el músculo gastrocnemio de la extremidadmás afectada a una profundidad de 1,5 cm. Se in-yectaron 0,50 ml por inyección separadas poruna distancia de 2-3 cm (Figura 2).

Se empleó la pierna contralateral como control,aplicando con igual técnica solución salina 0,9%.La pierna no tratada sirvió como control compa-rando, su situación previa al inicio de la movili-zación, el posible beneficio obtenido únicamentecon la movilización de los progenitores a la san-gre periférica.

Terminada la inyección, las dos piernas han si-do curadas con apósitos y vendas sin compre-sión, que fueron retiradas al día siguiente tras laexploración clínica y analítica (Figura 1). Se pro-cedió al alta de los pacientes tras la analítica.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Por tratarse de un estudio que aún se está desa-rrollando y no tener finalizado el periodo de in-clusión de pacientes nos limitamos a comentar elseguimiento de los tres primeros casos sin haceranálisis estadístico de los resultados del ensayo.

RESULTADOS

Paciente 1

Aféresis: Se procesaron 3 volemias y se reco-lectaron 595 x 108 de células nucleadas. Selec-ción: Se obtuvieron 1.9 x 108 de células AC133positivas. Las células se dividieron en dos alí-cuotas: una de ellas con 0.95 x 108 de célulasAC133+ se utilizó para la inyección en la panto-rrilla en las 6 horas siguientes tras la finaliza-ción de la leucoaféresis. La otra alícuota se crio-preservó en un volumen de 50 ml con plasmaautólogo y dimetil-sulfóxido (DMSO, al 10%del volumen final).

El procedimiento de aféresis y la inyección decélulas AC133+ fueron bien tolerados. Tras másde un año de seguimiento se constata preserva-ción de la extremidad (no amputación). El pa-ciente no presenta dolor de reposo y es capaz decaminar hasta 200 metros. Desaparición de lospuntos de gangrena digital, cicatrización de la úl-cera situada en el maléolo externo. Las ulceras

maleolares internas no han reducido su tamañohasta pasados 1 año y medio desde el transplante.Actualmente con 2 años de seguimiento hubo unareducción de más del 50% del área total de lasmismas (Figura 3). Los índices tobillo/brazo no sehan modificado significativamente (0.25/0.53).Los estudios de imagen objetivan mayor capta-ción en la arteria tibial anterior derecha y flujo enla arteria peronea derecha (que no presentaba enla exploración pre-procedimiento), mientras quela extremidad contralateral no evidencia altera-ciones (Figura 4). La valoración por parte del pa-ciente del dolor ha pasado de 5 a 2 puntos y lapuntuación del WIQ de 48 a 54.

Fig. 2. Infusión intramuscular en el gastrocnemio de célulasAC133+ (Inf.). Identificación mediante citometría de flujo,expresión de los antígenos CD34 y AC133 (Sup.).

Fig. 3. Cicatrización de las lesiones cutáneas post infusiónde progenitores AC133+. Área total de las lesiones: pre-infusión: 37,12cm2; Post-infusion: 17,25cm2. Reduccióndel 53,26%.

Pre 1 año 2 años


Paciente 2

Aféresis: Se procesaron 2,6 volemias y se reco-lectaron 525 x 108 de células nucleadas. Selec-ción: Se obtuvieron 2,26 x 108 de células AC133positivas. Las células se dividieron en dos alícuo-tas: una de ellas con 1,13 x 108 de célulasAC133+ se utilizó para la inyección en la panto-rrilla en las 6 horas siguientes tras la finalizaciónde la leucoaféresis, la otra se criopreservó.

Igualmente al primer paciente, el procedimientode aféresis y la inyección de células AC133+ fue-ron bien tolerados. Tras más de seis meses de se-guimiento se constata preservación de la extremi-dad (no amputación). El paciente no presentadolor de reposo y es capaz de caminar más de144 metros. Los índices tobillo/brazo se han mo-dificado de 0.61 D / 0.27 I a 0.63 D / 0.37 I. Elgrado de dolor puntuado por el paciente varió de8 para 5. La angio-RM objetiva mayor captaciónen la arteria tibial anterior izquierda y aumentode la colateralización en pantorrilla izquierda(que no presentaba en la exploración pre-proce-dimiento), mientras que la extremidad contrala-teral no evidencia alteraciones. La arteriografíano evidencia aumento de colateralización en pan-torrilla izda. La puntuación del WIQ de 64 a 70.

Paciente 3

Aféresis: Se procesaron 2 volemias y se recolec-taron 669 x 108 de células nucleadas. Selección:Se obtuvieron 1,88 x 108 de células AC133 posi-tivas. Las células se dividieron en dos alícuotas:una de ellas con 0,94 x 108 de células AC133+

se utilizó para la inyección en la pantorrilla en las6 horas siguientes tras la finalización de la leuco-aféresis, la otra se criopreservó.

El procedimiento de aféresis y la inyección decélulas AC133+ también fueron bien tolerados.Tras 6 meses de seguimiento se constata mejoríasubjetiva. El paciente no presenta dolor de repo-so y es capaz de caminar 118 metros. Los índicestobillo/brazo se han modificado de 0.72 D / 0.81I a 0.56 D / 0.64 I reflejando progresión lenta dela enfermedad bilateralmente. El grado de dolorpuntuado por el paciente varió de 8 para 6 en laextremidad tratada y no varió en la contralateral.La angio-RM objetiva mayor captación en la ar-teria peronea derecha y aumento de la colaterali-zación en pantorrilla derecha (que no presentabaen la exploración pre-procedimiento), mientrasque la extremidad contralateral no evidencia alte-raciones. La arteriografía no evidencia aumentode colateralización en pantorrilla derecha. Lapuntuación del WIQ de 75 a 69. El paciente re-fiere mejoría en la calidad del dolor en la extre-midad tratada con menos dolor que en la contra-lateral (mejoría subjetiva).

DISCUSIÓN

La Terapia Celular es una alternativa clínica dereciente aplicación que presenta grandes pers-pectivas en el tratamiento de diferentes patologí-as como el infarto de miocardio, diabetes, enfer-medad de Parkinson, isquemias periféricas, etc.Además, el número de órganos productores decélulas madre en individuos adultos ha aumenta-do, existiendo, en la actualidad, diversas locali-zaciones de las mismas: MO, SP movilizada,músculo, etc.

Estudios preclínicos han demostrado que facto-res de crecimiento angiogénico promueven el de-sarrollo de arterias colaterales, lo cual se denomi-na «angiogénesis terapéutica»(13). Al mismotiempo, las células madre adultas (células madreobtenidas de tejidos adultos) han demostrado sucapacidad de diferenciarse a tejidos derivados delas tres capas embrionarias. En concreto, diversostrabajos han demostrado que existen células en lamédula ósea adulta, como las células madre me-senquimales, células madre hematopoyéticas y,más recientemente, las células madre multipoten-

Fig. 4. Angio-RMN pre y post infusión (24 semanas) decélulas AC133+. Aparición de la arteria peronea derecha(flecha).

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ciales (MAPC), con capacidad de diferenciarse adistintos tejidos (14-18).

Entre las células madre existentes en médulaósea, la expresión del antígeno de superficieAC133, como ya abordado anteriormente, defineuna población enriquecida en progenitores he-mangioblásticos (célula con capacidad de diferen-ciarse tanto a células hematopoyéticas como a cé-lulas endoteliales) (10, 19). Las células AC133+co-expresan el antígeno CD34, aunque existe unpequeño porcentaje que son CD34 negativas (6).

Se encontraron, además, indicios de que estasmismas células estaban presentes en diversos ór-ganos (bazo, pulmones, hígado, intestino, piel ymusculatura isquémica), lo que implica un papelde las CPE en el mantenimiento fisiológico delos órganos. Las CPE derivadas de la MO circu-lantes deben dirigirse hacia el estroma de los ór-ganos, en respuesta a ciertos estímulos como eltrauma o la isquemia (20, 21) con el propósitode suministrar reservorios de mantenimiento decélulas endoteliales (EC). Estos hallazgos sugie-ren que tanto el endotelio vascular como las cé-lulas mesenquimales pueden derivarse de la MOy contribuir a la regeneración y mantenimientode los órganos.

El presente estudio se basa en los siguientesprincipios: 1. Las células AC133+ son capaces dediferenciarse, tanto in vitro como in vivo, a célu-las endoteliales y contribuir a la angiogénesis yvasculogénesis (10, 11, 25). 2. La administraciónde progenitores hemangioblásticos enriquecidosen células AC133+ en un modelo animal de in-farto de Miocardio aumenta la vasculogénesis yangiogénesis en la región infartada y contribuye amejorar la función cardiaca previniendo la apop-tosis de cardiomiocitos (15). 3. Es posible obte-ner un número elevado de células AC133+ a par-tir de sangre periférica mediante el tratamientodurante 5 días con G-CSF (20). 4. Las célulasAC133+ pueden ser seleccionadas mediante unsistema comercial aprobado para su utilizaciónclínica. 5. Existen poblaciones de células madreen médula ósea con capacidad de ser movilizadasa sangre periférica y de diferenciarse hacia célulascon características de endotelio 6. El ensayo lle-vado acabo por Tateishi-Yuyama et al. demuestraque la inyección de células de MO sin seleccionarpermite la revascularización en EEII isquémicas.

En nuestro estudio, buscamos aislar tal célula,el hemangioblasto (AC133+ inyectarlas directa-mente en la zona afectada (EEII isquémicas), adiferencia de lo que hicieron Tateishi-Yuyama etal (7). El valor potencial de este abordaje resideen el hecho de que proporciona una fuente de cé-lulas endoteliales resistentes que puede comple-mentar las estrategias actuales de terapia con fac-tores de crecimiento angiogénicos. De hecho,actualmente se piensa que parte del impacto fa-vorable de la terapia con estos factores se debe ala movilización de las EPC (9) desde la MO (22,23). Estudios con el VEGF y FGF-2 como induc-tores de neovascularización, demuestran que lacontribución de las EPC movilizadas desde laMO es de hasta un 26% y que las mismas actúanno solamente al estar involucradas directamenteen la formación del nuevo vaso, sino también co-mo fuentes productoras de factores de crecimien-to/citocinas (24).

Nuestros resultados aunque preliminares sonesperanzadores; en todos los casos la valoracióndel procedimiento (movilización, recolección einyección de las células) ha transcurrido sin mor-bi/mortalidad alguna; pero lo más relevante es lafavorable evolución a medio-largo plazo, tantoobjetiva (casos 1 y 2) como subjetiva (caso 3).

A pesar de todo ello, hemos de ser prudentes encorrelacionar causa (terapia celular) y efecto (mejo-ría clínica). En este periodo, nuestros pacientes nohan recibido ningún tratamiento hiperémico (pros-taglandinas, simpatectomía lumbar o neuroestimu-lador), y solo han continuado con la medicaciónprevia a la terapia celular (antiagregación plaqueta-ria convencional y heparina de bajo peso moleculara dosis profilácticas). Evidentemente, la evoluciónnatural de la enfermedad isquémica puede habergenerado circulación colateral, y también es sabidoque la heparina de bajo peso molecular tiene pro-piedades relacionadas con la angiogenesis; sin em-bargo estas dos condiciones no afectaron en nada ala extremidad contralateral (que actuó como con-trol). Los resultados finales del ensayo referido,donde nos falta incluir tres nuevos casos con estric-tos criterios de inclusión-excusión, y el seguimientode los mismos a medio plazo seguramente nos clari-fique el deseado efecto clínico de las células AC133positivas, obtenidas de sangre periférica, en la is-quemia crítica de las extremidades inferiores.


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Referencias bibliográficas

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