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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Análise da expressão de antígenos neurais e do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células mononucleadas da medula óssea de ratos adultos e do sangue de cordão umbilical humano
Leda Maria Neumann Keim
2006 Rio de Janeiro
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Leda Maria Neumann Keim
Análise da expressão de antígenos neurais e do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células mononucleadas da medula óssea de ratos adultos e do sangue de cordão umbilical humano
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).
Orientadora: Rosalia Mendez Otero
Rio de Janeiro Maio de 2006
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Neumann Keim, Leda Maria Análise da expressão de antígenos neurais e do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células mononucleadas da medula óssea de ratos adultos e do sangue de cordão umbilical humano/ Leda Maria Neumann Keim. Rio de Janeiro: UFRJ, IBCCF, 2006. xiv, 120f.:il; 31cm. Orientadora: Rosalia Mendez Otero. Dissertação (mestrado) – UFRJ/ IBCCF/ Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), 2006. Referências Bibliográficas: f 109-120. 1. diferenciação neuronal. 2. Células mononucleadas de sangue de cordão umbilical. 3. Células mononucleadas de medula óssea. 4. gangliosídeo 9-O-acetil GD3. I. Mendez-Otero, Rosalia II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia). III. Título.
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Leda Maria Neumann Keim Análise da expressão de antígenos neurais e do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células mononucleadas da medula óssea de ratos
adultos e do sangue de cordão umbilical humano
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).
Rio de Janeiro, 29 de Maio de 2006.
Rosalia Mendez Otero
orientadora professora titular do IBCCF, UFRJ
Marcelo Marcos Morales,
professor adjunto do IBCCF, UFRJ
Regina Coeli dos Santos Goldenberg professora titular do IBCCF, UFRJ
Fernando Costa e Silva Filho professor titular do IBCCF, UFRJ
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O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia Celular e
Molecular do programa de Bioengenharia e Biotecnologia Animal do Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a
orientação da Dra. Rosalia Mendez Otero e na vigência de auxílios concedidos pelo
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação
Universitária José Bonifácio (FUJB), Fundação Carlos Chaga Filho de Amparo à
Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto do Milênio de Bioengenharia
Tecidual (IMBT).
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“Um prazer desfeito em pó, pois era meio inventado, como muito bem o sabia; inventada aquela aventura (...); fabricada, como se fabrica a melhor parte da vida”
Virginia Woolf em Mrs. Dalloway
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Agradecimentos
A todos os colegas com quem convivi no Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular no período de julho de 2002 até hoje, pela amizade, pelo apoio, pelos inúmeros favores, pelos ensinamentos e pelas opiniões.
A Vanessa, Fábio Fortes, professora Regina Goldenberg e ao professor Antônio Carlos (IBCCF); a Maria do Carmo e ao professor Juan Clinton Llerena Júnior (Laboratório de Genética do Instituto Fernandes Figueira) pelas colaborações com material e troca de informações.
A professora Cerli Gatass, pelo uso da citocentrifuga. Aos amigos, por me distraírem quando necessário e por compreenderem
quando eu não podia acompanhá-los. Aos meus pais, que sempre incondicionalmente me apoiaram e se
empolgaram com cada uma das minhas pequenas conquistas. Às minhas irmãs, cunhados, tios e avós, por sempre terem se mostrado
interessados com meus trabalhos, por se preocuparem comigo e por me fazerem companhia sempre que possível.
A minha irmã Carolina por, junto a vários professores da graduação, ter ajudado a despertar o meu interesse pela pesquisa, por ter me apoiado desde o início, ou simplesmente por termos tido muitas conversas intrigantes.
A professora Regina Goldenberg, pelas valiosas sugestões na revisão da tese.
A professora Rosalia Mendez Otero pela forma ponderada com que conduziu a orientação.
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Resumo ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE ANTÍGENOS NEURAIS E DO GANGLIOSÍDEO 9-O-ACETIL GD3 EM CÉLULAS MONONUCLEADAS DA MEDULA ÓSSEA DE RATOS ADULTOS E DO SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO Leda Maria Neumann Keim Orientadora: Rosalia Mendez Otero Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia). A possibilidade de células provenientes da medula óssea (MO) e do sangue de cordão umbilical (UCB) adentrarem o sistema nervoso central e se diferenciarem em células da linhagem neural tem sido objeto de um número crescente de estudos na atualidade. Em cultura, células tronco mesenquimais de MO expressam espontaneamente vários genes característicos de diversas linhagens celulares, e células tronco hematopoiéticas ex vivo expressam vários marcadores neurais. No presente trabalho, as células mononucleadas (CMN) da medula óssea de ratos adultos e do sangue de cordão umbilical humano foram analisadas, logo após serem isoladas, quanto à expressão de antígenos neurais. Além disto, analisamos também a expressão do gangliosídeo 9-O-Acetil-GD3 nestas mesmas populações de células. A expressão deste gangliosídeo está relacionada à migração neuronal e à extensão axonal no sistema nervoso em desenvolvimento e a áreas de neurogênese no sistema nervoso central adulto, sugerindo que o mesmo possa ser utilizado como marcador de células tronco e/ou progenitores neurais. Nas CMN de medula óssea de ratos observamos que 58% expressavam S-100, 47% vimentina, 59% β-III-tubulina, 46% NSE e 79% NF-200. As CMN de UCB também apresentaram estes antígenos. Estes resultados demonstram que a expressão desses antígenos deve ser usada com cautela no estudo da diferenciação neural de células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical. Nestas mesmas células, o gangliosídeo 9-O-Acetil-GD3 estava expresso em 30% das CMN da MO de ratos e em 12% das CMN de sangue de cordão umbilical humano. Células CD34+ da medula óssea de ratos (um marcador de células tronco hematopoiéticas) também eram positivas para este gangliosídeo, sugerindo que o mesmo possa ser utilizado para purificar e enriquecer sub-populações celulares da medula óssea e de sangue de cordão umbilical, uma vez que é um marcador de superfície celular. Palavras-chave: 1. diferenciação neuronal. 2. sangue de cordão umbilical. 3. medula óssea. 4. gangliosídeo 9-O-acetil GD3. Rio de Janeiro Maio/2006
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Abstract
The possibility of bone marrow cells and umbilical cord blood cells to enter the central nervous system and differentiate in neuronal cells has been the issue of a growing number of studies nowadays. In culture, bone marrow mesenchymal stem cells spontaneously express a large amount of genes characteristic of diverse cell lineages, and hematopoietic stem cells ex vivo express several neural markers. In the present work, the bone marrow mononucleated cells of adult rats and of human umbilical cord blood were analyzed, once have been isolated, for the expression of neuronal antigens. In addition, we also analysed the expression of the ganglioside 9-O-acetyl GD3 in the same cell populations. The expression of this ganglioside is related with neuronal migration and axonal outgrowth in the developing nervous system and whith neurogenic areas in the adult nervous system, suggesting that this can be used as a neural stem cell and/or progenitor cell marker. In the rat bone marrow, we noticed that 58% of the mononucleated cells expressed S-100, 47% expressed vimentin, 59% expressed β-III-tubulin, 46% expressed NSE and 79% expressed NF-200. The umbilical cord blood mononucleated cells also expressed these antigens. These results demonstrate that the expression of these antigens should be used with special caution in studies of neuronal differentiation of bone marrow and umbilical cord blood cells. The ganglioside 9-O-acetyl GD3 was expressed in 30% of the bone marrow mononucleated cells of rats and in 12% of the human umbilical cord blood mononucleated cells. Rat bone marrow CD34+ cells (a hematopoietic stem cell marker) already expressed this ganglioside, suggesting that this can be used to purify or enrich sub-populations of cells from bone marrow or umbilical cord blood, since this is a cell surface marker.
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Lista de Abreviaturas α-MEM – Minimum Essential Medium α BDNF – Brain Derived Neurotrofic Factor bFGF – Basic Fibroblast Growth Factor BME – β-Mercaptoetanol BrdU – 5-bromo-2’-deoxiuridina CD – Cluster Differentiation CFC – Colony-Forming Cells CFU – Colony-Forming Units CFU-E – Colony-Forming Units – Erythroid CFU-F – Colony-Forming Units Fibroblasts CFU-G/M – Colony-Forming Units – Granulocytic/Monocytic CFU-MIX – Colony-Forming Units – Multipotent CMN – Células Mononucleadas Cy3 – Indocarbocianina DAPI – 4’,6-Diamino-2-Fenilindol dbcAMP – Dibutiril AMP Cíclico DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium DMSO - Dimetilsulfóxido EGF – Epidermal Growth Factor ESC – Embrionic Stem Cell FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting FCS – Fetal Calf Serum FITC - Fluorescein Isothiocyanate FN – Fibronectina GAD65 – Ácido Glutâmico Descarboxilase GalC – Galactocerebroside G-CSF – Granulocytic Colony-Stimulating Factor GDNF – Glial Cell Line–Derived Neurotrophic Factor GFAP – Glial Fibrilar Acidic Protein HSC – Hematopoietic Stem Cell HPC – Hematopoietic Progenitor Cell IBMX – Isobutilmetilxantina LIF – Leukemia Inhibitory Factor Lin- - Células negativas para linhagens hematopoiéticas Mab – Monoclonal antibody MAP1B – Proteína Associada de Microtúbulo 1B MAP2 – Proteína Associada de Microtúbulo 2 MAPC – Células Progenitoras Adultas Multipotentes MBP – Myelin Basic Protein MO – Medula Óssea MOSP – Proteína de Mielina Específica de Oligodendrócito MSC – Mesenchimal Stem Cell NF – Neurofilamento NF-200 – Neurofilamento de 200kDa NGF – Nerve Growth Factor NGS – Normal Goat Serum NOD-SCID –Non-Obese Diabetic/Severe Compromised Immune Deficient NSE – Neuron Specific Enolase
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Neu-N – Neuron-specific neuronal protein PBS – Phosphated Bufered Saline PCR – Polymerase Chain Reaction PDGF-BB – Platelet Derived Growth Factor PPD - Paraphenylenediamine RT-PCR – Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction SC – Stem Cell SP – Sangue Periférico SN – Sistema Nervoso SNC – Sistema Nervoso Central SNP – Sistema Nervoso Periférico SSEA-1 – Stage-Specific Antigen 1 TA – Temperatura ambiente TH – Tirosina Hidroxilase Tuj-1 – Neuronspecific Tubulin UCB – Umbilical Cord Blood WB – Western Blot
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Sumário
Resumo ................................................................................................................. viii Abstract ................................................................................................................ ix Lista de abreviaturas ............................................................................................ x 1. Introdução
1.1. As células tronco ......................................................................................... 14 1.2. A medula óssea e o sangue de cordão umbilical ....................................... 17 1.2.1. A célula tronco hematopoiética .............................................................. 17 1.2.2. A célula tronco hematopoiética na circulação ...................................... 18 1.2.3. Células tronco e progenitoras hematopoiéticas no sangue de cordão
umbilical .................................................................................................................. 19 1.2.4. A célula tronco mesenquimal ou estromal ............................................. 20
1.3. Multipotencialidade, microquimerismo, fusão e potencial terapêutico das células do sistema hematopoiético ....................................................................... 21
1.3.1. Multipotencialidade das células tronco do sistema hematopoiético in vitro ................................................................................................................................. 21
1.3.2. Microquimerismo de células do sistema hematopoiético em outros tecidos .................................................................................................................... 25
1.3.3. Fusão das células do sistema hematopoiético com células de outros tecidos .................................................................................................................... 33
1.3.4. Potencial terapêutico das células do sistema hematopoiético para outros sistemas .................................................................................................................. 35
1.4. Expressão de genes de tecidos derivados dos três folhetos embrionários em células do sistema hematopoiético ......................................................................... 38
1.4.1. Expressão de genes de tecidos derivados dos três folhetos embrionários em células do estroma de medula óssea (MO) em cultura ................................... 38
1.4.2. Expressão de genes de tecido nervoso em células de sangue de cordão umbilical in vitro ..................................................................................................... 47
1.4.3. Expressão de genes de tecido nervoso em MO, sangue periférico (SP) e UCB ex vivo ........................................................................................................... 49
1.5. O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 ................................................................... 54
2. Objetivos ........................................................................................................... 58 3. Materiais e Métodos
3.1. Animais utilizados ...................................................................................... 60 3.2. Extração de medula óssea ........................................................................ 60 3.3. Amostras de sangue de cordão umbilical ................................................... 60 3.4. Separação das células mononucleadas .................................................... 61 3.5. Imunocitoquímica ....................................................................................... 63 3.5.1. Identificação de gangliosídeos 9-O-acetilados em células vivas em
suspensão ............................................................................................................... 63 3.5.2. Identificação de gangliosídeos 9-O-acetilados e do antígeno de superfície
CD34 em células fixadas em suspensão ................................................................ 64 3.5.3. Identificação de proteínas intracelulares consideradas específicas de
tecido nervoso em células fixadas citocentrifugadas .............................................. 65
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3.5.4. Identificação de proteínas intracelulares consideradas específicas de tecido nervoso em células fixadas em suspensão .................................................. 66
4. Resultados
4.1. Amostras .................................................................................................... 67 4.2. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido nervoso em
CMN de medula óssea de ratos adultos ............................................................ 67 4.3. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido nervoso em
CMN de sangue de cordão umbilical humano ................................................... 77 4.4. Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula óssea de
ratos adultos e de sangue de cordão umbilical humano .................................... 83 4.5. Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula óssea de ratos adultos que expressam o antígeno CD34, marcador de células tronco e progenitores hematopoiéticos ............................................................................ 89
5. Discussão
5.1. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido nervoso em CMN de medula óssea de ratos adultos e de sangue de cordão umbilical humano................................................................................................................ 91 5.2. Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula óssea de
ratos adultos e de sangue de cordão umbilical humano .................................... 96 5.3. Implicações da expressão espontânea de antígenos neurais em células da
medula óssea e do sangue de cordão umbilical para as terapias celulares ............................................................................................................................ 100 5.4. Implicações clínicas: níveis séricos de proteínas de tecido nervoso no
sangue de recém nascidos são usadas na detecção e avaliação de lesões do SNC ................................................................................................................... 104
6. Conclusões ………….........................................................................................108
Referências Bibliográficas ................................................................................ 109
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1. Introdução
A terapia celular foi usada pela primeira vez em 1951, por Lorenz e
colaboradores, ao demonstrarem que a infusão intravenosa de medula óssea
singenêica prevenia a morte após doses letais de irradiação em roedores. Após um
longo período de uso das células da medula óssea (Ball E.D. et al., 2000) e mais
tarde, do sangue de cordão umbilical (Gluckman E., et al., 1989; Gluckman E. et al.,
1997) para recomposição do sistema hematopoiético, evidências apontaram para a
possibilidade de tratamento de patologias de outros sistemas com essa mesma
abordagem (Kopen G.C. et al., 1999; Jiang Y., Jahagirdar B.N. et al., 2002; Munoz
J.R. et al., 2005). Neste sentido, vários estudos clínicos foram realizados com
sucesso (Strauer B.E. et al., 2002; Escolar M.L. et al., 2005). No entanto, a
caracterização destas células ainda apresenta várias lacunas, constituindo uma
questão fundamental para a progressão do estudo das terapias celulares.
1.1. As células tronco
As células tronco são definidas como células indiferenciadas com alta
capacidade de auto-renovação e que podem dar origem a um ou mais tipos
celulares especializados. As células tronco estão no topo hierárquico da linhagem
celular de um determinado tecido. Na maior parte dos casos, entre as células tronco
e sua progenia terminalmente diferenciada existe uma população intermediária de
progenitores comprometidos, com capacidade proliferativa limitada e potencial de
diferenciação mais restrito (figura 1) (Mayani H., 2003).
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Figura 1. Esquema proposto de diferenciação celular a partir de uma célula tronco (Mayani, H., 2003).
Durante o desenvolvimento, as células tronco são classificadas de acordo
com sua plasticidade. O óvulo fertilizado ou zigoto, é classificado como uma célula
tronco totipotente capaz de produzir todas as diferentes células de um animal,
inclusive aquelas que não vão fazer parte do embrião, mas sim dos folhetos extra-
embrionários como as células da placenta. No estágio de mórula, cada célula
produzida é idêntica às demais e todas são consideradas células tronco
totipotentes. Mais adiante no desenvolvimento, no estágio de blastocisto, cada
célula que forma a massa celular interna é capaz de produzir todas as células do
embrião, mas não as estruturas extra-embrionárias. Estas células tronco
embrionárias (ESC, de Embryonic Stem Cells), sob condições específicas de
cultura, podem ser induzidas a proliferar indefinidamente e a manterem-se
indiferenciadas (Mayani H., 2003). Destas células, duas diferentes células tronco
são derivadas: aquela que dá origem à linhagem germinal, que mais tarde irá dar
origem aos gametas, e aquela que produz todas as células somáticas. As células
que irão dar origem aos tecidos ectodermais, mesodermais e endodermais são, por
sua vez, derivadas desta última (figura 2).
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Figura 2. Classificação das células tronco (SC) durante o desenvolvimento. (Mayani, H., 2003).
Inicialmente era atribuída às células tronco somáticas apenas a capacidade
de diferenciação restrita a seu tecido de origem. Algumas células eram bem
conhecidas pela capacidade de regenerar lesões nos tecidos em que residiam,
como os tecidos muscular (Berne R.M. & Levy M.N. 1993), epitelial (Slack J.M.W.
2000) e sangüíneo (Till J.E. & McCulloch E.A., 1980). Contudo, há atualmente
evidências de que a alteração experimental dos fatores microambientais pode levar
uma célula tronco adulta a adquirir fenótipos diferentes da linhagem que lhe era
anteriormente atribuída. A clonagem de um mamífero acentuou a discussão de que
o estado diferenciado de uma célula requer contínua regulação para manter-se e
que genes silenciados podem ser ativados num núcleo adulto sob condições
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citoplasmáticas adequadas (Wilmut I. et al., 1997).
1.2 A medula óssea e o sangue de cordão umbilical
1.2.1 A célula tronco hematopoiética
As células tronco hematopoiéticas (HSC, do inglês Hematopoietic Stem Cell)
são definidas como células primitivas, indiferenciadas e capazes de auto-renovação
e de diferenciação em todos os tipos celulares sangüíneos (Szilvassy S. & Hoffman
R., 1995). A vasta maioria das HSCs residem na medula óssea, na qual
representam 0.005% do total de células deste tecido (Szilvassy S. & Hoffman R.,
1995). Estas células podem ser identificadas e quantificadas usando ensaios in vivo
em que sua capacidade para repovoar o sistema hematopoiético de um
camundongo NOD-SCID (non-obese diabetic/severe compromised immune
deficient) é avaliada. Sua progenia imediata, denominada células progenitoras
hematopoiéticas (HPC, do inglês Hematopoietic Progenitor Cell) compreende
células com uma limitada capacidade de auto-renovação e com a habilidade de
formar colônias hematopoiéticas em culturas semi-sólidas (desta forma, são
também conhecidas como Células formadoras de colônias – CFC, do inglês Colony-
Forming Cells ou CFU, do inglês Colony-Forming Units). HPCs representam 0.1%
do total de células da medula óssea e neste grupo estão incluídas células
multipotentes e células comprometidas com linhagens individuais (Mayani H et al.,
2003).
A maioria das HSCs e HPCs expressam o antígeno CD34, uma glicoproteína
de membrana plasmática de 90-120kD que funciona como um regulador da adesão
das células hematopoiéticas às células estromais do microambiente hematopoiético.
Os antígenos CD90, CD117 e o CD133 também são expressos pelas HSCs. De
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acordo com sua imaturidade, as HSCs não expressam CD38, CD45RA, CD71,
HLA-DR ou qualquer outro antígeno específico de linhagem. Desta forma elas são
referidas como células negativas para linhagens (células Lin-) (Mayani H et al.,
2003). Alguns artigos (Bathia M. et al., 1998; Zanjani E.D. et al., 1998) relataram
que uma pequena proporção de HSCs não expressam o antígeno CD34, sendo
conhecidas como células CD34- CD38- Lin-. Além disso, há evidências de que estas
células dão origem às HSCs que expressam CD34 (Zanjani E.D. et al., 1998).
1.2.2. A célula tronco hematopoiética na circulação:
A medula óssea é distribuída por todo o esqueleto, o qual, em humanos,
compreende mais de 200 ossos. No adulto, o montante total de medula óssea ativa
corresponde a aproximadamente 2,6Kg, com aproximadamente 123x1010 células e
tem uma taxa de renovação de 188x106 células/Kg/h (Fliedner T.M. et al.,1976).
Curiosamente, a despeito do tecido hematopoiético encontrar-se distribuído por
muitas cavidades ósseas, seu funcionamento é como o de um órgão único. Isto é
possível devido a migração de HSCs através do sangue periférico (SP). A migração
das HSCs pelos sítios de medula óssea faz com que a produção de células
sangüíneas e os níveis locais de HSCs e HPCs mantenham-se adequados, o que é
pré-requisito para a regulação humoral (Mayani H. et al., 2003).
Durante a vida pré-natal os padrões de migração celular correspondem ao
desenvolvimento da medula óssea. A matriz estromal está estabelecida na clavícula
entre a sexta e oitava semana de gestação. Contudo, são necessárias quinze a
dezoito semanas para a medula óssea se distribuir por todo o esqueleto. Durante as
semanas dez e onze da gestação o sangue contém aproximadamente 134CFC/mL.
Na décima oitava semana de gestação, quando os ossos de todas as partes do
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corpo estão prontos para receber as células tronco, as HSCs e HPCs atingem a
densidade máxima, chegando até 65.000 CFC/mL. Ao nascimento, quando todos os
sítios de medula óssea já foram colonizados com HSCs e HPCs, a densidade no
sangue periférico é de aproximadamente 10.000 CFC/mL. Em adultos, em
condições normais, a freqüência de células progenitoras é baixa. Um mililitro de
sangue periférico contém, em média, 4x103 células CD34+, o que corresponde a
0,06% das células nucleadas (Mayani H. et al., 2003).
1.2.3 Células tronco e progenitoras hematopoiéticas no sangue de cordão
umbilical
Um mililitro de sangue de cordão umbilical (UCB) contém entre 1.000 e
10.000 progenitores multipotentes (CFU-MIX), 8.000 CFU-E (Colony-Forming Units
– Erythroid) e entre 5.000 e 14.000 progenitores mielóides (CFU-G/M, do inglês
Colony-Forming Units – Granulocytic/Monocytic). Desta forma, o número total de
CFC é aproximadamente 23.000 por mililitro. Quando comparados os números
relativos de células tronco e progenitoras no UCB e na medula óssea conclui-se que
não há grandes diferenças entre o valor total de CFCs. Contudo, importantes
diferenças na freqüência de tipos particulares de HPCs têm sido observadas, sendo
que, enquanto os níveis de progenitores relativamente maduros são similares entre
as duas fontes, a freqüência de progenitores primitivos, incluindo os multipotentes,
os eritróides e os bipotentes granulo-mielóides, é significantemente maior em UCB
que na medula óssea (Mayani H. et al., 2003).
Morfologicamente, as células CD34+ presentes na circulação periférica
adulta e fetal têm aspecto linfóide, de tamanho pequeno a intermediário, com
morfologia de blasto, uma razão núcleo/citoplasma alta e citoplasma basofílico e
20
agranular. A maioria destas células expressam CD38, CD44 e HLA-DR, além dos
antígenos relacionados a mielócitos CD33 e CD133 (Mayani H. et al., 2003).
1.2.4 A célula tronco mesenquimal ou estromal
A forma usada para identificar e quantificar as células tronco mesenquimais
(MSC) da medula óssea é o ensaio in vitro em que a capacidade para originar
colônias de fibroblastos é testada (Colony-Forming Units Fibroblasts/CFU-F assay).
Estas MSC têm a capacidade de dar origem, in vitro, sob condições apropriadas, à
osteócitos produtores de matriz mineralizada, adipócitos que apresentam vacúolos
contendo lipídeos e condrócitos produtores de matriz cartilaginosa (Otto W.R. & Rao
J., 2004; Tondreau T. et al., 2004a).
Usando o ensaio de CFU-F, Wexler S.A. e colaboradores (2003) encontraram
uma freqüência de uma MSC por 3-4x104 células de medula óssea. No entanto, nas
condições utilizadas naquele estudo, não foram encontradas MSC em amostras de
UCB de bebês nascidos a termo, nem de SP humano adulto. De acordo com o
método empregado por aqueles autores, 107 células foram cultivadas em 10ml de
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium) suplementado com 10% de soro fetal
bovino (FCS, do inglês fetal calf serum), em placas de 25cm2. A cada semana
metade do meio era trocado até que fosse atingida a confluência. A seguir a placa
foi tratada com tripsina e as células resultantes foram semeadas numa densidade
de 1x106 CMN por placa.
Em outro estudo, Erices A. e colaboradores (2002) encontraram
predominância de células multinucleadas, semelhantes a osteoclastos, positivas
para CD45, em 75% das culturas aderentes obtidas de UCB. Estas culturas eram
quiescentes e não resistiam à primeira passagem. Apenas 25% das amostras de
21
UCB originaram culturas mesenquimais, sendo a maior parte delas provenientes de
UCB pré-termo.
Yu M. e colaboradores (2004) encontraram células com características de
MSC em sangue de fetos humanos de 16 a 26 semanas de idade, mas não em
UCB de bebês nascidos a termo. As células mononucleadas das amostras de
sangue eram separadas através de gradiente de densidade e cultivadas em α-MEM
(do inglês, Minimum Essential Medium α) suplementado com 15% de FCS, em uma
concentração de 5x105 células/cm2. Após 48 horas o meio era trocado e as células
não aderentes eram removidas; ao ser atingida 80% de confluência, cada cultura
era tripsinizada e recultivada em três placas. As células aderentes obtidas do UCB
pós-natal não sobreviviam a mais de uma passagem em cultura e eram CD45+,
duas características incompatíveis com MSC. Ao contrário, as culturas obtidas a
partir de sangue fetal eram CD45-, CD34-, sobreviviam às passagens e podiam ser
mantidas in vitro por mais de 4 meses; ao serem induzidas à diferenciação em
tecido ósseo ou adiposo, produziam respectivamente matriz mineralizada ou
apresentavam vacúolos lipídicos.
1.3 Multipotencialidade, microquimerismo, fusão e potencial terapêutico das
células do sistema hematopoiético
1.3.1 Multipotencialidade das células tronco do sistema hematopoiético in
vitro
Vários autores têm demonstrado a plasticidade das células da medula óssea.
Dentre eles, Woodbury D. et al. (2000) atribuíram às MSC da MO de ratos e de
humanos a capacidade de diferenciarem-se em neurônios in vitro. As células eram
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cultivadas por 20 passagens em DMEM suplementado com 20% de FCS. A seguir,
eram tratadas com meio de cultura DMEM adicionado de 10ng/ml de bFGF (do
inglês: basic fibroblast growth factor) e depois 1-10mM β-Mercaptoetanol (BME), 2%
Dimetilsulfóxido (DMSO) e 200µM hidroxianisole butilado (BHA). Após apenas 5
horas de exposição a estas condições de cultura, 80% das células expressavam os
marcadores neuronais Neu-N e NF-M e Tau, com dramática modificação
morfológica com retração dos corpos celulares e aparecimento de prolongamentos
finos, semelhantes a cones de crescimento e filopódios.
Neste mesmo ano, Sanchez-Ramos J. e colaboradores (2000) submeteram
MSCs humanas e de camundongos à cultura na presença de EGF (Epidermal
Growth Factor) ou BDNF (Brain Derived Neurotrofic Factor) e conseguiram
resultados semelhantes, com expressão de GFAP (do inglês: glial fibrilar acidic
protein) e Neu-N e surgimento de células em formato de fuso com prolongamentos,
após 7 a 14 dias in vitro.
Em consonância com os trabalhos anteriores, Deng W. et al. (2001)
cultivaram MSC humanas por duas passagens em α-MEM com 20% FCS e depois
as trataram com meio adicionado de 0.5mM de isobutilmetilxantina (IBMX) e 1mM
Dibutiril AMP Cíclico (dbcAMP) por 6 dias, uma condição capaz de aumentar os
níveis intracelulares de AMPc. Cerca de 25% das células da cultura apresentaram
morfologia típica de neurônio, com aumento da expressão de vimentina e NSE
(neuron specific enolase). No entanto, a cultura não tratada também expressava
marcadores neuronais, como MAP1B (microtubule-associated protein 1B), NSE,
Tuj-1 (neuronspecific tubulin) e vimentina.
Em contraste com os resultados descritos acima, Lu e colaboradores (2004)
recentemente demonstraram que DMSO, BME e BHA não causam diferenciação
23
neuronal, mas sim modificação morfológica por toxicidade celular, constituindo-se
em um artefato. Neste estudo, a análise por microscopia em tempo intervalado
(figura 3) indicava que a exposição química das MSC não causava crescimento de
neuritos, mas sim retração da maioria das expansões celulares, resultando em
poucos e finos prolongamentos parecidos com neuritos. Inclusive, a exposição
celular a outros estressantes celulares, incluindo detergentes, alta molaridade de
cloreto de sódio e extremos de pH gerava resultados semelhantes, principalmente
no que se refere aos detergentes (figura 4). Além disto, o bloqueio da síntese de
proteínas com ciclohexamida interrompeu a proliferação celular, mas não impediu
que as células adotassem a ‘morfologia de neurônios’ após a exposição a estes
agentes.
Neuhuber e colaboradores (2004), também reavaliando o protocolo de
diferenciação através de DMSO, concluíram que as alterações morfológicas
encontradas eram causadas por rápida desconstituição do citoesqueleto de actina.
A retração do citoplasma originava longos prolongamentos semelhantes a neuritos,
mas que em observações microscópicas em tempo intervalado não apresentavam
motilidade. Prolongamentos semelhantes a neuritos também foram obtidos através
de tratamentos com agentes despolimerizantes de filamentos de actina.
24
Figura 3. Microscopia em tempo intervalado demonstrando modificações morfológicas induzidas quimicamente com DMSO/BHA em MSC. A: MSCs com morfologia plana e espalhada em cultura; B: Retração celular pode ser observada tão cedo quanto 15’ após o início da incubação com DMSO/BHA; C–E: A MSCs retraídas adquirem uma morfologia semelhante a de neurônios com corpo celular condensado e prolongamentos finos após apenas 45’; F–H: Exposição continuada das MSC a DMSO/BHA resulta em maior retração do corpo celular e perda de alguns dos prolongamentos celulares (cabeça de seta); o tamanho celular original é indicado por setas verticais (13µm). Lu, P. et al. ( 2004).
25
Figura 4. Modificações morfológicas após exposição de MSC a estresse químico. A, B: MSCs adotam uma morfologia semelhante a de neurônios após exposição aos detergentes Tween 20 (A) e Triton X-100 (B) por 5h. Lu P. et al. (2004).
1.3.2 Microquimerismo de células do sistema hematopoiético em outros
tecidos
Outra característica das células do Sistema Hematopoiético é sua capacidade de formar quimeras em outros tecidos. Neste contexto, Bianchi D.W. et al. (1996) verificaram que células progenitoras masculinas persistem no sangue materno até mesmo após 27 anos do nascimento de um menino. Neste estudo, amostras de sangue periférico foram recolhidas de mulheres grávidas ou que tinham tido filhos homens 6 meses a 27 anos antes. As CMN foram separadas por FACS utilizando anticorpos para linfócitos B (CD19 ou 23), linfócitos T (CD3, 4 ou 5), HSC (CD34) e progenitores comprometidos com as linhagens mielóide ou linfóide (CD34 e CD38). Nestas frações foram rastreadas seqüências do cromossomo Y através de PCR. Em 13 das 19 mulheres grávidas de fetos do sexo masculino foi encontrado DNA masculino. Em 6, das 8 mulheres que tinham filhos homens, foi encontrado DNA masculino na fração CD34+CD38+, inclusive em uma mulher que havia tido um filho 27 anos antes da coleta da amostra de sangue.
Em um estudo semelhante, Khosrotehrani K. et al. (2004) investigaram a
existência de células epiteliais, hepáticas e hematopoiéticas derivadas de células
fetais em mulheres que haviam tido filhos homens. Usou-se hibridização in situ para
detectar o cromossomo Y e imunocitoquímica para identificar citoqueratina em
células epiteliais (AE1/AE3), CD45 em leucócitos e heppar-1 em hepatócitos. Em
média, havia 227(+/- 128) células microquiméricas masculinas (XY) por 106 células
maternas (total de 701 células, em dez mulheres). Nos tecidos epiteliais (tireóide,
26
cérvix, intestino e vesícula biliar) 14 a 60% das células XY expressavam
citoqueratina. Nos tecidos hematopoiéticos (baço e linfonodos) 90% das células XY
expressavam CD45. De duas amostras hepáticas analisadas, ambas apresentavam
células XY, sendo que em uma delas 4% das células XY expressavam heppar-1.
Estas percentagens devem ser consideradas com precaução, já que o estudo foi
realizado propositalmente com mulheres que já se sabia, por um trabalho anterior,
possuírem grande número de células microquiméricas.
Particularmente no sistema nervoso central (SNC) o tráfego de leucócitos é,
em situações normais, restrito, devido à barreira hemato-encefálica. Basicamente,
são encontrados no SNC intacto apenas linfócitos T, B e células
macrofágicas/monocíticas. Linfócitos T precisam estar ativados para adentrarem o
SNC, independente de o antígeno ser encontrado neste sistema ou não. No
entanto, estes linfócitos só permanecem no SNC se o antígeno puder ser
reconhecido localmente. Linfócitos B, de forma semelhante, transitam pelo SNC,
mas só permanecem no local se puderem reconhecer seu antígeno nesta região.
Células Natural Killer (NK) e neutrófilos entram apenas durante os processos
inflamatórios no SNC. As células derivadas da família macrofágica-monocítica no
SNC intacto ou lesionado incluem as células microgliais, as células perivasculares
macrofágicas ou microgliais, os macrófagos meníngeos, os macrófagos do plexo
coróide, as células do epiplexo e os macrófagos fagocíticos padrão ou células de
Gitter, encontrados em áreas de lesão tecidual. As células microgliais parenquimais
aparentemente invadem o encéfalo e aí se tornam residentes através de um único e
maciço influxo durante a vida fetal. Durante a vida adulta estas células são repostas
numa taxa de poucos pontos percentuais por ano. Outros elementos monocíticos
são substituídos rapidamente durante toda a vida, como os macrófagos meningeais,
27
as células perivasculares e os macrófagos do plexo coróide (Hickey W.F., 1999;
Hickey W.F., 2001).
Aprofundando os estudos sobre a migração das células do sistema
hematopoiético para o SNC, Eglitis M.A. & Mezey E. (1997) investigaram se as
células da glia são derivadas apenas de células presentes no encéfalo desde o
período fetal ou se o aporte de células provenientes do sistema hematopoiético
durante a vida adulta também contribui com células para a microglia. Para verificar
esta hipótese, os autores transplantaram em camundongos fêmeas MO de machos
ou MO geneticamente marcada. Usando hibridização in situ e imunohistoquímica,
foi identificado um fluxo contínuo de células hematopoiéticas para dentro do
encéfalo. Células derivadas de MO no encéfalo foram identificadas após três dias
do transplante, e a quantidade aumentou com o passar das semanas (sendo a
análise feita até a décima semana). Estas células estavam largamente distribuídas
através do encéfalo, incluindo cerebelo, córtex cerebral, hipocampo, tálamo e tronco
encefálico. Quando a hibridização in situ foi combinada com imunohistoquímica
usando marcadores de linhagem, algumas células derivadas de MO apresentaram
imunorreatividade para o marcador de microglia F4/80. Outras células,
surpreendentemente, apresentaram imunorreatividade para o marcador astroglial
GFAP. Os autores concluíram que estes resultados indicavam que algumas células
da microglia e astroglia eram derivadas de precursores presentes na medula óssea
adulta.
Corroborando com os dados anteriores, Brazelton T.R. et al. (2000) extraíram
medula óssea de camundongos adultos que expressavam constitutivamente GFP
(Green Fluorescent Protein) e a transplantaram para camundongos C57BL/6
irradiados sub-letalmente. Nos encéfalos processados meses após o transplante,
28
podia-se encontrar células GFP no bulbo olfatório, hipocampo, áreas corticais e
cerebelo. A análise por citometria de fluxo realizada com células extraídas dos
encéfalos dos animais hospedeiros revelou que 20% das células GFP encontradas
não expressavam o marcador pan-leucócito CD45 nem o marcador de células
mielo-monocíticas e microglia CD11b. Podia-se observar células derivadas da
medula óssea expressando os marcadores de neurônio imaturos TuJ-1, e β-III-
tubulina e os marcadores de neurônios maduros Neu-N e NF-200 (neurofilamento
de 200kD) e pCREB (CREB fosforilado). Não foram encontradas células derivadas
da medula óssea expressando o marcador de astrócitos GFAP. Algumas células
estavam tão integradas ao tecido hospedeiro que não podiam ser distinguidas dos
neurônios vizinhos exceto pela visualização da GFP.
Em outro estudo, Mezey E. et al. (2000) observaram células Neu-N+ e NSE+
derivadas de medula óssea em encéfalos de camundongos. Após 24 horas do
nascimento camundongos fêmeas PU.1Null recebiam injeções intraperitoneais de
medula óssea proveniente de camundongos selvagens machos. Os encéfalos eram
analisados 1 a 4 meses depois, procurando-se células portadoras do Cromossomo
Y e que expressassem Neu-N. Entre 2,3 e 4,6% de todas as células nucleadas,
incluindo as da vasculatura, eram positivas para o Cromossomo Y. Células Y+/Neu-
N+ eram encontradas principalmente no córtex cerebral e também no hipotálamo,
hipocampo, amígdala, substância cinzenta periaquedutal e striatum.
Em 2003, o mesmo grupo (Mezey E et al., 2003) observou em humanos
células Neu-N+ ou KV2.1+ (canal de potássio dependente de voltagem específico de
neurônios) derivadas de medula óssea no encéfalo. Estes pesquisadores
analisaram encéfalos pós-mortem de indivíduos do sexo feminino que tinham
recebido transplante de medula óssea de doadores masculinos um a nove meses
29
antes do óbito para tratamento de doenças hematológicas. O neocórtex, o striatum
e a parede ventricular, o hipocampo e o cerebelo foram analisados. Células
duplamente positivas para os marcadores neuronais e para o cromossomo Y foram
encontradas principalmente no neocórtex e no hipocampo. Células Y/KV2.1+ foram
encontradas em todas as áreas corticais e no hipocampo. Células Y+ negativas
para os marcadores neuronais foram encontradas na substância branca, junto aos
vasos sangüíneos e nas paredes endoteliais. No entanto, estas células duplamente
marcadas eram em um número muito pequeno.
Em contraste com os estudos acima, Castro R.F. et al. (2002) não
encontraram células neurais derivadas de medula óssea em camundongos. Animais
sub-letalmente irradiados recebiam transplante de 2x103 células side population
(células tronco detectadas por extrusão de corante) de camundongos ROSA26,
cujas células expressam LacZ. Quatro meses depois, apesar de 80 a 95% das
células sangüíneas serem positivas para LacZ as únicas células LacZ+ encontradas
nos encéfalos e na medula espinhal eram perivasculares (cinco células em 106
células analisadas por encéfalo). A adição a este protocolo de uma lesão no tecido
nervoso não foi capaz de produzir resultados diferentes, nem o transplante de
medula óssea não fracionada.
De forma semelhante, Wagers A.J. et al. (2002) concluíram que eventos de
transdiferenciação de células circulantes no sangue em linhagens não
hematopoiéticas é um fenômeno muito raro, pelo menos em condições fisiológicas.
Este grupo produziu quimeras através do transplante de uma única célula tronco
hematopoiética GFP+ em camundongos não transgênicos letalmente irradiados e 4
a 9 meses depois procurou células GFP+ que apresentassem antígenos tecido-
específicos, mas não o antígeno pan-leucócito CD45 e com morfologia distinta,
30
indicativa de célula diferenciada não hematopoiética. Apesar de ser eficiente em
reconstituir o sistema hematopoiético, o transplante não foi capaz de contribuir de
forma apreciável para outros tecidos, incluindo encéfalo, rins, fígado e músculos. A
vasta maioria das células GFP+ encontradas nos tecidos eram CD45+ e não
marcavam para os antígenos tecido-específicos α-actinina e distrofina no músculo
esquelético, pan-citoqueratina no intestino, lectina aglutinina de gérmen de trigo
(WGA) no rim, ou MAP2 no encéfalo. As únicas células GFP+ não hematopoiéticas
encontradas foram uma célula de Purkinje no cerebelo e alguns hepatócitos. Usou-
se, então, camundongos parabióticos, em que uma circulação anastomosada
comum foi desenvolvida através de cirurgia e mantida por 6 a 7 meses, sendo um
animal GFP e o outro não transgênico. Neste estudo também não foram
encontradas células GFP+ não hematopoiéticas no animal não transgênico, apesar
de o quimerismo hematopoiético ter atingido o equilíbrio após 8 a 10 dias.
Nesta mesma abordagem, Vallières L. & Sawchenko P.E. (2003) injetaram
células de medula óssea de camundongos GFP na circulação sistêmica de
camundongos não transgênicos sub-letalmente irradiados. Centenas de células
GFP+ foram encontradas nos encéfalos dos animais hospedeiros sacrificados 1-12
meses depois, mas nenhuma apresentava fenótipo neuronal, macroglial ou
endotelial, mesmo após a injúria. No córtex cerebral, 99,7% destas células eram
macrófagos perivasculares. Nenhuma célula GFP+ expressava o marcador glial
GFAP ou os marcadores neurais Neu-N e Tuj-1 e todas elas eram positivas para o
marcador pan-leucócito CD45.
Um estudo polêmico publicado pelo grupo de Catherine Verfaille (Jiang Y.,
Jahagirdar B.N. et al., 2002) produziu, através do implante de células derivadas da
medula óssea em blastocistos, dados contrastantes com os descritos acima, obtidos
31
em animais adultos. Neste estudo os autores concluíram que células purificadas de
MSC, denominadas MAPCs (multipotent adult progenitor cells) diferenciam-se in
vivo em células com características mesodermais, neuroectodermais e
endodermais. As MAPCs quando injetadas em um blastocisto, contribuíam para a
maioria, talvez todos os tipos celulares somáticos com exceção de células da
linhagem germinativa. MAPCs eram obtidas de medula óssea humana isolando
células negativas para CD45 e Glicoforina-A a partir da porção mononucleada de
medula óssea e cultivadas com 0,2% de FCS, 10 ng/mL de EGF (epidermal growth
factor) e 10 ng/mL PDGF-BB (platelet derived growth factor). MAPCs foram isoladas
de camundongos através do cultivo das células da porção mononucleada da
medula óssea em Fibronectina (FN) com 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL PDGF-BB e 10
ng/mL de LIF (Leukemia Inhibitory Factor). As células obtidas eram negativas para
CD3, Gr-1, Mac-1, CD19, CD34, CD44, CD45, cKit, MHC classe-I e classe-II;
expressavam baixos níveis de Flk-1 e Sca-1 e altos níveis de CD13 e SSEA-1
(Stage-Specific Antigen 1). O fenótipo das MAPCs na medula óssea fresca é
desconhecido. A morfologia e o fenótipo mantinham-se após 30 até 120 duplicações
da população. Aproximadamente 1% dos poços semeados com 10 células CD45-
/TER119- da porção mononucleada da medula óssea eram capazes de originar
culturas que cresciam continuamente, sugerindo que uma em 1.000 células CD45-
/TER119- cultivadas a partir de células mononucleadas eram capazes de iniciar
culturas de MAPCs. Cultivadas por 14 dias em FN, sem PDGF-BB nem EGF, mas
com bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) cerca de 15% das células adquiriram
morfologia e fenótipo de astrócitos (GFAP), 12% de oligodendrócitos (GalC –
Galactocerebroside) e 69% de neurônios (NF-200). NF-200, GalC e GFAP nunca
eram encontradas na mesma célula. Quando introduzidas em blastocistos de 3,5
32
dias, um nível variável de quimerismo podia ser encontrado em 80% dos filhotes.
Células derivadas das MAPCs contribuíam para o encéfalo, retina, pulmão,
miocárdio, músculo esquelético, intestino, rins, fígado, medula óssea e sangue
(figura 5).
Figura 5. Quimerismo detectado através de marcação de X-Gal em animais gerados de blastocistos microinjetados com uma única célula MAPC. A, imagem de uma secção de um animal não quimérico; B, animal 45% quimérico. Adaptado de Jiang Y. et al. (2002).
1.3.3 Fusão das células do sistema hematopoiético com células de
outros tecidos
Outro fenômeno que pode explicar pelo menos parte dos fenômenos de
adoção de fenótipo de células de linhagens não usuais pelas células tronco é a
fusão. Esta questão foi apresentada por Ying Q.L. et al. (2002) ao demonstrarem a
fusão celular entre células tronco embrionárias e células tronco neurais em cultura e
ao mesmo tempo por Terada N. et al. (2002), que usaram células tronco
33
embrionárias e células mononucleadas de medula óssea. No entanto, a fusão
espontânea in vitro foi considerada um fenômeno raro, ocorrendo 2 a 11 vezes para
cada 106 células mononucleadas de medula óssea ou uma vez a cada 104 a 105
células tronco neurais plaqueadas.
Duas publicações simultâneas demonstraram fusão in vivo. Através de
transplantes de medula óssea usando doadores e hospedeiros geneticamente
distintos Wang X. et al. (2003) e Vassilopoulos G. et al. (2003) observaram
hepatócitos derivados de medula óssea originados por fusão celular entre células
doadas e células do hospedeiro.
Resultados semelhantes foram obtidos por Alvarez-Dolado M. et al. (2003).
Estes autores demonstraram que a fusão era o principal mecanismo pelo qual
células hematopoiéticas podiam originar cardiomiócitos, neurônios de Purkinge e
hepatócitos in vivo. As demais células derivadas da medula óssea encontradas no
encéfalo, sem envolvimento com fusão, faziam parte da microglia, e no coração,
eram macrófagos. Não foi encontrada evidência de fusão com células da medula
óssea na musculatura esquelética, nos intestinos, rins ou pulmões.
Camargo F.D. et al. (2003) acharam fortes indícios que as células
musculares esqueléticas derivadas de células do sistema hematopoiético
esporadicamente encontradas são originadas apenas a partir de fusão de células
mielóides, após processos inflamatórios em que ocorre infiltração dessas células.
No desenho experimental utilizado, células CD45- não foram capazes de originar
células musculares: 5x105 células de medula óssea CD45- MLacZ+ e 1x105 células
não marcadas de medula óssea total foram injetadas em camundongos irradiados
letalmente 24 horas antes; duas semanas depois os músculos tibiais anteriores
foram processados para imunohistoquímica e não foram encontradas células
34
MLacZ+ (marcação com X-Gal). Animais LysM-Cre/ROSA flox/STOP, em que apenas
as células da linhagem mielóide expressam β-galactosidase e que tiveram um
músculo tibial anterior lesionado com cardiotoxina apresentavam células
musculares marcadas com X-Gal.
Doyonnas R. et al. (2004) encontraram resultados diferentes, de que tanto o
transplante de células tronco hematopoiéticas, quanto o de precursores mielóides
gera miócitos em músculo esquelético lesionado. Neste estudo diversas frações de
células da medula óssea eram capazes de invadir o músculo lesado com notexina
(NTX), sendo que a maior parte das células contribuía na forma de macrófagos para
as ações de fagocitose das células danificadas do tecido hospedeiro e somente as
frações que continham células tronco hematopoiéticas (lin- ckit+ Sca1+ e lin- ckit+)
e as que continham precursores mielóides (ckit+ Sca1-, lin- ckit+ Sca1- e lin- ckit+
CD31+) pareciam contribuir para a restauração da lesão, através de fusão celular
ou transdiferenciação.
1.3.4. Potencial terapêutico das células do sistema hematopoiético no sistema
nervoso
Chen J. et al. (2001) administraram células CD34+ de UCB em ratos
submetidos à isquemia cerebral focal e investigaram o quanto estas células
adentravam o encéfalo, sobreviviam, se diferenciavam e melhoravam as
deficiências funcionais resultantes da isquemia. Num dos grupos, 3x106 células de
UCB enriquecidas em células CD34+ (77,2 a 95%) foram transplantadas na veia da
cauda 24 horas após os animais serem submetidos a oclusão transitória da artéria
35
cerebral média direita. Estes animais foram sacrificados 14 dias depois para análise
dos tecidos. Outro grupo de animais recebeu o transplante 7 dias após a oclusão e
foram sacrificados 35 dias depois da oclusão. O transplante 24 horas após a
isquemia foi mais efetivo em melhorar as deficiências funcionais em relação à
infusão feita 7 dias após a isquemia, havendo diferença significante do primeiro
grupo para o grupo controle (animais que não receberam células). Não houve
redução significativa na área de infarto em nenhum dos grupos tratados, em relação
ao controle. Significantemente mais células transplantadas foram encontradas no
hemisfério cerebral da lesão do que no contralateral. Destas células, 2 a 8%
expressavam proteínas fenotípicas de astrócitos, neurônios ou endoteliais (GFAP,
Neu-N, Map-2 e vWF).
Estudos similares foram realizados por Li Y. et al. (2002) nos quais testaram
os efeitos de MSC humanas sobre as deficiências funcionais causadas por acidente
vascular encefálico (AVE) em ratos. Para isso, ratos adultos foram submetidos à
oclusão transitória da artéria cerebral média direita e após 24 horas foram
transplantados com 3x106 MSC humanas através da veia da cauda. O desempenho
funcional dos animais foi medido antes do AVE experimental e 1, 7 e 14 dias
depois, com significativa melhora quando comparados a animais isquêmicos que
não receberam MSC. Os níveis de BDNF e NGF medidos 7 dias após o transplante
eram maiores nos animais isquêmicos que haviam recebido MSC do que em
animais que receberam transplante de fibroblastos hepáticos ou que não receberam
transplante, como controles. Não houve redução significativa no volume da lesão
isquêmica 14 dias depois da oclusão nos animais tratados com MSC, mas o número
de células apoptóticas diminuiu na borda da lesão isquêmica. Cerca de 124x103 ±
46x103 células humanas eram encontradas por cérebro. Cerca de 60% deste total
36
localizava-se na zona isquêmica. Apenas 1 a 5% das células humanas encontradas
expressavam proteínas fenotípicas de astrócitos, neurônios ou endotélio (GFAP,
Neu-N, Map-2 e vWF) após 14 dias do transplante. Além disto, a quantidade de
células proliferativas aumentou na zona subventricular dos animais isquêmicos que
receberam o transplante.
Uma pesquisa do mesmo grupo, (Chen J. et al., 2003) usando um protocolo que diferia do anterior apenas pelo fato de usar MSC de ratos em ratas e não usar transplante de fibroblastos como controle, obteve resultados semelhantes, acrescido do dado de que a promoção da expressão de bFGF endógena na área de penumbra isquêmica pode ser mais um dos possíveis mecanismos responsáveis pela recuperação funcional obtida com a infusão de MSC.
Em outra série de estudos, Munoz J.R. et al. (2005) demonstraram que a
implantação estereotáxica de MSC humanas no giro denteado do hipocampo de
camundongos aumentava a proliferação endógena dos neurônios daquela região.
Os animais recebiam 5 x 104 ou 105 células e eram sacrificados 7 ou 30 dias após o
transplante. Após 1 a 3 dias do implante houve aumento significativo da proliferação
endógena no giro denteado, quando comparada à mesma área no hemisfério
contralateral. As células que haviam proliferado eram positivas para Sox-2, um
marcador de célula tronco neural. Sete dias após o transplante, estas células eram
positivas para doublecortin, um marcador de célula neuronal migratória e haviam
migrado para a camada celular CA1 e para o stratum oriens do hipocampo. Neste
estágio, algumas das células eram positivas para o marcador de célula tronco
nestina e para NG-2, marcador de progenitores de oligodendrócitos. Após 30 dias,
diferentemente de após 7 dias, algumas das novas células expressavam
marcadores de neurônios adultos. As MSC aumentaram a expressão dos fatores de
sobrevivência neuronal NGF, VEGF, CNTF, FGF-2 e BMI-1 nas áreas próxima ao
implante, o que não ocorreu nas mesmas áreas no hemisfério contralateral, nem
nos controles, que receberam infusão apenas do veículo. A maior expressão de
37
NGF e NT-4/5 foi encontrada aos 7 dias, mas a diferença de expressão entre os
animais que receberam células e os controles desaparecia aos 30 dias.
Borlongan C.V. et al. (2004) analisaram se em um modelo de AVE isquêmico
agudo o efeito de neuroproteção obtido através da infusão sistêmica de CMN de
UCB é dependente da entrada destas células no SNC. Para isto uma dose baixa de
CMN de UCB (2 x 105 células) foi infundida intravenosamente em camundongos
enquanto estes eram submetidos à oclusão transitória da artéria cerebral média
direita. Três dias depois não podiam ser detectadas células provenientes do
transplante nos encéfalos, mesmo quando imediatamente após o transplante os
animais eram tratados com manitol, um permeabilizante da barreira hemato-
encefálica. No terceiro dia após a isquemia a infusão de CMN de UCB sem o
permeabilizante, assim como o tratamento com apenas manitol, não trazia
benefícios na avaliação comportamental dos animais, na redução da área de infarto,
ou na concentração encefálica de neurotrofinas. Por outro lado, o tratamento com
CMN de UCB seguido imediatamente pelo tratamento permeabilizante causava
melhoras significativas, reduzia a área de infarto e aumentava a concentração
tecidual de GDNF, em relação aos controles. Estes efeitos eram nulos se as CMN
de UCB eram expostas antes do transplante a anticorpos neutralizadores das
neurotrofinas GDNF (glial cell line–derived neurotrophic factor), NGF, e BDNF
indicando que estas eram as responsáveis pelos efeitos terapêuticos observados
neste grupo de animais. Os níveis sangüíneos de GDNF, NGF e BDNF
encontravam-se aumentados no terceiro dia nos animais tratados com as células
seguido de manitol.
1.4 Expressão de genes de tecidos derivados dos três folhetos embrionários
38
em células do sistema hematopoiético
1.4.1 Expressão de genes de tecidos derivados dos três folhetos embrionários
em células do estroma de medula óssea (MO) em cultura
Seshi et al. (2000) demonstraram que células não hematopoiéticas (células
estromais) obtidas de medula óssea humana adulta, quando cultivadas pelo sistema
de Dexter, (Dexter T. M. et al. 1977 e Greenberger J. S. 1978) expressavam
homogeneamente marcadores específicos para múltiplas linhagens celulares
mesenquimais. Neste estudo, após punção, as células estromais foram separadas
das demais células da medula óssea através do sistema de cultura de Dexter.
Neste sistema, as células mononucleadas são cultivadas em placas com meio de
cultura em que foi adicionado soro de cavalo e hidrocortisona e na presença das
células hematopoiéticas, que permanecem flutuantes, por quatro semanas (em
duas passagens). As células mesenquimais (ou estromais) aderem à placa,
juntamente com os macrófagos, que são eliminados com L-leucina metil éster.
Como controle deste experimento foram usadas células mononucleadas (CMN) de
medula óssea separadas por gradiente de Ficoll e não cultivadas. A análise por
northern blotting, RT-PCR (do inglês Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction) e imunocitoquímica revelou que todas as células não hematopoiéticas da
cultura aderente expressavam marcadores de adipócitos (Oil Red e Oil Red O), um
marcador de osteoblasto (fosfatase alcalina) e marcadores de fibroblasto
(fibronectina e prolil-4-hidroxilase). Observaram ainda que mais de 80% destas
células também eram positivas para o marcador muscular actina. Por outro lado,
estas células eram negativas para CD34, que é um marcador de célula tronco
hematopoiética. Nas células mononucleadas de medula óssea não cultivada de
39
todos os marcadores citados acima, havia marcação apenas para o marcador de
adipócitos adipsina.
Outros estudos usando RT-PCR mostraram que células de estroma de
medula óssea em cultura expressam genes das linhagens germinal, ectodermal,
endodermal e mesodermal. Neste caso, células tronco mesenquimais de medula
óssea de ratos adultos foram mantidas em cultura em meio DMEM suplementado
com 20% de soro fetal bovino por 15 a 20 passagens. Estas células expressavam
genes ectodermais tais como: receptor NMDA, aldolase C, proteína precursora
amilóide, subunidade de ligação de glutamato de NMDA, sintaxina, proteína acídica
fibrilar glial – GFAP e NeuroD. Além destes, estas células expressavam genes da
linhagem endodermal tais como: lanoesterol-14a-demetilase, IPP isomerase e
ceruloplasmina; genes da linhagem mesodermal: leptina, cadeia pesada de miosina,
SM22α e da linhagem germinal como a protamina 2. A exposição por 48 horas
destas culturas a um meio de indução neural (NIM, de neuronal induction media,
constituído de 100 µM BHA, 10 µM de forskolin, 2% DMSO, 5 U/ml de heparina, 5
nM K252a, 25 mM KCl, 2 mM de ácido valpróico, suplemento N2 na concentração
indicada pelo fabricante [Life Technologies], 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml PDGF [de
platelet-derived growth factor], tendo DMEM como base) causou dramática
modificação morfológica, com retração dos corpos celulares e aparecimento de
prolongamentos finos, semelhantes a neuritos. A expressão do gene germinal
protamina 2 foi reduzida a níveis indetectáveis e o do gene endodermal
ceruloplasmina foi reduzido dramaticamente. Inesperadamente, alguns genes
neurais também tiveram os níveis de RNAm reduzidos, como a subunidade de
ligação de glutamato de NMDA, a aldolase C, o GFAP (marcador de astrócitos), o
NeuroD (fator de transcrição expresso transitoriamente por precursores neuronais)
40
e a Sintaxina 13. Por outro lado, marcadores de neurônios como Tau e NF-M que
não tinham expressão detectável nas células mesenquimais, apareceram após a
exposição ao meio de indução neural (Woodburry D. et al., 2002).
A expressão de proteínas específicas de tecido neuronal em cultura de
células mesenquimais derivadas de medula óssea humana, mesmo sem passarem
por qualquer processo de diferenciação foi também descrita por Tondreau T. et al.
(2004). Neste estudo, proteínas gliais e neuronais tais como nestina, βIII tubulina,
Tuj-1, tirosina hidroxilase (TH), proteína associada de microtúbulo 2 (MAP-2) e
GFAP tiveram sua expressão detectada por imunocitoquímica, western blots e RT-
PCR em células mesenquimais humanas separadas por aderência ao plástico ou
por depleção negativa com anticorpos específicos. Na separação por aderência ao
plástico, as células mononucleadas eram colocadas em placas de cultura com α-
MEM e este era trocado após 48 horas, eliminando as células não aderentes, que
são hematopoiéticas (Cultura de Friedenstein, Friedenstein A.J. et al., 1976). Na
separação por depleção negativa as células negativas para CD45 e para glicoforina
A eram utilizadas. Em ambos os casos as células eram cultivadas por duas
passagens com tripsinização. Desta forma a cultura não mais continha macrófagos,
porque estes apesar de aderirem ao plástico juntamente com as células
mesenquimais, não são descolados da placa na tripsinização e são assim
descartados. Foi observado que nestina e Tuj-1, que são proteínas de neurônios
imaturos, são expressas constitutivamente em mais de 80% destas células após
cultura por duas passagens, enquanto proteínas de neurônios mais maduros como
MAP-2 e TH (tiroxina hidroxilase) ou de astrócitos como a GFAP são expressas
após mais de cinco passagens. Após exposição a um meio de indução neural
ocorria um aumento na expressão de proteínas neurais ou gliais mais maduras (TH,
41
MAP-2 e GFAP) e diminuição na expressão de Tuj-1, sem diminuição significante
na expressão de nestina ou de marcadores mesenquimais, como SH2 e SH3.
Células mononucleadas separadas por gradiente de densidade, usadas como
controle, expressavam βIII tubulina, mas não nestina, nem MAP-2, o que foi
evidenciado por western blots e RT-PCR. Como as células mesenquimais
cultivadas expressavam espontaneamente antígenos neuronais e gliais, maduros e
imaturos concomitantemente, os autores concluíram que a funcionalidade das
células submetidas às condições indutoras deve ser demonstrada para que se
possa inferir que essas células têm realmente a capacidade de se diferenciarem em
neurônios.
Em outro estudo, a análise por microarray feita com material genético de uma
única célula permitiu demonstrar que uma mesma célula mesenquimal humana de
medula óssea em cultura expressa concomitantemente genes de múltiplas
linhagens. Neste estudo, as células estromais foram separadas das demais células
da medula óssea através do sistema de cultura de Dexter como explicado em
parágrafos anteriores. Uma única célula mesenquimal aderida à placa era retirada
da cultura através de laser-capture microdisection (LCM), tinha o RNA extraído,
amplificado e processado para microarray analysis (total de 10 células). Os
resultados demonstraram que células analisadas isoladamente expressavam
simultaneamente uma grande quantidade de transcritos característicos de
diferenciação em osteoblastos, fibroblastos, miócitos, adipócitos, epitélio, endotélio,
neurônios e glia confirmando estudos anteriores com outras técnicas (tabela 1 e 2).
(Seshi B. et al., 2003).
42
Genes relacionados a células neurais, neuroendócrinas ou associados a desordens neurológicas ativos em uma célula estromal de medula óssea humana
Sumário/exemplos representativos: Enolase específica de neurônios (gama), proteínas associadas ao receptor de GABA, NCAM, N-caderina, presenilina 1, proteína interativa com huntingtina, adrenomedulina, axotrofina, BDNF (brain-derived neurotrophic factor), proteína ligadora de sintaxina 1, proteína de mielina periférica 22, anquirina 3 (nodo de Ranvier, anquirina G), fator de maturação glial, etc.
ID da sonda
Nome do gene
ID no banco de genes
Breve descrição
34394_at ADNP AB018327 Neuroprotetor dependente de atividade 34777_at ADM D14874 adrenomedulina 41136_s_at APP Y00264 Proteína precursora beta amilóide (A4) (protease
nexina-II, doença de Alzheimer). Doença de Alzheimer 1, relacionada à APP; Amiloidose, cerebroarterial, tipo Dutch; Esquizofrenia, crônica.
36965_at ANK3 U13616 anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G). Proteínas conhecidas como moléculas ligadoras da membrana plasmática ao citoesqueleto no SNP.
34817_s_at A2LP U70671 Proteína relacionada à ataxina 2 35268_at AXOT AL050171 axotrofina 32607_at BASP1 AF039656 Abundante no encéfalo; proteína sinalizadora ligada na
membrana 1; 32606_at BASP1 AA135683 Abundante no encéfalo; proteína sinalizadora ligada na
43
membrana 1; 37945_at BACH U91316 Hidrolase acetil-Co-A do encéfalo 37958_at BCMP1 AL049257 Proteína de membrana celular no encéfalo 1 40023_at BDNF X60201 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) 2053_at CDH2 M34064 caderina 2, tipo 1, N-caderina (neuronal) 36190_at CDR2 M63256 Proteína relacionada à degeneração cerebelar (62kD) 38657_s_at CLTA M20471 Clatrina, polipeptídeo leve (Lca), seqüências de
inserção específicas do encéfalo. 40936_at CRIM1 AI651806 neurônios motores ricos em cisteína 32824_at CLN2 AF039704 Deficiente em lipofucinose cerosa neuronal infantil
tardia; gene da pepstatina lisossomal insensível à protease de homo sapiens (CLN2). Lipofucinose cerosa, neuronal 2, classicamente tardia na infância.
37692_at DBI AI557240 Inibidor de ligação de diazepam (modulador do receptor de GABA, proteína ligadora de acil-Coenzima A)
39542_at ENC1 AF059611 Córtex, ectodermal-neural (com domínio BTB-like) / associados com p110(RB). Seletores OMIM: fortemente expresso no encéfalo.
33817_at D10S102 S63912 FBRNP; homólogo heterogêneo de ribonucleoproteína; 41091_at FALZ U05237 Antígeno fetal de Alzheimer. Seletores OMIM:
anormalmente expresso no encéfalo fetal. O anticorpo correspondente ALZ50 reconhece uma patologia neurofibrilar associada com a doença de Alzheimer.
37298_at GABARAP AF044671 Proteína associada ao receptor de GABA(A)
35785_at GABARAPL1 W28281 Proteína associada ao receptor de GABA(A) like 1
Tabela 1, primeira parte. Genes de célula neural ou neuroendócrina ou associados a desordens neurológicas encontrados em uma célula estromal de medula óssea. OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man. Adaptado de Seshi B. et al. (2003), material suplementar. ID da sonda
Nome do gene
ID no banco de genes
Breve descrição
35767_at GABARAPL2 AI565760 Proteína associada ao receptor de GABA(A) like 2
763_at GMFB AB001106 Fator de maturação de glia, beta 39793_at GBAS AF029786 Seqüência amplificada de glioblastoma 38233_at HOMER-3 AF093265 Gene precoce imediato neuronal, homer, 3 40193_at ENO2 X51956 Gene para enolase específica de neurônio (gama)
humana ENO2. 216_at PTGDS M98539 Gene para a prostaglandina D2 sintase humana, exon
7, encéfalo. 40121_at HIP2 U58522 proteína interativa com huntingtina 2 35973_at HYPH AB023163 proteína interativa com huntingtina H 39687_at E46L AI524873 Proteína de encéfalo de camundongo like E46 39686_g_at E46L AL050282 Proteína de encéfalo de camundongo like E46 39685_at E46L AL050282 Proteína de encéfalo de camundongo like E46 1452_at LMO4 U24576 Domínio único LIM 4. Seletores OMIM: é fortemente
expresso nas células da crista neural cranial, somitos, botão mesenquimal da borda dorsal, neurônios motores, progenitores de células de Schwann e na linhagem de linfócitos T.
39072_at MXI1 L07648 Proteína interativa MAX 1. Neurofibrosarcoma; suscetibilidade a câncer de próstata; fator de transcrição; formas heterodiméricas com a proteína
44
Max.
654_at MXI1 L07648 Proteína interativa MAX 1. Neurofibrosarcoma; suscetibilidade a câncer de próstata; fator de transcrição; formas heterodiméricas com a proteína Max.
33769_at MPZL1 AF087020 Proteína de mielina zero-like 1 39356_at NEDD4L AB007899 Expressa em precursores neurais, regulada pelo
desenvolvimento 4-like 40281_at NEDD5 D63878 Expressa em precursores neurais, regulada pelo
desenvolvimento 5 1695_at NEDD8 D23662 Expressa em precursores neurais, regulada pelo
desenvolvimento 8 37005_at NBL1 D28124 neuroblastoma, supressão de tumorigenicidade 1 31896_at NAG AL050281 Proteína amplificada de neuroblastoma 37286_at NRCAM AB002341 Molécula de adesão celular neuronal 36933_at NDRG1 D87953 Gene regulador diminutivo N-myc 1. Neuropatia,
neuropatia hereditária motora e sensitiva tipo Lom. 38653_at PMP22 D11428 Proteína de mielina periférica 22. Doença de Charcot-
Marie-Tooth com surdez; neuropatia de Charcot-Marie-Tooth 1A; Doença de Dejerine-Sottas; Neuropatia recorrente.
41221_at PGAM1 J04173 Fosfoglicerato mutase 1 (encéfalo) 36667_at PYGB U47025 Fosforilase, glicogênio; encéfalo. 38291_at PENK J00123 Preproencefalina (gene da encefalina humana: exon 3 e
flanco 3'). Tabela 1, segunda parte. Genes de célula neural ou neuroendócrina ou associados a desordens neurológicas encontrados em uma célula estromal de medula óssea. OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man. Adaptado de Seshi B. et al. (2003), material suplementar.
ID da sonda
Nome do gene
ID no banco de genes
Breve descrição
641_at PSEN1 L76517 presenilina 1 (doença de Alzheimer 3). Doença de Alzheimer, familiar, com paraparesia espástica e placas incomuns; Doença de Alzheimer 3.
38406_f_at PTGDS AI207842 prostaglandina D2 sintase (21kD, encéfalo) 38841_at GDBR1 AF068195 Relacionado à diferenciação celular em glioblastoma 1659_s_at RHEB2 D78132 Homólogo de Ras fortemente presente no encéfalo 2 34265_at SGNE1 Y00757 Grânulo secretório, proteína neuroendócrina 1 (proteína
7B2) 38818_at SPTLC1 Y08685 Serina palmitiltransferase, subunidade de base de
cadeia longa 1. Neuropatia, hereditária sensorial e autonômica, tipo 1.
36609_at SLC1A3 D26443 Família carreadora de soluto 1 (transportador glial de alta afinidade por glutamato), membro 3
34166_at SLC6A7 S80071 Família carreadora de soluto 6 (transportador de neurotransmissor, L-prolina), membro 7
32102_at SACS AB018273 Ataxia espástica de Charlevoix-Saguenay (SACSIN)/ Ataxia espástica, tipo Charlevoix-Saguenay.
45
36142_at SCA1 X79204 Ataxia espinocerebelar 1 (ataxia olivopontocerebelar 1, autossômica dominante, ataxina 1)
36998_s_at SCA2 Y08262 Ataxia espinocerebelar 2 (ataxia olivopontocerebelar 2, autossômica dominante, ataxina 2). Ataxia espinocerebelar 2.
38040_at SPF30 AF107463 splicing factor 30, relacionado à sobrevivência de neurônio motor
38800_at STMN2 D45352 stathmin-like 2. Seletores OMIM: proteína associada ao crescimento neuronal SCG10.
40467_at SDHD AB006202 Complexo succinato desidrogenase, subunidade D, proteína integral de membrana. Paragangliomas, familiar, sistema nervoso central; Paragangliomas, acromatina familiar, 1, com e sem surdez; Feocromocitoma.
33942_s_at STXBP1 AF004563 Proteína ligadora de sintaxina 1 / implicação no tráfego de vesículas e liberação de neurotransmissores.
36990_at UCHL1 X04741 Ubiquitina carboxil-terminal esterase L1 (ubiquitina tiolesterase), específico neuronal. Doença de Parkinson, familiar. Seletores OMIM: altamente específico de neurônios e do sistema neuroendócrino e dos seus tumores.
1058_at WASF3 S69790 Família de proteínas WAS, membro 3 35681_r_at ZFHX1B AB011141 zinc finger homeobox 1b. Síndrome de retardo mental da
doença de Hirschsprung; Síndrome de retardo mental da doença de Hirschsprung na ausência da doença de Hirschsprung. Seletores OMIM: proteína interativa de SMAD 1 (SMADIP1) aparentemente essencial ao desenvolvimento neural embriônico e da crista neural.
40140_at ZFP103 D76444 Proteína homóloga zinc finger 103 (camundongo). Seletores OMIM: título alternativo KF1, expresso no cerebelo normal e no córtex cerebral na Doença de Alzheimer, mas não no córtex cerebral normal.
Tabela 1, terceira parte. Genes de célula neural ou neuroendócrina ou associados a desordens neurológicas encontrados em uma célula estromal de medula óssea. OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man. Adaptado de Seshi B. et al. (2003), material suplementar. Linhagem celular Exemplos de genes representativos associados às linhagens A. Osteoblastos Caderina 11 (tipo 2, OB-caderina, osteoblasto), osteonectina,
osteopontina, fator específico de osteoblasto 2 (fasciclina I-like), condroitina sulfato proteoglicano 2 (versican), biglican, bamacan, colágeno tipo I, α2 (osteogênese imperfeita).
B. Músculo Vários tipos de miosina, tropomiosina 1 e 2, transgelina, transgelina 2, caldesmon 1, distrofina, distroglican 1, distrofia muscular congênita tipo Fukuyama (fukutina), ATPase (transporte de Ca2+, músculo cardíaco, contração lenta 2/ doença de Darier), filamento de actina, linha Z muscular (α2 e β).
C. Fibroblasto Prolil 4-hidroxilase, fibronectina, fibrillina 1, fibroglicano, gene de alfa-1 colágeno tipo IV, fator de crescimento de fibroblasto 7 (fator de crescimento de queratinócito) e proteína de fibroblasto de ligamento periodontal.
D. Adipócito Proteína relacionada à diferenciação de adipócito (adipofilina), adipsina, lipídio desaturase, proteína ECM 2 (adipócito específica), vigilina, necdina e perilipina.
E. Carcinoma e célula epitelial Citoqueratina 10, queratina (cabelo, básica, 6, monilethrix), proteína de membrana epitelial 1, proteína de membrana epitelial 2, antígeno bullous pemphigoid 1, milk fat globule-EGF factor 8 protein (lactaderina), antígeno associado à mucina epitelial
46
mamária, protimosina α e timosina β4 β10. F. Célula endotelial, vasculogênese e angiogênese
Angiopoietina, VEGF, VCAM1, gene associado ao fator VIII, EDF1 (endothelial differentiation-related factor 1) e EDG2 (endothelial differentiation, G-protein-coupled receptor 2).
G. Célula neural Enolase específica de neurônio, proteínas associadas ao receptor de GABA, NCAM, N-caderina, presenilina 1, proteína interativa com Huntingtinian, adrenomedulina, axotrofina, BDNF (brain-derived neurotrophic factor), proteína ligada a sintaxina 1, proteína de mielina periférica 22, anquirina 3 (nodo de Ranvier, anquirina G), fator de maturação glial.
H. Célula mielóide/leucemia mielóide
MLLT2 (mixed-lineage leukemia trithorax homolog, Drosophila), CBFB (core-binding factor, β-subunit), ABL proto-oncogene, MCL1 (myeloid cell leukemia sequence 1), e oncogene DEK.
I. Célula T, célula NK e leucemia
CD4, proteína ligadoraTAX1 1, seqüência de reconhecimento de tumor de natural killer, RAP1, estimulador de associação 1 GTP-GDP.
J. Célula B e neoplasmas de célula B
Proteína associada à tirosina cinase de Bruton, 135 kDa (BAP135), inibidor de tirosina cinase de Bruton, fator de transcrição de leucemia de célula pré-B 3 (PBX3), proteína associada de RAG de célula B, ciclina D1, BCL6, TCF 3 (E12/E47), CALLA (CD10), (CD79A, COPEB [core promoter element binding protein, expressão limitada a células B CD19+ e testículos]), proteína tirosina fosfatase, tipo receptor, F (similar a CD45, que é PTPRC), restina (expressa em células de Reed-Sternberg no linfoma de Hodgkin, conhecido como um tipo de linfoma de célula B).
Tabela 2. Lista de genes associados a diversas linhagens celulares encontrados em células estromais de medula óssea. Adaptado de Seshi B. et al. (2003).
1.4.2 Expressão de genes de tecido nervoso em células de sangue de cordão
umbilical in vitro
Foi demonstrado recentemente que células de UCB (do inglês Umbilical Cord
Blood) em cultura expressam marcadores característicos de células neurais
(Sanchez-Ramos J.R. et al., 2001). Neste estudo, células mononucleares (CMN)
obtidas de UCB humano foram cultivadas em DMEM por 24 a 72 horas e foi
demonstrado que estas células expressam a proteína musashi-1 relacionada ao
desenvolvimento neural (1,5% das células), β-tubulina-III (8,0% das células),
47
pleiotropina (neurite-outgrowth-promoting protein), GFAP (34% das células), e Neu-
N (neuron-specific protein). Após cultivo por mais 24 a 48 horas em meio acrescido
de ácido retinóico e NGF (Nerve Growth Factor) ocorreu um aumento na expressão
de musashi-1, β-tubulina-III, pleiotropina e de Neu-N, mas não de GFAP na
avaliação através de Western Blot. Além disto, a imunocitoquímica revelou que,
além da quantidade de proteínas, a proporção de células que expressava os
antígenos musashi-1, β-tubulina-III e GFAP também aumentou após este
tratamento. A análise por DNA Microarray demonstrou aumentos significantes na
expressão de 322 genes de um total de 12.600 genes analisados. Destes, 20
podiam ser considerados produtos de neurônios, glia ou células neurais imaturas
(Tabela 3).
Aumento da expressão de genes associados a neurônios, glia ou a células neurais imaturas após tratamento com RA e NGF
Transcritos de genes Fator de
multiplicação Breve descrição
Proteína promotora de expansão de neuritos (pleiotrofina)
44 Proteína associada à matriz extracelular que aumenta o crescimento axonal em neurônios cerebrais perinatais.
Glipican-4 4,9 Glipican-4 é expresso em células imunorreativas para nestina e para o antígeno D1.1, marcadores de precursores neurais; sua expressão não é detectável em neurônios pós-mitóticos recentes ou terminalmente diferenciados.
GFAP (Glial acidic fibrillary protein)
3,2
Pentraxina neuronal II (NPTX2)
2,3 Membro de uma nova família de proteínas identificadas através da interação com a toxina
48
pressináptica de veneno de cobra taipoxina; pode ter função durante a formação sináptica e remodelamento.
Proteína de crescimento neuronal 43 (GAP-43)
2,7 Identifica neurônios, mas também células musculares em desenvolvimento.
PAS1 neuronal (NPAS1) 2,3 Fatores de transcrição seletivamente expressos no sistema nervoso central.
BMP-1 (bone morphogenetic protein 1)
2 BMP-1 é encontrado na placa neural e na transição ectodermal; a expressão é mantida na crista neural pré-migratória e transitoriamente nas células migratórias da crista neural cefálica.
trkC 2 Receptor para neurotrofina 3 (NT3) PAS2 neuronal (NPAS2) 1,7 Fatores de transcrição seletivamente expressos no
sistema nervoso central. MAP-2 (Microtubule-associated protein 2)
1,6
Transportador vesicular de acetilcolina
1,6
Subunidade M de neurofilamento (NF-M)
1,5
Subunidade L de neurofilamento (NF-L)
1,5
Musashi-1
1,5 Proteína ligadora de RNA encontrada no sistema nervosa central em desenvolvimento e adulto de rãs, pássaros roedores e humanos.
BMP11 (bone morphogenetic protein 11)
1,5 BMP-11 é expressa no sistema nervoso em desenvolvimento.
Tabela 3. Expressão de genes associados a neurônios, glia ou a células neurais imaturas em células de sangue de cordão umbilical cultivadas antes e após indução de diferenciação neural através de tratamento das culturas com ácido retinóico (RA) e NGF. Os autores observaram que após a indução a quantidade de transcritos de genes relacionados ao SN aumenta. Adaptado de Sanchez-Ramos J.R. et al. (2001).
1.4.3 Expressão de genes de tecido nervoso em MO, sangue periférico (SP) e
UCB ex vivo
Marty M.C. et al. (2002) demonstraram que proteínas básicas de mielina
(MBP, do inglês Myelin Basic Protein) são expressas nas células CD34 da medula
óssea, em uma vasta maioria dos linfócitos T e B do timo, linfonodos e baço, nas
células de linhagem mielóide – macrófagos, células dendríticas e granulócitos –
assim como em eritroblastos e megacariócitos. Neste trabalho, os timos de
49
camundongos adultos foram mecanicamente dissociados gerando uma população
de células T imaturas 96% puras. Western blots feitos com esta população de
células demonstrou MBPs na região de 26 a 28kDa. Nas imunocitoquímicas, a
maior parte das células estava marcada para estas proteínas. Células T maduras
extraídas dos linfonodos e do baço apresentavam transcritos para MBP nos
experimentos com RT-PCR. Análises imunocitoquímicas realizadas nestas células
vivas não apresentaram nenhuma marcação, demonstrando que o epítopo
reconhecido pelo anticorpo não se encontrava na superfície das células. Uma
investigação ultraestrutural demonstrou que pedaços de membrana plasmática e
membranas intracelulares eram claramente imunorreativas para este marcador e o
citoplasma possuía marcação difusa, mas não o núcleo, semelhante à marcação
clássica de MBPs encontrada em oligodendrócitos e células de Schwann. Análise
por RT-PCR realizada com células B positivas para CD19 demonstrou a expressão
de MBPs nestas células e a análise por imunocitoquímica revelou positividade em
uma vasta maioria destas células, mas não em todas. Adicionalmente, análises por
imunocitoquímica foram realizadas em macrófagos (F4/80+) ou células dendríticas
(NLDC 145+) isoladas de vários tecidos para demonstrar a expressão de MBPs
também na linhagem mielóide. Nesta população, foi também observado que a maior
parte das células era positiva para MBPs. Na análise por western blots foram
identificadas proteínas com peso molecular de 26-28 kDa, como esperado, e o RT-
PCR demonstrou que as MBPs eram expressas em níveis altos nestas células.
Granulócitos e células mielóides, extraídos da medula óssea e do sangue periférico,
também apresentaram marcação na maioria das células. A maioria dos eritroblastos
(TER119+) e megacariócitos (CD41+) eram positivos para MBPs, mas nenhuma
marcação foi encontrada em eritrócitos adultos (células TER119+ de 6 micrômetros
50
de diâmetro). Utilizando anticorpos para o antígeno CD34 para distinguir as células
tronco hematopoiéticas, pôde-se demonstrar que as MBPs estavam presentes na
vasta maioria destas células, com forte expressão dos transcritos.
Em uma série de outros estudos, Goolsby J. et al., (2003) também
concluíram que progenitores hematopoiéticos cultivados e não cultivados
expressam genes neurais. Neste estudo, a medula óssea de camundongos foi
extraída e cultivada em meio suplementado com IL-3, IL-6 e 2-mercaptoetanol,
sendo apenas as células flutuantes aproveitadas nas passagens, num total de 6
semanas a 4 meses de cultivo. Foi utilizada também medula óssea de
camundongos adultos fixada com paraformaldeído imediatamente após a extração
(medula óssea total, ex vivo), que foi processada para imunocitoquímica. Cerca de
1,5% das células de medula óssea adulta não cultivada expressavam o fator de
transcrição neurogênico PAX-6 e as 4 proteínas neuronais examinadas
(neurofilamento H, Neu-N, HuC/HuD [neuronal RNA-binding protein] e a enzima
responsável pela síntese de GABA, a ácido glutâmico descarboxilase [GAD65]).
Imunocitoquímicas duplas demonstraram que Pax-6 e neurofilamento H estavam
presentes em uma mesma célula. Nenhuma marcação foi encontrada para a GFAP,
um marcador de astrócitos (tabela 4). Aproximadamente 20% das células positivas
para CD34, um marcador de células tronco hematopoiéticas de medula óssea, eram
positivas também para neurofilamento H, Neu-N, HuC/HuD e GAD65. No entanto,
após 4-5 semanas de cultivo, todas as células flutuantes expressavam CD34, Sca-1
e cKit (expressos em células tronco e progenitores hematopoiéticos), CD45
(marcador geral de células hematopoiéticas), PAX-6 (fator de transcrição
neurogênico), HuC/HuD, Neu-N, GAD65 e neurofilamento H (marcadores de
diferenciação neuronal), CNPase, proteína de mielina específica de oligodendrócito
51
(MOSP), galactocerebrosidase e proteoglicano condroitina sulfato NG2
(marcadores de oligodendrócitos). Estas células não expressavam neurofilamentos
M e L, tirosina hidroxilase, receptor muscarínico de acetilcolina M2, filamento
intermediário de astrócitos (GFAP) e nem o marcador de oligodendrócitos O4.
Estes resultados foram obtidos utilizando imunocitoquímica, RT-PCR e western blot.
Para testar a funcionalidade destas células, as mesmas foram marcadas com Cell
Trace Orange (Molecular Probes) e injetadas estereotaxicamente no hipocampo e
no striatum de camundongos adultos. Os cérebros foram processados para
imunohistoquímica após 1 a 14 meses de sobrevida, sem que qualquer alteração de
comportamento tivesse sido notada nos animais injetados. Aproximadamente 40%
das células injetadas sobreviveram e após 1-2 meses do transplante parte das
células continuavam a expressar CD34. No entanto, 6 meses após o transplante a
percentagem de células que expressavam Neurofilamento H, Neu-N e CNPase,
diminuiu de 100% para 40%, e de 40% e 30%, respectivamente. Além disto, 30%
das células passaram a expressar GFAP, o que não ocorria em cultura. Reações
imunocitoquímicas com dupla marcação demonstraram que as células que
expressavam neurofilamento H ou Neu-N não expressavam CNPase ou GFAP e
CNPase não era encontrada em células que expressavam GFAP. Isto significa que,
enquanto em cultura estas células expressavam concomitantemente moléculas de
astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, no ambiente encefálico esta expressão
gênica foi segregada em populações distintas, pelo menos no que diz respeito às
moléculas analisadas.
Percentagem de células positivas Marcador Ex vivo dia 21 in
vitro Dias 56 e 110 in vitro
Fatores de transcrição neuronal Pax-6 1,5 92 100 Oct-4 1,5 92 100
52
Neurônios HuC/HuD 1,5 92 100 Neurofilamento-H 1,5 92 100*† NeuN 1,5 91 100* Ácido glutâmico descarboxilase GAD65 1,5 ND 100 Tirosina hidroxilase ND ND 0 Receptor muscarínico de acetilcolina M2
ND ND 0
Astroglia GFAP 0 0 0* Oligodendrócitos CNPase 1,5 92 100*† MOSP ND ND 100* HMBP/MBP2 100 ND 100*† Galactocerebrosidase ND ND 100* NG2 condroitina sulfato proteoglicano ND ND 100* O4 0 0 0
Tabela 4. Marcadores de células neurais em células CD34+ ex vivo e in vitro. HMBP/MBP2, hemopoietic myelin basic protein e myelin basic protein 2. ND, não determinado. *Determinado por análise de Western blot. † Determinado por análise de PCR. Adaptado de Goolsby J. et al., 2003.
Ratajczak M.Z. et al. (2004) compararam a expressão de antígenos tecido-
específicos em CMN extraídas de medula óssea e de sangue periférico (SP) após
recrutamento das células da medula óssea para a periferia com agentes
farmacológicos (G-CSF, do inglês granulocite-colony stimulating factor), em
humanos e em camundongos adultos. Nos camundongos, as CMN foram isoladas
através de gradiente de densidade Ficoll-Paque, da medula óssea, do sangue
periférico normal ou do sangue periférico de animais que receberam G-CSF. Destas
frações foram separadas as células Sca-1 positivas, através de anticorpos
associados à mini-contas paramagnéticas. Em humanos, células mononucleadas de
baixa densidade de medula óssea foram coletadas e depletadas de células
aderentes e de linfócitos T. Sangue periférico de humanos adultos que receberam
ou não G-CSF foi também coletado. As frações humanas foram enriquecidas em
células tronco através de seleção por imunoafinidade com contas paramagnéticas
conjugadas a anticorpos para AC133 e CD34. A análise por RT-PCR revelou que
havia expressão de marcadores musculares precoces (Myf-5, Myo-D e miogenina),
neurais (GFAP e nestina) e hepático (CK19 e fetoproteína) em CMN de sangue
53
periférico de camundongo e de humanos adultos. A expressão de mRNA para todos
estes marcadores era muito maior nas células provenientes de amostras de sangue
em que se tinha usado G-CSF. A expressão de mRNA para estes marcadores em
diferentes subgrupos de células isoladas da medula óssea de camundongos e de
humanos foi analisada por RT-PCR (Real Time –PCR). Esta expressão era muito
maior – até mais de 400 vezes – nas células mononucleadas não aderentes que
nas células mononucleadas aderentes de medula óssea (células tronco
mesenquimais e macrófagos) humanas e de camundongo. Estes marcadores
também eram muito mais freqüentes nas células humanas CD34 ou AC133 quando
comparadas à medula total, às células CD34 negativas e às células AC133
negativas. Em camundongos, a expressão dos marcadores musculares precoces,
neurais e hepáticos era muito maior nas células de medula óssea SCA-1 positivas
que nas negativas.
Em outro estudo, Ha Y. et al. (2003) demonstraram que monócitos de sangue
de cordão umbilical humano expressam nestina. Nestina é uma molécula da classe
de filamentos intermediários expressos em células tronco neurais que são
convertidos em proteínas de citoesqueleto maduro, como GFAP e neurofilamentos.
Neste estudo, monócitos umbilicais humanos foram isolados de sangue venoso
umbilical através de gradiente de Ficoll 1077 e cultivados por 2 horas em lamínulas.
Análises imunocitoquímicas para o filamento intermediário nestina e para o
marcador de célula tronco hematopoiética CD133 revelaram que cerca de 4,2 %
das células aderidas expressavam nestina e 5,8% expressavam CD133. Cerca de
60% das células positivas para CD133 co-expressavam nestina e 92% das células
que expressavam nestina co-expressavam CD133. A análise por RT-PCR
confirmou tanto a expressão de nestina quanto de CD133 nos monócitos umbilicais
54
humanos. Monócitos de sangue de adultos foram usados como controles, não
sendo encontrados produtos de amplificação de genes de Nestina nem de CD133.
1.5. O gangliosídeo 9-O-acetil GD3
Gangliosídeos formam um extenso grupo de glicoesfingolipídeos contendo
ácido siálico e são largamente expressos nos tecidos dos mamíferos e
particularmente abundantes no sistema nervoso. O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 é
uma modificação do gangliosídeo GD3 em que uma O-acetilação está localizada na
posição nove do resíduo de ácido siálico (Blum A.S. & Barnstable C.J. 1987).
O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está localizado na membrana de neurônios e
células gliais e sua distribuição é temporalmente e espacialmente correlacionada
com migração neuronal e extensão de neuritos no SN (Mendez-Otero R. et al.,
1988). Esta molécula é reconhecida pelo anticorpo monoclonal denominado Jones
(Constantine-Paton M. et al. 1986). O epítopo reconhecido por este anticorpo
depende do grupo acetil na posição nove do ácido siálico (Blum A.S. & Barnstable
C.J. 1987). No SN em desenvolvimento de ratos a expressão do gangliosídeo 9-O-
acetil GD3 está correlacionada particularmente com períodos de migração celular
na retina, colículo superior, cerebelo e telencéfalo e em regiões nas quais ocorra
extensão de neuritos, como o trato óptico em desenvolvimento, a substância branca
do cerebelo, os gânglios das raízes dorsais, o sistema trigeminal e o nervo olfatório
(Constantine-Paton M. et al. 1986; Mello L.E.A.M. & Mendez-Otero R. 1996;
Mendez-Otero R. et al. 1988; Mendez-Otero R. et al. 1992; Mendez-Otero R. &
Santiago M.F. 2001; Mendez-Otero R. & Ramon-Cueto A. 1994; Schlosshauer B. et
al. 1988).
A molécula reconhecida pelo anticorpo Jones apresenta um gradiente
55
dorsiventral pronunciado na retina do embrião do rato durante o período em que os
axônios das células ganglionares da retina estão formando projeções
topograficamente organizadas dentro do sistema nervoso central. Este gradiente
deve ter função semelhante ao de outros gradientes espaciais de moléculas
presentes no encéfalo em desenvolvimento, isto é, a função de controlar a
deposição de neurônios e prolongamentos neuronais. A primeira aparição do
antígeno do Jones na retina, no 12º - 13º dia embrionário coincide com o início do
período em que os primeiros axônios das células ganglionares da retina deixam o
olho (Constantine-Paton M. et al. 1986).
No adulto é encontrada imunorreatividade para o gangliosídeo 9-O-acetil
GD3 na zona subventricular do ventrículo lateral e na cadeia migratória rostral. A
marcação pode ser observada em células individuais com morfologia similar à de
neurônios migratórios. A zona subventricular é uma das áreas de neurogênese no
adulto e a expressão deste gangliosídeo deve estar correlacionada à migração dos
interneurônios ali formados (Mendez-Otero R. & Cavalcante L.A. 2003; Mendez-
Otero R et al., 2005).
O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 é re-expresso no SNP adulto em situações de
regeneração. Por exemplo, durante a regeneração do nervo ciático submetido a
esmagamento ocorre um aumento da expressão deste gangliosídeo cinco dias
após, atingindo o máximo de expressão no dia 7 e retornando aos níveis basais no
décimo dia (Ribeiro-Resende V.T., et al. 2006).
O papel funcional do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 foi estudado através do
seu imunobloqueio. Cadeias migratórias obtidas a partir de explantes de zona
subventricular de ratos neonatos expressam o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e seu
imunobloqueio interrompe a migração neuronal (Miyakoshi L. et al., 2001). A
56
migração neuronal também pôde ser bloqueada, de maneira dose-dependente, na
camada celular do cerebelo em desenvolvimento, in vitro (Santiago M.F. et al.,
2001). Através da administração crônica intracerebroventricular do anticorpo
monoclonal Jones pôde-se observar a perturbação da migração in vivo em ratos
neonatos. Células pós-mitóticas identificadas através de marcação com 5-bromo-2’-
deoxiuridina (BrdU) acumulavam-se na camada granular externa do cerebelo e
apenas um pequeno número delas alcançavam as camadas internas (Santiago M.F.
et al., 2004).
Em gânglios da raiz dorsal o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está colocalizado
com vinculina e β1 integrina nos cones de crescimento. Estas proteínas identificam
os pontos de contato da membrana plasmática com a matriz extracelular, sugerindo
um possível papel do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 na modulação destes contatos
durante a extensão neurítica (Negreiros E.M.A., et al. 2003).
O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 também é encontrado no Sistema
Imunológico, sendo o antígeno denominado CDw60. No sangue periférico humano
a maior concentração de CDw60 extra ou intracelular, por célula, é encontrada em
granulócitos e linfócitos T, enquanto em linfócitos B e em monócitos as
concentrações são consideravelmente menores (Kniep B. et al., 1993). No entanto,
na superfície celular de células de sangue periférico este antígeno só foi encontrado
em linfócitos T (Lünsdorf H. et al., 2000) ou em linfócitos B ativados (Vater M. et al.,
1997), concluindo-se que em monócitos e granulócitos o antígeno tem localização
intracelular. No sangue periférico humano, 20 a 40% dos linfócitos CD8+ e 40% dos
linfócitos CD4 expressam CDw60. Toda a população de CD8+ T helper expressa
CDw60 na superfície, de forma que este antígeno pode ser usado para diferenciar
estas células daquelas CD8+ com atividades citotóxicas ou supressoras (Rieber
57
P.E. & Rank G., 1994). A função do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 nas células do
Sistema Imune pode estar relacionada a contatos de adesão entre células vizinhas
(Vater M. et al., 1997).
O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 também é comum em diversos tipos de
tumores (Gocht A. et al., 2000).
Uma vez que a expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está relacionada
ao desenvolvimento do SN e à neurogênese no adulto, têm-se sugerido que o
mesmo possa ser utilizado como marcador de células tronco e/ou progenitores. Em
nenhum dos estudos citados acima sobre o sistema imunológico células tronco ou
progenitoras foram analisadas quanto à expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3.
No sistema hematopoiético este gangliosídeo poderia ter alguma função na
migração celular e na modulação dos contatos da membrana plasmática com o
substrato.
2. Objetivos
Vários autores têm utilizado a expressão de antígenos considerados restritos
a linhagens para demonstrar fenômenos de transdiferenciação in vitro (Woodbury et
al., 2000; Sanchez-Ramos et al , 2000; Deng et al., 2001) e in vivo (Eglitis & Mezey ,
1997; Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000; Mezey et al., 2003; Khosrotehrani
et al., 2004). Antígenos teoricamente marcadores restritos a algum outro tecido são
também expressos por MSC cultivadas (Seshi et al., 2003), mas pouco se sabe
sobre a expressão dos mesmos em MSC não cultivadas e nas demais células do
sistema hematopoiético. Em função destas observações, um dos objetivos deste
58
trabalho foi:
1) Verificar e quantificar a expressão de antígenos marcadores de glia (S-
100, vimentina e GFAP), de neurônios imaturos (ß-III-tubulina) e maduros
(NSE, NF-200 e MAP-2) em células mononucleadas de sangue de cordão
umbilical humano e de medula óssea de ratos adultos.
A fração mononucleada foi considerada apropriada para este objetivo, por ser
um conjunto de células comumente usado para transplante em terapias celulares.
Além disso, vários tipos celulares contidos na fração mononucleada são capazes de
adentrar o SNC (Hickey, 1999; Hickey, 2001) e células da linhagem mielóide têm um
especial tropismo por tecidos lesados (Doyonnas et al., 2004). Estas células podem
ser confundidas com células transdiferenciadas se a expressão de antígenos do
tecido hospedeiro for o único critério utilizado para essa avaliação.
Um dos antígenos que estudamos nas células da fração mononucleada foi o
gangliosídeo 9-O-acetil GD3. O interesse nesta molécula se deve ao fato de que a
mesma foi descrita em células do sistema nervoso e do sistema hematopoiético. No
sistema nervoso este antígeno tem sido descrito em células tronco e/ou progenitores
neurais e sua função tem sido associada a fenômenos de migração celular. No
sistema hematopoiético a expressão deste antígeno é restrita a uma sub-população
celular e sua função tem sido associada à modulação dos contatos da membrana
plasmática com o substrato. A expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células
tronco ou progenitoras do sistema hematopoiético não foi ainda investigada.
Portanto, dois outros objetivos deste trabalho foram:
2) caracterizar e quantificar a expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em
CMN de sangue de cordão umbilical humano e de medula óssea de ratos
adultos.
59
3) Verificar a expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em células tronco e
progenitoras da medula óssea de ratos adultos, identificadas pela
expressão do antígeno CD34.
3. Materiais e Métodos
3.1. Animais utilizados
Utilizamos 6 ratos adultos de 3 a 12 meses de idade da variedade Lister com
livre acesso a água e comida. Esses animais foram fornecidos pelo Biotério de
Roedores do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF) e utilizados em
conformidade com o Comitê de Uso de Animais da instituição.
3.2. Extração de medula óssea
60
Os ratos foram anestesiados por inalação de éter e, em seguida, sacrificados
por deslocamento cervical. As patas traseiras foram removidas sem a pele e
transferidas para uma placa de Petri, contendo salina tamponada com fosfato (PBS)
10mM pH 7,4. Os ossos longos foram dissecados e transferidos para outra placa
contendo PBS.
A medula óssea foi retirada do canal medular após a remoção das epífises
dos ossos. Uma seringa contendo 5ml de PBS 10mM pH 7,4 foi utilizada para
expulsar a medula do interior do canal através de pequenos jatos. Após a remoção,
as células da medula foram dissociadas mecanicamente em um tubo de plástico de
15ml, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Em seguida as células dissociadas foram
centrifugadas a 100xg por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o
precipitado foi ressuspendido em 3ml de PBS 10mM pH 7,4.
3.3. Amostras de sangue de cordão umbilical
As amostras foram obtidas do Instituto Fernandes Figueira ou do Instituto
Nacional do Câncer (INCA), de acordo com os requerimentos éticos dos comitês
locais. O sangue de cordão umbilical (n=15; idade gestacional de 35 a 40 semanas)
era coletado da veia umbilical da placenta, logo após o parto, em seringas contendo
heparina sódica sem conservantes (10µl/ml de sangue; Beckton, Dickinson &
Company) ou em bolsas contendo citrato fosfato dextrose adenina (citrato de sódio
[2,63g/100ml], ácido cítrico [0,299g/100ml], sódio bifosfato [0,222g/100ml], adenina
[0,0275g/100ml] e dextrose [3,19g/100ml]; BD-Boin Blood Bag, Beckton, Dickinson &
Company). Em ambos os casos as amostras eram utilizadas até 48 horas depois do
nascimento.
As amostras eram diluídas com PBS 10mM pH 7,4 na proporção 1:1 para
61
então ser procedida a separação da fração mononucleada, descrita a seguir.
3.4. Separação das células mononucleadas
As células mononucleadas foram separadas utilizando-se como gradiente de
densidade a solução isotônica de metrizoato de sódio com densidade d=1,077g/mL
Ficoll-PaqueTM Plus 1077 (Amersham Biosciences). Em um tubo de 15ml adicionou-
se 3ml de Ficoll em temperatura ambiente. Lentamente adicionou-se 4ml do PBS
10mM pH 7,4 contendo as células da medula óssea ou o sangue diluído sobre o
Ficoll, formando duas fases distintas. O tubo foi centrifugado por 20 minutos a
400xg, sem frenagem, entre 18 e 25o C. Após a centrifugação recolheu-se o halo
branco, que contém as células mononucleadas, localizado na interface Ficoll-PBS.
Nas amostras de UCB, após a retirada da fase de CMN, a fase superior, constituída
por plasma e PBS, era recolhida e guardada a –20o C. As células foram lavadas
duas vezes com PBS 10mM pH 7,4 para retirada do resíduo de Ficoll.
Após a última lavagem as células foram suspendidas em 1ml de PBS 10mM
pH 7,4 para contagem. Uma alíquota de 10µL foi retirada da suspensão de células e
o seu volume foi completado para 100µL e em seguida adicionou-se igual volume de
azul de tripan. Células mortas, que incorporaram o azul de tripan foram descartadas
da contagem. Para a contagem foi utilizada uma câmara de Neubauer (Improved
Bright Line, Boeco Germany), na qual foi adicionada a amostra da suspensão de
células num volume suficiente para seu preenchimento. A média aritmética do
número de células encontrado em dois campos da praça da câmara, contendo 16
quadrados cada um, foi multiplicado por 2x106, para obtenção do número de células
contido no volume total da suspensão
Parte das células mononucleadas foi então fixada com 4ml de solução de
62
paraformaldeído 1% em tampão fosfato e guardada a 4o C até a utilização.
Para a realização das reações imunocitoquímicas parte das amostras de
células mononucleadas fixadas foram distribuídas por citocentrifugação em lâminas
gelatinizadas. Para isso a densidade celular da suspensão foi alterada para 5x105
células/ml e 200µL eram utilizados para a preparação de cada lâmina. As células
eram então citocentrifugadas entre 540 e 600rpm por 3 minutos numa citocentrífuga
Cito Spin (Incibras). As lâminas com células eram guardadas em freezer a –20oC até
a sua utilização.
Uma parte das amostras de CMN de sangue de cordão umbilical foi
congelada, para a realização de imunocitoquímica nas células vivas. Para isso, após
o término da separação da fração mononucleada, as células eram suspensas em
soro fetal bovino contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para serem resfriadas
lentamente até o congelamento, os criofrascos contendo a suspensão de células
eram acondicionados em uma câmara contendo álcool absoluto, que estava dentro
de dentro de outra câmara contendo nitrogênio líquido. O sistema era agitado por 20
minutos e então os criofrascos eram guardados em nitrogênio líquido.
3.5. Imunocitoquímica
3.5.1. Identificação de gangliosídeos 9-O-acetilados em células vivas em
suspensão
As amostras de CMN de sangue de cordão umbilical (n=2) foram
descongeladas em banho a 37ºC, centrifugadas a 100xg por 10 minutos para
retirada da solução de congelamento e suspendidas para lavagem em PBS 10mM
pH 7.4, adicionado de 5% de plasma humano (recolhido na separação das CMN,
conforme registrado na sessão acima).
As células foram centrifugadas e suspendidas em solução de bloqueio
63
contendo 5% de soro normal de cabra (NGS; Sigma), sendo incubadas por 10
minutos, para bloqueio das reações inespecíficas. A seguir, foram incubadas com
solução do anticorpo primário monoclonal (Mab) anti-gangliosídeos 9-O-acetilados –
Jones – (IgM 1:200, Sigma) à temperatura ambiente (TA) por 30 minutos ou com
PBS 10mM pH 7.4, para controle do anticorpo secundário.
Após duas lavagens com 6mL de PBS 10mM pH 7.4 adicionado de 5% de
plasma humano, as células foram incubadas com solução do anticorpo secundário
cabra anti-camundongo específico para IgM (µ-chain), conjugado ao cromógeno
fluorescente Indocarbocianina (Cy3, 1:800, Jackson), por 1h à TA. As células foram
novamente lavadas duas vezes com PBS.
As lâminas foram montadas na forma de esfregaço, e as células foram
observadas e fotografadas imediatamente com câmera digital (Axiocam, Zeiss)
acoplada a um microscópio óptico de fluorescência (Axiovert 135 Zeiss).
3.5.2. Identificação de gangliosídeos 9-O-acetilados e do antígeno de superfície
CD34 em células fixadas em suspensão
Após três lavagens de 5 minutos de duração com PBS 10mM pH 7.4, as
células foram incubadas em câmara úmida com solução a 5% de NGS por 30
minutos, para bloqueio das reações inespecíficas. A seguir, foram incubados com
solução do anticorpo primário Jones (1:200) ou do Mab anti-CD34 (IgG 1:100, Santa
Cruz Biotechnology) ou com PBS 10mM pH 7.4, para controle do anticorpo
secundário, à TA por 1h ou durante a noite a 4oC.
Após três lavagens com PBS, as células foram incubadas com solução do
64
anticorpo secundário cabra anti-camundongo específico para IgM (µ-chain, 1:800),
ou com o anticorpo secundário cabra anti-camundongo γ-chain, (1:1000, Jackson)
conjugados a Cy3 (ambos da Jackson), por 2h à TA.
Para a realização da dupla marcação as células foram incubadas com os
anticorpos primários conjuntamente e foi utilizado o anticorpo secundário anti-
camundongo específico para IgM (µ-chain, 1:200) Alexa 488 (Molecular Probes), em
lugar do anticorpo anti-camundongo específico para IgM (µ-chain) conjugado a Cy-3.
Ao término das incubações com anticorpos secundários as células foram
lavadas três vezes por 5 minutos com PBS 10mM pH 7.4. Os núcleos foram corados
com DAPI (4’,6-Diamino-2-Fenilindol, Sigma) e as lâminas foram montadas com
solução de PPD (paraphenylenediamine) ou Glicerol Gelatin (Sigma), na forma de
esfregaço.
As reações foram fotografadas com câmera digital (Axiocam, Zeiss) acoplada
a um microscópio óptico de fluorescência (Axiovert 135, Zeiss).
3.5.3. Identificação de proteínas intracelulares consideradas específicas de
tecido nervoso em células fixadas citocentrifugadas
Para facilitar a contagem das células positivas para moléculas intracelulares
consideradas específicas de tecido nervoso parte das imunocitoquímicas foram
realizadas em células distribuídas em lâminas por citocentrifugação.
Após duas lavagens de 5 minutos de duração com PBS 10mM pH 7.4, e uma
com PBS acrescido com 0,1% Triton X-100 (Sigma), as lâminas com células foram
incubadas em câmara úmida com solução de bloqueio das reações inespecíficas,
contendo 5% de NGS, por 30 minutos.
65
As incubações com as soluções dos anticorpos primários MAb anti-ß-III-
tubulina (IgG, 1:40, Sigma), MAb anti-MAP-2 (IgG, 1:50, Chemicon), MAb anti-
vimentina (IgG, 1:40, Invitrogen), MAb anti-GFAP (IgG, 1:100, Biomedical
Tecnologies), policlonal anti-NF-200 (IgG, 1:50, Sigma), policlonal anti-S100 (IgG,
1:80, Sigma), policlonal anti-NSE (Igs, 1:100, Dako), policlonal anti-GFAP (1:400,
Dako) foram feitas em câmara úmida, por 2h à TA ou durante a noite a 4ºC. O
controle do anticorpo secundário foi realizado pela incubação de algumas lâminas
com PBS no lugar da solução de anticorpo primário.
Após três lavagens com PBS, para revelar a reação dos anticorpos
monoclonais, as lâminas foram incubadas com solução do anticorpo secundário
cabra anti-camundongo γ-chain conjugado com Cy3 (1:1000, Jackson) e, para
revelar os anticorpos policlonais, foi utilizado solução do anticorpo secundário cabra
anti-coelho, conjugado com Cy3 (1:800, Jackson). A incubação com os anticorpos
secundários ocorreu por 2h à TA.
Ao término das incubações com anticorpos secundários as lâminas foram
lavadas três vezes por 5 minutos com PBS 10mM pH 7.4. Os núcleos foram corados
rapidamente com DAPI e as lâminas foram montadas com solução de PPD.
Para a análise das reações estas foram observadas e fotografadas com
câmera digital (Axiocam ou Axiocam MRm, Zeiss) acoplada a um microscópio óptico
de fluorescência (Axiovert 135 ou Axiovert 200M, Zeiss).
3.5.4. Identificação de proteínas intracelulares consideradas específicas de
tecido nervoso em células fixadas em suspensão
Para melhor visualização das características da marcação das moléculas
intracelulares consideradas específicas de tecido nervoso parte das
66
imunocitoquímicas foi realizada nas células em suspensão.
Após 2 lavagens de 5 minutos de duração com PBS 10mM pH 7.4, e uma
com PBS acrescido com 0,1% Triton X-100 as células foram incubadas em solução
a 5% de NGS por 30 minutos, para bloqueio das reações inespecíficas e, a seguir,
com solução dos anticorpos primários (conforme item 5.3 acima) ou com PBS 10mM
pH 7.4, para controle do anticorpo secundário, à TA por 1h ou durante à noite a 4oC.
Após três lavagens com PBS, as células foram incubadas com solução do
anticorpo secundário cabra anti-camundongo γ-chain, conjugado com Cy3 (1:1000,
Jackson) ou cabra anti-camundongo específico para IgG (γ chain), conjugado a FITC
(fluorescein isothiocyanate, 1:100, Cappel), ou cabra anti-coelho, conjugado com
Cy3 (1:800, Jackson), de acordo com o anticorpo primário utilizado, por 2h à TA.
As células foram novamente lavadas três vezes com PBS. Os núcleos foram
corados rapidamente com DAPI e as lâminas foram montadas com solução de PPD
ou Glicerol Gelatin, na forma de esfregaço. As células foram fotografadas com
câmera digital (Axiocam, Zeiss) acoplada a um microscópio óptico de fluorescência
(Axiovert 135, Zeiss).
4. Resultados
4.1. Amostras
Para comparar o rendimento do procedimento de separação da fração
mononucleada em nosso trabalho com aquele descrito na literatura, as células
destra fração eram examinadas ao microscópio óptico. Após a separação por
gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus, polimorfonucleados ou eritrócitos eram
encontrados apenas esporadicamente na maior parte das amostras de MO ou UCB.
O gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus separa as células mononucleadas da
67
MO ou do sangue, eliminando a grande maioria de eritrócitos e granulócitos. Como
rendimento típico deste procedimento em amostras de sangue periférico tem-se que
95 ± 5% das células da fração são mononucleares, 3 ± 2% são granulócitos e 5 ±
2% são eritrócitos (Ficoll-Paque Plus instructions; Amersham Biosciences web page,
2002).
Vale ressaltar que as amostras de células mononucleadas de UCB
necessitaram da adição de 5% de plasma humano nas soluções de lavagem para a
manutenção da viabilidade no manejo das células vivas. A adição de 5% de
albumina de soro bovino (BSA, Life Sciences) não se mostrou eficiente neste
sentido. Estas células necessitaram também de comedimento extra nos movimentos
de ressuspensão, evitando excessiva agitação que resultava em morte e agregação
de uma grande quantidade de células.
4.2. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido nervoso em
CMN de medula óssea de ratos adultos.
Neste trabalho um de nossos objetivos foi verificar e quantificar a expressão
de antígenos marcadores de glia (S-100, vimentina e GFAP), de neurônios imaturos
(ß-III-tubulina) e maduros (NSE, NF-200 e MAP-2) em células mononucleadas de
medula óssea de ratos adultos. A análise em microscopia de fluorescência das
reações imunocitoquímicas revelou que S100, vimentina, ß-III-tubulina, NSE e
NF200 são expressos em CMN de medula óssea de ratos adultos (figuras 6 a 10).
Na figura 6 vemos núcleos marcados com DAPI, em azul, em A e D, a
proteína de astrócitos e células de Schwann S-100, em vermelho (CY-3) em B e E e
a sobreposição das imagens em C e F. Observamos que não há um padrão único
de marcação para este antígeno para as células positivas dentro de uma mesma
68
amostra. Em A, B e C a marcação se apresenta na forma de um aro fino e distante
do núcleo, mas forte, enquanto em D, E e F, a marcação aparece mais difusa no
citoplasma e ao redor do núcleo. A intensidade da marcação também é variável
entre as células de uma mesma amostra (não representado).
Na figura 7 observamos núcleos marcados com DAPI, em azul, em A e D, o
filamento intermediário de células de origem mesenquimal vimentina, em vermelho
(CY-3) em B e E e a sobreposição das imagens em C e F. O padrão de marcação
encontrado foi o mesmo descrito na literatura, de concentração ao redor do núcleo
(Bohn W. et al., 1992), para todas as amostras positivas para este antígeno.
Na figura 8 vemos núcleos marcados com DAPI, em azul, em A e D, a
proteína constituinte de microtúbulos de neurônios imaturos ß-III-tubulina, em
vermelho (CY-3) em B e E e a sobreposição das imagens em C e F. A intensidade
da marcação para este antígeno é diferente entre as amostras. A amostra Rato 3
teve todas as células consideradas positivas para ß-III-tubulina (figura 8, D, E e F),
mas com marcações fracas, enquanto as amostras Rato 4 (figura 8, A, B e C) e Rato
5 (não representada) tinham marcações relativamente mais fortes.
As amostras negativas para ß-III-tubulina (Rato 1 e Rato 6) apresentavam nas
reações ligeira diferença em relação ao controle (background), em grande proporção
das células.
Na figura 9 investigamos a presença do marcador de neurônios maduros
enolase específica de neurônios. Podemos observar nesta figura núcleos marcados
com DAPI, em azul; em A e D, a marcação para enolase específica de neurônios,
em vermelho (CY-3) em B e E; e a sobreposição das imagens em C e F. A amostra
Rato 5 teve muitas células consideradas positivas para NSE, mas a marcação
estava fraca (figura 9 A, B e C), em comparação com as amostras Rato 4 (D, E e F),
69
Rato 3 e Rato 6 (não ilustradas). A amostra negativa para NSE (Rato 1) apresentava
na reação ligeira diferença em relação ao controle (background), em grande
proporção das células.
Na figura 10 investigamos a presença do neurofilamento de 200kDa (NF-200)
característico de neurônios maduros. Nesta figura observamos núcleos marcados
com DAPI, em azul, em A e D; o neurofilamento de 200kDa, em vermelho (CY-3) em
B e E e a sobreposição das imagens em C e F. As duas amostras representadas
apresentaram diferentes intensidades de marcação para este antígeno. A amostra
Rato 3 teve muitas células consideradas positivas para NF-200 (figura 10 A, B e C),
mas com intensidade fraca. A amostra Rato 4 (D, E e F) teve marcação mais forte
que todas as outras amostras de medula óssea de rato para este antígeno. No
entanto, em nenhuma das amostras o padrão de marcação encontrado foi
filamentoso, como é típico em neurônios.
Nenhuma das amostras testadas apresentou qualquer imunorreatividade para
a proteína típica de astrócitos GFAP ou de neurônios maduros MAP-2 embora estes
anticorpos sejam de uso corriqueiro no nosso laboratório e demonstrem
imunorreatividade em cortes histológicos de cérebro (tabela 5).
As reações controle dos anticorpos secundários, em que não foram utilizados
anticorpos primários, não apresentaram qualquer imunomarcação excluindo a
possibilidade de uma marcação inespecífica (resultados não representados).
A percentagem de células positivas variou muito entre as amostras para todos
os antígenos neurais estudados nesta etapa do trabalho (tabela 5 e gráfico 1).
A quantificação de cerca de 2000 células por reação imunocitoquímica
demonstrou que 58,38 ± 36,10% das CMN expressavam S-100, 47,79 ± 27,81%
70
expressavam vimentina, 59,05 ± 53,92% expressavam β-III-tubulina, 46,09 ± 27,80
expressavam NSE e 79,63 ± 37,79 expressavam NF-200 (tabela 5 e gráfico 1).
A amostra Rato 1 não apresentou qualquer marcação para vimentina, em dois
experimentos (tabela 5). Apesar de esta amostra apresentar quantidades muito
menores de células positivas ou completa negatividade para todos os marcadores de
tecido neural testados (tabela 5), a possibilidade de degradação da amostra foi
descartada devido às proporções de células CD34+ e Jones+ serem semelhantes às
demais amostras (tabela 7, na sessão 4.4).
Dada a grande proporção (freqüentemente mais de 50%) de células positivas
para cada um dos marcadores (tabela 5), fica evidente que antígenos característicos
de tipos celulares diferentes são expressos de forma concomitante em muitas
células: antígenos de neurônios imaturos (ß-III-tubulina) e maduros (NF200 e NSE)
com antígenos de glia (S100 e vimentina).
71
Figura 6: expressão de S-100 em CMN de medula óssea de ratos adultos. Amostra 5 (A, B e C) e 4 (D, E e F). Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 135; núcleos corados com DAPI (A e D); S-100 em vermelho (Cy-3) (B e E); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
72
Figura 7: expressão de vimentina em CMN de medula óssea de ratos adultos. Amostra 4 (A, B e C) e 3 (D, E e F). Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional (microscópio Axiovert 200M); núcleos corados com DAPI (A e D); vimentina em vermelho (Cy-3) (B e E); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
73
Figura 8: expressão de β-III-tubulina em CMN de medula óssea de ratos adultos. Amostra 4 (A, B e C) e 3 (D, E e F). Observe a baixa imunorreatividade da amostra 3 em (E) e (F); Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional (microscópio Axiovert 200M); núcleos corados com DAPI (A e D); β-III-tubulina em vermelho (Cy-3) (B e E); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
74
Figura 9: expressão de NSE em CMN de medula óssea de ratos adultos. Amostra 5 (A, B e C) e 4 (D, E e F). Observe a baixa imunorreatividade da amostra 5 em (B) e (C); Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 135; núcleos corados com DAPI (A e D); NSE em vermelho (Cy-3) (B e E); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
75
Figura 10: expressão de NF200 em CMN de medula óssea de ratos adultos. Amostra 3 (A, B e C) e 4 (D, E e F). Observe a baixa imunorreatividade da amostra 3 em (B) e (C); Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 135; núcleos corados com DAPI (A e D); NF-200 em vermelho (Cy-3) (B e E); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
76
Tabela 5: Percentagem de CMNMO de ratos (R) adultos positivas para antígenos neurais. A quantidade de células positivas para os marcadores neurais teve grande variação entre as amostras. Foram contados cerca de 2000 eventos em cada reação imunocitoquímica para cálculo da percentagem. *anticorpo monoclonal; **desvio padrão; ***dois experimentos; ND não determinado.
S-100 Vimentina GFAP β-III-tubulina NSE NF-200 MAP 20
25
50
75
100
célu
las
posi
tivas
(%)
Gráfico 1: Expressão de antígenos neurais na fração mononuclear de medula óssea de ratos adultos. Gráfico construído a partir dos valores da tabela 5.
Tabela 5: Percentagem de CMNMO de ratos adultos positivas para antígenos neurais S100 Vimentina GFAP* β-III-tubulina NSE NF200 MAP 2
R 1 4,19 0*** 0 0 0 12,09 0 R 3 59,20 48,40 0 100 48,45 97,18 ND R 4 47,27 68,35 0 96,88 55,29 98,50 0 R 5 96,70 65,11 0 98,39 51,49 96,72 0 R 6 84,56 57,10 ND 0 75,22 93,66 0
Média 58,38 47,79 0 59,05 46,09 79,63 0 DP** 36,10 27,81 0 53,92 27,80 37,79 0
77
4.3. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido nervoso em
CMN de sangue de cordão umbilical humano.
Neste trabalho um de nossos objetivos foi verificar e quantificar a expressão
de antígenos marcadores de glia (S-100, vimentina e GFAP) e de neurônios
imaturos (ß-III-tubulina) e maduros (NSE, NF-200 e MAP-2) em células
mononucleadas de sangue de cordão umbilical humano. A análise em microscopia
de fluorescência das reações imunocitoquímicas revelou que marcadores da
linhagem neural tais como: S100, vimentina, ß-III-tubulina, NSE e NF200 são
expressos em CMN de UCB (figuras 11 a 13).
Na figura 11, em A, B e C podemos observar o padrão de marcação para S-
100 que é geralmente utilizada como marcador de astrócitos e células de Schwann.
Podemos observar nesta figura a marcação para S-100 (em vermelho, CY-3, em B)
na amostra UCB 12. Os núcleos estão marcados com DAPI (em azul) em A e a
sobreposição das imagens é vista em C. As três amostras de sangue de cordão
umbilical analisadas apresentaram a mesma distribuição difusa da marcação.
Na figura 11, em D, E e F vemos a reação para identificar o filamento
intermediário de células de origem mesenquimal vimentina (em verde, Alexa 488, em
B) na amostra UCB 14. Os núcleos estão marcados com DAPI (em azul) em A e a
sobreposição das imagens é vista em C. As duas amostras analisadas apresentaram
a marcação descrita na literatura, concentrada ao redor do núcleo (Bohn W. et al.,
1992).
Na figura 12, em A, B e C vemos a reação para identificar a proteína
constituinte de microtúbulos de neurônios imaturos ß-III-tubulina (em vermelho, CY-
3, em B) na amostra UCB 15. Os núcleos estão marcados com DAPI (em azul) em A
e a sobreposição das imagens é vista em C. A amostra UCB 15 teve 75,57% das
78
células consideradas positivas para ß-III-tubulina, apesar da marcação fraca. A
amostra UCB 14 apresentava na reação para ß-III-tubulina apenas ligeira diferença
em relação ao controle (background), sendo considerada negativa, em dois
experimentos (tabela 6).
Na figura 12, em D, E e F vemos a reação para identificar o filamento
intermediário de neurônios maduros NF-200 (em vermelho, CY-3, em E) na amostra
UCB 14. Os núcleos estão marcados com DAPI (em azul) em D e a sobreposição
das imagens é vista em F. A amostra UCB 14 teve todas as células consideradas
positivas para NF-200, mas a marcação estava fraca. A marcação se apresentava
como um fino aro junto à membrana plasmática nas duas amostras analisadas. Em
nenhuma das amostras o padrão de marcação encontrado foi filamentoso, como é
típico em neurônios.
Na figura 13 vemos núcleos marcados com DAPI em azul em A e D, a enzima
de neurônios maduros NSE, em vermelho (CY-3) em B e E e a sobreposição das
imagens em C e F. A amostra UCB 15 apresentou marcação nas células nucleadas
(figura 13 A, B e C). Todas as células mononucleadas da amostra UCB 12 (figura 13
D, E e F) eram negativas para NSE. No entanto, os eritrócitos, identificados como
células anucleadas menores que 06 micrômetros e presentes nesta amostra como
um resquício da separação por gradiente de densidade, apresentavam
imunorreatividade fraca para este antígeno (figura 13 D, E e F, cabeças de seta,
próximas aos núcleos das células mononucleadas). Não foram encontrados
eritrócitos nas demais amostras. A amostra UCB 14 não apresentava qualquer
marcação para este antígeno (resultado não representado).
Nenhuma das amostras testadas apresentou qualquer imunorreatividade para
a proteína típica de astrócitos GFAP (anticorpo monoclonal IgG ou policlonal) ou de
79
neurônios maduros MAP-2 (anticorpo monoclonal IgG) (tabela 6). Estes três
anticorpos são usados regularmente em nosso laboratório, sabendo-se, assim, que
sua eficácia não está comprometida. Desta forma estes anticorpos podem ser
considerados controles negativos para os demais anticorpos primários monoclonais
IgG ou policlonais utilizados neste trabalho.
A percentagem de células positivas variou muito entre as amostras de UCB
para todos os antígenos neurais estudados (tabela 6), exceto para NF-200. Como
para este antígeno foram analisadas apenas duas amostras, não se pode descartar
a possibilidade de esta variabilidade existir.
80
Figura 11: expressão de S-100 e vimentina em CMN de sangue de cordão umbilical (UCB). Amostras 12 (A, B e C) e 14 (D, E e F). Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 135; núcleos corados com DAPI (A e D); S-100 em vermelho (Cy-3) em B e C; vimentina em verde (FITC) em E e F; sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
81
Figura 12: expressão de β-III-tubulina e NF-200 em CMN de sangue de cordão umbilical (UCB). Em vermelho (Cy-3), β-III-tubulina em B e C e NF-200 em E e F. Amostras 15 (A, B e C) e 14 (D, E e F). Observe baixa imunorreatividade de ambas as reações. Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 200M (A, B e C) ou Axiovert 135 (D, E e F); núcleos corados com DAPI (A e D); sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
82
Figura 13: expressão de NSE em CMN e em eritrócitos de sangue de cordão umbilical (UCB). Em A até C amostra 15 com CMN imunorreativas para NSE; em D até F amostra 12 com CMN negativas para NSE, mas com eritrócitos imunorreativos (cabeças de seta). Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional usando o microscópio Axiovert 135; núcleos corados com DAPI (A e D); NSE em vermelho (Cy-3) em B, C, E e F; sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
83
Tabela 6: Percentagem de CMN de UCB positivas para antígenos neurais
S-100 Vimentina GFAP β-III-tubulina NSE NF-200 MAP-2ucb 9 ND ND 0** ND ND ND ND ucb 12 2,88 18,75 0** ND 0**** ND ND ucb 14 1,81 43,54 0* 0*** 0 100 0* ucb 15 91,87 ND 0* 75,57 90,38 93,92 0*
Tabela 6: Percentagem de CMN de UCB positivas para antígenos neurais. A quantidade de células positivas para os dos marcadores teve grande variação entre as amostras. Foram contados cerca de 2000 eventos em cada reação imunocitoquímica para cálculo da percentagem. *anticorpo monoclonal; **anticorpo policlonal; ***dois experimentos; ****eritrócitos positivos; ND não determinado. 4.4. Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula óssea de
ratos adultos e de sangue de cordão umbilical humano.
Uma vez que a expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está relacionado
no sistema nervoso a fenômenos de migração celular e no sistema hematopoiético à
modulação dos contatos da membrana plasmática com o substrato, nós
investigamos a expressão deste gangliosídeo em CMN de medula óssea de ratos
adultos e de sangue de cordão umbilical humano.
Em estudos preliminares do presente trabalho a realização de
imunocitoquímica para a identificação do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 ou CD34 em
citospin mostrou-se pouco adequada para a quantificação e identificação destes
antígenos. Provavelmente tenha ocorrido algum grau de perda de conformação das
células na citocentrifugação, relacionada à aceleração centrífuga excessiva.
Provavelmente o motivo de a visualização destes antígenos ser mais prejudicada
que a dos demais estudados aqui seja a pequena quantidade de ambos e o fato de
estarem localizados na membrana plasmática. A imunocitoquímica realizada nas
células em suspensão permitiu que se observasse o padrão de marcação destes
antígenos.
84
A imunomarcação com o anticorpo monoclonal (Mab) Jones, que reconhece
especificamente gangliosídeos 9-O-acetilados, em CMN de medula óssea de ratos
adultos e de UCB, é similar. Em ambos os tecidos, o padrão de distribuição
predominante é o pontual (Figuras 14 e 15), com grande variação na intensidade e
distribuição da marcação entre as células de uma mesma amostra.
A figura 14 apresenta células mononucleadas de medula óssea de ratos
adultos. Os núcleos estão marcados com DAPI, em azul, em A e D, o gangliosídeo
9-O-acetil GD3 está em vermelho (CY-3) em B e em verde (Alexa 488) em E. Em C
e F as imagens estão sobrepostas. Em A, B e C é possível observar o padrão
pontual da marcação dos gangliosídeos 9-O-acetilados uniformemente distribuídos
na superfície da célula. Em D, E e F pode-se observar um outro tipo de distribuição
da marcação, bastante comum nestas células: a concentração dos gangliosídeos 9-
O-acetil GD3 em um pólo da célula (cabeças de seta, em F), na forma de placa.
A figura 15 apresenta células mononucleadas de sangue de cordão umbilical
humano. Em A, B e C são apresentadas três células fixadas marcadas para o
gangliosídeo 9-O-acetil GD3. Os núcleos estão marcados com DAPI, em azul e o
gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está em vermelho (CY-3), em imagens sobrepostas.
Nas fotos D, E e F estão representadas três células em que a reação
imunocitoquímica foi realizada nas células vivas. Na reação com o Mab Jones em
células vivas o antígeno reconhecido está no lado externo da membrana
citoplasmática (Constantine-Paton, M. et al. 1986).
Na figura 15 A, B, C, D e F é possível observar o padrão pontual da
distribuição dos gangliosídeos 9-O-acetilados na presumível superfície da célula.
A forma de distribuição mais comum da marcação com o Mab Jones está
representada na figura 15 A, com pontos e esporadicamente pequenas placas
85
distribuídas aleatoriamente na superfície de uma célula com razão núcleo/citoplasma
alta. A marcação concentrada em apenas um lado da célula pode apresentar-se em
padrão pontual (figura 15 F), além da forma de placa já descrita anteriormente. A
marcação em forma de placas pode estar uniformemente distribuída (figura 15 E).
Algumas células apresentam uma grande intensidade de marcação em forma de
raios contínuos, envolvendo toda a célula, num padrão semelhante a meridianos
contorcidos (não representado).
Não foi evidenciada qualquer diferença no padrão de marcação nas
imunocitoquímicas realizadas nas células fixadas ou vivas (figura 15), a despeito de
nas células fixadas o anticorpo ter acesso a antígenos localizados no interior da
célula (Lünsdorf H., et al 2000).
Na figura 15 também pode ser observado que as células mononucleadas de
sangue de cordão umbilical humano, separadas pela solução isotônica de metrizoato
de sódio com densidade d=1,077g/mL (Ficoll-PaqueTM Plus 1077, Amersham
Biosciences), são pequenas, freqüentemente menores que 10 micrômetros e
apresentam um núcleo muito grande em relação ao citoplasma (figura 15 A, B e C).
As células tronco e progenitoras do sistema hematopoiético apresentam esta
configuração (Morrison S.J. et al., 1995).
A quantificação das reações imunocitoquímicas demonstrou que 11,85% ±
4,96 das CMN de UCB (n=3) e 30,10 ± 6,37 das CMN de MO de ratos adultos (n=3)
expressavam gangliosídeos 9-O-acetilados reconhecidos pelo Mab Jones (tabelas 7
e 8).
86
Figura 14: expressão do Gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 em CMN de medula óssea de ratos adultos. Marcação característica puntiforme em grande aumento (B e C); marcação concentrada em apenas um lado da célula (cabeças de seta, em F); fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional (microscópio Axiovert 135); imunocitoquímica de células fixadas montada como esfregaço; Jones em vermelho (Cy-3) em B e C e em verde (Alexa 488) em E e F; núcleos corados com DAPI (azul) em A, C, D e F; sobreposição das imagens (C e F); barra de calibração: 10µm.
87
Figura 15: marcação característica puntiforme para o Gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 em CMN de UCB. Imunocitoquímica em células fixadas (A, B e C) e em células vivas (D, E e F), esta última indicando que o antígeno reconhecido pelo MAb Jones está do lado externo da membrana citoplasmática. Freqüentemente a marcação é concentrada em apenas um lado da célula (F), mas a distribuição pontual uniforme também é encontrada (B, D e E). Observe o pequeno tamanho das células e seu aspecto linfóide, representado pela grande razão núcleo-citoplasma (A, B e C). Fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional (microscópio Axiovert 135); imunocitoquímica montada como esfregaço; Jones em vermelho (Cy-3); núcleos corados com DAPI (azul) em A, B e C; barra de calibração: 10µm.
88
Tabela 7: Percentagem de CMNMO de ratos adultos positivas para Jones e CD34. Foram contados cerca de 2000 eventos em cada reação imunocitoquímica para cálculo da percentagem; **desvio padrão; ND não determinado. Tabela 8: Percentagem de CMN de UCB positivas para o Mab Jones. *Desvio Padrão.
Tabela 7: Percentagem de CMNMO de ratos adultos positivas para
Jones e CD34 Jones CD34
Rato 1 22,73 0,41 Rato 2 ND 0,52 Rato 4 33,85 0,54 Rato 5 33,71 0,66 Média 30,10 0,54 DP** 6,37 0,10
Tabela 8: Percentagem de CMN de UCB positivas para
o Mab Jones amostra percentagem
ucb 2 14,05 ucb 3 6,17 ucb 5 15,35 Média 11,85 DP* 4,96
89
4.5. Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula óssea de
ratos adultos que expressam o antígeno CD34, marcador de células tronco e
progenitores hematopoiéticos.
A quantificação das reações imunocitoquímicas para o marcador de células
tronco e progenitoras hematopoiéticas CD34 demonstrou que 0,54 ± 0,12% das
CMN de MO de ratos adultos expressam este antígeno (n=4, tabela 7). Diferente do
que ocorreu com os antígenos neurais testados, a freqüência de células CD34+ na
medula óssea dos ratos não apresentou grande variabilidade.
Reações imunocitoquímicas duplas para identificar a expressão de CD34
concomitantemente ao gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN demonstraram que há
células tronco ou progenitoras na medula óssea de ratos adultos que expressam o
gangliosídeo 9-O-acetil GD3 (n=2). A figura 16 representa este resultado. Em A os
núcleos estão marcados com DAPI, em azul; em B, o gangliosídeo 9-O-acetil GD3
está identificado por Alexa 488, em verde; em C, CD34 está identificado por Cy3, em
vermelho; em D está apresentada a sobreposição das imagens, mostrando uma
célula duplamente marcada.
90
Figura 16: expressão concomitante de gangliosídeos 9-O-Acetil GD3 e CD34 em CMN de medula óssea de ratos adultos; núcleos corados com DAPI (azul) em A; Jones em verde (Alexa 488) em B; CD34 em vermelho (Cy-3) em C; sobreposição das imagens em D; fotomicrografia em microscopia de fluorescência convencional (microscópio Axiovert 135); imunocitoquímica de células fixadas montada como esfregaço; barra de calibração: 10µm.
91
5. Discussão
5.1. Expressão de antígenos usados como marcadores de tecido
nervoso em CMN de medula óssea de ratos adultos e de sangue de cordão
umbilical humano
A proteína S-100 pertence a um grupo de proteínas ligadoras de cálcio, de
baixo peso molecular (10 a 12kD) que está largamente distribuída em vários tecidos
e que se apresenta como dímeros de subunidades homólogas ou diferentes (α e β).
No SN, existem os dímeros ββ (S-100b) e αβ (S-100a), sendo o monômero β o mais
freqüente no encéfalo (80 a 90%). A localização intracelular da S-100 é
principalmente restrita ao compartimento citoplasmático glial (astrócitos para o SNC
e células de Schwann no SNP), com uma pequena fração nas membranas. A S-
100a está presente nos rins e músculos e em pequena proporção no SNC (5%)
(Fanò G. et al. 1995). A S-100ao (dímero αα) é encontrada em neurônios, células
musculares lisas, cardiomiócitos, monócitos e em células dendríticas (Bobryshev
Y.V. & Lord R.S.A., 1995; Stent G. et al., 2002).
Os resultados do nosso trabalho quanto às células que expressam S-100 têm
que ser analisados levando em conta que o anticorpo policlonal utilizado reconhece
tanto a subunidade β, que caracteriza a S-100 encontrada mais frequentemente no
SN (dímeros ββ e βα) quanto à subunidade α, o que não nos possibilitou diferenciar
o dímero αα presente também nos rins e músculos e muito menos freqüente no
SNC (apenas 5%).
A vimentina é um filamento intermediário do tipo III, de 52kDa, característico
de células de origem mesenquimal. O padrão típico de marcação para os filamentos
de actina é sua forte concentração ao redor do núcleo (Bohn W. et al., 1992). No
nosso trabalho, as CMN de medula óssea de rato e de sangue de cordão umbilical
92
humano quando reagidas com anticorpo para vimentina apresentaram a marcação
concentrada próximo ao núcleo celular.
As enolases (hidrolase 2-fosfo-D-glicerato) são isoenzimas glicolíticas homo-
ou heterodiméricas, que catalisam a interconversão de 2-fosfoglicerato e
fosfoenolpituvato. Três subunidades, α (46 kDa), β (44 kDa) e γ (46kDa), constituem
as unidades de construção das moléculas de enolase e cinco formas (αα, ββ, γγ, αβ
e αγ) da enzima foram identificadas em ratos e em humanos. A forma αα é
encontrada nas células gliais e hepáticas, as formas ββ e αβ são encontradas nos
músculos esquelético e cardíaco e a forma γγ é encontrada principalmente em
neurônios e células neuroendócrinas. A enolase γγ é denominada enolase
específica de neurônio (NSE, de neuron-specific enolase) e também é conhecida
como proteína 14-3-2. A NSE pode ser encontrada no núcleo, no citoplasma e nos
prolongamentos dos neurônios do SN central e periférico (Soler Federsppiel B.S. et
al., 1987).
A imunoreatividade para S-100, NSE e vimentina foi testada por Shin S.S. et
al. (1992) em fatias congeladas ou fixadas de medula óssea normal humana. A
maior parte das células não era reativa para S-100. Apenas três amostras
apresentaram reatividade espaçada. A marcação para NSE foi notada em poucos
casos e era fraca, com marcação de fundo moderada. Na maior parte dos casos, a
negatividade era completa. Contudo, em três amostras 20% a 30% das células
apresentavam marcação fraca. A vimentina apresentou marcação em todas as
amostras, em células endoteliais ou outras células estromais. Os autores
caracterizaram o tecido de 21 doadores, usando uma coleção de anticorpos. CD19
e CD2, marcadores confiáveis e sensíveis para linfócitos T e B, identificaram 5% e
9% das células medulares, respectivamente, nos tecidos congelados. O marcador
93
pan-leucocitário CD45 marcou entre 15% a 45% das células, com média de 31%. O
antígeno associado a células de linhagem mielóide CD13 marcou em média 15,5%
das células. Nos tecidos fixados, 5% a 30% das células marcavam para CD45, com
média de 14%. Apenas 1% a 5% (em média 3%) das células eram marcadas com
CD20, que é um marcador de linfócitos B. Entre 10% e 70% (em média 33%) das
células marcaram com BM1, um marcador de células mielóides. CD68, marcador de
monócitos, macrófagos e precursores mielóides marcou em média 59% das células.
Uma semelhança dos resultados deste grupo para os encontrados no nosso
trabalho com medula óssea de ratos e sangue de cordão umbilical, é que havia
grande variabilidade na presença de NSE e S-100 entre as amostras.
Talvez a grande variabilidade de marcadores neurais encontrada pelo grupo
de Shin S.S. e colaboradores reflita a também grande variabilidade encontrada nos
marcadores hematopoiéticos. É possível sugerir que exista uma correlação entre as
freqüências das populações hematopoiéticas e a expressão dos antígenos neurais.
Provavelmente uma forma de começar a esclarecer tamanha variação seja
estudando os tipos celulares do sistema hematopoiético separadamente quanto à
expressão dos antígenos neurais.
Uma observação curiosa é a presença de imuno-reatividade em níveis
reativamente altos para NSE em eritrócitos. Embora este não fosse o objetivo de
nosso estudo, em uma das amostras de sangue de cordão umbilical, uma
quantidade razoável de eritrócitos se manteve perceptível mesmo após a reação
imunocitoquímica em suspensão. Nesta amostra observamos marcação forte para
NSE nestas células um resultado semelhante ao descrito por Brown et al. (1980) em
eritrócitos humanos. Esta imuno-reatividade era específica uma vez que não
94
observamos qualquer marcação na lâmina usada como controle do anticorpo
secundário.
A tubulina é um heterodímero composto de subunidades α e β de 50kDa
cada uma, sendo a principal proteína constituinte de microtúbulos. Existem seis
isotipos de tubulinas α e sete isotipos de tubulina β. As diferentes funções
desempenhadas pelos microtúbulos podem estar relacionadas às diferentes
combinações de isotipos α e β. No encéfalo dos mamíferos existem cinco isotipos α
e cinco isotipos β. O isotipo III da β tubulina representa 25% das β-tubulinas do
encéfalo e foi considerada inteiramente restrita ao encéfalo (Banerjee A. et al.,
1990).
Tondreau T. et al. (2004), no entanto, verificaram que células mononucleadas
de medula óssea humana separadas por gradiente de densidade expressam β-III-
tubulina, mas não MAP-2, o que foi evidenciado por western blots e RT-PCR. Esta
técnica não estabeleceu, contudo, qual proporção de células expressava este
antígeno. Em nosso trabalho, duas de cinco amostras de medula óssea de ratos
não apresentavam expressão de β-III-tubulina, mas as outras três amostras
apresentavam entre 96 e 100% das células positivas para esse antígeno.
Neurofilamentos são filamentos intermediários específicos de neurônios,
sendo nestas células o principal elemento do citoesqueleto. São muito mais
abundantes nos axônios, principalmente nos mais calibrosos. São produzidos nos
corpos neurônios e transportados para os axônios. São três os principais
neurofilamentos: de 68kDa, de 160kDa e de 200kDa, sendo este último denominado
NF-200 ou NF-H. A marcação de NF-200 tem padrão fibroso, nos corpos dos
neurônios, nos dendritos e nos axônios (Gotow T. 2000).
95
No nosso trabalho, NF-200 não apresentou, nas células do sistema
hematopoiético, o padrão de marcação filamentoso que ocorre nas células neurais.
Goolsby J. et al. (2003) verificaram que 1,5% das células da medula óssea de
camundongos adultos não cultivadas expressavam NF-200. Não foi encontrada
nenhuma marcação para GFAP nestas células. Estes pesquisadores demonstraram
que 20% das células tronco ou progenitoras da medula óssea, identificadas pela
expressão de CD34, expressavam todas as quatro proteínas neuronais examinadas
(NF-200, Neu-N, HuC/HuD e GAD65) e o fator de transcrição neurogênico PAX-6.
De todas as células da medula óssea (a fração mononuclear não foi isolada), 1,5%
expressavam estes antígenos. Imunocitoquímicas duplas demonstraram que Pax-6
e NF-200 estavam presentes nas mesmas células. Não foi informada a
percentagem de células CD34+ encontrada.
Diferente do grupo de Goolsby J., as percentagens de células positivas para
NF-200 no nosso trabalho são muito altas, descartando a possibilidade de que a
expressão observada esteja concentrada em células tronco. No nosso trabalho,
apenas 0.54% das células era CD34+, percentagem compatível com o encontrado
por outros autores (Hao et al., 1995). Os antígenos neurais expressos apresentaram
médias de freqüência maiores que 46% em CMN de medula óssea de ratos. Pelo
menos uma porção das células expressava concomitantemente os antígenos, já que
a expressão passava de 50% para vários antígenos em uma mesma amostra. Mas
como houve variabilidade entre a expressão dos antígenos numa mesma amostra,
pode-se concluir que estes antígenos não estavam expressos numa mesma
população de células.
Analisando nos parágrafos do início desta sessão as características e
funções das moléculas pesquisadas neste trabalho, percebe-se que não é uma idéia
96
razoável acreditar que única molécula com suas características ou funções, sozinha,
defina um tipo celular e, ao mesmo tempo, seja exclusiva deste tipo celular.
Exemplificando, não se pode dizer que um neurônio é uma célula que expressa
NSE, apesar de muitos neurônios terem esta característica, por que esta molécula
não é responsável por uma função que define um neurônio, e ao mesmo tempo, a
função desempenhada por esta molécula não é exclusiva de neurônios.
O uso de antígenos específicos é largamente usado para distinguir células
dentro do tecido em que estes antígenos estão classicamente presentes (distinguir
neurônios de astrócitos dentro do parênquima cerebral, por exemplo). Mas nosso
trabalho colabora para a idéia de que o uso destes antígenos em tecidos em que
eles não foram ainda suficientemente estudados deve se cercar de mais cuidados.
5.2. Expressão do Gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em CMN de medula
óssea de ratos adultos e de sangue de cordão umbilical humano
Não há dados de outros autores sobre a freqüência do gangliosídeo 9-O-
acetil GD3 em células mononucleadas de medula óssea de ratos e de sangue de
cordão umbilical humano. No nosso trabalho o gangliosídeo 9-O-Acetil-GD3 estava
expresso em 30 ± 6,37% das CMN da MO de ratos e em 12 ± 4,96% das CMN de
sangue de cordão umbilical humano. No entanto, essa freqüência foi medida em
células fixadas e assim, a localização intra e extracelular não pôde ser distinguida.
Em sangue periférico humano a expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3
foi investigada em populações celulares específicas: granulócitos, monócitos,
linfócitos B ou T, sendo encontrada em linfócitos T helper e em linfócitos B ativados,
mas a expressão desse gangliosídeo em células tronco hematopoiéticas não foi
abordada (Kniep B. et al., 1993; Vater M. et al., 1997). Neste sistema, o grupamento
97
9-O-acetil foi denominado antígeno CD60b (Mason et al., 2001). No nosso trabalho,
encontramos células da medula óssea de ratos que expressam concomitantemente
o marcador de células tronco CD34 e o gangliosídeo 9-O-acetil GD3.
A CD34 é uma glicoproteína transmembrana altamente glicosilada de 105-
120 kDa, expressa nas células progenitoras hematopoiéticas, nas células
endoteliais e em alguns fibroblastos. A sua expressão é específica do estágio
indiferenciado das células tronco e progenitoras hematopoiéticas e decresce com a
maturação até a extinção nas células terminalmente diferenciadas. As células
CD34+ da medula óssea humana incluem as unidades formadoras de colônias
(CFU), as células iniciadoras de cultura de longa duração, os progenitores
multipotentes (formadores de colônias mistas mielóides e eritróides) e os
progenitores comprometidos (CFU-granulócito-macrófago, burst-forming unit-
erythroid [BFU-E], e CFU-megacariócito). O transplante de células CD34+ permite a
reconstituição a longo prazo do compartimento hematopoiético (Krause D.S. et
al.,1994). Alguns estudos sugerem que a CD34 pode ter alguma função na
transdução de sinais e na adesividade das células tronco hematopoiéticas e pode
ter também uma função na adesão de alguns antígenos ao endotélio (Majdic O. et
al., 1994).
A expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 está relacionada à migração
neuronal e à extensão axonal no SN em desenvolvimento e em áreas de
neurogênese no sistema nervoso central adulto, o que tem sugerido que o mesmo
possa ser utilizado como marcador de células tronco e/ou progenitores neurais
(Mendez-Otero R. et al., 2005).
Esses dados indicam que seria interessante quantificar e separar as células
que expressam concomitantemente o marcador de células tronco CD34 e o
98
gangliosídeo 9-O-acetil GD3, através de FACS (fluorescence activated cell sorting),
o que permitiria utilizar o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 para purificar e enriquecer
sub-populações celulares a partir de medula óssea e de sangue de cordão umbilical,
uma vez que é esta molécula é expressa na superfície celular.
No nosso trabalho, um dos padrões encontrados de distribuição do
gangliosídeo 9-O-acetil GD3 foi sua concentração em apenas um lado das células, o
que pode estar relacionado a fenômenos de polarização celular. Polarização celular
é o conjunto de modificações espaciais que ocorre em uma célula para uma
determinada função. Na migração por diapedese, por exemplo, para que ocorra a
adesão do pólo anterior da célula e o descolamento do pólo posterior ao substrato,
várias moléculas especializadas da membrana citoplasmática se concentram em um
pólo da célula, causando subseqüentes modificações no citoesqueleto (Gómez-
Moutón C. et al., 2001).
As membranas plasmáticas de muitas células contêm domínios ricos em
colesterol e esfingolipídeos, que são denominados rafts lipídicos. Nos linfócitos, os
rafts formam estruturas firmemente emalhadas, insolúveis em detergentes a baixas
temperaturas, sendo por este motivo denominadas membranas resistentes a
detergentes. Na polarização celular os rafts podem ser redistribuídos na membrana
do linfócito, concentrando-se num pólo da célula (Giurisato E. et al., 2003).
Os domínios de membrana com rafts ricos em gangliosídeos GM1 e GM3
sofrem redistribuição assimétrica, formando pólos opostos, em linfócitos T que
adquirem fenótipo migratório. A redistribuição destes rafts é conjunta à redistribuição
das proteínas de membrana especificamente associadas a cada raft (Gómez-
Moutón C. et al., 2001).
99
Muitas proteínas envolvidas na transdução de sinais têm sido encontradas
nestes domínios de membranas resistentes a detergentes de linfócitos T e muitas
outras evidências apontam para o envolvimento dos rafts lipídicas na transdução de
sinais (Giurisato E. et al., 2003).
A polarização e o recrutamento de rafts lipídicos em células imunes têm sido
demonstrados em resposta à ligação de receptores e à estimulação por citoquinas e
quimioatratores. A formação de uma sinapse imunológica entre uma célula
apresentadora de antígenos e uma célula T causa significante redistribuição de
lipídeos e proteínas na membrana da célula T, para regiões específicas da zona de
contato (Nguyen D.H. et al., 2005).
Sinapses imunológicas são também observadas nas interações das células
NK. A sinalização através dessas áreas de contato é conhecida pela transmissão
direta dos sinais de uma célula para a outra, que podem causar ativação ou
inativação celular ou citólise. A redistribuição dos rafts lipídicos nas sinapses
imunológicas são reconhecidamente críticas para a transmissão de sinais, por
proverem plataformas estáveis para a acumulação de moléculas sinalizadoras
intracelulares e serem sítios para organização do citoesqueleto. A polarização de
rafts lipídicos pode ser causada em células imunes por gradientes de
quimioatratores (Nguyen D.H. et al., 2005).
Nosso trabalho demonstrou que o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 pode se
apresentar concentrado em um pólo de uma célula mononucleada de sangue de
cordão umbilical humano e de medula óssea de ratos. Desta forma, este
gangliosídeo pode estar relacionado à migração celular e à transmissão de sinais
nessas células.
100
5.3. Implicações da expressão espontânea de antígenos neurais em
células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical para as terapias
celulares
Após AVC experimental em roedores, alguma recuperação funcional pode ser
induzida pelo transplante estereotáxico no cérebro (Li Y. et al., 2000) ou transplante
na circulação sistêmica (Chen J. et al., 2001; Li Y. et al., 2002; Chen J. et al., 2003;
Borlongan C.V. et al., 2004) de células da medula óssea ou do sangue de cordão
umbilical. Os mecanismos pelos quais essa recuperação se dá não são claros.
Como esta recuperação ocorre mesmo quando o número de células transplantadas
que passam a expressar marcadores neuronais no encéfalo do hospedeiro é muito
baixo e a morfologia permanece indiferenciada (Chen J. et al., 2001), acredita-se
que a melhora das deficiências não se dá devido à transdiferenciação destas células
em células neurais. Há resultados que indicam que um dos fatores causadores da
melhora é a redução da área de infarto (Borlongan C.V. et al., 2004), mas outros
trabalhos encontram melhora significativa do quadro sem redução dessa área (Chen
J. et al., 2001; Li Y. et al., 2002). Uma hipótese que vem sendo levantada sugere
que a produção de fatores tróficos pelas células transplantadas poderia auxiliar na
recuperação funcional através de neuroproteção (Chen J. et al., 2003; Borlongan
C.V. et al., 2004) ou da proliferação endógena de células tronco neurais (Munoz J.R.
et al., 2005).
Também está claro que o transplante de células tronco neurais, células
neuronais derivadas de linhagens imortalizadas ou transplantes de células ou tecido
neuronal fetal diminuem as deficiências funcionais causadas por um AVC (Wechsler
L.R. & Kondziolka D. 2003). Nestes casos, os meios pelos quais a recuperação
funcional ocorre também ainda não estão esclarecidos. Há indícios de que a
101
reposição neuronal tem uma participação maior nestes tipos de transplante do que
nos transplantes de células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical.
Supõe-se que células neuronais transplantadas podem preservar as células e
conexões sinápticas do hospedeiro através da secreção de fatores tróficos,
estabelecimento de novas conexões que aumentem a atividade sináptica, ou
funcionem como suporte estrutural para regeneração axonal do hospedeiro ou
mesmo reponham elementos celulares (Wechsler L.R. & Kondziolka D. 2003). Entre
os indícios da participação da reposição celular estão os resultados de Sorensen
J.C. et al. (1996) em que enxertos corticais fetais implantados no neocórtex adulto
após isquemia produziram conexões com os neurônios hospedeiros. Nestes animais
ocorreu melhora comportamental quando houve exposição a um ambiente
enriquecido. Células neuronais derivadas de uma linhagem celular de
teratocarcinoma humano (células NT2), implantadas no striatum após infarto,
sobreviveram, se integraram no cérebro do animal hospedeiro, e produziram
axônios e sinapses (Kleppner S.R. et al., 1995). Neste caso, os déficits neurológicos
foram revertidos apenas quando uma quantidade suficiente de células foi
implantada, indicando que os benefícios estavam relacionados à reposição celular.
Estes trabalhos reforçam a idéia de que as causas da melhora das
deficiências funcionais são diferentes em transplantes de células que efetivamente
se diferenciam em células neuronais (células tronco neurais, células neuronais
derivadas de linhagens imortalizadas ou células ou tecido neuronal fetal) e em
transplantes de células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical.
Não há uma conclusão a respeito da transdiferenciação em modelos de
transplante de células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical no SNC.
Vários artigos encontram a quase totalidade das células derivadas do doador com
102
aspecto de blastos, com localização perivascular (Castro R.F., 2002) e expressando
o marcador pan-leucócito CD45 (Wagers A.J. et al., 2002; Vallières L. & Sawchenko
P.E., 2003), indicando que as células destas fontes só contribuem para o SNC com
microglia e células macrofágicas. Vários outros artigos, no entanto, encontram
células completamente integradas ao tecido hospedeiro, muitas vezes
indistinguíveis das células hospedeiras vizinhas, expressando antígenos de tecido
nervoso e numa quantidade maior do que se supõe ser a freqüência de fusão
celular, resultados compatíveis com fenômenos de transdiferenciação (Eglitis M.A. &
Mezey E., 1997; Kopen G.C. et al., 1999; Brazelton T.R. et al. 2000; Mezey E. et al.,
2003; Crain B.J. et al., 2005).
O presente trabalho contribui para a idéia de que a melhora em transplante
de células da medula óssea e do sangue de cordão umbilical não ocorre por
transdiferenciação destas células em células neuronais, porque a expressão prévia
de antígenos considerados específicos do tecido nervoso pode estar sendo
confundida com transdiferenciação. A hipótese da transdiferenciação deve ser mais
bem avaliada, incluindo a possibilidade de fusão destas células com uma célula do
hospedeiro (Ying Q.L. et al., 2002; Terada N. et al., 2002; Wang X. et al., 2003;
Vassilopoulos G. et al., 2003). A análise prévia da expressão dos antígenos usados
para avaliar a transdiferenciação nas células que serão transplantadas ou induzidas
à transdiferenciação in vitro pode evitar conclusões errôneas.
Nosso trabalho indica que em estudos de diferenciação de células
mononucleadas de MO de ratos e de sangue de cordão umbilical é aconselhável
que a expressão de NF-200, NSE, vimentina, β-III-tubulina ou S-100 só seja usada
de forma comparativa com a expressão basal em CMN, mas que GFAP e MAP-2
são marcadores confiáveis. Essa verificação deve ser feita, inclusive, com cada
103
amostra a ser transplantada, visto que nossos resultados mostram uma grande
variabilidade entre as amostras na expressão dos antígenos avaliados.
Ao fazer uma análise prévia da expressão dos antígenos usados para avaliar
a transdiferenciação Mezey E. et al. (2000) verificaram que células da medula óssea
de camundongos não expressavam Neu-N, nem O4 (marcador de oligodendrócitos),
nem NG2 (presente em células de Schwann). Após o transplante, estas células
expressavam Neu-N no encéfalo, mas NG2 e O4 não foram verificados. No entanto,
a expressão de NSE foi verificada após o transplante, mas sua expressão prévia não
foi testada. Goolsby J. et al. (2003) observou que depois de implantadas no encéfalo
células CD34+ de MO de camundongos deixavam de expressar concomitantemente
os antígenos de neurônio NF-200 e Neu-N e o antígeno de oligodendrócitos
CNPase, segregando em populações distintas. GFAP, que não era expresso nas
células antes do implante, passava a ser expresso, também de forma segregada.
Outros autores também encontraram expressão de GFAP em células derivadas do
sistema hematopoiético integradas no parênquima cerebral (Eglitis M.A. & Mezey E.,
1997; Kopen G.C. et al., 1999).
Woodburry D. et al. (2002), no entanto, verificaram em cultura de células
mesenquimais de medula óssea de ratos adultos que, após indução de
diferenciação neural por exposição a meio suplementado com DMSO, bFGF e
PDGF, ocorria diminuição na expressão tanto de marcadores de tecidos não neurais,
quanto de vários antígenos neurais (subunidade de ligação de glutamato de NMDA,
aldolase C, GFAP, NeuroD e Sintaxina 13) o que constituía uma incongruência com
a hipótese de transdiferenciação.
A revisão de publicações anteriores mostra que cuidado muito maior deve ser
tomado com células mesenquimais de medula óssea cultivadas, visto que estas
104
expressam uma infinidade de antígenos teoricamente marcadores restritos a algum
outro tecido (Seshi B. et al., 2003; Seshi B. et al., 2000).
Provavelmente, a forma mais coerente de se verificar a transdiferenciação,
seria através da avaliação funcional (Tondreau T. et al., 2004), como as provas
eletrofisiológicas para os neurônios. A expressão de um conjunto de antígenos
correlacionados para uma mesma função e não de um antígeno isolado também
seria uma avaliação mais fidedigna dos fenômenos de transdiferenciação.
5.4. Implicações Clínicas: níveis séricos de proteínas de tecido nervoso
no sangue de recém nascidos são usadas na detecção e avaliação de lesões
do SNC.
Usa-se o aumento dos níveis séricos de proteínas de tecido nervoso no
sangue de recém nascidos para diagnosticar e definir prognóstico de lesão perinatal
do SNC. Gazzolo, D. et al. (2002), encontraram correlação entre os níveis séricos
de S-100 e o grau de impedimento do fluxo sangüíneo feto-placental em fetos
humanos de 28 a 39 semanas com retardo do crescimento. Çeltik, C. et al. (2004)
avaliaram as concentrações séricas de NSE como um marcador de severidade de
encefalopatia hipóxica-isquêmica em recém nascidos. Concluíram que as taxas de
NSE tinham sensibilidade e especificidade moderadamente altas para a avaliação
do diagnóstico e de prognóstico ruim em encefalopatia hipóxica-isquêmica, mas os
valores preditivos positivos e negativos eram relativamente baixos. Tekgul et al.
(2004) tiraram conclusões diferentes quando procuraram definir os valores
preditivos das concentrações sérica e liquórica de NSE para prognóstico em
crianças com asfixia perinatal. As crianças (n=21) foram monitoradas até a idade de
dois anos quanto à avaliação neurológica e do desenvolvimento. Não havia
105
diferença significativa nos níveis séricos de NSE medidos entre 24 e 72 horas após
o nascimento entre crianças com graus de encefalopatia hipóxica-isquêmica severo
e mínimo, mas a concentração de NSE no líquor medida no mesmo período tinha
correlação com o grau de encefalopatia e o prognóstico após dois anos.
O uso do aumento dos níveis séricos de proteínas de tecido nervoso no
sangue de recém nascidos para diagnosticar e definir prognóstico de lesão perinatal
do SNC tem sido questionado devido à constatação da presença de NSE e S-100,
as proteínas mais comumente usadas para este fim, no parênquima da placenta e
do cordão umbilical. Wijnberger, L.D.E. et al. (2002) encontraram imuno-reatividade
para as subunidades α e β de S-100 na placenta e no cordão umbilical, em células
musculares lisas da parede vascular, em miofibroblastos, no epitélio amniótico, nos
macrófagos e no sinciciotrofoblasto. Imuno-reatividade para NSE foi encontrada nas
mesmas estruturas citadas acima e no endotélio. Não foi encontrada qualquer
imuno-reatividade para GFAP e B-50. Desta forma, os níveis aumentados de S-100
e NSE encontrados em bebês com lesão encefálica perinatal podem estar
relacionados, na verdade, à lesão da placenta ou cordão umbilical e ter uma relação
mais indireta que direta com a lesão neurológica.
Wirds J.W. et al. (2003) mediram as concentrações de S-100 sérica em UCB
de 81 neonatos saudáveis nascidos de parto normal ou cesárea. As isoformas αβ e
ββ foram encontradas em todas as amostras, numa concentração média de 1.62
µg/l de sangue arterial e 1.36 µg/l de sangue venoso. Bebês nascidos através de
parto normal apresentavam níveis significativamente mais altos que os nascidos
através de cesárea. Os autores questionaram a confiabilidade de se usar a
concentração de uma proteína que existe no sangue de bebês saudáveis para
diagnosticar ou avaliar a gravidade de lesão perinatal do SNC. Os autores
106
ponderaram que a lógica deste uso era frágil, por conter muitas variáveis. Para que
uma lesão encefálica causasse o surgimento de S-100 (ou qualquer outro antígeno
considerado específico de tecido nervoso) no soro deviam ocorrer os fatos narrados
a seguir: a proteína proveniente do interior de uma célula que morreu devia ser
lançada na matriz extracelular e daí alcançaria o líquido cérebro-espinhal; a proteína
então atingiria o sangue se ultrapassasse a barreira hemato-encefálica. Quanto à
necessidade de a barreira hemato-encefálica ser ultrapassada, postula-se que em
recém nascidos sua permeabilidade é maior que em adultos, que não apresentam
S-100 no soro normal. Para a questão de os bebês saudáveis apresentarem a
proteína no soro foram apontadas as seguintes soluções: ou a matriz extracelular do
SNC de neonatos apresenta quantidades maiores de S-100 que em adultos, ou a
fonte da proteína não é o SNC. A placenta foi apontada como uma possível fonte
para a proteína S-100 encontrada no soro, mas esta resposta não pareceu
suficiente, porque as suas concentrações arteriais eram maiores que as venosas.
Se as fontes de S-100 e de NSE no soro de recém nascidos normais são,
além da placenta e do cordão umbilical, as células sanguíneas, a presença e a
concentração dessas proteínas no soro sofrerão variação sob influência da variação
dessas proteínas nessas células. Com a grande variação encontrada no nosso
trabalho na presença e freqüência de células de UCB que expressam NSE ou S-
100, seria difícil determinar uma concentração basal considerada normal e
diferenciá-la de concentrações consideradas indicativas de lesão no SNC, podendo
ser esta uma das explicações para os resultados controversos de Çeltik, C. et al.
(2004), Tekgul et al. (2004) e Wirds J.W. et al. (2003).
A extrapolação dos resultados indica que seria interessante verificar se as
células do sangue periférico adulto também contêm alguma imuno-reatividade para
107
estes antígenos, já que a quantificação dos níveis séricos destes antígenos também
é usada para a avaliação de lesão neurológica em adultos (Persson L. et al. 1987;
Aurell A. et al. 1991).
108
6. Conclusões
1. Uma grande proporção das células mononucleadas da medula óssea de
ratos adultos e do sangue de cordão umbilical humano expressa antígenos
marcadores de células da linhagem neural tais como: células de glia (S-100 e
vimentina), neurônios imaturos (ß-III-tubulina) e maduros (NSE e NF-200). Estes
resultados sugerem que a expressão desses antígenos deve ser usada com cautela
no estudo da diferenciação neural destas populações.
2. O gangliosídeo 9-O-Acetil-GD3 é expresso em 30% das CMN da MO de
ratos e em 12% das CMN de sangue de cordão umbilical humano.
3. O gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 pode se distribuir de forma assimétrica na
superfície de células mononucleadas da medula óssea de ratos adultos e do sangue
de cordão umbilical humano o que indica que ele poderá estar relacionado a
fenômenos de polarização celular.
4. A presença do gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 em células tronco
hematopoéticas e/ou progenitoras da medula óssea de ratos adultos sugere que
este antígeno possa ser utilizado para purificar e enriquecer sub-populações
celulares da medula óssea.
109
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