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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS VISANDO À
INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA GONDII
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
ILHÉUS - BAHIA - BRASIL
Fevereiro de 2016
ii
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS
VISANDO À INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA
GONDII
Tese apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Doutor em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e
Biologia Molecular
ILHÉUS - BAHIA - BRASIL
Fevereiro de 2016
S474 Sena, Jamilly Azevedo Leal. Clonagem e expressão heteróloga de antígenos visando à indução de imunidade contra Toxoplasma gondii / Jamilly Azevedo Leal Sena. – Ilhéus, BA: UESC, 2017. xiii, 79 f. : il. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Gené- tica e Biologia Molecular. Inclui referências e apêndice.
1. Toxoplasma gondii. 2. Toxoplasmose. 3. Siste- ma imunológico. 4. Antígenos. I. Título. CDD 616.016
iii
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS VISANDO À
INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA GONDII
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de Doutor
em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular
APROVADA: 24 de fevereiro de 2016
Dr. Arlindo Gomes Macêdo Junior Dra. Luciana Debortoli Carvalho
(UFOB) (UESC)
Dra. Sara Pereira de Menezes Dra. Tahise Magalhães de Oliveira
(UESC) (UESC)
Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani
(Orientador - UESC)
iv
"Se não houver frutos, valeu a beleza das flores;
Se não houver flores, valeu a sombra das folhas;
Se não houver folhas, valeu a intenção da semente".
Henfil
v
À minha avó Jardelina Azevedo Leal,
nossa matriarca, exemplo de sabedoria,
humildade, perseverança e fé.
DEDICO
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela bondade suprema, dando-me fé e saúde e por me sustentar nos
momentos mais difíceis. A Ele, toda gratidão!
À minha família, minha base e meu suporte, pelo apoio nas minhas decisões e
pelo incentivo sempre. Pelos momentos de união, alegria, carinho e
compreensão. Meus pais sempre dedicados à minha formação, incentivando-
me nas minhas decisões. Minha irmã Fernanda, que carinhosamente sempre
demonstra orgulho da irmã aqui.
Ao meu sobrinho Arthur, que chegou para abrilhantar nossa família. E à Júlia
Laert, a quase sobrinha que tanto sentiu minha falta nesses últimos anos.
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani, pela orientação,
confiança, preocupação, ensinamentos e incentivo constantes.
À Profa. Dra. Jane Lima, pela contribuição ao trabalho e pelo incentivo
oferecido sempre. E às alunas do Laboratório de Imunobiologia, por sempre
estarem dispostas a ajudar.
Às alunas de iniciação científica Thaíse Rocha e Nancy Trindade, por tornarem
a luta diária menos árdua, sempre comprometidas, ajudando na realização dos
experimentos.
Às amigas-irmãs Laís Freire, Luciana Cidade, Joise Hander, Cristina Martins.
Obrigada por tudo!
Aos colegas do Centro de Biotecnologia e Genética, dos laboratórios Cultura
de Tecidos, Proteômica, Genômica e Biologia Molecular. Em especial às
minhas amigas CBGets. Os momentos que compartilhamos experiências e
alegrias serão inesquecíveis.
vii
Aos demais colegas do CBG, em especial o técnico Horlei, pelos momentos de
descontração e sempre tão disposto a ajudar e dedicado em cumprir suas
tarefas.
Aos meus grandes amigos, por sempre acreditarem e compreenderem a minha
ausência e pela torcida sempre. Em especial, às minhas "Migas", que tanto
alegram meus dias, seja pelas resenhas ou pelos bons momentos
compartilhados.
Ao meu querido Gilter Ramos, um ser humano maravilhoso que Deus me
apresentou. Obrigada pelos momentos especiais e pela compreensão nos
momentos em que precisei me ausentar.
Aos meus tios e tias, pelo carinho e atenção sempre, em especial ao tio
padrinho Ito (in memorian). E a todos os meus primos, principalmente Jorginho
e Júnior, que são meus primos-irmãos.
À Profa. Dra. Fátima Alvim e Dr. Júlio Cascardo (in memorian), casal amigo
que me incentivou e ajudou a trilhar o caminho da ciência.
À Universidade Estadual de Santa Cruz e Programa de Pós-Graduação em
Genética e Biologia Molecular, pela oportunidade. E às secretárias do
programa por sempre estarem disponíveis e solucionando nossos problemas
sempre.
Aos professores doutores membros das bancas de qualificação e defesa
Arlindo Macêdo, Aurizângela Sousa, Luciana Debortoli, Sara Menezes e Tahise
Magalhães, pelas excelentes contribuições. Profa. Luciana, agradeço a linda
mensagem que tanto me emocionou.
À CAPES, CNPq e BNB, pela concessão da bolsa e pelos auxílios financeiros.
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para que este
doutoramento fosse possível.
viii
ÍNDICE
EXTRATO ..................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................. xii
INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 3
Toxoplasma gondii .................................................................................................... 3
Os antígenos de T. gondii ......................................................................................... 8
Macrófagos e polarização fenotípica ......................................................................... 9
Plantas como biorreatores na produção de antígenos e vacinas ............................. 11
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................... 14
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with peritoneal cells
of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii .............................................. 14
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with peritoneal cells
of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii .............................................. 15
ABSTRACT ................................................................................................................ 15
INTRODUCTION ........................................................................................................ 15
MATERIAL AND METHODS ....................................................................................... 17
Production of the recombinant SAG2A protein ........................................................ 17
Preparation of mice peritoneal macrophages .......................................................... 17
Cell viability assay ................................................................................................... 18
Extraction of proteins ............................................................................................... 18
Two-dimensional gel electrophoresis ...................................................................... 19
Acquisition and analysis of images .......................................................................... 19
Treatments of spots and extraction of peptides ....................................................... 20
Identification of proteins by MS ............................................................................... 20
Construction and analysis of protein-protein interaction networks based on
proteomics data ....................................................................................................... 20
Real-time qPCR ...................................................................................................... 21
Statistical analyses .................................................................................................. 21
ix
RESULTS ................................................................................................................... 22
1. Production of recombinant SAG2A protein production and analysis of cytotoxicity
................................................................................................................................ 22
2. Proteome of mice’s peritoneal macrophages in response to rSAG2A protein ...... 22
3. Identification and analysis of differentially expressed proteins by peritoneal cells
exposed to rSAG2A ................................................................................................. 23
4. Analysis of protein-protein interaction in peritoneal macrophages exposed to
rSAG2A ................................................................................................................... 24
5. Protein-protein interactions in BALB/c and C57BL/6 ............................................ 24
6. Modulation of M1 and M2 gene expression in peritoneal cells of BALB/c and
C57BL/6 mice exposed to SAG2A ........................................................................... 25
DISCUSSION ............................................................................................................. 26
CONCLUSION ............................................................................................................ 30
Supporting Information ............................................................................................ 30
Author Contributions ................................................................................................ 30
REFERENCES ........................................................................................................... 31
SUPPLEMENTAL FIGURE ......................................................................................... 49
CAPÍTULO 2 ............................................................................................................... 50
Clonagem e expressão heteróloga de antígenos visando à indução de imunidade
contra Toxoplasma gondii. .......................................................................................... 50
RESUMO .................................................................................................................... 51
ABSTRACT ................................................................................................................ 52
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 53
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 55
2.1. Clonagens de antígenos em vetores de expressão em plantas ........................ 55
2.2. Preparo e transformação de células competentes de Agrobacterium tumefaciens
(LBA4404) ............................................................................................................... 57
2.3. Transformação genética de Lactuca sativa L. (alface) ...................................... 57
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 59
3.1. Clonagem de antígenos para transformação genética de plantas .................... 59
3.2. Obtenção de plantas transformadas de Lactuca sativa L. (alface) .................... 62
4. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 64
5. REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 65
APÊNDICE ................................................................................................................. 71
REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES ....................................................................... 79
x
EXTRATO
SENA, Jamilly Azevedo Leal, D.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, fevereiro de 2016. Clonagem e expressão heteróloga de antígenos
visando à indução de imunidade contra Toxoplasma gondii. Orientador:
Carlos Priminho Pirovani. Co-orientador: Márcio Gilberto Cardoso Costa.
A toxoplasmose é uma doença infecciosa causada pelo protozoário
intracelular obrigatório Toxoplasma gondii, sendo classificada como uma
importante zoonose amplamente difundida entre animais homeotermos,
incluindo o homem. Esta doença resulta em graves problemas em humanos e
animais, justificando a busca de estratégias que visam o controle do parasito. A
superfície celular do Toxoplasma gondii é coberta por antígenos da família
SRS, denominados de SAG, ancorados por glicosilfosfatidilinositol (GPI) e
incluem antígenos membros da família SAG2, potenciais em ativar a resposta
imune humoral e na caracterização da fase aguda da infecção. No presente
estudo, sequências referentes aos antígenos Sag2a e Sag2b do parasito foram
utilizadas na forma recombinante para análise de expressão em plantas
biorreatoras visando avaliar o potencial imunológico contra a toxoplasmose. O
antígeno recombinante Sag2a foi avaliado quanto à polarização fenotípica por
qPCR, bem como o perfil proteico induzido em macrófagos peritoneais de
camundongos resistentes e susceptíveis ao T. gondii, por espectrometria de
massas, resultando numa expressão diferenciada de proteínas inflamatórias,
além da análise de biologia de sistemas que permitiu verificar agrupamentos de
proteínas envolvidas em processos inflamatórios. A análise de expressão
xi
gênica revelou a ativação preferencial de macrófagos na via clássica por
SAG2A nas linhagens murinas, induzindo uma resposta imune pró-inflamatória,
caracterizada pelo perfil M1, com uma expressão elevada da interleucina
inflamatória IL-1β nos camundongos susceptíveis. Além disso, as sequências
dos antígenos Sag2a e Sag2b foram inseridas em vetores de expressão, para
transformação genética de plantas via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de
Lactuca sativa L. (alface) foram produzidas como biorreatoras com esses
antígenos e os brotos emitidos foram selecionados e individualizados para
confirmação e futuras análises de imunização em cobaias poderão ser
realizadas a fim de avaliar o efeito imunológico dos antígenos contra a
toxoplasmose.
Palavras-chave: toxoplasmose, sistema imune, polarização fenotípica, plantas
biorretoras.
xii
ABSTRACT
SENA, Jamilly Azevedo Leal, D.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, fevereiro de 2016. Cloning and heterologous expression of antigens
in order to induce immunity against Toxoplasma gondii. Advisor: Carlos
Priminho Pirovani. Advisor Committee Member: Márcio Gilberto Cardoso Costa.
Toxoplasmosis is an infectious disease caused by the obligate
intracellular protozoan Toxoplasma gondii, it is classified as a major zoonosis
widespread among warm-blooded animals, including humans. This disease
results in serious problems in humans and animals, justifying the pursuit of
strategies to control the parasite. The cell surface is covered by Toxoplasma
gondii SRS family of antigens, referred to as SAG anchored by
glycosylphosphatidylinositol (GPI) and includes members antigens SAG2 family
potential in activating the humoral immune response and the characterization of
the acute phase of infection. In this study, sequences related to antigens Sag2a
and Sag2b the parasite have been used in recombinant form for expression
analysis in bioreactors plants to evaluate the immune potential against
toxoplasmosis. The Sag2a recombinant antigen was evaluated for phenotypic
polarization by qPCR as well as the protein profile induced peritoneal
macrophages of mice susceptible and resistant to T. gondii by mass
spectrometry resulting in differential expression of inflammatory proteins, as well
as systems biology analysis has shown that proteins of groups involved in
inflammatory processes. Gene expression analysis revealed the preferential
activation of macrophages in the classical pathway by SAG2A in murine strains
xiii
inducing a pro-inflammatory immune response, characterized by the profile M1
with a high expression of the interleukin IL-1β in inflammation susceptible mice.
Furthermore, the sequences of Sag2a and Sag2b antigens were inserted into
vectors for genetic transformation of plants through Agrobacterium tumefaciens,
respectively. Lactuca sativa (lettuce) bioreactors plants were produced with
these antigens and shoots were selected and issued individually for verification
and future immunization in mice analysis may be performed to evaluate the
immunological effect against the antigen toxoplasmosis.
Keywords: toxoplasmosis, immune system, phenotypic polarization,
bioreactors plants
1
INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é um protozoário do filo Apicomplexa que se encontra
ubiquitariamente distribuído na natureza, infectando uma ampla gama de
animais homeotermos, causador da toxoplasmose. As infecções causadas pelo
protozoário, aparentemente assintomáticas, afetam seres humanos e animais
em todo o mundo, sendo considerada uma infecção oportunista, principalmente
em pacientes com HIV, por exemplo, e podendo ser fatal ao feto durante a
gestação, onde a toxoplasmose é um resultado de uma infecção aguda em que
os mecanismos são desconhecidos (DUBEY et al.,1998). A prevalência do
parasito no mundo é alta e nos países da América Latina, incluindo o Brasil, a
incidência é elevada, passando de 70% da população (TENTER,
HECKEROTH, WEISS, 2000).
A transmissão do parasito ocorre por via oral, através da ingestão de
alimentos contaminados com oocistos, sendo este o meio de infecção natural
do T. gondii, e a transmissão congênita ocorre durante o período de gestação
por mulheres infectadas pelo parasito, levando a sérios problemas como
aborto, microcefalia, hidrocefalia e má formação fetal (MONTOYA,
LIESENFELD, 2004). Transfusão de sangue e doação de órgãos também
representam formas de infecção por T. gondii (MONTOYA, LIESENFELD,
2004).
A patofisiologia da doença pode ser descrita como toxoplasmose aguda,
ocorrendo principalmente pela forma infectiva taquizoítos no hospedeiro ou a
toxoplasmose crônica, que ocorre após a fase aguda, após a supressão da
divisão de taquizoítos pelo sistema imune do hospedeiro, levando a formação
de cistos teciduais (bradizoítos) (SUDAN et al., 2015).
A presença de determinados antígenos específicos do ciclo de vida do
parasito atua na diferenciação dos estágios de taquizoítas e dos bradizoítas
(BÉLA et al, 2008). Antígenos componentes da família SAG1 codificam
proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) pertencentes à superfamília
SAG, divididos em dois subgrupos de SAG1 e SAG2 e um segundo grupo de
genes da família SAG definidos por homologia com SAG2 (SAG2B, SAG2C e
SAG2D) (LEKUTIS et al., 2000), são responsáveis pela invasão do protozoário
2
às células hospedeiras, pela modulação da resposta imune, virulência e
proteção do mesmo para sua sobrevivência (BOOTHOYD et al.,1998).
Este trabalho foi delineado visando clonar e produzir sequências
referentes a antígenos recombinantes de Toxoplasma gondii em bactérias e
plantas biorreatoras. Os estudos realizados com uma proteína recombinante do
parasito expressa em bactéria constam no primeiro capítulo da tese,
apresentado em forma de artigo científico, e nesse contexto, o capítulo 1
apresenta resultados obtidos com a análise do perfil proteômico por meio da
espectrometria de massas e rede de interações a partir da proteína
recombinante SAG2A em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e
C57BL/6, bem como a análise por qPCR do perfil de polarização fenotípica
induzida por este antígeno nas células estudadas. Este trabalho foi formatado e
submetido de acordo com as normas do periódico PloS One.
O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos com as clonagens e
expressão dos antígenos em plantas de Lactuca sativa L. (alface), e em
seguida, o apêndice contém clonagens de antígenos em bactérias, a fim de
futuramente avaliar as respostas imunológicas induzidas em cobaias, por meio
da inserção desse material em forma de rações (vacinas comestíveis), e com
isso, disponibilizar um meio de proteção contra a toxoplasmose.
3
REVISÃO DE LITERATURA
Toxoplasma gondii
O protozoário Toxoplasma gondii é o agente etiopatogênico da
toxoplasmose, sendo o gato o seu hospedeiro definitivo e o homem e outros
animais os hospedeiros intermediários (DUBEY & JONES, 2008). O patógeno
apresenta três vertentes infectantes: (i) os taquizoítos, formas de proliferação
rápida, presentes preferencialmente nas infecções agudas, verificados
principalmente no sangue; (ii) os bradizoítos que são formas de reprodução
lenta do T. gondii, presentes nas infecções crônicas, particularmente em
músculos e tecido nervoso e; (ii) os oocistos que são formas resultantes do
ciclo sexuado do parasito, que ocorre no trato gastrointestinal dos felídeos,
eliminados nas fezes ainda não esporulados, tornando-se infectantes no meio-
ambiente, sendo portanto, formas esporofíticas (COUTINHO & VERGARA,
2005).
As características morfológicas e ultra-estruturais nas três formas
infectantes do T. gondii apresentam diferenças sob microscopia de luz e
eletrônica. Os taquizoítos (sinônimos: merozoítos, endozoítos) são as formas
de reprodução rápida assexuada, que se desenvolvem em quase todas as
células em hospedeiros com infecção aguda; exibem forma de meia-lua com
película de revestimento interno e externamente contínua (plasmalema), a
extremidade anterior situa-se no conóide com dois anéis de microtúbulos
(apicais e polares), com dimensões de 4-9 x 2-4 µm (DUBEY & BEATTIE,
1998).
Os bradizoítos (sinônimos: cistozoítos) representam as formas de
reprodução lenta assexuada, em cistos teciduais nos hospedeiros, na infecção
crônica. Acomete tecidos muscular e nervoso, além da retina (REY, 1991). O
citoesqueleto subapendicular compreende 22 microtúbulos em espiral sobre a
membrana interna até o exterior do parasito, conferindo mobilidade (BÉLA,
2008). Apresentam no seu citoplasma organelas secretórias (roptrias),
micronemas e grânulos densos e outras típicas eucarióticas apicomplexas
(complexo golgiano, corpos lipídicos, mitocôndrias, retículo endoplasmático na
porção central celular) e o núcleo apresenta-se deslocado para um dos pólos
(REY, 1991; DUBEY, 1994; SPEER et al., 1998).
4
Os esporozoítos formados dentro dos oocistos representam o ciclo
sexuado do parasito e ocorrem em hospedeiros definitivos como os felídeos.
São eliminados nas fezes de animais contaminados na forma imatura e não-
infectante. Porém, cinco dias após a eliminação, ocorre a esporulação no meio
ambiente, e os oocistos tornam-se infectantes aos hospedeiros intermediários
(FRENKEL et al., 1970). Os oocistos são altamente infecciosos a todos os
animais de sangue quente, incluindo o homem (FRENKEL et al., 1970; SPEER
et al., 1998).
A toxoplasmose é uma das mais comuns parasitoses, afetando
praticamente os animais homeotérmicos em todo o mundo, constituindo-se em
uma importante zoonose (REY, 1991). Representa importante problemática
para as criações de suínos e pequenos ruminantes, causando prejuízos
agroeconômicas como abortos, infertilidade, diminuindo a produção dos
animais infectados pela via congênita, encefalite (no homem), complicante para
portadores da síndrome da imunodeficiência imunológica adquirida (AIDS) e
imunodeprimidos, causador de lesões neurológicas e oftálmicas em crianças,
devido à capacidade dos parasitos de atravessar a barreira placentária e
transferir para o feto em casos de gestantes portadoras da infecção (GLASER
et al., 1994; FACHADO et al., 1997; HEGAB & AL-MUTAWA, 2003).
Epidemiologicamente, T. gondii apresenta prevalência de infecção em
todo mundo, com incidências variadas de 10 a 80% no Brasil, conforme região
geográfica (COSTA, 2008). A soroprevalência varia entre 51 a 80% em países
da América Latina, como Argentina, Brasil, Cuba e Venezuela (TENTER, et al.
2000). Nos Estados Unidos, a prevalência está acima de 15,8% em humanos
na faixa etária de 15 a 49 anos, sendo que mundialmente está presente em 70
a 99% dos adultos (COSTA, 2008). Em determinadas regiões, 40 a 70% de
humanos adultos, supostamente saudáveis, apresentam-se sorologicamente
positivos para a infecção por T. gondii, cotando este parasito como o mais
difundido entre a população de vertebrados e homeotérmicos, incluindo as
aves (REY, 1991; AIGNER, 2008).
Etiologicamente, os gatos (hospedeiros definitivos) infectam-se
principalmente pela ingestão dos micro-organismos encistados presentes nos
tecidos de hospedeiros intermediários, durante a caça a pequenos animais, ou
pela ingestão de carnes infectadas com cistos ou mal cozidas. Os cistos sendo
5
digeridos se rompem, liberam formas infectantes na luz intestinal, que se
multiplicam e formam os taquizoítos. Estes se dispersam pelo organismo
através do sangue e da linfa e reproduzem-se nas células da parede intestinal.
Enquanto o hospedeiro adquire imunidade, o parasito começa a encistar, em
forma de bradizoítos, podendo reativar novos cistos, excretados com as fezes
(COUTINHO & VERGARA, 2005; DENKERS, 1999).
O sucesso da sobrevivência do T. gondii está basedo em seu complexo
ciclo de vida: um lítico, em que os taquizoítos disseminam a infecção e um
encistado, com bradizoítos que estabelecem a fase latente, representando a
infecção crônica (TENTER et al., 2000). O ciclo biológico (Figura 1) começou a
ser elucidado de forma completa em 1969, após a sua identificação e
classificação, onde foram demonstradas as fases assexuadas e sexuadas do
parasito (WEISS, 2000; BÉLA, 2007). Após a ingestão de cistos ou oocistos, os
parasitos são liberados, ocorrendo a diferenciação dos taquizoítos,
caracterizando outros estágios intermediários da infecção e em um deles inicia-
se o ciclo de vida sexuado do parasito, com a formação dos gametas
masculino e feminino. Com a fusão destes, há formação dos oocistos, que são
altamente infecciosos se ingeridos e quando liberados, podem permanecer no
solo ou ambiente por mais de um ano (DUBEY; LINDSAY et al., 1998).
Após o contato do protozoário com o organismo do hospedeiro, a
imunidade inata é ativada representando a linha de defesa do sistema imune
por células da linhagem natural killer (NK) para ocorrer a liberação de
interferon-gama (IFNγ), principalmente, e a ativação dos mecanismos
microbicidas de macrófagos para limitar a rápida replicação dos taquizoítos.
Por conseguinte, os macrófagos podem atuar com os linfócitos B e T
produzindo citocinas, como IFNγ que induz e mantém a resposta imune eficaz
nas fases aguda e crônica da infecção (DENKERS & GAZZINELLI, 1998). Na
fase aguda, ocorre primeiramente a produção de imunoglobulina M (IgM), e em
seguida a produção de imunoglobulina G (IgG), que é considerada a principal
classe de imunoglobulina envolvida na resposta imune humoral contra o
parasito. A imunoglobulina A (IgA) também pode ser produzida durante a
infecção, em casos de transmissão por via oral no contato inicial do parasito
com a mucosa intestinal (CANTOS et al., 2000).
6
Figura 1: Ciclo de vida do Toxoplasma gondii (Adaptado de DUBEY,
1998).
Os felídeos, ponto-chave da epidemiologia da toxoplasmose, são os
únicos hospedeiros da forma sexuada do parasito e, por eliminarem oocistos
nas fezes, são a única fonte de infecção dos animais herbívoros. Nestes
animais, como suínos, caprinos, ovinos, roedores e outros, ocorre ciclo
extraintestinal, com proliferação de taquizoítos nos órgãos e, com a resposta
imune, desenvolvem-se os cistos teciduais; que permanecem viáveis e são
infectantes para os gatos e para hospedeiros intermediários como o homem e o
cão (COUTINHO & VERGARA, 2005).
A infecção pode acontecer por via natural, sendo pela ingestão de
oocistos, presentes no solo ou alimentos de origem vegetal ou carne com
cistos tissulares. A transmissão congênita do T. gondii tem consequências mais
sérias aos fetos: a infecção do parasito em mulheres durante a gestação causa
abortos e morte neonatal (DUBEY & BEATTIE, 1988), uma vez que os
7
taquizoítos atravessam a placenta e invadem os órgãos do feto, prevalecendo
no sistema nervoso central (causando encefalomielite) e na retina (REY, 1991).
A transmissão do T. gondii também pode ocorrer após o nascimento em
indivíduos imunocompetentes, caracterizando a toxoplasmose adquirida, sendo
assintomática, e a infecção pode manifestar de forma leve ou temporariamente
(TENTER et al., 2000). Todavia, indivíduos imunocompetentes podem
desenvolver um quadro clínico de encefalite aguda fatal, em consequência de
baixa no sistema imunológico (ROBERTS et al., 1994).
O diagnóstico da toxoplasmose baseia-se em métodos diretos, na
identificação do parasito em materiais dos animais infectados, exames
histológicos, cultivos celulares, reação em cadeia da polimerase (PCR) e
métodos indiretos, baseados na identificação de anticorpos específicos por
meio de testes imunoenzimáticos (MONTOYA, 2002; COUTINHO &
VERGARA, 2005).
Situações como virulência do parasito, background genético e estado
imunológico do hospedeiro afetam o curso da infecção em humanos e modelos
animais (MONTOYA, LIESENFELD, 2004). A infecção ocorre
semelhantemente em ambos e, por isso, o modelo murino é muito utilizado
como ferramenta experimental para o entendimento das alterações patológicas
causadas pelo T. gondii (DENKERS, 1999). Durante a infecção natural por T.
gondii em hospedeiros, ocorre o desenvolvimento desordenado de inflamações
intestinais em linhagens de camundongos. De acordo com Liesenfeld et al.
(1996), camundongos da linhagem C57BL/6, considerados susceptíveis ao
parasito, obtiveram mortalidade de 100% quando infectados por cepas de T.
gondii, enquanto camundongos da linhagem BALB/c (resistentes) sobreviveram
à mesma situação de infecção. Então, humanos e modelos animais
compartilham características morfológicas e histológicas, que podem levar a
uma resposta inflamatória exacerbada, resultando na morte precoce de
hospedeiros susceptíveis (LIESENFELD, 2002).
Sendo assim, uma imunoregulação adequada é importante para prevenir
as complicações causadas pela infecção por T. gondii. Isto induz a novas
abordagens para controle da doença, como a produção de antígenos em
plantas, visando uma melhoria no quadro epidemiológico geral da
toxoplasmose.
8
Os antígenos de T. gondii
A presença específica de proteínas também diferenciam os taquizoítas
dos bradizoítos em seus estágios (BÉLA et al, 2007). Dentre os antígenos
imunogênicos de taquizoíto caracterizados, encontram-se: antígeno de
superfície 1: SAG1; de superfície 2: SAG2A e SAG2B; LDH1: desidrogenase
do lactato 1; ENO2: enolase 2; Ptdins(t) – fosfatidilinositol e também proteínas
de superfície – SRS1 e SRS3. Dentre os imunogênicos de bradizoítas,
destacam-se: antígeno de superfície 2: SAG2C e SAG2D; antígeno de
superfície 4: SAG4; de bradizoítos: BSR4; antígeno de matriz: MAG1;
dehidrogenase lactato 2: LDH2; ENO1: enolase 1; Ptdins(b) – fosfatidilinositol;
antígeno de bradizoíto: BAG1 e p-ATPase. As linhagens clonais de T. gondii
apresentam diferenças na virulência e padrões epidemiológico, apresentando
três genótipos (tipo I, II, III), que são similares, com raros polimorfismos
(LEKUTIS et al., 2001; LYONS et al., 2002).
A patogenicidade e interação antígeno-anticorpo têm na invasão celular
seu principal episódio, semelhante ao que ocorre nos apicomplexa, envolve
receptores da superfície celular do hospedeiro liberando proteínas
consecutivas de micronomas, roptrias e grânulos densos, sumarizando esta
invasão: a) aderência primordial dos parasitos na célula é aleatória, envolve
imunógenos de superfície imunodominantes, pela reorientação parasitaria,
promove na extremidade exterior exclusão da conóide, invaginando e formando
o vacúolo parasitóforo (VP) (local de secreção de proteínas micronemas
parasitarias); b) segue liberação do interior do (VP, de proteínas de roptrias,
estendendo suas membrana (MVP) para associar as organelas celular do
hospedeiro, posicionando as mitocôndrias e retículo endoplasmáticos
adjacentes ao VP (BÉLA, 2008).
Na resposta imunitária, as imunoglobulinas da classe M (IgM), indicam
infecção recente (não de re-infecção), presente nos primeiros sete dias até
nove a doze meses, com o transcorrer das infecções as IgM apresentam
elevada avidez. As IgG aparecem de uma a duas semanas após a infecção,
com baixa avidez para antígenos correspondentes. Os anticorpos de alta
avidez de IgG são úteis como marcadores para exclusão de infecção recente
(BÉLA et al., 2008).
9
Nesse processo, participam células T CD4+, T CD8+ e macrófagos, além
de células natural killer (NK). Na fase aguda, os macrófagos infectados
produzem IL-12, estimulam as NK a produzir IFNγ (principal mediador de
resistência). Este interferon é mediador na formação dos cistos e crítico para a
sobrevivência do hospedeiro. A IL-10 é uma citocina na resposta imune que
tem efeitos inibitórios na atividade microbicidas dos macrófagos advindos do
IFNγ, assim a regulação da IL-10 na infecção por T. gondii é importante para a
sobrevivência do hospedeiro (BÉLA et al., 2008; AIGNER, 2008).
Macrófagos e polarização fenotípica
Macrófagos são células fagocitárias da imunidade inata que
desempenham funções essenciais para mecanismos de defesa,
desenvolvimento de tecidos e homeostase (SICA et al., 2015). Quando
ativados, liberam citocinas e apresentam antígenos aos linfócitos, além de
fagocitar e destruir micro-organismos (MARTINEZ, GORDON, 2014). Possuem
uma heterogeneidade funcional caracterizada por diferentes fenótipos, agindo
na proteção da integridade e na cicatrização de tecidos ou sendo destruidores
de tecidos em inflamações crônicas, por exemplo, devido à produção de
citocinas inflamatórias (MANTOVANI et al., 2013; BISWAS et al., 2013).
Os macrófagos protagonizam o processo inflamatório e cicatrização.
Primeiramente, a inflamação ocorre como resposta natural à presença de
corpos estranhos, produzindo citocinas pró-inflamatórias, como fator de
necrose tumoral (TNFα) e interleucinas (IL-1), que alertam o sistema imune a
nível local e sistêmico e recrutam células como neutrófilos e monócitos para o
microambiente (ALVAREZ et al., 2016). Em geral, os macrófagos permanecem
na interface do tecido e tornam-se mediadores chave na inflamação, e agem
fagocitando o material exógeno. Dependendo do tipo de estímulo liberado, eles
são ativados e podem se modificar, adquirindo fenótipos induzidos por
diferentes estados de polarização, relacionados aos perfis M1 e M2.
Macrófagos M1 referem-se a ativação de forma clássica em estágios iniciais da
infecção, exibindo um perfil pró-inflamatório, enquanto os macrófagos M2 são
ativados de maneira alternativa em estágios tardios, configurando um perfil
10
anti-inflamatório (CHÁVEZ-GALÁN et al., 2015; SPILLER et al., 2015) (Figura
2).
Células M1 exercem atividades citotóxica e anti-proliferativa, como
consequência da produção de óxido nítrico (NO) e algumas citocinas, sendo
TNFα e IL-1β as duas proeminentes que são superexpressas na maioria das
doenças inflamatórias (MANTOVANI et al., 2005; MURRAY et al. 2014). Além
disso, macrófagos M1 medeiam a resistência a patógenos intracelulares e a
destruição de tecidos.
Por outro lado, a via alternativa apresenta característica de macrófagos
predominando a cascata da enzima arginase ativada, inibindo a resposta
inflamatória, e envolvidos na limpeza de detritos, reparo e remodelação de
tecidos (HESSE et al., 2001). Macrófagos polarizados em M2 geralmente estão
envolvidos na resistência a parasitos e regulação da imunidade. Possuem
níveis reduzidos de citocinas inflamatórias e liberam quantidades elevadas de
moléculas anti-inflamatórias como IL-10 e TGFβ. Além disso, exercem função
imunosupressora, inibindo a proliferação de células-T (KONG et al., 2015).
No início da infecção por T. gondii, ocorre a liberação de IL-12 e TNFα
por macrófagos, células dendríticas e neutrófilos estimulados. A IL-12 induz
células natural killer na produção de interferon-gama (IFNγ), que agem
conjuntamente com TNFα e aumentam a atividade fagocítica dos macrófagos,
induzindo a proliferação de linfócitos T produtores de IFNγ, sendo também
essas células importantes no controle da infecção aguda e crônica por T. gondii
(GAZZINELLI, 1994; YAP, SHER, 1999). Todavia, apesar de IFNγ induzir
mecanismos potentes, os parasitos não são eliminados completamente (YAP,
SHER, 1999).
Protozoários como Toxoplasma e Leishmania geralmente elicitam
polarização inicial de macrófagos M1 que contem a parasitemia e controla a
doença, seguido de uma mudança parcial de M1 para M2 que limitam os danos
causados no tecido durante o processo inflamatório, mas sustentando uma
infecção crônica (RAES et al., 2007). Sendo assim, um leve equilíbrio
inflamatório entre M1 e M2 reforça o controle de doenças. Em suma, ambos
macrófagos M1 e M2 são requeridos em diferentes tempos durante o processo
de infecção e cicatrização de tecidos (SICA et al., 2015).
11
Figura 2: Polarização de macrófagos. Macrófagos não ativados são polarizados em fenótipos distintos por agentes indutores específicos, mostrando mudanças típicas na expressão de genes. Nota-se que não há inclusão de todos os agentes e o perfil de expressão para diferentes macrófagos M2 pode diferir dependendo da natureza da indução (Fonte: FERRANTE et al., 2012).
Plantas como biorreatores na produção de antígenos e vacinas
Antígenos proteicos específicos podem ser produzidos em plantas que
induzirão uma resposta imune quando utilizadas como alimento por animais ou
humanos (STREATFIELD & HOWARD, 2003) (Tabela 1). O uso da tecnologia
recombinante tem mostrado boa eficácia na produção de vacinas comestíveis
(ou oral) na proteção de animais e humanos contra patógenos. Em alguns
casos, a proteção tem sido melhor com as vacinas comestíveis do que com as
vacinas comercialmente disponíveis (LAMPHEAR et al., 2002).
12
Tabela 1: Proteínas expressas em plantas utilizadas como vacinas
Espécie alvo Proteína Planta Nível de expressão
Resultado
E. coli enterotoxigênica
(humanos)
Toxina Lt (subunidade)
Batata 0,19% proteína total
Imunogênica quando administrada oralmente
E. coli enterotoxigênica
(humanos)
Toxina Lt (subunidade)
Milho Não mostrado Imunogênica e protetora quando administrada
oralmente Vibrio cholerae
(humanos) Toxina B do
cólera Batata 0,30% proteína
total Formas da proteína
intactas, protetora quando administradas oralmente
Vírus da raiva (humanos)
Glicoproteína Tomate 1,00% proteína total
Proteína intacta
Febre aftosa (animais)
VP1 Alfafa Não mostrado Imunogênica e protetora quando administrada
oralmente e por injeção Coronavírus da gastroenterite transmissível
(porco)
Glicoproteína S
Milho <0,01% peso fresco
Protetora quando administrada oralmente
Fonte: DANIELL et al., 2001.
As plantas são diferenciados sistemas de expressão, viabilizando
atender a atual demanda mundial por novas proteínas terapêuticas,
solucionando questões de interesses industriais. Esta engenharia genética
atrelada a Molecular Farming desponta enquanto alternativa economicamente
atraente para a produção de biofármacos (vacinas, anticorpos, proteínas
recombinantes e outros), oferecendo maior biossegurança e menores custos
em seus processos (COUTINHO, 2005; MODOLO, 2009).
Por serem organismos eucariotos, as plantas possuem a capacidade de
processar diversos tipos de proteínas de mamíferos com altos níveis de
expressão e além disso, muitas proteínas sofrem glicosilação em humanos, o
que não ocorre em bactérias (DANIELL et al., 2001). Enquanto biorreatores,
apresentam outras vantagens como: podem ser produzidas em larga escala,
não necessitam da etapa de purificação, já que servem de alimento, e os riscos
de contaminação por patógenos de humanos são minimizados (CRAMER et
al., 1999; DANIELL et al., 2001).
Uma vacina ideal deve ser termoestável, fácil de administrar, sem efeitos
colaterais, potente e eficaz (LAMPHEAR et al., 2002). Estes são requisitos
importantes para vários segmentos socioeconômico, industrial e
biossegurança, sendo assim, as vacinas comestíveis representam uma ótima
13
alternativa, pois os antígenos bioencapsulados em células vegetais eliminam o
alto custo com purificação, transporte e estocagem a frio e esterilidade, pois
são livres de injeções (LAMPHEAR et al., 2002; UVAROVA et al., 2013).
Considerando isto, os EUA já estudam 390 moléculas recombinantes,
referendando que o custo de produção de proteínas no sistema vegetal é
vantajoso (RICHTER, 2001; VILANNI, 2009).
A comercialização de proteínas recombinantes purificadas a partir de
sementes do milho demonstram o seu potencial na produção de proteínas em
larga escala, pois a integridade e a atividade biológica das proteínas são
mantidas. A toxina Lt-B, causadora da diarreia provocada por E. coli, foi
expressa em sementes transgênicas e resultou numa aumentada resposta
imune de mucosas e demonstraram uma alternativa potente, estável e de baixo
custo para a vacina recombinante (STREATFIELD et al., 2002). Também tem-
se confirmado a efetividade com o antígeno de superfície do vírus da Hepatite
B, comprovadamente induzida em tabaco e experimentada em camundongos,
desde a década de 90 (TWYMAN, 2003).
Estudos desenvolvidos com tomates transgênicos como vacina oral
indicam a sua viabilidade. A proteína VP1, referente ao Enterovirus71 ou EV71,
causador de uma infecção viral em crianças, foi produzida em tomates
transgênicos e camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados oralmente
com extratos de folhas de plantas do tomateiro. Observou-se que o soro dos
animais alimentados com os tomates contendo VP1 pôde neutralizar o EV71 e,
então, a imunidade protetora desejada foi alcançada (CHEN et al., 2006).
A toxina b do cólera não patogênico (subunidade CTB) foi produzida em
batata e tomate e inoculados oralmente em camundongos. O sistema imune de
mucosa produziu anticorpos cólera-específicos, que respaldaram um grau de
proteção imunológica importante (ARAWAKA et al., 1998; RICHTER, 2001).
Plantas de cenoura expressando o antígeno HIV-1 p24 (human
immunodeficiency virus type 1) foram usadas como biorreatoras para a
produção de uma vacina HIV-1, devido à depleção de células CD4+ nos tecidos
gastrointestinais (GALT). Os resultados preliminares indicaram a indução da
resposta imune humoral, principalmente em doses mais baixas do antígeno na
planta (LINDH et al., 2014).
14
CAPÍTULO 1
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with
peritoneal cells of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii
Jamilly Azevedo Leal Sena1, Jane Lima dos Santos1, Thaise Anne Rocha
dos Santos1, Edson Mário de Andrade1, Tiago Mendes2, Jair Pereira da
Cunha-Júnior3, Tiago Wilson Patriarca Mineo3, José Roberto Mineo3,
Carlos Priminho Pirovani1*.
1Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil,
2Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil, 3Universidade Federal de
Uberlândia, Uberlândia, MG.
15
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with
peritoneal cells of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii
Jamilly Azevedo Leal Sena1, Jane Lima dos Santos1, Thaise Anne Rocha
dos Santos1, Edson Mário de Andrade1, Tiago Mendes2, Jair Pereira da
Cunha-Júnior3, Tiago Wilson Patriarca Mineo3, José Roberto Mineo3,
Carlos Priminho Pirovani1*.
1Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil,
2Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil, 3Universidade Federal de
Uberlândia, Uberlândia, MG.
ABSTRACT
The cell surface of Toxoplasma gondii is covered by antigens (SAGs) from the
SRS family anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI), and includes
antigens from the SAG2 family, among which there is the SAG2A surface
antigen that shows great potential in activating the humoral response and has
been used in the characterization of the acute phase of infection, as well as in
the serological diagnosis of toxoplasmosis. In this study we aimed to evaluate
the rSAG2A-induced proteins in mice macrophages susceptible and resistant to
T. gondii and to evaluate the phenotypic polarization induced in the process. To
this end, we treated peritoneal macrophages of mice resistant and susceptible
to Toxoplasma gondii with rSAG2A to analyze the proteomic profile using mass
spectrometry and systems biology, and we also carried out the expression of
genes from these cells via RT-qPCR using the phenotypic markers M1 and M2.
The results of this study showed differences in the expression of the proteins
involved in the inflammatory process in both lineages and that macrophages
were preferentially induced to a pro-inflammatory immune response (M1) by the
overexpression of IL-1β in mice susceptible to this parasite. These data suggest
the SAG2A antigen induces macrophages to be phenotypically and classically
activated in the two lineages of mice in the acute phase of the disease.
INTRODUCTION
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that causes the
toxoplasmosis disease, affecting a large number of people from different
geographical regions around the world. Definitive hosts are felids such as
16
domestic cats that house the sexual form of this protozoan in their intestinal
tract, which becomes a worsening factor for pregnant and immunosuppressed
individuals [1, 2].
The protozoan’s cell surface is covered by SAG antigens from the SRS
family anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI), also including antigens
from the SAG2 family, among which there is the SAG2A surface antigen [3, 4].
This protein is involved in the modulation of the immune response and in the
attenuation of parasite virulence. Despite also being involved in parasite
protection to survive in the environment [3], it shows great potential to activate
the humoral response [5] and has been used in the characterization of the acute
phase of infection, as well as in the serological diagnosis of toxoplasmosis [5,
6].
The modulation of the cellular immune response by T. gondii varies
according to the immune status of the host, thus affecting the infection course
that occurs similarly in humans and animal models [7]. BALB/c and C57BL/6
mice infected with the parasite present distinct inflammatory responses. In the
beginning of the infection, T. gondii stimulates macrophages and dendritic cells
to release different proinflammatory cytokines such as IL-1β, IL-2, IFN-γ, TNF-
α, and IL-12 that act together to increase the phagocytic activity of these cells,
leading to the host’s strong and protective defense and showing an immune
response to Th1 [8, 9, 10, 7]. Thus, resistant lineages (BALB/c) survive the
infection in contrast to susceptible strains (C57BL/6), which present early
mortality [11].
Macrophages provide many necessary functions to protect the host
during infections with T. gondii. When classically activated (M1), they show a
high ability to present antigens and induce the production of nitric oxide (NO),
considered the main effector molecule in what concerns cytotoxicity [12]. On the
other hand, alternatively activated macrophages (M2) are frequently produced
by Th2 cells and show high levels of arginase (Arg-1), in addition to the
synthesis of proline and polyamines capable of stimulating cell growth and
tissue repair [13, 14]. Despite SAG2A of T. gondii being involved in innate and
adaptive responses [15], it is unclear if SAG2A polarizes the macrophage
phenotype in lineages susceptible and resistant to T. gondii. To clarify this
17
polarization is important to intervene in the immune response directed to the
protection against toxoplasmosis.
Proteomics and gene expression studies with the T. gondii parasite can
contribute to the understanding of mechanisms of the immune system in hosts
[15]. Proteomics has been widely used to analyze the profile of protein
accumulation in cells, keeping reliability under certain conditions [16]. This
technique can be used to compare variations in protein accumulation in cells
and tissues, helping to elucidate cytotoxicity effects or target-drugs [16, 17]. In
the present study, we analyzed gene expression in mice macrophages BALB/c
and C57BL/6 submitted to treatment with SAG2A of T. gondii to verify the
phenotypic polarization. We also characterized the protein profile of
macrophages using the 2D-SDS/PAGE, followed by mass spectrometry,
resulting in the identification of proteins related to phenotypic responses. We
predicted an interaction network of comparative proteins among mice
genotypes, reinforcing the differential responses of such genotypes.
MATERIAL AND METHODS
Production of the recombinant SAG2A protein
Both expression and purification of the recombinant SAG2A protein
(rSAG2A) were held from the clone previously obtained [15]. Induced extracts of
Escherichia coli BL21 (DE3) and purification fractions of the rSAG2A protein
were observed in 12.5% of SDS-PAGE, and protein concentration was
determined by the Bradford method [18].
Preparation of mice peritoneal macrophages
Female mice of BALB/c and C57BL/6 with six weeks of age were
obtained from the Central Vivarium of the Federal University of Minas Gerais
(UFMG), Belo Horizonte, Brazil, and maintained according to the institutional
guide to animal ethics approved by the Animal Ethics Committee of the State
University of Santa Cruz, under Protocol 04/2011. Peritoneal macrophages
were harvested 4 days after intraperitoneal (i.p.) injection of 2.0 mL of 3%
thioglycollate medium to 8 week-old BALB/c and C57BL/6 mice. The cells were
18
plated in RPMI 1640 medium (SIGMA) supplemented with 10% Fetal Bovine
Serum (FBS) (GIBCO) and 50 mg.mL-1 gentamicin (GIBCO). Concentrations of
1 x 105, 5 x 106 and 1 x 107 cells/well were used in MTT assays, RT-qPCR and
protein extraction, respectively. The cells were incubated for 24 h at 37°C in an
atmosphere of 5% CO2.
Cell viability assay
Cell viability upon treatment with the rSAG2A protein was verified by the
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay [19].
Peritoneal macrophages from BALB/c and C57BL/6 mouse strains were treated
with rSAG2A protein at concentrations 1.25, 5 and 10 µg.mL-1 in an incubator at
37°C with 5% CO2 for 24 h. After that, 20 µL of MTT solution was added (50
mg.mL-1) to the cells and incubated for more than 4 h under the same
conditions. The absorbance was measured at 570 nm after adding 150 µL
dimethylsulfoxide (DMSO); the results have been expressed as the percentage
of viable cells in relation to the control group.
Extraction of proteins
Peritoneal cells (1 x 107) of mice from BALB/c and C57BL/6 lineages
were previously incubated with rSAG2A for 24 h, lysed with extraction buffer
containing 25 mM of Tris-HCl, pH 8.8 (SIGMA), 4% of CHAPS 3-[(3-
cholamidopropyl) dimethylammonio]1-propanesulfonate (GE Healthcare) and
1% of Triton-X-100. Samples were kept at 4°C for 1 h, then centrifuged at 5,000
xg for 10 min at 4°C, and the supernatant was transferred to a new tube
containing 2 mg/mL-1 of dithiothreitol (DTT; Thermo Scientific) in acetone for
precipitation at -20°C for 16 h and centrifuged at 16,000 xg at 4°C for 10 min.
Precipitates were washed 4 times with the same DTT solution in acetone, put
again in a rehydration buffer (7M of urea, 2% of CHAPS and 2M of thiourea)
and kept the at -80°C until use. Proteins were quantified using the 2-D Quant Kit
(GE Healthcare), according to the manufacturer’s instructions, using BSA as the
pattern.
19
Two-dimensional gel electrophoresis
A mass of 250 µg of total protein was divided according to the isoelectric
point using the Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare) system in strips of 13 cm and
pH 3-10 NL (non-linear) (GE Healthcare), containing the rehydration solution
(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, ampholytes at 1% for pH of 3-10 NL (GE
Healthcare), and 0.5% DTT), according to the following parameters: 12 h of
rehydration at 20°C, 500 Vh for 1 h, 1000 Vh for 1 h and 4 min, 8000 Vh for 2.5
h, and 8000 Vh for 40 min. After the isoelectric focusing, strips were maintained
with an equilibrium solution (2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30%
glycerol (v/v), 0.002% blue bromophenol, and 1% DTT) and 250 mM
iodoacetamide (GE Healthcare) for 15 min. Then, strips were applied in a
12.5% polyacrylamide gel (1 mm x 13 cm x 19 cm) and sealed with a 1%
agarose solution (25 mM Tris-base, 0.1% SDS, 192 mM of glycine, 0.5%
agarose, 0.002% blue bromophenol). Proteins were divided according to the
following parameters: 15 mA for 15 min, 40 mA for 30 min, and 50 mA for 3 h,
11°C. After this, gels were kept in a fixative solution (40% ethanol,10% acetic
acid) for 60 min and stained with Coomassie Blue G-250 0.08% (p:v) [20] for 7
days under mild agitation. After this, gels were bleached with deionized water
and kept at 7% acetic acid for further analyses.
Acquisition and analysis of images
Images of the gels were obtained with 300 dpi using the Image Scanner
III (GE Healthcare) and analyzed using the Image MasterTM 2D Platinum 7.0
(GE Healthcare). The spots were detected by the program according to the
relative volume. The volume percentage of each spot was determined by
comparing the volume of the spot with the total volume of the gel. Differentially
expressed protein spots were determined by the ANOVA quantitative analysis
of volume percentage in spots of cells treated and untreated with the rSAG2A
during three times. Spots with the fold change value greater than or equal to 1.5
were considered with significant differences if p<0.05.
20
Treatments of spots and extraction of peptides
The spots of differentially expressed proteins were manually excised
from gels and maintained in microtubes (Axygen®) for digestion by following
Shevchenko et al [21]. The solution containing peptide mixtures was divided by
reversed-phase chromatography (LC/MS/MS) using the nanoAcquity UPLC
(Waters, Mildford, MA) coupled with the Q-TOF mass spectrometer (Waters)
[22]. The raw data from MS/MS were processed by the ProteinLynx software
version 2.3 (Waters).
Identification of proteins by MS
The MS/MS data containing peptides generated for each spot were
analyzed with the Mascot program (http://www.matrixscience.com), against the
(non-redundant) NCBInr database and the taxonomy of the Mus musculus
(house mouse), according to parameters such as enzyme (trypsin); fixed
alterations (carbamidomethylation - C); variable alterations (oxidation - M);
peptide mass error tolerance (± 0.3 Da); ion fragments (0.1 Da); peptides loads
(+1, +2, +3); Ions with score equal to or greater than 37 were considered
significant (p<0.05) according to Mascot. To determine the name and the
function of this protein we used the Blast2GO 3.0.7 (Oracle Corporation).
Construction and analysis of protein-protein interaction networks based
on proteomics data
Informations on protein-protein interactions (PPIs) regarding the profiles
of mice lineages BALB/c and C57BL/6 were obtained in the search for proteins
in Mus musculus. Thus, we searched for interactions with around 36 protein
sequences in BALB/c and 25 in C57BL/6 using the online tool STRING 10
(http://www.string-db.org), according to the following parameters: high
confidence score (0.400 and 0.700), no more than 50 interactions, with selected
prediction methods, except for textmining, neighborhood, and gene fusion.
Interaction networks obtained in String10 were overlapped and combined,
which generated a consensus network with no redundancy by using the
platform R (https://www.R-project.org), the R-Studio, and the IGRAPH data
library to detect the modules or clusters of functional proteins. Biological
21
processes associated with clusters generated in R were analyzed using the
platform Cytoscape 3.2.1 plugin BiNGO (Biological Network Gene Ontology)
version 1.4 with hypergeometric distribution and multiple tests associated with
the FDR algorithm of significance level p<0.05.
Real-time qPCR
Peritoneal cells of mice BALB/c and C57BL/6 at a concentration of 5 x
106 treated with rSAG2A were collected in a RA1 solution from the Illustra
RNAspin Mini (GE HealthCare, UK) kit for the extraction of RNA, according to
the manufacturer’s manual. The total RNA was extracted from macrophages
and the concentration of the samples was determined using the NanoDrop 2000
(Thermo Scientific) spectrophotometer after the treatment with DNAse I from
the kit and integrity was verified by electrophoresis in 1% agarose gel. The
cDNA was synthesized from 1 µg RNA using the First Strand cDNA Synthesis
Kit (Thermo Scientific, USA), according to the manufacturer. Amplifications
were made with the Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo
Scientific, USA) in Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies). Gene
expression markers for macrophages M1: IRF5, iNOS, IL-1β and for M2: IRF4,
Arginase1, Ym1 was normalized with the expression of the endogenous gene
18S (Table 1). The reaction containing 300 ƞg of cDNA and final volume of 22
µL was composed of initial denaturation step at 95°C for 10 minutes and 40
cycles of denaturation at 95°C for 5 secondes, annealing at 60°C for 30
secondes, extension at 75°C for 30 secondes. Then, reaction products were
separated to check the formation of unique and specific products for each
reported target. All qPCR reactions were carried out in four experiments,
including the controls. The relative expression of genes was determined using
the method 2-ΔΔCt [23].
Statistical analyses
Data were presented with mean ± SD of three experiments and analyzed
using the software GraphPad Prism 5.0. One-way ANOVA and Student’s t-test
were used to compare the differences between the samples of expression data.
Differences were considered to be statistically significant at value p<0.05.
22
RESULTS
1. Production of recombinant SAG2A protein production and analysis of
cytotoxicity
We obtained the recombinant SAG2A protein purified from a previously
cloned clone in E. coli [15] in the form of a single band in SDS-PAGE 12.5%
and stained with Coomassie Brilliante Blue (Figure 1A).
Mice’s phagocytic cells determined the effect of different concentrations
of this protein in cell viability and none of the tested doses caused cytotoxic
effects to the cells after the period of 12 h when compared to the control (Figure
1B). From this, we determined the protein concentration as 10 µg.mL-1 to
evaluate the level of cytokine expression and analyze the proteomics profile in
mice’s peritoneal cells.
2. Proteome of mice’s peritoneal macrophages in response to rSAG2A
protein
To evaluate the proteome modulation in peritoneal cells of mice BALB/c
and C57BL/6 with the SAG2A antigen of Toxoplasma gondii, the comparative
protein profile was analyzed by 2D-SDS/PAGE (Figure 2). We observed the
protein profile of both lineages under control conditions and treated with 10
µg/mL-1 of rSAG2A in a range between 14-97 kDa and pI 3-10 NL (non-linear).
We detected a total of 314 spots in extracts of BALB/c, 54 of those being
exclusively detected in cells treated with rSAG2A, 190 in control cells, and 70
being common among the treatments. Among the common ones, there was
greater and lesser abundance in treated cells (p<0.05). We identified a total of
36 spots, including those with exclusive detection and those with significant
differential accumulation.
In C57BL/6, we detected 178 spots, 3 of them being exclusive of treated
cells, 126 of control cells and, 49 common among the treatments. We identified
31 of these, which showed to be significantly abundant, also presenting
differences in cell expression (Figure S1, supplemental data).
23
3. Identification and analysis of differentially expressed proteins by
peritoneal cells exposed to rSAG2A
We excised the spots from the 2D-SDS/PAGE that presented control
conditions and differential accumulation after adding the rSAG2A protein to
mice’s peritoneal cells, being subjected to trypsin digestion and identified via
mass spectrometry (Tables 2 and 3).
In mice from the BALB/c lineage, we identified 36 proteins (Table 2).
Among the ones identified in the cell gel treated with rSAG2A, nine proteins
were exclusive such as calreticulin, heat shock 71, interleukin-25, and ataxin-7-
like-protein (spots 86, 94, 97 and 100, respectively).
Among these, we identified the two proteins that presented increased
expression as fetuin-A and alpha skeletal muscle (spots 0 and 34) and a total of
eight proteins had low accumulation; serotransferrin, for example, had
significative reduction in cell expression with fold change 4.2E-6. The other 18
identified were exclusive of control and were down-accumulated.
We identified and listed a total of 31 proteins of the lineage C57BL/6 in
Table 3. In this lineage, 29% were common among the treatments, four being
excessively accumulated, particularly the ones such as peroxiredoxin-1 (spot 3),
endoplasmin (spot 17), kallikrein-1 (spot 46), and serotransferrin (spot 22) with
fold change 3.73, contrasting with BALB/c that presented reduced expression.
Among control exclusive proteins, we identified the pyruvate kinase in 3 spots
(52, 118, and 119) and the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in 2
spots (80, 82), as well as 4 types of annexin (spots 78, 85, 153, and 154). Some
proteins have been identified in more than one spot, suggesting the presence of
several isoforms or post-translational modifications that may occur [24].
Proteins were classified according to the Blast2GO database (Figure 3A
and B). Most of the identified BALB/c proteins have been classified in groups
involving cellular and metabolic processes (spots 17, 19, 34, 40, 139, 143, for
example), immune systems (spots 40, 86, 97, 79, 211), biological regulations
(spots 11, 15, 19, 97, 144), and signaling (spots 1, 7, 19, 79, 82, 96, 133)
(Figure 3A). In C57BL/6, proteins also had their functions grouped according to
the Blast2GO and performed the same functions seen in BALB/c, only differing
regarding the amount of proteins found in each functional group. Stimulus-
response processes, signaling, and metabolic processes maintained the same
24
numbers in both lineages, while concerning biological regulations, immune
systems, organization of cellular components, cellular processes, and
developments presented differences (Figure 3B).
4. Analysis of protein-protein interaction in peritoneal macrophages
exposed to rSAG2A
From the proteins that showed differential accumulation in response to
the recombinant SAG2A antigen, we built protein-protein interaction networks in
proteomic profiles of the two studied lineages of mice (Figure 4). The exclusive
network of BALB/c resulted in 1,725 nodes and 49,037 connectors, while the
C57BL/6 generated 2,756 nodes and 72,283 connectors. We calculated the
density (number of nodes in relation to connectors) of both networks, which
resulted in 3.3% for BALB/c and 2% for the C57BL/6 network. Despite the
C57BL/6 network being more numerous regarding nodes and connectors, the
BALB/c network showed greater connectivity, revealing greater density value
and the existence of some specific clusters in this lineage. The consensus
network with no redundancy generated between lineages showed 3,337
(proteins) and 94,787 connectors. The overlapping of networks obtained from
each lineage was divided into functional clusters of the 10 most populous ones
(greater number of nodes) and significant ones; of these, 9 clusters were
estimated, showing highly connected regions and proteins in the interatomic
network of both lineages.
5. Protein-protein interactions in BALB/c and C57BL/6
Proteins with differences in numbers presented 9 connected clusters of
Mus musculus proteins, of which 7 contained proteins identified by MS/MS in
the two lineages (Figure 4). Among the 9 clusters formed by overlapping
networks, 5 of them showed proteins in BALB/c and C57BL/6, including the
ones common in all lineages: regulation of biological processes, biogenesis of
ribosomes, signaling routes, receptor coupled with protein G, mRNA
processing, and transport of protons; 2 presented BALB/c and common proteins
(biogenesis of ribosomes and cell signaling); 1 containing C57BL/6 and
common proteins (cell contraction) and 1 containing proteins exclusive to
BALB/c (regulation of immunological processes). Three clusters, including the
25
proteins identified via MS/MS, showed to be associated with the inflammatory
process (G-protein coupled with the receptor, transport of H+ and,
immunological processes). A total of six proteins identified as involved in the
process of receptors coupled with G proteins such as fetuin A, kallikrein-1, and
aldose reductase. Meanwhile, we noted three identified proteins (among them,
serotransferrin, V-type H+ ATPase) are associated with protons transport (H+)
and the specific protein exclusive to BALB/c (immunoglobulin kappa) associated
with the regulation of the immune process.
6. Modulation of M1 and M2 gene expression in peritoneal cells of BALB/c
and C57BL/6 mice exposed to SAG2A
We measured the MRNA expression of M1 and M2 profile genes in
adherent cells treated with the rSAG2A antigen of Toxoplasma gondii using
qPCR. As shown in Figure 5, the expression levels of the IRF5 transcription
factor associated with M1 macrophages increased significantly in cells of both
lineages exposed to the antigen SAG2A when compared to the control (with
non-exposed cells). However, C57BL/6 mice’s adherent cells featured four
times more accumulation of this gene’s transcripts while BALB/c treated with
the antigen accumulated two times more transcripts. For factors concerning
macrophages M2, we observed a negative regulation for the expression of the
Ym-1 gene and the absence of IRF4 modulation for cells of both strains
exposed to rSAG2A.
The expression of the iNOS transcript, specific for macrophages M1,
increased 4 and 8 times in BALB/c and C57BL/6, respectively. While the gene
Arginase-1, specific enzyme of the M2 profile, increased 4 times in cells of
BALB/c and 6 times in C57BL/6 cells. The ratio between iNOS/Arg-1 in cells of
BALB/c is equal to 1, showing an equivalence in the expression of these genes
as the ratio iNOS/Arg-1 for C57BL/6 mice’s cells is equal to 1.3.
Surprisingly, the accumulation of mRNA for IL-1β pro-inflammatory
cytokine showed to be different in adherent cells of BALB/c and C57BL/6
exposed to SAG2A. In susceptible mouse’s cells, the transcripts of the cytokine
gene increased the accumulation in 54 times. Together, our results suggest the
SAG2A preferably induces a pro-inflammatory response in both lineages of
mice, despite being greater in C57BL/6 mice compared to BALB/c.
26
DISCUSSION
Surface proteins SAG2 of T. gondii are important during the process of
parasite invasion in host cells [25]. Among them we have the SAG2A protein
with 22 kDa present in the surface of T. gondii tachyzoites [26], being a
potential marker in the diagnosis of the acute phase of toxoplasmosis in
humans [5, 6], as well as in the detection of antibodies induced by T. gondii in
natural and experimental infections [15].
Several studies have been conducted on infection models with
Toxoplasma gondii by comparing the immune response in mice from resistant
and susceptible lineages. Such studies suggest that the inappropriately
regulated inflammatory response increases parasite’ susceptibility [27, 28, 29].
Our study is the first report using SAG2A of T. gondii in the treatment of
peritoneal macrophages by comparing the role of this antigen in the innate
immune response of mice BALB/c and C57BL/6 susceptible to toxoplasmosis.
In this investigation, we comparatively assess the effect of the antigen SAG2A
on protein expression using peritoneal macrophages of both lineages, which
resulted in the total identification of 67 proteins. The proteomic analysis
revealed many proteins involved in pro-inflammatory and anti-inflammatory
responses with different levels of abundance between the lineages BALB/c and
C57BL/6, respectively.
In BALB/c mice, there was a excessive accumulation of proteins type
fetuin-A (spot 10), a glycoprotein also known as negative acute-phase protein
that had function revealed in the anti-inflammatory process [30]. High levels of
fetuin led to the reduction of IL-1β when we stimulated macrophages with
lipopolysaccharides (LPS), showing the production of IL-1β is depends on the
concentration of fetuin in the medium [31, 32]. Interestingly, we put together this
protein with the kallikrein-1 serine protease, excessively accumulated in
macrophages from C57BL/6 in the cluster network associated with receptors
coupled with G proteins involved in the modulation of the inflammatory
response in mice and that kallikrein proteases was able to render the active
form of IL-1β [33, 34, 35]. Proteins calreticulin and interleukin-25 were also
excessively accumulated in macrophages of BALB/c treated with rSAG2A.
Present in lumun of the endoplasmic reticulum (ER), calreticulin is a chaperonin
27
involved in the intracellular storage of calcium and in extracellular functions and
also in the immunomodulatory activity, activating dendritic cells and
macrophages [36]. In addition, calreticulin with surface made of apoptotic and
tumor cells works as a sign that says “eat me” during phagocytosis and there is
a strong synergy between the decrease of calcium in the endoplasmic reticulum
with the innate immune response [37]. While the accumulation of interleukin-25,
a cytokine identified as a member of the family IL-17 and nominated as IL-17E,
is associated with anti-inflammatory functions that mitigate inflammations
mediated by IL-17 and this cytokine is also involved in controlling the immunity
of chronic diseases associated with the gastrointestinal tract [38, 39, 40]. Initial
studies have shown the effect of IL-25 by inducing the expression of pro-
inflammatory cytokines. However, in vivo additional studies indicated the
importance of this cytokine in the regulation of the immune response type-2
[39].
Other proteins involved in inflammatory and cellular processes including
HSP71 (spot 94) [41, 42] and tRNA methyltransferase (spot 81) [43, 44] have
also been accumulated in BALB/c macrophages exposed to rSAG2A. However,
proteome data of excessive accumulation of proteins such as fetuin,
calreticulina, and interleukin 25, known to be involved in the negative regulation
of macrophages pro-inflammatory response, which allows us to suggest the
SAG2A does not seem to change the phenotypic profile of alternatively
activated macrophages of mice from BALB/c genetic background.
Proteins such as endoplasmin and peroxiredoxin-1 increased after
treating macrophages from C57BL/6 with rSAG2A. Endoplasmin is a chaperone
ofToll-like (TLRs) receptors also called gp96 that induces a strong pro-
inflammatory immune response because of the release of cytokines such as IL-
1 and IL-6 by dendritic cells and activated macrophages [45, 46]. Whereas
peroxiredoxin participates in the process of cell homeostasis in T. gondii. It is
known that the cellular redox mechanism is involved in diseases caused by
parasites like Toxoplasma, Trypanosoma, Plasmodium, and Leishmania [47].
The T. gondii has a variety of secreted proteins that modulate the host’s cellular
response and, surprisingly, we have been seen that peroxiredoxin alternatively
activates macrophages in Schistosoma mansoni and Fasciola hepatica,
inducing the excessive accumulation arginase-1, Ym1, and FIZZ, while in
28
Plasmodium berghei there is the release of pro-inflammatory cytokines in
peritoneal macrophages, such as the tumor necrosis factor (TNF-α) [48 , 49,
50]. Despite the role of peroxiredoxin in cellular homeostasis, it is not clear how
the activation of macrophage hosts of T. gondii works if classically activated (as
in P. berghei) or alternatively activated (as the Prx in helminths). The excessive
accumulation of peroxiredoxin after adding rSAG2A of Toxoplasma looks similar
to that observed in Plasmodium since both are intracellular parasites, differing
from what occurs in the extracellular parasites Schistosoma and Fasciola.
The serotransferrin-1 protein shared between the two lineages of mice
had its accumulation pattern modified after treating peritoneal macrophages
with rSAG2A, showing low accumulation in BALB/c and excessive accumulation
in C57BL/6 (included in cluster H+ transport). Transferrins are iron-binding
proteins with between 75-80 kDa, being widely distributed among the phyla [51].
Iron deficiency influences the host’s metabolism response to infections caused
by pathogens [52], resulting in defects in gene products involved in major
histocompatibility complex class I (MHC I) that interact with transferrin
receptors. One of the main development mechanisms of parasites such as the
T. gondii during infection is the acquisition of iron from transferrin-type proteins
[53] that is also synthesized by macrophages, being at inflammation sites during
the initial inflammatory responses [54]. By regulating innate immunity, we
reported that transferrin acts as an acute-phase protein during the invasion by
pathogens and in cases of defense against infectious agents and tissue injuries,
leading to strong pro-inflammatory responses by macrophages of different hosts
[55, 54]. In addition, we classified this protein in the cluster involved with proton
transport in interaction networks, and proton channels affect cellular functions
by regulating different aspects of defence [56].
Differently from BALB/c mice’s proteome macrophages, proteins
excessively accumulated by C57BL/6 macrophages treated with rSAG2A,
endoplasmin, peroxiredoxin, kallikrein, and serotransferin are mainly associated
with a pro-inflammatory response very common of the phenotypic profile of
classically activated macrophages with the genetic background of this lineage of
mice.
Macrophages are mediators of several functions of innate and adaptative
immunities, also acting in replication control of protozoa such as T. gondii
29
during an infection [57]. Its functional profile features a classic or alternative
profile, modulating the host’s immunity or prolonging the parasite’s survival [58].
Classic pro-inflammatory macrophages (M1) are crucial in the defense against
intracellular pathogens, while the alternative ones (M2) are mediators of
homeostasis and tissue repair [59, 60], being important in the resolution of
harmful inflammations, but it is still unclear if these activations occur in an
exclusive way or if they can co-exist within the same cell [61, 62]. In rats, T.
gondii induces macrophages polarization to classic and alternative phenotypes,
depending on the host’s genotype [63].
In our study, the analysis of the phenotypic profile of peritoneal
macrophages by the quantification of gene expression M1 and M2 was relevant
to complement the data obtained in proteomics. The phenotypic polarization
pattern of BALB/c and C57BL/6 mice’s macrophages treated with rSAG24
shows the positive regulation of the levels of gene expression of the following
transcription factors: IRF5 and INOS (markers M1), Arginase-1 (marker M2),
non-alterated levels of IRF4 (marker M2), low accumulation of Ym1 transcripts
(marker M2), and low accumulation of Ym1 transcripts (marker M2) for
macrophages of both mice. Interferon regulatory factors (IFRs) are involved in
the transcription regulation of immune system genes, and it was recently
reported that IRF4 deficient macrophages induced high levels of pro-
inflammatory cytokines, such as IL-β1, suggesting the low levels of IRF4
induced a strong polarization M1 [64]. The increases in Ym1 and arginase-1
feature a response to stimuli for Th2 cytokines, as seen by Welch et al. (2002)
[65], when high levels of these markers induced to a Th2 response in mice
macrophages challenged with allergenic proteins. On the other hand, Zhang et
al. (2013) [66] reported that BALB/c macrophages treated with some strains of
T. gondii presented low expression of Ym1, reinforcing our results.
The SAG2A positively regulates two key-proteins and the competitive
use of the L-arginine substrate in macrophages of both mice: iNOS and
Arginase-1 presented the highest level of transcripts of these enzymes in
C57BL/6 macrophages compared to BALB/c. However, the balance between
the iNOS and Arg-1 expression kept stable in BALB/c macrophages and
C57BL/6 macrophages, not changing the phenotypic polarization M1 of these
cells. Surprisingly, the rSAG2A led to high expression levels of the pro-
30
inflammatory cytokine IL-β1 by C57BL/6 macrophages, which reinforced the M1
profile, and to a tendency of reducing the gene expression levels of this
cytokine in BALB/c mice.
CONCLUSION
The analysis of proteome and macrophages’ gene expression are two
useful tools to understand the mechanisms that explain the differences between
resistance and susceptibility in infection models such as BALB/c and C57BL/6.
Our data suggest the SAG2A may preferably induce to a phenotype of
classically activated macrophages in both lineages of mice in the acute phase
of infection with T. gondii. But it exacerbates a pro-inflammatory response
regarding M1 macrophages in C57BL/6 mice compared to BALB/c ones, which
can contribute to the susceptibility of this lineage of mice to the parasite.
Because of excessive inflammatory responses bing associated with serious
damages in the host’s tissue, responses regarding the IL-1β may explain why
SAG2A fails as an imunoprotector of animals susceptible to T. gondii infection.
However, it turns into an important subject for studying the immunopathology of
toxoplasmosis.
Supporting Information
S1 Fig. Venn diagram for proteins identified in peritoneal macrophages from
BALB/c and C57BL/6 mice via mass spectrometry.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: JLS, JALS, CPP. Performed the
experiments: JALS, JLS, TARS. Analyzed the data: JALS, JLS, CPP, TM,
JPCJ. Contributed reagents/material/analysis tools: CPP, JLS, EMA, TM. Wrote
the paper: JALS, JLS, CPP.
31
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37
Table 1: Sequence of primers used in real-time PCR reactions (qRT-PCR)
Primer Sequência (5' - 3') Forward/Reverse
IRF5 TAGAGGCTACCCAGGAGCAA/ GCCCACTCCAGAACACCTTA
iNOS CAGCTGGGCTGTACAAACCTT/ CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG
IL-1β GCACACCCACCCTGCA/ ACCGCTTTTCCATCTTCTTCTT
IRF4 GCCCAACAAGCTAGAAAG/ TCTCTGAGGGTCTGGAAACT
Arginase1 AAAGCTGGTCTGCTGGAAAA/ ACAGACCGTGGGTTCTTCAC
Ym1 GGGCATACCTTTATCCTGAG/ CCACTGAAGTCATCCATGTC
18S TTCGTATTGCGCCGCTAGA/ CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT
38
Table 2. Identification of proteins from BALB/c mice after treatment with rSAG2A
Spot IDa
Protein name Accession nºb Mr Theor/Expc
pI Theor/Expd
Mascot Scoree Expression levelf C/T
Fold changeg (P<0.05) C/T
0 Alpha-2-hs-glycoprotein (fetuin-A) gi|27806751 39/62 5.26/4.02 470 1.44
1 Iq motif and sec7 domain-containing protein 1 isoform x2
gi|74192167 24/29 9.07/4.44 42 0.29
5 Cytoplasmic 2
gi|49868 39/38 5.78/5.31 452 0.47
7 Proteinase-activated receptor 1
gi|132230 8/42 4.47/8.59 50 0.28
11 Prdm9
gi|114325431 26/38 5.58/5.24 45 0.61
16 Integrator complex subunit 12
gi|159163280 10/53 7.75/6.94 44 0.87
17 Immunoglobulin kappa- partial
gi|196866 11/54 5.24/8.36 44 0.29
19 Glutamate receptor kainate 1 isoform x1
gi|568997301 92/62 9.12/8.95 42 0.42
34 Alpha skeletal muscle
gi|49864 38/65 5.45/5.84 41 1.24
40 Serotransferrin isoform x1 gi|602117 79/76 6.75/7.39 223 4.2E-06
79 Cytoplasmic 1
gi|74213524 42/34 5.30/5.56 664 ∞
81 Trna (guanine -n2)-methyltransferase homolog isoform x1
gi|568965709 30/44 7.70/6.21 37 ∞
82 Glial fibrillary acidic protein gi|51066 48/44 5.29/6.11 63 ∞
39
84 Protein disulfide-isomerase a6
gi|60502437 49/47 5.05/4.89 354 ∞
85 Atp h+ mitochondrial f1 beta polypeptide
gi|23272966 56/48 5.24/3.85 139 ∞
86 Calreticulin
gi|6680836 48/48 4.33/3.75 74 ∞
94 Heat shock cognate 71 kda protein
gi|309319 71/66 5.37/5.2 115 ∞
97 Interleukin-25
gi|17266280 18/66 7.70/4.53 37 ∞
100 Ataxin-7-like protein 2 isoform x1
gi|568924172 78/69 9.44/8.31 38 ∞
133 5-hydroxytryptamine receptor 1f
gi|6680321 42/27 9.14/4.49 76 ∞
139 Protein mto1 mitochondrial isoform x1
gi|171460946 74/29 9.09/8.13 43 ∞
143 Small ubiquitin-related modifier 2
gi|148680845 10/30 5.32/7.76 38 ∞
144 Upstream stimulatory factor 1 isoform x2
gi|568910659 27/30 5.89/8.89 38 ∞
145 Pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase domain-containing protein 2
gi|26332547 12/30 9.91/8.52 40 ∞
150 Collagen alpha-1 chain isoform x1
gi|12805485 12/31 5.92/8.05 56 ∞
158 Ribosome-binding protein 1 isoform x4
gi|568918954 97/36 5.55/7.79 58 ∞
163 E3 ubiquitin-protein ligase kcmf1 gi|126517505 42/42 5.48/8.02 61 ∞
164 Cdna sequence bc034902
gi|22028193 10/42 9.70/7.78 37 ∞
40
169 Mitochondrial inner membrane protein isoform x6
gi|74180557 27/44 9.33/7.06 46 ∞
170 Ah receptor-interacting protein
gi|148701061 27/45 9.33/8.11 46 ∞
178 Leucine-rich repeat-containing protein 45
gi|568973559 51/48 6.04/6.64 39 ∞
181 Protein spaca7-like
gi|21313198 19/49 9.07/8.69 36 ∞
182 Glutamate receptor kainate 1 isoform x2
gi|3287850 95/50 8.94/8.19 44 ∞
199 Melanoregulin
gi|568906629 22/54 6.44/8.23 43 ∞
200 Nicotinamide n-methyltransferase
gi|12839438 15/54 5.59/8.09 45 ∞
211 26s proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 isoform x1
gi|8918330 28/57 5.60/6.33 41 ∞
aSpot ID corresponding to the position in the 2D gel according to Figure 2A and B. bProtein accession number conforming NCBI database (http://www.ncbi.org) cTheorical and experimental masses of identified proteins (kDa). dTheorical and experimental pIs of identified proteins. eMascot score of the homology annotated in NCBI non-redundant (NCBInr). fExpression levels, presented as the % normalised volume, in the macrophages control (C) and macrophages with rSAG2A (T). Vertical bars corresponding to mean ± SE. gFold change (macrophages incubed-rSAG2A normalised volume/macrophages control normalised volume): bold: increased protein abundance; italic: decreased abundance; ∞: present in one treatment.
41
Table 3. Identification of proteins from C57BL/6 mice after treatment with rSAG2A
Spot IDa
Protein name Accession nºb Mr Theor/ Expc
pI Theor/ Expd
Mascot Scoree
Expression levelf C/T
Fold changeg (P<0.05) C/T
3 Peroxiredoxin-1
gi|6754976 22/31 8.26/6.59 303 1.99
6 Annexin v
gi|6753060 35/38 4.83/5.97 567 0.46
9 Macrophage-capping protein
gi|110227377 39/52 6.47/5.95 169 0.71
10 Actin-related protein 3
gi|12835802 47/60 5.54/6.25 43 0.04
17 Endoplasmin
gi|6755863 92/54 4.74/3.89 539 2.41
22 Serotransferrin
gi|2501351 79/71 6.75/7.47 121 3.73
46 Kallikrein 1-related peptidase b24
gi|8393675 29/45 8.47/4.9 39 1.72
47 Cytoplasmic 1
gi|809561 41/45 5.56/5.0 102 0.24
49 Cytoplasmic partial
gi|49868 39/72 5.78/9.9 1279 1.46E-6
52 Pyruvate kinase pkm isoform M2
gi|31981562 58/78 7.18/7.75 536 ∞
66 Arginase-1
gi|7106255 34/24 6.51/8.39 129 ∞
67 Peroxiredoxin-1
gi|6754976 22/27 8.26/8.0 303 ∞
69 Lectin galactoside-binding soluble 3 protein gi|126679 27/29 8.46/4.39 68 ∞
42
70 14-3-3 protein zeta delta
gi|1841387 27/30 4.72/7.82 224 ∞
73 v-type proton ATPase subunit e 1
gi|1184663 26/30 9.28/5.85 134 ∞
78 Annexin a4
gi|1778313 36/33 5.43/8.33 469 ∞
79 Lactate dehydrogenase b
gi|223115 36/34 7.25/8.47 86 ∞
80 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
gi|6679937 36/34 8.44/8.79 119 ∞
82 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
gi|55153885 36/34 7.59/7.93 49 ∞
83 Aldose reductase
gi|3046247 36/34 6.71/7.68 207 ∞
85 Annexin a1
gi|198845 38/35 6.56/7.97 147 ∞
90 Alcohol dehydrogenase NADP+
gi|10946870 36/38 6.9/8.7 71 ∞
91 Fructose-bisphosphate aldolase a isoform x2
gi|6671539 39/40 8.31/5.54 192 ∞
99 Synaptic vesicle membrane protein vat-1 homolog
gi|33859662 43/50 5.95/8.0 85 ∞
105 Elongation factor 1-alpha 1
gi|148694454 38/54 9.13/4.82 236 ∞
110 Cytosolic non-specific dipeptidase
gi|12697592 53/56 5.43/5.5 164 ∞
118 Pyruvate kinase pkm isoform x1
gi|31981562 58/59 7.18/8.19 439 ∞
119 Pyruvate kinase pkm isoform x1
gi|31981562 58/59 7.18/8.0 173 ∞
43
145 Heat shock protein hsp 90-beta
gi|40556608 83/92 4.97/5.16 233 ∞
153 Annexin a3
gi|2437840 36/33 5.33/8.18 73 ∞
154 Annexin a2
gi|6996913 38/45 7.55/6.14 335 ∞
aSpot ID corresponding to the position in the 2D gel according to Figure 3A and B. bProtein accession number conforming NCBI database (http://www.ncbi.org) cTheorical and experimental masses of identified proteins (kDa). dTheorical and experimental pIs of identified proteins. eMascot score of the homology annotated in NCBI non-redundant (NCBInr). fExpression levels, presented as the % normalised volume, in the macrophages control (C) and macrophages with rSAG2A (T). Vertical bars corresponding to mean ± SE. gFold change (macrophages incubed-rSAG2A normalised volume/macrophages control normalised volume): bold: increased protein abundance; italic: decreased abundance; ∞: present in one treatment.
44
FIGURES
Figure 1: Bacterial expression of the recombinant SAG2A protein and MTT
assay. (A) SDS-PAGE (12.5%) analysis of bacterial expression and purification
of the protein representing the (1) total extract of pET28A vector, (2) total
extract of SAG2A, (3) soluble fraction of pET28A vector, (4) soluble fraction of
SAG2A, (5) insoluble fraction of pET28A vector, (6) insoluble fraction of
SAG2A, and purified SAG2A. (B) Cell viability of mice’s peritoneal macrophages
interacting with different concentrations of SAG2A using the MTT assay.
45
Figure 2: Analysis of 2-DE of BALB/c mice’s peritoneal macrophages
under controlled conditions (A) and treated with rSAG2A (B) and C57BL/6
under controlled conditions (C) and treated with rSAG2A (D). Spots
indicated with arrows were the differentially expressed ones, while the marked
in red are the ones exclusive of each lineage.
46
Figure 3: Functional classification of proteins of mice’s peritoneal cells
with different accumulation in response to rSAG2A. In A, functional
classification of proteins that presented significant different levels in BALB/c. In
B, proteins that presented significant differences concerning abundance in
C57BL/6.
47
Figure 4: Protein-protein interaction network of differently expressed
genes in BALB/c and C57BL/6 mice. Network overview with protein
representations in more connected clusters. Two clusters correspond to
proteins involved in ribosome biogenesis; one cluster corresponds to the
biological process regulation; one is associated with receptors coupled to G
proteins; one includes proteins in mRNA processing; one cluster with cellular
signaling proteins; one cluster involving proton transport proteins; one cluster
corresponds to cell contraction proteins and one cluster includes proteins that
regulate the immunological process .
48
Figure 5. Analysis of accumulation of specific genes M1 and M2
transcripts in peritoneal macrophages treated with rSAG2A. The
accumulation of cytokines transcripts were evaluated in the presence of the
protein for 6 h by real time-qPCR and used the 18S endogenous as a reaction
normalizer. We determined the relati e quantification of genes by comparing
RNA samples of treated macrophages with control samples. Data with mean ±
standard error of independent experiments (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001,
treated cells vs controls or between treatments, n=4).
49
SUPPLEMENTAL FIGURE
S1 Fig. Venn diagram for proteins identified in peritoneal macrophages
from BALB/c and C57BL/6 mice in mass spectrometry. In A: Proteins
identified in the control cells of BALB/c (190), cells treated with rSAG2A (54)
and common (70). In B: Proteins identified in C57BL/6 controll (126), cells
treated with rSAG2A (3) and common (49).
50
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CAPÍTULO 2
Clonagem e expressão heteróloga de antígenos visando à indução de
imunidade contra Toxoplasma gondii.
51
RESUMO
A toxoplasmose é uma doença sistêmica infecciosa causada por um
protozoário intracelular, Toxoplasma gondii, que invade vários tecidos do
organismo humano e de várias espécies animais. Os gatos albergam o
protozoário no trato intestinal. Os roedores, suínos, bovinos, ovinos, caprinos e
outros mamíferos são hospedeiros intermediários do T. gondii. A toxoplasmose
é um importante problema para as criações de animais, causando prejuízos
agroeconômicos, como abortos e infertilidade. O desenvolvimento de sintomas
depende da condição imunológica do infectado e o tratamento não garante a
completa eliminação do parasito. Sendo assim, em parceria com
pesquisadores da Universidade Federal de Uberlândia, sequências referentes
aos antígenos de T. gondii foram obtidos e plantas transgênicas foram
utilizadas para a expressão de antígenos, visando à produção de vacina oral
futuramente. Com essa proposta, objetivou-se clonar e produzir antígenos
plantas transgênicas. Para tanto, os antígenos Sag2a e Sag2b do parasito
foram isolados e clonados nos vetores para expressão pBI426 (transformação
via biobalística) e pCAMBIA1390 (Agrobacterium tumefaciens). Então,
epicótilos e cotilédones de plantas de Lactuca sativa L. (alface) foram usados
como explantes para transformação genética via A. tumefaciens, seguindo
protocolos já estabelecidos. Na continuidade destas pesquisas, a confirmação
da inserção dos antígenos nas plantas será confirmada via PCR para
posteriores ensaios de imunização de cobaias com o material vegetal
transgênico. A produção de anticorpos no soro dos animais imunizados será
avaliada por ELISA. A proliferação de esplenócitos e a produção de citocinas
serão analisadas. A execução destas análises permitirá estabelecer condições
para a produção de vacina contra o T. gondii em plantas transgênicas e a
introdução em rações para promover proteção contra a toxoplasmose.
Palavras-chave: toxoplasmose, antígenos de T. gondii, SAG2, vacina oral.
52
ABSTRACT
Toxoplasmosis is a systemic infectious disease caused by an intracellular
protozoan Toxoplasma gondii invades various tissues of the human body and
various animal species. Cats harboring the parasite in the gastrointestinal tract.
Rodents, pigs, cattle, sheep, goats and other mammals are intermediate hosts
of T. gondii. Toxoplasmosis is an important problematic for the creations of
animals, causing damage agroeconomic as abortions and infertility. The
development of symptoms depends on the immune status of the infected and
the treatment does not completely eliminate the parasite. Thus, in partnership
with researchers from the Federal University of Uberlândia, sequences related
to T. gondii antigens were obtained and transgenic plants were used for the
expression of antigens, aiming at the production of oral vaccine in the future.
With this proposal aimed to cloning and producing antigens in transgenic plants.
To this, Sag2a and parasite Sag2b antigens were isolated and cloned in vectors
for expression pBI426 (biolistic transformation) and pCAMBIA1390
(Agrobacterium tumefaciens). Then, hypocotyl and cotyledon plants Lactuca
sativa (lettuce) were used as explants for genetic transformation by A.
tumefaciens, following established protocols. The continuity of research,
confirming the insertion of antigens in plants will be confirmed via PCR for
further mice immunization trials with transgenic plant material. The production of
antibodies in the serum of immunized animals will be evaluated by ELISA. The
splenocyte proliferation and cytokine production will be analyzed. Performing
these analyzes allowed to establish conditions for the production of vaccine
against T. gondii in transgenic plants and the introduction of feed to provide
protection against toxoplasmosis.
Keywords: toxoplasmosis, T. gondii antigens, SAG2, oral vaccine.
53
1. INTRODUÇÃO
Os parasitos intracelulares obrigatórios como Toxoplasma gondii são
causadores de infecções graves que afetam milhões de indivíduos a cada ano
(RODRIGUES et al., 2003). T. gondii é o agente causador da toxoplasmose,
uma doença considerada cosmopolita que atinge entre 10 a 80% da população
mundial (COSTA, 2008). Tendo em vista a problemática causada pela
toxoplasmose e apesar do padrão de transmissão e da mortalidade causada
por este parasito, uma vacina contra a infecção ainda não está disponível.
Nesse sentido, estratégias de controle e combate a esta doença são de grande
necessidade.
As plantas como alface, tomate, batata e cenoura são consideradas
atraentes para a produção de vacinas e têm sido consideradas excelentes
biorreatores para a produção de proteínas de interesse humano, por meio de
transgenia (ZHANG et al., 2010). Trata-se de um sistema de baixo custo que
pode resultar na produção de grande massa de material de interesse em
pequenas áreas de cultivos (MA et al., 2005). Além disso, esse sistema
envolve uma maquinaria de modificação e processamento de proteínas que é
conservada em diferentes espécies eucarióticas, podendo produzir proteínas
funcionais a partir de genes de diferentes origens (DANIELL et al., 2001).
Alface (Lactuca sativa L.) é uma planta comestível da família
Asteraceae, cultivada mundialmente, de ciclo curto, podendo ser colhida com
grande rendimento e qualidade em poucos meses após o plantio (CURTIS,
2006; KANAMOTO et al., 2006). Além disso, é adequada para produção de
vacina oral, pois seus explantes (tecidos) são altamente responsivos a
diversos meios na cultura de tecidos, e pode ser cultivada em ambientes
54
fechados padronizados, sob condições rigorosamente controladas (CURTIS,
2006; MATSUI et al., 2011).
Portanto, considerando o potencial das plantas como biorreatoras, a
escolha de espécies vegetais como ponto de partida para o desenvolvimento
de uma metodologia que venha a dar suporte para um futuro
desenvolvimento de vacina contra toxoplasmose, em planta transgênica,
pode assegurar o estabelecimento de novas estratégias de controle da
doença.
Este trabalho visou a clonagem e expressão de antígenos de
Toxoplasma gondii em plantas, candidatos à imunização oral. Os cassetes de
expressão foram inseridos em plantas de alface e a transformação genética
possibilitou a obtenção de brotos confirmados por PCR. As plantas de alface
transgênicas futuramente serão avaliadas quanto ao nível de expressão dos
genes inseridos por qPCR e servirão como material para ensaios em cobaias
em forma de ração (vacina comestível), a fim de verificar a indução de
imunização dos antígenos citados.
55
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Clonagens de antígenos em vetores de expressão em plantas
As sequências dos antígenos foram obtidas a partir do banco de
dados de Toxoplasma gondii (NCBI) e isoladas via PCR (Polymerase Chain
Reaction). Oligonucleotídeos específicos (primers) das sequências referentes
aos antígenos Sag2a e Sag2b foram confeccionados (Tabela 1) e as
temperaturas de anelamento dos primers determinadas utilizando o DNA
genômico de T. gondii (cepa RH) como molde. As sequências amplificadas
foram inseridas no vetor intermediário pGEM-T Easy Vector (Promega, EUA)
para facilitar posteriores clonagens nos vetores de expressão.
As clonagens dos antígenos em vetores de expressão pBI426 e
pCAMBIA1390 foram realizadas de acordo com as técnicas estabelecidas por
Sambrook et al (1989) (Figura 1). Para a inserção de Sag2a e Sag2b no vetor
pBI426, foi realizada a amplificação destas sequências via PCR. Os produtos
da amplificação foram purificados com o Kit Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification (GE Healthcare) e inseridos nos sítios de clivagem XbaI e
BamHI do vetor, resultando nos clones pBI426:Sag2a e pBI426:Sag2b (estes
poderão ser utilizados futuramente para transformação de plantas via
bombardeamento).
Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos utilizados nas clonagens
Primer Sequência (5' - 3') Amplicon
SAG2A F:GTTCTAGAAACTGAGTTGTGATTGTGCACA R:GAGTCCCCACGTGAAACAAC
800 pb
SAG2B F:CCCGGGTCTAGAACAACTAACATTTTATTCTCTGC R:GAGGACCCTTGAAAACGCTACGTGATCCCTAGG
500 pb
56
Em seguida, os cassetes de expressão gerados foram retirados
juntamente com a região promotora duplicada CAMV35S do vetor pBI426 e
inseridos nos sítios de clivagem HindIII e BamHI do vetor pCAMBIA1390,
originando os clones 35S:Sag2a e 35S:Sag2b, para a realização da
transformação de plantas via Agrobacterium tumefaciens. Então,
transformações de E. coli (estirpe TOP10) e A. tumefaciens (LBA4404) foram
realizadas, seguidas da confirmação via PCR, para as etapas de
transformação genética de plantas.
Figura 1 – Esquema ilustrativo dos vetores pBI426 e pCAMBIA1390, utilizados para a inserção dos antígenos Sag2a e Sag2b de T. gondii.
57
2.2. Preparo e transformação de células competentes de Agrobacterium
tumefaciens (LBA4404)
Para o preparo das células eletrocompetentes LBA4404, uma colônia foi
inoculada em meio YEP com rifampicina 50 mg.L-1 e incubada por 48 horas à
28°C. Uma colônia isolada obtida foi inoculada em meio YEP com rifampicina e
incubada a 28°C, 220 rpm durante 48 horas. A colônia foi transferida para
250mL de meio YEP com rifampicina e a cultura foi mantida a 28°C, 220 rpm
até que atingisse absorbância a 600 ηm (A600ηm) entre 0,5 e 1,0. A cultura foi
então centrifugada a 5000 x g, durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
descartado e o pellet bacteriano ressuspenso em H2O pura autoclavada, sendo
centrifugado e lavado por 3 vezes e o pellet foi então ressuspenso em 2 mL de
glicerol 10% estéril e gelado, sendo em seguida dividido em alíquotas de 20 μL
em microtubos, congelados em N2 líquido e armazenados a -80°C.
A transformação das células foi realizada por eletroporação e para isso,
alíquotas 20 μL de células competentes foram transferidas para cubeta de
eletroporação (Gene Pulser 0,2 cm) contendo DNA plasmidial de 35S:Sag2a e
35S:Sag2b previamente extraído. Um pulso elétrico de aproximadamente 2,5
kV foi realizado nas células em aparelho BioRad® (modelo MicroPulserTM).
Então, as colônias obtidas após a seleção em meio de cultura foram
submetidas à confirmação por PCR.
2.3. Transformação genética de Lactuca sativa L. (alface)
Sementes de Lactuca sativa L. foram desinfestadas em solução de
hipoclorito 0,5% por 15 minutos e em seguida, lavadas três vezes em água
destilada estéril. As sementes foram mantidas em meio contendo sais de MS
(Murashige & Skoog, 1962) na sala de crescimento do laboratório, sob
fotoperíodo 16 horas e temperatura de 27±2 °C. Após duas semanas, os
cotilédones foram usados como fonte de explantes para a transformação
genética, seguindo protocolo de Lovato et al. (1998).
Para tanto, os cotilédones foram excisados do nó cotiledonar das
plântulas e foram incubados, juntamente com fragmentos de epicótilos, por 15
minutos em solução de Agrobacterium LBA4404 contendo os insertos
35S:Sag2a e 35S:Sag2b, previamente crescida a 28°C sob agitação, contendo
antibiótico rifampicina (50 mg.L-1). Em seguida, os explantes foram mantidos
58
em meio de co-cultivo em placa de Petri acrescido dos reguladores de
crescimento ácido naftaleno acético (ANA) a 0,1 mg.L-1 e 6-benzilaminopurina
(BAP) a 0,5 mg.L-1 durante 5 dias no escuro. Após este período, os explantes
foram transferidos para novo meio de cultura contendo higromicina (10 mg.mL-
1) e cefotaxima (300 mg.mL-1) como antibióticos de seleção, além dos
reguladores citados, e mantidos sob fotoperíodo em sala de crescimento num
período de 15 a 25 dias, renovando o meio de cultura aos 15 dias.
Os brotos formados foram individualizados em meio de cultura MS
acrescido de reguladores de crescimento citados e mantidos nas mesmas
condições já citadas.
59
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Clonagem de antígenos para transformação genética de plantas
Os antígenos foram amplificados com primers específicos, sintetizados
para uso nas clonagens em vetores de expressão em plantas. O vetor pBI426
(DATLA et al., 1991) possui região promotora duplicada, sendo um vetor com
enhancer na expressão de genes, comumente usado para transformação
genética via biobalística, enquanto o pCAMBIA1390 é utilizado para
transformação de plantas via A. tumefaciens. A transformação genética de
plantas utilizando ferramentas como a transferência indireta de genes via
Agrobacterium ou direta através da biobalística é aplicada a mais de 120
espécies de plantas (AZEVEDO et al., 2013).
As sequências dos antígenos Sag2a e Sag2b tiveram suas
temperaturas de anelamento determnadas em 53°C via PCR, tendo como
molde o DNA genômico de T. gondii. O produto da amplificação dos
fragmentos gerados pode ser visualizado na Figura 2, confirmando os
tamanhos dos insertos.
60
Figura 2 – Amplificação das sequências referentes aos antígenos de T. gondii em temperaturas otimizadas. M1: 1 Kb Ladder (Fermentas); Amplificações a temperatura de 53ºC. Controle negativo: reação sem adição de DNA.
Os produtos obtidos após amplificação dos fragmentos dos antígenos
por PCR foram purificados e utilizados para a inserção no vetor intermediário
pGEM-T Easy, sendo em seguida propagados em E. coli (TOP 10), conforme
mostra a Figura 3, contendo amplificações das colônias resultantes. Clones
positivos foram utilizados para etapas seguintes de clonagens em vetores para
transformação genética de plantas.
Figura 3 – Clonagem de Sag2a (A) e Sagb (B) em pGEM-T Easy, propagado em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica de cada antígeno. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA. Em A, 1 a 8: colônias submetidas ao PCR diagnóstico; em B, 1 a 4: colônias submetidas ao PCR diagnóstico.
61
Após obtenção das sequências de antígenos no vetor pGEM-T Easy,
os fragmentos liberados por reação de digestão de Sag2a e Sag2b foram
purificados e inseridos no vetor pBI426 para expressão, que poderão ser
utilizadas futuramente em transformações de plantas via bombardeamento. As
colônias obtidas após transformação de E. coli foram diagnosticadas por PCR e
a confirmação das amplificações das colônias 1 referente ao Sag2a e 5
referente ao Sag2b podem ser visualizadas em gel de agarose 1% (Figura 4).
A fim de obter clones dos antígenos para transformação genética das
plantas via A. tumefaciens, Sag2a e Sag2b foram isolados do vetor pBI426 e
inseridos no vetor pCAMBIA1390, nomeados 35S:Sag2a e 35S:Sag2b, para
posteriores etapas de transformação das plantas. Estes clones foram inseridos
em células eletrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens via eletroporação
e as colônias foram submetidas a PCR para diagnóstico, utilizando primers
específicos para cada sequência, conforme Figura 5.
Figura 4 – Clonagem das sequências de antígenos Sag2a (A) e Sag2b (B) em pBI426, propagados em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica do antígeno, após clivagem deste do vetor pGEM-T Easy. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; 1: colônia submetida a PCR diagnóstico.
62
Figura 5 – Clonagem dos insertos 35S:Sag2a e 35S:Sag2b no pCAMBIA1390 e propagados em Agrobacterium tumefaciens (LBA4404): colônias submetidas a amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região do antígeno Sag2a. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; 1 a 6: colônias usadas para a reação.
3.2. Obtenção de plantas transformadas de Lactuca sativa L. (alface)
Para obter plantas de alface contendo antígenos Sa2a e Sag2b de T.
gondii, transformações genéticas via A. tumefaciens foram realizadas. Após 25
dias de contato com meio de cultura seletivo acrescido de antibióticos e
reguladores de crescimento adequados, os explantes (cotilédones e epicótilos)
emitiram brotos possivelmente transformados (Figura 6). Estes foram
individualizados em meios de cultura para futura extração de DNA genômico e
confirmação da transformação por meio da PCR com primers referentes aos
antígenos de T. gondii.
As plantas são importantes fontes de propriedades medicinais e
nutricionais para o homem e tornou-se uma útil estratégia de produção de
proteínas recombinantes, devido às características desejáveis como alta
capacidade de produção, estabelecida transferência de genes e custos
reduzidos (MA et al., 2005). Atualmente, uma variedade de plantas é utilizada
para a produção comercial de proteínas, seja para produzir anticorpos,
citocinas, fatores de crescimento, hormônios e vacinas, tornando esse sistema
de expressão capaz de produzir moléculas heterólogas de maneira bem-
sucedida (TWYMAN et al., 2005).
As proteínas SAG2A e SAG2B pertencem a superfamília SAG,
expressas especificamente em taquizoítos, responsáveis pela invasão do
parasito nas células hospedeiras (LEKUTIS et al., 2000).
63
Então, as plantas transgênicas produzidas neste trabalho poderão ser
utilizadas em ensaios de imunização em cobaias e a produção de anticorpos
no soro dos animais imunizados avaliada por ELISA. A produção de citocinas
também poderá ser analisada por meio de dosagens por ELISA e qPCR em
tempo real. Isto permitirá estabelecer condições para a produção de vacina
contra o T. gondii em plantas transgênicas e a introdução em rações para
promover proteção contra a toxoplasmose.
Figura 6 – Brotos de alface obtidos em meio de cultura seletivo: cotilédones e epicótilos de alface foram submetidos à infecção por A. tumefaciens e após 25 dias em meio de cultura seletivo, os brotos possivelmente transformados com as sequências referentes aos antígenos Sag2a (A) e Sag2b (B) foram emitidos.
64
4. CONCLUSÕES
- A proteína SAG2A induziu preferencialmente um fenótipo de macrófago
ativado classicamente em linhagens de camundongos na fase aguda da
infecção por T. gondii.
- SAG2A induziu uma forte resposta inflamatória em camundongos,
exacerbando a expressão de IL-1β, associada a danos teciduais em
hospedeiros.
- As plantas de Lactuca sativa L. foram produzidas contendo as sequências
referentes aos antígenos Sag2a e Sag2b de Toxoplasma gondii.
- Como perspectiva, as plantas produzidas servirão para avaliar o efeito
imunológico destes antígenos em hospedeiros susceptíveis ao T. gondii, por
meio da introdução do material vegetal em forma de rações.
65
5. REFERÊNCIAS
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71
APÊNDICE
Neste trabalho, os antígenos recombinantes de T. gondii também foram
produzidos em bactérias para futura introdução em rações, juntamente com as
plantas transgênicas. Para tanto, SAG1, SAG2A, SAG2B, SAG5C (taquizoítos)
e BSR4 (bradizoítos) foram clonados em vetores da série pET e alguns já
purificados.
O uso de bactérias como a E. coli para a expressão de proteínas é
bastante difundido devido ao conhecimento de seu genoma e ao fácil cultivo e
manipulação, sendo também uma estratégia economicamente viável (BANEYX,
1999). Importantes aplicações desta tecnologia englobam sua utilização em
imunização, estudos bioquímicos, análise tridimensional da proteína, uso
biotecnológico e terapêutico e atualmente, o uso de proteínas recombinantes é
rotina tanto na pesquina quanto na indústria farmacêutica (PAVLOU &
REICHERT, 2004). Além disso, os vetores da série pET são amplamente
utilizados na expressão heteróloga, pois a produção da proteína fusionada a
uma etiqueta de poli-histidina possibilita a purificação da proteína em um passo
único por cromatografia de afinidade (MAKRIDES, 1996; BANEYX, 1999).
As proteínas SAG2A e SAG2B pertencem a superfamília SAG,
expressas especificamente em taquizoítos, responsáveis pela invasão do
parasito nas células hospedeiras (LEKUTIS et al., 2000). Além disso, SAG2A
tem sido indicada como ferramenta de diagnóstico para caracterizar a fase
aguda da infecção por T. gondii (BÉLA et al., 2008) e foi proposto por Priest et
al. (2015) que ensaios com a SAG2A recombinante podem fornecer uma uma
ferramenta conveniente em estudos epidemiológicos da prevalência mundial da
infecção por T. gondii, permitindo assim uma melhor estimativa dos riscos
causados pela infecção em gestantes.
A proteína SAG5C apresenta estrutura semelhante às proteínas da
família SAG1 (p30), que pertence a um grupo comum de antígenos
compartilhados pelas fases de taquizoítos e bradizoítos, sendo encontrados em
diferentes regiões do parasito, principalmente na superfície celular e está
relacionado com a indução de uma resposta imunoprotetora (SPANO, et al.,
2002; BOOTHROYD et al., 1998). Essas características apresentadas pelas
proteínas de superfície têm implicações importantes para a epidemiologia da
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toxoplasmose humana e veterinária e podem ser importantes no entendimento
da evolução da virulência de T. gondii (ELSHEIKHA et al., 2008).
Os estudos relacionados com proteína BSR4 são importantes para
entender como os bradizoítos (forma altamente infecciosa do T. gondii) estão
envolvidos na regulação da imunidade do hospedeiro, no estabelecimento da
fase crônica e na transmissibilidade do parasito às células naïve do hospedeiro
(LEKUTIS et al., 2001).
Clonagem e expressão de proteínas em bactérias
A amplificação das sequências dos antígenos de Toxoplasma gondii
Sag1 e Sag5c via PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizada utilizando
oligonucleotídeos anteriormente desenhados, a inserção dos fragmentos foi
feita nos sítios de clivagem de NdeI e XhoI do vetor pET28a, utilizando a
proporção de 3:1 (inserto:vetor). O sistema de ligação foi propagado em células
competentes de E. coli (estirpes TOP10 e Rosetta DE3) por choque térmico e o
DNA plasmidial extraído foi estocado a -20°C.
Os clones selecionados foram cultivados em meio de cultura LB
contendo os antibióticos kanamicina (50 mg.L-1) e cloranfenicol (34 mg.L-1) por
16 horas à 37°C, sob agitação (200 rpm). Em seguida, as culturas foram
concentradas e o pellet usado como inóculo para o meio Circlegrow 4%, com
kanamicina e cloranfenicol, sendo mantido a 200 rpm a 37°C, até atingir
absorbância a 600 ηm (A600ηm) entre 0,7 e 1,0. Em seguida, foi adicionado
isopropil-tio-β-galactosídeo (IPTG 0,4 mM de concentração final) para indução
da expressão das proteínas de Toxoplasma gondii. As culturas foram mantidas
a 37°C, 200 rpm por quatro horas (para SAG1) e a 18°C por 16 horas (para
SAG5C). A expressão das proteínas SAG2A, SAG2B e BSR4, previamente
clonadas, também foi induzida em bactérias a 37ºC para posteriores ensaios.
Após a obtenção das frações dos extratos bacterianos, a purificação
proteica foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de His-trap FF
crude (GE HealthCare), de acordo com as recomendações do fabricante. Os
extratos bacterianos bem como as frações purificadas das proteínas foram
visualizadas em SDS-PAGE 12,5% e corados com azul de Coomassie (G-250).
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RESULTADOS ALCANÇADOS
Expressão e purificação de proteínas em bactéria
A expressão das proteínas SAG2A, SAG2B e BSR4 por sistema
heterológo ocorreu em células de E. coli Rosetta (DE3) e a purificação por meio
de cromatografia em coluna contendo níquel, HisTrap FF crude. Os extratos
celulares foram analisados através de SDS-PAGE a 12,5% confirmando a
expressão das proteínas. A Figura 1 apresenta as proteínas diferencialmente
expressas nas frações solúvel e insolúvel do extrato bacteriano, bem como as
frações purificadas destas proteínas. A presença das bandas induzidas e
purificadas mostra o tamanho esperado para cada proteína, sendo 22 kDa para
SAG2A, 19 kDa para SAG2B e aproximadamente 45 kDa para BSR4,
correspondendo às massas teóricas de cada proteína. Isto revelou sucesso na
técnica de expressão adotada.
Figura 1 – Expressão das proteínas SAG2A (A), SAG2B (B) e BSR4 (C) clonadas em vetor pET28a: Vinte microlitros de extrato total (ET), frações solúvel (FS) e insolúvel (FI), além das frações purificadas a partir da fração solúvel, de cada amostra, foram aplicados em SDS-PAGE 12,5%. M= Unstained Protein Marker (kDa) (Fermentas).
Semelhante a este trabalho, Chen et al. (2012) usaram a proteína
recombinante BSR4 induzida e expressa em células de E. coli (BL21) e a
fração purificada foi avaliada quanto às suas características imunológicas. A
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BSR4 recombinante apresentou imunoreatividade e imunogenicidade
específicas da fase crônica em pacientes infectados com T. gondii.
As Figuras 2 e 3 mostram o diagnóstico, por PCR com primers
específicos, da inserção dos fragmentos da ORF de SAG5C (Figura 2) e SAG1
(Figura 3), ambos contendo 1000 pb no vetor pET28a, sendo após propagados
em células competentes de E. coli, estirpe TOP10, e posteriormente,
transferida para Rosetta (DE3) seguindo a etapa de indução e expressão das
proteínas.
Figura 2 – PCR diagnóstico das colônias obtidas após tratamento de pET28a:SAG5C em células de E. coli. Em A: estirpe TOP10 e em B: estirpe Rosetta (DE3). M: 1 Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: Reação sem adição de DNA; 1 a 3 (A) e 1 a 7 (B): colônias selecionadas.
Figura 3 – PCR diagnóstico das colônias obtidas após transformação de pET28a:SAG1 em células de E. coli (Rosetta DE3). M: 1 Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: Reação sem adição de DNA; 1 a 9: colônias selecionadas.
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Após a etapa de clonagem no vetor pET28a, as colônias obtidas foram
submetidas à indução da expressão de SAG5C e SAG1 (Figura 4). Géis de
poliacrilamida contendo frações solúvel e insolúvel, bem como o extrato total da
indução, com tamanho esperado para cada proteína, sendo 40 e 35 kDa,
respectivamente, mostram que a expressão das proteínas foi bem sucedida
ocorrendo na fração insolúvel do extrato bacteriano.
Figura 4 – Expressão das proteínas SAG5C (A) e SAG1 (B) clonadas em vetor pET28a: Vinte microlitros de extrato total (ET), frações solúvel (FS) e insolúvel (FI) foram aplicados em SDS-PAGE 12,5%. M= marcador PWM GE (kDa); ET de pET28a vazio e colônias positivas; FS de pET28a vazio e colônias positivas; FI de pET28a vazio e colônias positivas. Seta indica tamanho da proteína expressa na fração insolúvel do extrato bacteriano.
Clonagem de antígenos para transformação genética de plantas
Além de Sag2a e Sag2b, as sequências dos antígenos Sag5c, Sag1 e
Bsr4 também tiveram suas temperaturas de anelamento estabelecidas, sendo
53°C para Sag5c, Sag1 e de 55°C para Bsr4. O produto da amplificação dos
fragmentos gerados pode ser visualizado na Figura 5, confirmando os
tamanhos dos insertos.
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Figura 5 – Amplificação das sequências referentes aos antígenos de T. gondii em temperaturas otimizadas. M1: 1 Kb Ladder (Fermentas); Amplificações a temperatura de 53ºC. Controle negativo: reação sem acréscimo de DNA.
Figura 6 – Clonagem dos antígenos Sag1 (A), Sag2a (B), Sagb (C) e Sag5c (D) em pGEM-T Easy, propagado em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica de cada antígeno. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; e colônias submetidas ao PCR diagnóstico.
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A conclusão da clonagem, posteriormente, desses antígenos nos
vetores de expressão em plantas, como o pCAMBIA1390, permitirão produzir
plantas transgênicas, para avaliar a indução de imunidade dos antígenos em
cobaias, em forma de rações (vacinas comestíveis).
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Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos utilizados nas clonagens para expressão em plantas
Primer Sequência (5' - 3') Amplicon
SAG1 F:CTGTGCTGTGCAGCTTTCCG R:TCTAGATCACGCGACACAAG
1000 pb
SAG2A F:GTTCTAGAAACTGAGTTGTGATTGTGCACA R:GAGTCCCCACGTGAAACAAC
800 pb
SAG2B F:CCCGGGTCTAGAACAACTAACATTTTATTCTCTGC R:GAGGACCCTTGAAAACGCTACGTGATCCCTAGG
500 pb
SAG5C F:GGTCTAGATGCCATTGTCTATCCGTCTTT R:GCCACGTATGACTTGAAACAAGATGCTACCTGATTGCCTAGG
1000 pb
BSR4 F:AGGTCTAGATCCTTAGACAGATCTTCTGCTTC R:AGTTACGGCGGATCCGCGCTAGAGGCT
1000 pb
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REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES
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