un estudi epigenètic: la influència de l'ambient a l'herència genètica
Post on 10-Mar-2016
222 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
TREBALL DE RECERCA
UN ESTUDI EPIGENÈTIC:
CARLA CASTIGNANI VILADOMIUDIRIGIT PER MONTSERRAT BOLÓS
2n DE BATXILLERAT 1
INSTITUT MONTSERRAT
6/11/13
LA INFLUÈNCIA DE L’AMBIENTA L’HERÈNCIA GENÈTICA
Voldria agraïr en primer lloc a la meva tutora l’entusiasme mostrat desde el primer moment
i pel seu acompanyament durant aquest treball de recerca. A la Dra. Novials per obrir-me
les portes dels laboratoris IDIBAPS. I molt especialment a la Dra. Parrizas pel seu afecte i
disponibilitat a l’hora d’ajudar-me i resoldre dubtes.
�
ÍNDEX GENERAL
�-INTRODUCCIÓ
2-OBJECTIUS
3-MARC TEÒRIC
3.1Introduccióalagenètica
3.2 Regulació gènica
3.2.� Regulació transcripcional
3.2.�.a Seqüència del DNA
3.2.1.bEstructuradelacromatina
3.2.1.b-1MetilaciódelDNA
3.2.1.b-2Modificacionsdeleshistones
3.2.2 Regulació post-transcripcional
3.2.2.a Micro RNA
4-QUÈ ÉS LA EPIGENÈTICA?
5-METODOLOGIA DEL TREBALL
5.� Extracció del teixit del ratolí
5.2 Obtenció de les mostres
5.3 Homogeneïtzació
5.4 Extracció del RNA
5.5 Valoració del RNA (pureses)
5.6 Valoració del RNA (integritat de la molècula)
5.7 Transcripció inversa (RT)
5.8 Reacció en cadena de la polimerasa (PCR a temps real)
6- RESULTATS
6.� Resultats valoració del RNA
6.�.� Puresa de la molècula
6.�.2 Integritat de la molècula
6.2 Valoració dels resultats de la PCR a temps real
7- CONCLUSIONS
8- BIBLIOGRAFIA
9- ÍNDEX D’IMATGES
pàg.2
pàg.3
pàg.4
pàg.4
pàg.6
pàg.6
pàg.7
pàg.8
pàg.8
pàg.�0
pàg.��
pàg.��
pàg.�2
pàg.�6
pàg.�6
pàg.�6
pàg.�7
pàg.�7
pàg.�9
pàg.�9
pàg.22
pàg.22
pàg.29
pàg.29
pàg.29
pàg.30
pàg.32
pàg.39
pàg.40
pàg.4�
2
1- INTRODUCCIÓ
Eltemad’aquesttreballs’haanatconsolidantapartir,d’unabanda,delmeuinterèsenelsestudis
genèticsi,del’altra,del’oportunitatqueemvadonarlamevatutoradecontactarambelcentrede
recercaIDIBAPS,onpodiaferuntreballpràctic.
LadirectoradelIDIBAPS,laDra.Novials,ensvaacollird’unamaneramoltgenerosaiensvasug-
gerirferuntreballenl’àmbitdelaepigenètica.Hepoguttreballarcomaestudiantenpràctiques
enl’IDIBAPSdesdefinalsd’abrilfinsamitjansdejuliol.L’IDIBAPSemvaassignarcomatutorala
Parrizas,doctoraenbiologia,quehatingutlapaciènciad’ajudar-meiassessorar-meentot.Haestat
JuntamentamblaDra.Parrizasquevàremacordarferuntreballques’ajustésalesmevespossibili-
tatsperòal’horafosinteressant.
Al’inicid’aquesttreball,jonodisposavadelsconeixementsnidelsrecursospertreballarlliurement.
Per tant, vaig començara cercar informació sobrequèés laepigenètica iquèestudia.Després,
ambl’ajutdelamevatutora,laDra.Parrizas,vaiganaraprenenttotalametodologiadeltreballen
genètica.Defet,aquesttreballésunapetitamostraaescalareduïdadelstipusd’investigacionsque
s’estan duent a terme actualment sobre l’ambient i els gens.
Finalment,isensepràcticamentadonar-me’n,m’haviaanatmarcantunsobjectiussecundarisque
esdevindrienessencialsal’horadeferaquesttreball,comconèixernovestècniquesdelaboratori
comlareaccióencadenadelapolimerasa(PCR),l’anàlisigenèticofinsitot,unaciènciamoltinno-
vadoracoméslaepigenètica,queésdedicaaestudiarl’efectedefactorsexternssobreelsnostres
gens.
Personalment,aquesttreballm’haestatútilperentendremillorelfuncionamentd’unlaboratori,
peròtambéperpoderaccediraunconeixementquenormalmentnohaguéspogutaccedir.Hepo-
gutaprendrecoms’efectuauntreballd’investigaciócientíficaactualment(fetqueemserviràsens
dubteenunfutur).Opinotambéqueaquesttreballm’hafetveurelaimportànciaqueestàadop-
tantlaepigenèticaisobretotfinsaquinpuntenspotajudaracombatremalaltiesoaprevenir-les.
3
2- OBJECTIUS
L’objectiugeneraldeltreballésdeterminarsil’expressiódecertsgensesveumodificadaperfactors
ambientals,enaquestcascontretperuncanvidedieta.
Eltreballconsisteixendeterminarsihihacanvienl’expressiógènicadecertsteixitsd’unsratolins
de3setmanes,alimentatsúnicamentamblletmaterna,ambunsde8setmanes,quehanestat
alimentatsambpinsoapartirdela3asetmana.
Aquesttreballs’emmarcadinsl’àmbitdelsestudisenepigenèticaquetéperobjectiugeneralelde
determinarsielsfactorsambientals–enelnostrecasladieta-modifiquenl’expressiódelsgens.
Unaltredelsobjectiusd’aquesttreballésconèixer,d’unabanda,elcampdelaepigenèticacomun
delsàmbitsd’investigacióbiomolecularactualimoltpunteri,del’altra,lametodologiaques’utilitza
enunlaboratorid’investigaciópertald’observarl’expressiód’ungen.
4
3- MARC TEÒRIC
3.� INTRODUCCIÓ A LA GENÈTICA
Entotselsorganismeselmaterialgenèticdetoteslessevescèl·lulesésidènticiestrobacontingut
enelnuclienformadeDNAcodificatenunaseqüènciadequatrenucleòtids(adenina,timina,ci-
tosinaiguanina)conegudacomàciddesoxiribonucleic(DNA).Aquestamolèculatéunaestructura
molt significativa:unadoble cadenahelicoïdal denucleòtidsen laqual cadaund’ells s’aparella
específicamentambunaltre(adeninaambtimina,citosinaambguanina).
Sónalgunesd’aquestesseqüènciesdelDNAlesqueconstitueixenelsgens(elgenomahumàestà
constituït per unes 3000megabasesde les quals nomésel 5% codifiquenunaproteïna, és a dir
s’expressenalacèl·lula),launitatfonamentaldel’herència.Percomplirlasevafunció,elsgenshan
desertranscrits,donantllocaunamolèculad’àcidribonucleic(RNA),unacadenasenzilladenu-
cleòtidstranscritaapartirdelDNA,peròambunacomposiciólleugeramentdiferent,jaqueconté
uracilenllocdetimina.Aquestprocésanomenattranscripcióesduatermeal’interiordelnuclide
lacèl·lula.
Cadagen,atravésdelRNA,seràtraduïtaunaproteïna.Aquestprocésanomenat“traducció”,dut
atermealsribosomes,s’efectuaseguintuncodisegonselqualcadacombinaciódetresnucleòtids
(un“codó”)corresponaunaminoàciddinsd’unacadenaproteica(ésadirunaproteïna).
Figura 1
Procés de l’expressió gènica (de DNA a proteïnes)
5
Perònototselsgenss’expressenalmateixtempsnientoteslescèl·lules.Defet,cadatipuscel·lular
eucariotaexpressanomésunafracciódelsgensqueté,alvoltantdel20%.Ésadir,nomésel20%
delsgensquecontél’ADNestranscriuaARNidesprésestradueixenproteïnes.
Aixídoncs,exceptuantelsgensconstitutius(gensques’expressenentoteslescèl·lulesdel’organisme
i codifiquen proteïnes que són essencials per al seu funcionament general) tots els altres gens
s’expressenonodepenentdelafunciódelacèl·lulaenunteixitparticular.Aquestfetéslògic,ja
queelcossempretendeixaeconomitzarinotindriacapsentitque,perexemple,unaneuronasin-
tetitzésunaproteïnaencarregadadeltransportdelaglucosa,jaquelaneuronanorealitzaaquesta
funció.
Pertant,lacomplexitatbiològicadepènmenysdelnombredegensquedelaformacomaquests
s’expressen.Enconseqüència,avuiendias’estàdestinantgransinvestigacionssobrecomestàre-
gulada l’expressió dels gens.
D’altrabanda,ésimportanttenirencomptequeenelshumans,elDNAmesuraaproximadament
uns dos metres de longitud (uns 3.200.000.000 parells de bases nitrogenades) però es troba encap-
sulat dins un nucli que consta d’uns pocs micròmetres de diàmetre. És per això que el DNA reque-
reixunempaquetamentocompactacióimportantiqueesduatermegràciesaunesproteïnes,les
histones,constituentaixílacromatina.
Existeixendiferentsnivellsd’empaquetament,diferenciant-seen:
1-Primernivelld’empaquetament:Fibradecromatina.
Lafibradecromatinaocollaretdeperlesestàformadapelsanomenatsnucleosomes,que
sónvuithistonesenrotlladesenunfragmentdeDNA.
2-Segonnivelld’empaquetament:Solenoide.
Esformaperl’enrotllamentsobresimateixadelafibracondensadadecromatina.Aixòpro-
vocal’escurçamentdecincvegadesaproximadamentlalongituddelcollaretdeperles.
3-Tercernivelld’empaquetament:Dominisestructuralsenformadebucle.
Lafibradesolenoideformaunasèriedebuclesquequedenestabilitzatsperdeterminades
proteïnes.
4-Nivellssuperiorsd’empaquetaments:
Aquestésl’últimnivelld’empaquetamentinosempreespresenta,depènsobretotdelmo-
mentenqueestrobalacèl·lula(enlametafasesobretot).Estariaconstituïtbàsicamentpels
cromosomes,ésadirperl’empaquetamenttotaldelDNA.Uncromosomatétantsols5,5um
delongitudiconté4cmdefibradeDNA.Pertant,elDNAocupaunalongitud7000vegades
inferior.
6
Primer nivell d’empaquetament
Segon nivell d’empaquetament
Tercer nivell d’empaquetament
Cromosoma
Figura 2
3.2- REGULACIÓ GÈNICA
Enaquesttreball,enscentraremen lescèl·luleseucariotes, tenintencompteque l’estudi l’hem
efectuatsobreunsratolins.Aixídoncs,elsmecanismesderegulaciógènicadelescèl·luleseuca-
riotessónmoltméscomplexesquelesprocariotesielspodemclassificarentresnivells.Elprimer
consisteixen la seqüènciadenucleòtidsde lamolèculadeDNAen si. El segonnivell depènde
l’estructuradelacromatinailaregulacióepigenètica(aquestnivellrespondriapertoteslesproteï-
nesqueenvoltenelDNAilainfluenciad’aquestessobrelamateixacadena).Finalment,eltercer
nivelleltrobemenlaregulaciópost-transcripcional,ésadirqueestrobadurantelprocésdeRNA
a proteïnes.
3.2.� REGULACIÓ TRANSCRIPCIONAL
Comjaheexplicatabans,latranscripcióéselprocéspelquals’obtéunamolèculadeRNAapartir
d’unadeDNA.Aquestprocésésmolt important, jaqueéselprocésquedeterminaràon iquan
s’expressaungen.Defet,lamajoriadegensdelescèl·luleseucariotesestanmajoritàriamentregu-
lats a nivell transcripcional.
7
3.2.�.a SEQUÈNCIA DEL DNA
Ésbàsicentendreque,elgenésunaseqüènciamoltpetita,comparadaambl’enormitatdelDNA.
Aixídoncs,existeixenseqüènciesqueaprimeravistaenspodensemblarintranscendents,jaque
nocodifiquencapproteïna,però resultenbàsiquesper l’expressiódelgenenqüestió.Aquestes
seqüències són les encarregades del control de la transcripció del gen.
Els promotors:
Unpromotoresdefineixcomaunaseqüènciadenucleòtids(generalmentd’unsquantscentenars)
que serveixen de punt de reconeixement per a la unió de la RNA polimerasa (enzim encarregat de
sintetitzarRNAapartirdelDNA,ésadir,d’efectuarlatranscripcióensi).Elspromotorsrepresenten
laregiónecessàriaperiniciarlatranscripció,ésadirensserveixencomasenyald’inici,iestanloca-
litzadesaunadistànciafixaimmediatamentadjacentsalsgensqueregulen.
Els intensificadors
Amésdelesregionspromotores,latranscripcióestàreguladaperseqüènciesdeDNAaddicionals
anomenades intensificadors.Aquestes regions interaccionenambproteïnes reguladores ipoden
incrementarl’eficiènciadelainiciaciódelatranscripcióopodenactivarelpromotor.Sónsenyals
d’activacióadistànciaqueespodentrobarenqualsevolllocdelaseqüènciadeDNA(potestarlo-
calitzatabans,desprésodinsdelgenqueregula),ésadiractuendeformaindependentalaseva
orientació o distància a la que es trobin.
Elsintensificadorsesconsiderenl’elementreguladormésabundant,representantpràcticamentun
10%delgenomahumà.
Lesseqüènciespromotoressónessencialsperalatranscripció,mentrequeelsintensificadorsno
hosón.Elsintensificadorspodenestimularelsnivellsdetranscripcióacertadistància,mentreque
això no passa amb els promotors.
Els silenciadors
Els silenciadors són seqüències de DNA que disminueixen la taxa de transcripció d’un gen quan son
reconeguts per una proteïna de transcripció.
8
2.�.2.b ESTRUCTURA DE LA CROMATINA
L’empaquetamentrealitzatperleshistones,prèviamentexplicatalprincipidel’apartat,ésl’encarregat
deregularl’estructuradelDNAil’accésdefactorsdetranscripcióalacadenadelDNA.Conseqüent-
ment,ungenestranscriuràdepenentjanodelasevaseqüènciasinódelnivelld’empaquetament
enqueestrobi.Laepigenèticaés,doncs,laciènciaqueestudial’estructuraexternadelDNAiles
seves mutacions.
Mecanismesepigenètics:
ElsmecanismesepigenèticsinclouenlametilaciódelDNA,lesmodificacionsdeleshistonesilare-
gulaciópost-traduccionalexercidapelsRNAsnocodificants(microRNA).Aquestsmecanismessón
els encarregats de controlar l’epigenoma i l’expressió dels gens.
3.2.�.b.� Metilació del DNA
LametilaciódelDNAésundelsmecanismesepigenèticsmésestudiats.Téunpaperfonamentalen
l’activacióoinactivaciódecertsgens.
Figura 3
Grup metil
Ungrupquímicanomenatmetil(CH3)s’uneixalesbasesnitrogenadesdelaCitosinaolaGuanina
(unidesentresi)id’algunamaneraimpedeixlaexpressiód’aquellgencompactant-lomoltifent-lo
difícilmentaccessiblepelsfactorsdetranscripció.
9
Figura 4
Diferències en la compactació del DNA segons grup metil o grup acetil.
D’altrabanda,elgrupacetil(-CO-CH3)actuaunint-sealeshistonesperòamblafunciócontraria
queelgrupmetil,deslligarelDNA,fer-lomésllegiblepelsfactorsdetranscripcióiconseqüentment
permetrel’expressiódelgenenqüestió.
Perexemple,s’hacomprovatqueungenanomenatGFPsintetitzaunaproteïnaquedónafluores-
cènciaauntipusdemeduses.Aixídoncs,imaginantqueaquestacèl·lulapertanyaquestamedusa,
nosaltrespodemcontrolarlafluorescènciadelacèl·lulafentelgenfàcilmentaccessibleoinacces-
sible.
Grupacetil
Figura 5 Gen activat - Grup acetil – La cèl·lula emet fluorescència
Grupmetil
Figura 6 Gen desactivat – Grup metilè – La cèl·lula no emet fluorescència
�0
3.2.1.b.2 Modificacions de les histones
RecordemqueleshistonessónlesproteïnesquevanunidesalDNAiqueenregulenlasevaestruc-
tura.Aquestess’uneixende8en8formantelsanomenatsnucleosomes.D’aquestamanera,leshis-
tonestambéinflueixenenlacompactaciódelacromatina.Defet,aleshistonesselipodenadherir
diferentsgrupsquímicsoproteïnes,quecanviïnlaestructurad’aquesta.
AnteriormenthemexplicatlametilaciódeDNA,ésadirlauniódegrupsmetilalacadenadeDNA.
Tanmateix,aquestsgrupsmetiloelsgrupsacetiltambéespodenenganxaraleshistonesambla
mateixafunciódecompactacióodeoberturadelDNA.
Unexempledemodificaciódeleshistonesésl’adherènciad’unaminoàcidanomenatlisinaambcà-
rregapositivaquecompactal’estructuradelDNAlaqualcàrreganegativa.Recordemquecàrregues
oposades s’atrauen.
LA EPIGENÈTICA ÉS REVERSIBLE?
Actualment es dona molta importància a la reversibilitat
delaepigenètica,jaquepotserclauenlacurademalal-
tiesambunfortcomponentepigenètic,comelcàncer.
S’haobservatals laboratorisqueenuncerttipusde ra-
tolins que tenen el gen que expressa el color del cabell
(agoutí) fortament regulat per la metilació del DNA, si
l’alimentavenambnutrientsricsengrupsmetil,estorna-
vendecolormarró,peròquesidespréselshiaplicaven
unadietaricaambgrupsacetil,tornavenalseucolorori-
ginal,colorcru.
D’aquestamaneraisabentqueelcàncerésunaduplicació
cel·lulardescontrolada, s’handetectat gensque regulen
laduplicaciócel·lularisis’investiguéscompodemregular
aquests gens es podria evitar l’expressió de gens malignes
o tumorals.
��
3.2.2 REGULACIÓ POST-TRANSCRIPCIONAL
3.2.� Micro RNA o RNA no codificant
UnmicroRNAésunRNAmonocatenarid’uns20o25nucleòtids,ésadirmoltpetitcomparatamb
lalongituddelDNAodelRNAmateix,queregulal’expressiógènicaanivellpost-transcripcional.Els
microRNAsónuntipusdeRNAno-codificant,quenocodifiquencapproteïnaitenenunmecanisme
moltsenzill:s’uneixenaunRNAsi-codificant,inhibint-loievitantques’expressi.
Figura 7
Funcionament dels microRNA
�2
4- QUÈ ÉS LA EPIGENÈTICA?
Laepigenèticaéslaciènciaqueestudiacoml’ambientilahistòriadel’individuafectenal’expressió
delsgens.S’atribueixlacreaciódeltermeaConradWaddingtonl’any1942comqueladefineixcom
“labrancadelabiologiaqueestudialesinteraccionscausalsentreelsgensielsseusproductes,que
donenllocalfenotip”.Tanmateix,novaserfinsapartirdel1990queesvacomençaracomprendre
quelaseqüènciadenucleòtidsdelDNAnohoeratotivancomençaraaparèixerinvestigacionsamb
l’objectiudeentendreiconèixermillorl’estructuradelDNA.Apartirdellavors,s’hanefectuatmol-
tesinvestigacionssobrelaregulaciódel’expressiógènicaidecoml’ambientpotmodificar-la.
Finsitot,avuidia,encaranoexisteixunacorduniversalsobrefinsaquinpuntlesinfluènciesgenèti-
ques i ambientals estan relacionades i com ens veiem modelats per aquestes.
EXEMPLES D’EPIGENÈTICA
Comjas’haditabans,actualments’estanduentatermemoltes investigacions idegranvarietat
relacionadesamblaepigenètica.Unexemplemoltgràficsobrelaepigenèticaestrobaenl’estudi
debessonsunivitel·lins,elsqualstenenelmateixcodigenètic.Malgratquedepetitspuguinsem-
blar-nosidènticsiavegadesenssiguidifícildistingir-los,quanarribenalaterceraedatsovinthan
adoptatunfísicdiferento,finsitot,malaltiesdiferents.Aixòésdegutalfetqueelsbessonsnohan
viscuttota lavida junts,hantingutestilsdevidadiferents.Perexemple,unpotserhacomençat
afumardesdemoltjoveihatingutunavidasedentària,encanvi,l’altreharealitzatexercicifísic
constantaixícomunadietaequilibrada,elmésprobableésqueenarribarals80anys,tinguinun
aspectecompletamentdiferent.
Lasegüentil·lustracióensmostraelscromosomesd’unsbessonsdetresanysambunsde50anys.
Alaprimerail·lustració,apareixengranstaquesdecolorgroc,quesónlessenyalsepigenètiques
queteneniguals.Mentrequealasegonaimatge,apareixentaquesverdesivermelles,significant
lessenyalsepigenètiquesdiferents.D’aquestamanera,observemque,encaraquecontinuïntenint
lamateixainformaciógenètica,havariatcompletamentlasevaexpressiódelsgens,ésadir,lain-
formacióepigenètica.
�3
Figura 8
Cromosomes de bessons de diferents edats
Investigacionsdutesatermeactualmentensdemostrenquehihaunasèriedetretsocaracterísti-
quesdelserhumàenlesqualslainfluènciadel’ambientésmésomenysdecisiva.Lasegüenttaula
ensposademanifestunasèriedemalaltieso tretsendiferentstipusdebessons, lescolumnes
blanquescorresponentsabessonsunivitel·linsilesgrisesclaretabessonsdiferentsgenèticament.
Aqueststretshanestatordenatsdemajorinfluenciagènica(perexemplel’alturaol’habilitatdelle-
gir)finsalamenorinfluenciagènica,pertantmajorinfluenciaepigenètica(comperexemplel’ictus
ol’artritisreumatoide).
Taula 9 Diferents influencies ambientals de diferents trets del ser humà
�4
Per il·lustraraixò, siobservem l’esquizofrèniaenbessons,podemdirque lamalaltiaenbessons
univitel·linsapareixentotsdosgermansenun60%delscasos,mentrequenomesenun10o15%
delsbessonsnounivitel·linsdesenvolupenlamalaltiatotsdos.Aixòsignificaquel’esquizofrèniaté
unaltcomponentgenètic,perònoésúnicamentlagenèticaelfactordecisiu,jaquel’altre40%res-
tant,onnomésundelsbessonsladesenvolupa,ésdegudaafactorsambientals.
Sabemquel’ambienti l’estildevidaqueportemafectaalsnostresgens,perònosempreésfàcil
demostrar-ho.Malgrataixò,undelsfactorsambientalsmésfàcilsd’estudiarallaboratoriésladie-
ta,peraixò,alllargdelsanyss’hananatrealitzantmoltsestudisepigenèticsqueestudienlaseva
influència.Elmenjarquemengemesdegradaennutrients,queentrenenelsistemametabòlici
arribenalescèl·lules.S’haobservatallaboratoriqueunmenjarricengrupsmetil,comlavitamina
B12olaB6queestrobaperexempleencarn,fetge,llet,vegetalsonouspotmetilarsegonsquins
gens.Tambés’haobservatquecertsalimentscomperexempleelbròquil,queésricenunnutrient
anomenatsulfuraran,aixícoml’all,ricendisulfurdeal·lil,causaunincrementenl’acetilaciódeles
histonesdegensanti-cancerígens.
Figura 10
Sulfuraran
Figura 11
Disulfur de al·lil.
�5
ELS SENYALS EPIGENÈTICS SÓN HERETABLES?
Aquestapreguntasel’hanfetmoltesvegadesmoltesvegadesmilersd’investigadors
queestudienlaepigenètica.Tanmateix,lesrespostesencaranosónclaresisovintes
considerenméscomaopinionsquenopascomafetsdemostrables.
Detotamanera,lahistòriaensproporcionaexemplesquedonensuportalaideaque
sónheretables.Durantel1944i1945,hivahaveraHolandaunaetapacaracteritzada
perlafaltad’alimentsirecursos.Aixídoncs,lesdonesqueestavenembarassadesen
aquellperíodevandonarallumaunsfillsdèbils,ambbaixpesiambmalaltiestant
cardiovasculars,d’hipertensióofinsitotdiabetis.
Figura 12
Herència transgeneracional
Elsinvestigadorsexpliquenaquestfetcoml’herènciatransgeneracional,jaque,durant
l’embaràsd’unadona,el fetus i lescèl•lulesreproductivesd’aquestesveuenexpo-
sadesamutacionsepigenètiques.Aixídoncs, lesrepercussionsd’unadietabaixaen
nutrientscoméselcasanteriormentexplicatpodenserexplicadesfinsa la tercera
generació.
Malgrataixò,existeixenteoriesqueafirmenquelessenyalsepigenètiquesadquirides
durantelcursdelavidas’heretenencaraquenosesapbenbécom.Pràcticamentcom
lesteoriesLamarckianes,queafirmavenqueelscaràctersadquiritss’heretaven.
�6
5- METODOLOGIA
Lametodologia seguidaperavaluar l’expressiógènicaendiversos teixitsd’uns ratolinsés la se-
güent:
5.� EXTRACCIÓ DELS TEIXITS
Aquestpasesfamitjançant la injecciód’unasubstànciaanestesiantcompotsereldiacepan. En
segonlloc,esdislocaalratolíambungestràpidifort,separantaixíelcapdelcos.Finalment,amb
l’ajutd’unbisturís’obreelratolí,s’extreuenelsteixitsdesitjatsiescongelenràpidament.Aquestpas
nol’hedutatermejopersonalment,jaquealslaboratorishihacertespersonesespecialitzadesen
duratermeaquestafeina.
5.2 OBTENCIÓ DE LES MOSTRES
Uncophempreparatlesmostresalsependorfers,classifiquemlesmostresdelasegüentmanera
per tal de mantenir un ordre clar.
RATOLINS
3 setmanes 8 setmanes
Ratolí 1 Ratolí 2 Ratolí 1 Ratolí 2
Pàncrees
(Pancreas1.3w)
Pàncrees
(Pancreas2.3w)
Pàncrees
(Pancreas1.8w)
Pàncrees
(Pancreas2.8w)
Fetge
(Liver1.3w)
Fetge
(Liver2.3w)
Fetge
(Liver1.8w)
Fetge
(Liver2.8w)
Teixit adipós marró
BAT(1.3w)
Teixit adipós marró
BAT(2.3w)
Teixit adipós marró
BAT(1.8w)
Teixit adipós marró
BAT(2.8w)
Taula 13
Esquema de les mostres obtingudes
�7
5.3 HOMOGENEÏTZACIÓ
L’homogeneïtzacióéselprocésques’haderealitzarpertaldegarantirquelesmostresqueanalit-
zaremestiguinenunamateixareferència.D’aquestamaneraensasseguremquequalsevolmostra
analitzadad’aquest teixittingui lesmateixes característiquesqueunaaltra i siguin comparables
proporcionadament.Aquestprocésespotrealitzardemoltesmaneres,però,enaquestcas,s’ha
preferitelmètodedelacongelacióitrituració,jaqueéselmésràpidieficaç.Elnitrogenlíquid�és
nitrogen pur en estat líquid que es troba a una temperatura igual o menor que la seva temperatura
d’ebullició(-195,8ºC)ienspermetcongelarqualsevolmaterialmoltràpidamenticonvertir-loenun
cosfràgil.Aixídoncs,ambl’ajutd’unmorteri,abocantprèviamentnitrogenlíquidsobrelesmos-
tresdeteixit,s’hatrituratselteixitscongelatsconvertint-losenpols.Méstard,s’hancol·locatenun
ependorfer2 a baixa temperatura.
5.4 EXTRACCIÓ DEL RNA
EnspodríempreguntarperquèhemvolgutextreureelRNAinoelDNAsielquevolemésanalitzar
elmaterialgenèticilasevaexpressió.PeròhemderecordarqueelRNAéselresultatd’unprocés
anomenattranscripcióiéselquevariaencadacèl·lulajaquedepèndel’expressiód’aquesta.Con-
seqüentment,notindriacapsentiranalitzarelDNAjaquelaseqüènciaésexactamentigualatotes
lescèl·lules.
L’extracciódeRNAesrealitzamitjançantelcloroformcomadissolvent.Aquestaextraccióesrealitza
en un ependorfer decolumna,quedónanomalmètodeutilitzat:“extraccióencolumna”.
Abansderealitzarl’extraccióambcloroform,esdesnaturalitzenelsteixitsambfenol(elfenolésun
dissolventorgànicicolorant,quedesnaturalitzaelteixit,ésadir,canvialasevaestructuraqueve
donadaperfactorscomlatemperatura,elpH,olapolaritatdeldissolvent)
iescentrifugalamostrapertaldebarrejar-hototbéimillorarl’eficàcia.Desprésdedeixar-horepo-
sardurant5minutsatemperaturaambient,s’obtéunasolucióambRNA,DNAiproteïnes.
Pertald’extreure’nelRNAhiafegim,almateixeppendorfer,140μldecloroformihotornemacen-
trifugarperò,aquestcop,15minpertaldesepararlasoluciósegonslesdensitats.Elcloroformés
1NITROGENLÍQUID:Elnitrogenlíquidésnitrogenpurenestatlíquidqueestrobaaunatemperaturaigualomenorquelasevatemperaturad’ebullició(-195,8ºC)ienspermetcongelarqualsevolmaterialmoltràpidamenticonvertir-loenuncosfràgil.2EPENDORFER:recipientdeplàstictotalmentesterilitzatambunatapaonpodemdipositarsolucions
�8
unaltredissolvent,molthidrofòbic3,comelRNAisobretotinsolubleenelfenol.D’aquestamanera,
elRNAesdissoldràenelcloroform,lesproteïnesquedaranalfonsjuntamentambelfenolielDNA
quedaràalmigdelsdosdissolventsjaquenoesdissol.
Imatge 14
En aquesta foto observem com, amb l’ajuda d’una pipeta separem el RNA disolt en el cloroform.
Acontinuació,s’agafaambunapipetalapartdelcloroformdel’eppendorfer,ambmoltdecompte
denocontaminarlamostraambDNAosoluciódefenoliproteïnes.
DisposemelRNAenunaltreeppendorferihiafegim1’5partsdelvolumdelasolucióiniciald’etanol
queenspermetran,alpassegüent,separarambmésfacilitatelRNAdelasolució.
Finalmenthodipositemenunaltreeppendorferdiferent,anomenatdecolumna.Aquesteppen-
dorferésespecíficperaquestafunció,extreureelDNAoRNA.Aixídoncs,estàcompostperdos
recipients,undinsdel’altre.S’utilitzaespecíficamentperapurificarARNoADNd’unasolució,ies
basa en el mètode d’elució4.Aixídoncs,elrecipientpetittéunaespèciederesinaanomenadasilica
que,gràciesalintercanviiònicdecàrregues,faquelesmolèculess’enganxinaella,comuncolador.
Aixídoncs,mentrenosaltrespassemelcloroformambelRNAaquestesquedaràenganxatalare-
sina,peròenpassar-hiaiguadesprésdelRNAbaixaràipodremtenirunasoluciópuradeRNAamb
aigua.
3HIDROFÒBIC:Anomenemunasubstànciahidrofòbicaquanaquestaesrepeladel’aiguaonoespotmesclarambella.
4ELUCIÓ:Laelucióésuntermeusatenquímicaanalíticaiorgànicaperdescriureelprocésd’extracciód’unmateriald’unaltremitjançantelrentatambundissolvent
Cloroform+RNA
DNA
Fenol+Proteïnes
�9
Imatge 15
Eppendorfer de columna
5.5 VALORACIÓ DEL RNA (puresa)
Uncops’haextretelRNA,s’hadecomprovarquelamostranos’hagicontaminatambdissolvents
coml’etanoloel fenolquetrencarienelsRNA(recordemquesónmolt fràgils).Perduraterme
aquestpas,utilitzemelmètodedelaespectrofotometria.
L’espectrofotòmetreésuninstrumentqueenspermetmesurar,enfunciódelalongitudd’ona,la
quantitatdellumabsorbidaenunadissolució,queésproporcionalalaquantitatdesolutqueconté
i que mesurem com a concentració de solut.
5.6 VALORACIÓ DEL RNA (integritat de la molècula)
LavaloraciódelaintegritatdelamolèculadeRNAs’efectuaactualmentmitjançantprocessosauto-
matitzats.Malgrataixò,enaquesttreballs’haefectuataquestprocésmanualmentpertald’entendre
millorelprocediment.Aquestprocéss’anomenaelectroforesi.
Laelectroforesienspermetsepararmolèculesenfunciódelseutamany,formaielectronegativitat
ensersotmesesaunadiferènciadepotencialelèctric.
Perferl’electroforesiesnecessitaunmediporós,peronpuguemferpassarlesmolèculesdeRNAa
través.Enaquestcashemutilitzatagarosa5,queestàenformadelíquidconcentrat.Acontinuació
s’escalfal’agarosais’hiafegeixunasoluciótampó(buffer)ques’anomenaTBE,queensmantéelpH,
5AGAROSA:Polisacàridderivatdel’agar(unaalgaques’utilitzaencuinacomaespessantjaquenotégust).
20
iuncolorant.Recordemqueaquestmedihadesertotalmentinert,ésadirquenoreaccioniamb
lesmolècules,poróspertaldequehipuguinpassariambpropietatsuniformespertaldepoder
avaluarproporcionalmenteldesplaçamentdecadamolècula.
Uncopaquestasoluciós’haescalfat,s’abocaaunmotlleon,alrefredar-ses’aniràsolidificant.S’hi
posemtambéunestriques’anomena“peineta”,queenspermetràferlaformad’unsorificisdins
delgelperonhiabocaremlasoluciódeRNA.
Imatge 16
Gel d’agarosa en els denominats pous
D’altrabanda,s’afegeixblaudemetiléalesmostresdeRNApertalque,desprésalposaraquestes
mostresa llumultravioleta, lespuguemveureambmésclaredat.Tambés’hiafegeixunasolució
tampó(buffer)decàrrega.Elsàcidsnucleicstenenpocamassa.Aixídoncs,uncopelssituéssima
cadaorificis’escaparienisurarien.Aquestbufferdecàrregaestàformatperglicerol,ambunagran
densitatperòunacapacitatmínimaperreaccionarambaltressubstàncies(ésadir,inerta).
Uncops’hadipositatcadasoluciómostraalseupou(elsanomenatsforatsfetsposteriormentamb
la“peineta”)hiapliquemuncampelèctric,detalmaneraque,lesmolèculesdeRNA,alestarca-
rregadesnegativament,esdesplaçarancapalpolpositiu.Conseqüentment,aquellesquesónmés
lleugeresiméspetitesarribaranmésllunyadiferènciad’aquellesambmésmassamolecular.
2�
Apliquemaquestscampselèctricsdurantuneshores,i,méstard,traiemelgeld’agarosamoltdeli-
cadamentielcol·loquemaunamàquinaderaigsultravioletesqueenspermetràanalitzarelresul-
tat.ObservemaixíelsdesplaçamentsdelsRNAs.
Elnostreresultatdelsraigsultravioleteséselsegüent:
Figures 17 i 18
Mostres 3 ratolins setmanes Mostres 8 ratolins setmanes
22
5.7 TRANSCRIPCIÓ INVERSA (RT)
Laretrotranscripcióotranscripcióinversaéselprocésqueefectuempertaldeconvertiraquelles
seqüènciesdeRNAquehemobtingutenDNA,jaqueésmésestable(recordemqueelDNAconté
timinainouracil,queésmésestable).ElDNAresultantdelaretrotranscripiciós’anomenaDNAc
(complementari).
Perefectuaraquestprocés,calmantenirconstantmenttoteslessubstànciesques’utilitzenentem-
peraturesmoltbaixes,jaquesónmoltsensiblesiespodrienfermalbé.Aixòs’aconsegueixenvoltant
degellasolucióomixmentrehitreballem.
Espreparaunasolucióomixquecontétantenzims(retrotranscriptasa),combasesnitrogenades
(seqüències aleatòries de bases nitrogenades anomenades random primers que s’adhereixen al
RNA i permetenque l’enzim comenci aduplicar la seqüència) o, fins i tot, proteïnes iminerals.
S’introdueixlamostraaaquestasolucióiseliaplicauncicletermalmoltespecíficdurantpràcti-
camentdueshoresenunamàquinaanomenadaRT.LamàquinadelaRTtéunagrancapacitatde
efectuargranscanvisdetemperaturaenuntempsmoltpetitgràciesal’efectePeltier,quepermet
tantrefredarcomescalfarelstubsdelamàquinainvertintelcorrentelèctric.
Elcicleconsisteixenelssegüentspassos:
Unsprimers10mina25ºC(éslatemperaturaidealperquèelRNAéssepariielsprimerss’hipu-
guinunir).Després,idurantdueshores,s’estàaunatemperaturade37ºC(temperaturaidealper
alfuncionamentdelaenzimdelaretrotranscriptasa,quefaràtotelprocésdetranscriureelRNAa
DNAc).Finalmentdurant5mina85ºC(comjasabemelRNAésmoltfràgiliatemperaturesalteses
degrada,s’aprofitaaquestapropietatperdegradar-loiobtenirnomésDNA)iuncoplareaccióha
estatfinalitzadaeldipositema4ºCpertalqueesconservimillorfinsquenos’hagid’utilitzar.
5.8 PCR A TEMPS REAL
Lareaccióencadenadelapolimerasa(conegudacomPCR,lessiglesanglesesdepolymerase chain
reaction)ésunatècnicadebiologiamolecularl’objectiudelaqualésobtenirungrannombrede
còpiesd’unfragmentd’ADNespecíficapartird’unaquantitatmínima.ElsegmentdeDNAaamplifi-
car-sepottenirdesde50finsamilsdenucleòtidsdelongitud.Aquestsistemad’ampliaciódeDNA
vaserdescobertamitjansdeladècadadels70is’haanatperfeccionantfinsal’apariciód’unesmà-
quinesutilitzadesal’actualitatqueefectuenl’anomenadaPCRatempsreal,queenspermetavaluar
lareaccióatempscontinu.
23
Lamàquinatéunfuncionamentmoltsenzill,jaqueellaensiesuntermociclador.Potfergranscan-
visdetemperaturaenuntempsmínimgràciesal’efectePeltier(aligualquelamàquinadelaRT).
Aquestamàquinadoncs,efectuaciclesonvacanviantlatemperatura,seguintunpatró.Acadacicle
observemaquestesetapes:
1- DesnaturalitzaciódelDNA:
Apliquemunatemperaturad’entre92i96ºCdurantuns5-10minpertaldequeladoble
hèlicedelacadenaessepariielsprimersoencebadorss’uneixinalessevesrespectives
cadenes.
2- Alineaciódeencebadorsoprimers:
Esredueixlatemperaturaa50o60ºCpertalque,uncoplescadenesjaestanseparades,
els primerss’hipuguinajuntar.Aquestaetapaduramoltspocsminuts(nosaltresl’hemfet
durar � min).
3- Extensió:
Uncopelsprimersjaestanenganxatsalessevesrespectivescadenescomplementaries,
l’enzimTaqpolimerasacomençaadoblartotalacadenaapartirdel’encebador.Aquest
procésesduatermeaunatemperaturad’entre70i75ºCdurantuntempsde5min.
Figura 19
Procés de la reacció en cadena de la polimerasa
24
Alfinaldecadacicle,elmaterialgenèticdesitjats’hauràduplicat.Malgrataixò,perl’amplificaciói
visualitzaciód’unaseqüènciaespecificaòptimaesrequereixende25a40cicles.
Figura 20
Imaginant que cada ramificació en aquest esquema és un cicle, al 6è cicle ja hi hauran unes 64 copies del DNA diana
Enaquesttreballs’hautilitzat laPCR,nonomésperampliarcertssectorsde lacadenadeDNA,
sinótambéperobservarcomaquestsmateixossectors(corresponentsacertsgensquenosaltresja
tenimidentificats)apareixenendiferentsquantitatsencadascunadelesdiferentsmostres,obser-
vantaixíladiferentexpressiógenètica(ésadirdediferentsgens)enlesdiferentsmostresdeteixits
analitzats.
Al’horadeprepararlaPCRipertald’obtenirunsresultatsmésfiables,s’hapreparatunduplicat
decadamostraresultantdelaRT.Aquestessolucionshandecontenirlamateixaconcentracióde
materialgenèticpertaldetenirunsresultatsproporcionals.Ésperaixòqueaalguness’hanhagut
de diluir anteriorment.
Acadamostra,totseguintelprotocolseliafegeixrespectivament5μld’unasoluciótampó(buffer),
quecontédesoxiribonucleicstrifosfatats,ésadirbasesnitrogenades(ATP,CTP,TTPiGTP),queens
servirandenucleòtidspertaldeformarlacadenacomplementària,tambécontémineralscomMg+
oK+ienzims(ésadir,laTAQpolimerasa,encarregadadefercomençarlareacció).Enaquestasolu-
ciótambéveincorporadaunasondaTaqmanqueenspermetràvalorarlafluorescència.
25
LA SONDA TAQMAN
La sondaTaqmanésundelsmecanismesutilitzatsperquantificar la quantitatdemate-
rial genèticobtingudaacadaciclede laPCR.Per talde feraixò, lamateixamàquinade
laPCResguiaper ladetecciód’unsenyalfluorescentproduïdaproporcionalmentdurant
l’amplificaciódelmateixproductedePCR.
AquestasondaTaqmanéslaqueenspropor-
cionaràel senyalfluorescent, sempredirec-
tament proporcional a la quantitat deDNA
dianaexistent,ésadir laquantitatdeDNA
quevolemamplificar.
La sonda Taqman es una cadena de nucleò-
tidsdelimitadaenunextremperunfluoro-
crom,encarregatd’emetrefluorescència i a
l’altre extrem per un segrestador o quencher.
Aixídoncs,mentreelfluorocromielsegres-
tador estan a la sonda, aquesta no emetrà
captipusdefluorescència,jaqueelsegresta-
dorinhibeixalfluorocromd’emetrecaptipus
defluorescència.
Malgrataixò,irecordemqueaquestasondaestàenganxadaalacadenad’ADNquevolem
duplicar,quanlaTaqpolimerasaarribialpuntonestasituadaaquestasonda,aquesta la
trencarà,permetentaixíqueelfluorocromemetifluorescència.Finalment,laquantitatde
fluorescènciaalliberadadurantcadacicled’amplificacióésproporcionala laquantitatde
producte generat en el mateix cicle .
Aixídoncs,uncoplamàquinahaefectuattotselsciclesnecessaris,ensproporcionauna
gràficaonal’eixdelesxapareixenelscicles(de0a40)ial’eixdelesylaquantitatdefluo-
rescència detectada.
Apartd’aquestasoluciótampótambélihemafegitelsprimersoencebadors,quesónoligonucleò-
tids(ésadirpetitesseqüènciesdeDNA)d’entre18o30bases.Aquestsencebadorscorresponen
alacadenacomplementàriad’unasecciódelprincipiofinaldelgenquevolemampliariobservar.
26
Pertant,sivolemobservar5gensdiferentss’haurandepreparar5solucionsdiferents(totesamb
lamateixabase,peròdiferentprimer).Talcomelseunomindica,elprimeréselprecursordela
reaccióencadenadelapolimerasa,seguitperlaTAQpolimerasa,queésl’encarregadad’efectuarla
majorpartdelareaccióensi.
Elsgensobjected’aquestestudis’hanseleccionattenintencomptequevolíemobservarelcanvi
d’expressiógènicaambl’edat.Pertanthemseleccionatunsgensquesuposàvemqueambl’edatva-
riarieniunsaltresqueno.Tambéhemseleccionatgensparticularsdecadaundelsteixitsestudiats,
perobservarunamicaladiversitatcel·lular.
Siesvolavaluarsihihacanvisenl’expressiógènica,enscalungenpatróquenocanvimailaseva
expressiópertaldecomparar-loambelsaltres.Ésadir,ungenconstitutiu6. Aquest gen s’anomena
actina(ACTB),icodificaposteriormentenunaproteïnaestructuralfonamentalenelcitoesqueletde
lescèl·lulesdelsorganismes.Conseqüentment,apareixatoteslescèl·lulesdel’organisme.
Abandadelgenquecodificalaactina,seleccionatcomagenconstitutiu,elsgensobjected’estudii
quecodifiquenlessegüentsproteïnessón:
ADIPOQ:L’adiponectinaésungenquesintetitzaunaproteïnaespecíficadelteixitadipós,quepar-
ticipaenelmetabolismedelaglucosaidelsàcidsgrassosiestàcomprovatqueaugmentalasensi-
bilitat a la insulina.
GLUT2:Aquestaésunadelesproteïnesencarregadesdeltransportdeglucosa,defetunadeles
méseficients,iensajudaamantenir-laenunsnivellsadequats,emmagatzemant-laquanelsnivells
alasangsónmoltaltsoutilitzant-laquanesnecessiti.Enspotservirtambéde“sensordeglucosa”
jaquelatrobemonhiapareixengransquantitatsdeglucosa.
IL6:Lainterleuquinasisésunaproteïnaambfuncionsantiinflamatòries,queensserveixdedefensa
dinselnostrecosisobretotfafuncionsdeneteja(decèl·lulesjamortes,perexemple).
P16:Aquestgenésunantioncogèn,quesintetitzaposteriormentunaproteïnasupressoradetu-
mors.Mutacionsenaquestgensovintdonenllocadiversoscàncers,sobretotmelanomes.
6GENCONSTITIU:Genquesempres’estàexpressantcausaqueésrequeritperalcorrectefuncionamentimanteniment
delesfuncionscel·lularscomtambéenelsprocessosmetabòlicsd’unorganisme.
27
Finalment,totamàquinadelaPCRentempsrealesbasaenunprincipimoltbàsiciéseldedetectar
laquantitatdefluorescènciaemesaalfinaldecadacicle.Uncopelprocéshaestatefectuat,lamà-
quina(quejaveambunprogramariinstal·lat)ensproporcionaungràficd’aquestestiloncadauna
d’aquestescorbescorresponaungenanalitzatdinsdediferentsmostres.
Gràfic 21
Gràfic de l’ampliació de ADN de les mostres.
Enaquestgràfic,al’eixdelesxapareixenelscicles(de0a40)ial’eixdelesylaquantitatdefluo-
rescènciadetectada.Podemobservarquetoteslescorbestenenunpatrósimilar:Normalmentels
primers15o25ciclesnosónunacorbaclara,anomenadadefons.Aixòesdegutaquelaquantitat
defluorescènciaemesaencaranoésmoltclara,ésmoltpetitajaquel’amplificaciórealitzadafins
almomenttambéesdebaixaquantitat.Apartird’aquestmoment,idepenentdelamostra,elDNA
escomençaaduplicardemaneraregulardetalmaneraquealfinaldecadacicleelmaterialgenètic
desitjats’hadoblat.Conseqüentment,lacorbadonaràllocaunaequacióexponencialcorresponent
ay=2xonxéselnombredeciclesiyéslaquantitatdeDNA.Alfinal,lacorbaadoptaràunapendent
mésdisminuïdafinsalpuntques’anul·larà.Aixòésdegutal’exhaurimentdenucleòtidsalamostra
i conseqüentment a l’impediment de crear cadenes de noves.
28
Uncophemobtingutaquestesdadeslamàquinadónacomavalordereferènciaunvalordefluores-
cènciaemesaqueanomenemCtollindariquecorresponmésomenysalameitatdelafaseexpo-
nencialdelescorbes.D’aquestamaneradistingiremsempreunamateixaquantitatdefluorescència
quecorrespondràaunnúmerodecicle(semprediferent).
Taula 22
Diferents Ct de diferents mostres efectuades
Perexemplesilamàquinaensproporcionaunagràficad’aquestestilpodremobservarquelesmos-
tresquetinguinunCtmésbaixsónlesquetindranunamajorexpressiógènicadelgenenqüestió,
jaqueperarribaralamateixaquantitatdefluorescènciahannecessitatmenyscicles,ipertant,i
haviaunaquantitatinicialdeDNAcmésgran.
29
6- RESULTATS
Els resultats de l’estudi de l’expressió gènica de certs gens ve exposada a les següents pàgines.
6.� VALORACIÓ DEL RNA
6.�.� PURESES DE LA MOLÈCULA
El resultat obtingut de l’anàlisi espectrofotomètric està exposat a la següent taula, en la que
s’especifiquenalaprimeracolumnalaconcentraciódeRNAdecadamostradeteixitexpressadaen
ng/μl,enlasegonacolumnalaquantitatd’àcidsnucleicsexpressadaenunitatsd’absorbància,en
laterceracolumnalaconcentraciódeproteïnesexpressadatambéenunitatsd’absorbànciaifinal-
mentalaúltimacolumnalarelacióquehihaentreelRNAilesproteïnes.
Taula 23
Resultats de l’anàlisi estequiomètric
LataulaensposademanifestquelaquantitatdeRNAvariasegonseltipusdeteixit.Observemque,
generalmentelfetgeielpàncreesacostumenatenirmésRNA,entreuns1000i3000ngdeRNA
perμldesolució(exceptuantlamostradelsegonpàncreesde8setmanes,Pancreas2.8w,queha
resultaten554encontrastalprimerpàncreesqueenté3423.Aixídoncssuposemquehihahagut
alguntipusd’error,d’aquestamanera,menyspreemaquestamostra).Encanvi,elBAT,ésadirel
teixit adipós marró7,acostumaatenirgeneralmentunaquantitatbastantpetitadeRNA.Aixòés
degutalfetquelescèl·lulesd’aquestteixitsónmésgrans(recordemquealteixitadipóss’higuar-
dentoteslesreservesdelcoscompodrienserelsgreixos)i,d’aquestamanera,enunmateixvolum
obtindremmenornombredematerialgenètic.
7TEIXITADIPÓSMARRÓ:Lafunciódelteixitadipósmarróésgenerarcalorapartirdereserveslipídiques,ésespecialmentimportantenmamífersdemidapetitaiennounatsdemoltesaltresespèciesdemamíferenelmantenimentdelaseva
temperatura corporal.
30
Sicontinuemobservantlataulaanterior,veuremquelasegonaiterceracolumnesdedadesenca-
pçaladespelsnomsdeA260iA280,quecorresponenaunafreqüènciadelesonesdelallum,que
posteriormenthaestatcomprovatquecorresponenrespectivamentalsàcidsnucleicsialesproteï-
nes.Ambduescolumnesdedadespotsemblarquenotinguingairesentit,jaquenosegueixencap
patróespecíficadiferènciadelacolumnadelaconcentració,malgrataixò,aquestesxifressónmolt
importants,perquèensajudenadecidirsilasolucióquehemobtingutestànetainocontaminada
ambdissolventsoaltressubstàncies.Diremqueelnostreexemplarestàmésomenysnetipurde
RNAsilarelaciódeRNAamblesproteïnesesmantéalvoltantde2.Observemaixíquemésomenys
toteslessolucionsesregeixenperaquestanorma,ambunintervalquevadesdeunmàximde2.14
iunmínim1.99.Pertant,lesmostresespodenconsiderarvàlides.
6.�.2 INTEGRITAT DE LA MOLÈCULA
Quanalaintegritatdelamolècula,elresultatdel’anàlisielectroforèticéselsegüent:
Figura 24
Mostres 3 ratolins setmanes Mostres 8 ratolins setmanes
Pernormageneral,quananalitzemelRNAapareixensempretresbandesmésmarcades,cadauna
d’aquestesmarquescorresponaungrupmésnombrósdemolèculesdeRNAamblesmateixesca-
racterístiquesdepesitamany.Enteoria,pertaldecomprovarquelaintegritatdelesnostresmos-
tresésbonalaprimerabandahauriadeserdedobleintensitatquelasegonailasegonabanda,a
unadistànciamésgranhauriadesermésdifuminada.Aixòésdegutalsimplefetquehihaeldoble
de molècules de RNA d’un que de l’altre.
3�
Cada una d’aquestes tres bandes correspon a un RNA ribosòmic8,laprimerabandaal28s,lasegona
al �8s i la tercera al 5s.
Imatge 25
Electroforèsi de RNA ideal
Siobservemlesmostresobtingudesal’anàlisielectroforètic,non’hihacapquehagisortitespecial-
mentíntegra,jaque,obélesbandespresentenlamateixaintensitatobélasegonabandaésmés
intensaquelaprimeraobépràcticamentnoesdistingeixen,cosaquesignificaqueelgraudede-
gradaciódelamolèculaseràmàximjaquesignificaràquelesmolèculeshanestattrencadesitotes
tenenmidesipesosdiferents.
Com podem observar si contrastem les bandes que corresponen als teixits dels ratolins de tres set-
manesamblesdelsratolinsde8setmanesveuremquehanquedatmésbendefinideslesmostres
delsratolinsde3setmanes.Aixòpotserdegutadosfactors,alareutilitzaciódelgeldel’electroforesi
perunabandaialacontaminaciódelamostraperl’altra,degudaalaimprecisióal’horad’extreure
elRNAoacausadediferentsdissolventsquehantrencatelRNA(recordemqueésmoltfràgil).
8RNARIBOSÒMICS:RNAsintetitzatsperlacèl•lulaqueapareixenambgranquantitat,encarregatdedescodificarRNAmissatgeraaminoàcids(procésanomenattraducció)juntamentambelRNAdetransferència.
32
6.2 VALORACIÓ DELS RESULTATS DE LA PCR
D’entretoteslesmostresanalitzadesn’hihaduesquehanestatmenystingudesd’entrada:lesdel
P16ilaIL6jaquenomostravenpràcticamentexpressiógènicailamàquinadelaPCRnohaviapogut
delimitar un Ct o cicle llindar exacte degut a la imprecisió de la part exponencial de les corbes.
Gràfic 26
Corba de P16
Gràfic 27
Corba de IL6
33
Uncopdescartadesaquestesduesmostres,elsresultatsobtingutsesmostrenalasegüenttaula:
Taula 28
Duplicats, mitjanes i desviació de les mostres de la PCR
Detector MostraCt1
(duplicat1)Ct2
(duplicat2) Mitja DesviacióACTB Pancreas1.3w 22,79975 22,907587 22,8536685 0,076252274ACTB Pancreas2.3w 22,754595 22,988987 22,871791 0,165740173ACTB Pancreas1.8w 23,356678 23,548515 23,4525965 0,135649244ACTB Pancreas2.8w 29,34604 29,559711 29,4528755 0,151088213
ACTB Liver1.3w 19,937523 20,201689 20,069606 0,18679357ACTB Liver2.3w 19,91288 19,532467 19,7226735 0,268992612ACTB Liver1.8w 22,02496 21,918354 21,971657 0,075381826ACTB Liver2.8w 22,543043 22,650488 22,5967655 0,075975088
ACTB BAT1.3w 20,51133 19,92522 20,218275 0,414442356ACTB BAT2.3w 20,517088 19,936037 20,2265625 0,410865102ACTB BAT1.8w 21,716288 21,245993 21,4811405 0,332548784ACTB BAT2.8w 22,412436 22,175957 22,2941965 0,167215905
ADIPOQ Pancreas1.3w 27,768198 27,877384 27,822791 0,077206161ADIPOQ Pancreas2.3w 27,416065 28,402145 27,909105 0,697263855ADIPOQ Pancreas1.8w 28,066978 28,515564 28,291271 0,317198203ADIPOQ Pancreas2.8w 32,772305 33,695827 33,234066 0,653028669
ADIPOQ Liver1.3w 33,556885 32,784252 33,1705685 0,546334034ADIPOQ Liver2.3w 32,770874 33,21623 32,993552 0,314914248ADIPOQ Liver1.8w 31,179636 31,150621 31,1651285 0,020516703ADIPOQ Liver2.8w 36,031986 - 36,031986 -
ADIPOQ BAT1.3w 20,878447 20,90818 20,8933135 0,021024406ADIPOQ BAT2.3w 20,201986 20,584654 20,39332 0,270587138ADIPOQ BAT1.8w 20,367727 21,982145 21,174936 1,141565915ADIPOQ BAT2.8w - 22,653812 22,653812 -
GLUT2 Pancreas1.3w 29,82613 30,084942 29,955536 0,18300772 GLUT2 Pancreas2.3w 29,934889 30,147522 30,0412055 0,150354236GLUT2 Pancreas1.8w 30,582697 30,336895 30,459796 0,173808261GLUT2 Pancreas2.8w - 37,007748 37,007748 -
GLUT2 Liver1.3w 21,883585 21,926823 21,905204 0,030573883GLUT2 Liver2.3w 21,970535 25,037712 23,5041235 2,168821656GLUT2 Liver1.8w 23,746319 23,744858 23,7455885 0,001033083GLUT2 Liver2.8w 24,300716 23,749624 24,02517 0,38968089
GLUT2 BAT1.3w 28,700047 28,99508 28,8475635 0,208619835GLUT2 BAT2.3w 29,601664 29,834185 29,7179245 0,164417176GLUT2 BAT1.8w 31,214537 31,752974 31,4837555 0,380732454GLUT2 BAT2.8w 32,613457 32,48728 32,5503685 0,089220612
34
Enaquestataula,s’indicaalaprimeracolumnaelgenqueestemanalitzant(Actina,Adiponectinai
Glut2).Alasegonacolumnas’assenyalaeltipusdemostraqueesconsidera.
Finalment,recordemqueperferlaPCRhemfetunduplicatdecadamostradeteixit,conseqüent-
ment,elsseusciclesllindarsesveuenreflectitsenaquestagràficaambelnomdeCt1iCt2(situats
alaterceraiquartacolumna).Ésimportanttambétenirencompteelfetquealgunesvegadesno
l’hemfetperquèse’nshaoblidatopassatperaltaixídoncsaquestescasellesestaranmarcadesamb
un guió.
Alacinquenacolumnas’hadeterminatelvalormigdelsciclesllindarsdelsdosduplicatsialasisena
columnas’expressaladesviacióestàndard(distànciaquehihaentrecadamostraielvalormig).Una
desviaciómoltgran,significaunafaltadeprecisióoerroral’horadeprepararlaPCR.Aixídoncs,
d’algunamaneradescartaremtambéaquestesmostresolestindremencompteambreservesa
l’horadefermitgesocomparar-lesambaltresmostres.Aquestesmostress’hanmarcatambver-
mell.
Primerament,icomjahavíemditenunprincipicompararemelsgensdelaadiponectina(adipoq) i
la glucosa (glut2)ambl’actina(actb).
Elsegüentpasefectuatpertaldeferlavaloraciódelsresultatsesmostralataulasegüent,onhi
apareixpercadageniteixitelΔCt.ElΔCtésladiferènciaentreelCTmigdecadamostraanalitzada
idecadateixitambeldelaactinacorresponent.Perentendre’nsmillor,estractarestarelCtdel
glut2 del pancrees1.3w amb el Ct de l’actina del pancrees1.3w.Siaquestnombreresultanegatiuo
zerovoldirqueelgenenaquellamostras’haexpressatmésquelaactina.Sielnombreéspositiu
voldirquenos’haexpressattant.
35
Taula 29
Δ Ct de les mostres de la PCR
Detector Mostra CtADIPOQ Pancreas.3w 4,9691225ADIPOQ Pancreas.3w 5,037314ADIPOQ Pancreas.8w 4,8386745ADIPOQ Pancreas.8w 3,7811905 ADIPOQ Liver.3w 13,1009625ADIPOQ Liver.3w 13,2708785ADIPOQ Liver.8w 9,1934715ADIPOQ Liver.8w 13,4352205 ADIPOQ BAT.3w 0,6750385ADIPOQ BAT.3w 0,1667575ADIPOQ BAT.8w -0,3062045ADIPOQ BAT.8w 0,3596155 GLUT2 Pancreas.3w 7,1018675GLUT2 Pancreas.3w 7,1694145GLUT2 Pancreas.8w 7,0071995GLUT2 Pancreas.8w 7,5548725 GLUT2 Liver.3w 1,835598GLUT2 Liver.3w 2,2478615GLUT2 Liver.8w 1,7739315GLUT2 Liver.8w 1,4284045 GLUT2 BAT.3w 8,6292885GLUT2 BAT.3w 9,491362GLUT2 BAT.8w 10,002615GLUT2 BAT.8w 10,256172
D’aquesta manera, podem observar amb claredat la diferenciació cel•lular. Per exemple,
l’adiponectinaenteixitscomelteixitadipóstéunaexpressióiguald’altaquel’actina(peraixòelΔ
Cts’acostaa0)peròmoltbaixaenteixitscomelfetgeoelpàncrees(observemqueperexempleal
pàncreeselΔCtésalvoltantde13).
36
Perestudiarsihihavariaciódel’expressiógènicaenteixitsderatolinsdediferentedats,determi-
nemelΔΔCt,totrestant,percadamostra,elCtmitjàde8setmanesdelCtmitjadelesmostresde
3 setmanes.
ElΔΔCtésunnombrequeensaportapocainformació,jaqueésdifícild’interpretar.Aixídoncs,en
llocdelΔΔCtesconsiderael2-ΔΔCt.D’aquestamanera,irecordantquelesmostresde3setmanes
s’aproparana0jaquehihemrestatlamitjadelesmostresde3setmanes,utilitzaremlapropietat
que20=1.Pertant,lesmostresdetressetmanesocontrolsseranpràcticament1,encanvilesaltres
variaransegonshagivariatl’expressiógènica.
Taula 30
Mostres corregides per l’exemplar de 3 setmanes
Detector Mostra Ct Ct 2 -ΔΔ Ct MitjaADIPOQ Pancreas.3w 4,9691225 -0,040061 1,028157298ADIPOQ Pancreas.3w 5,037314 0,031477 0,978418101 1,0032877 ADIPOQ Pancreas.8w 4,8386745 -0,1285915 1,093225866ADIPOQ Pancreas.8w 3,7811905 -1,18898 2,279914939 1,6865704 ADIPOQ Liver.3w 13,1009625 -0,077983 1,05554128ADIPOQ Liver.3w 13,2708785 0,0812965 0,945207839 1,00037456 ADIPOQ Liver.8w 9,1934715 -4,014426 16,16079203ADIPOQ Liver.8w 13,4352205 0,290074 0,817860107 8,48932607 ADIPOQ BAT.3w 0,6750385 0,2348675 0,849763039ADIPOQ BAT.3w 0,1667575 -0,2431055 1,183537567 1,0166503 ADIPOQ BAT.8w -0,3062045 -0,7068105 1,632191688ADIPOQ BAT.8w 0,3596155 -0,054965 1,038833901 1,33551279 GLUT2 Pancreas.3w 7,1018675 -0,0406075 1,028546843GLUT2 Pancreas.3w 7,1694145 0,0409765 0,971996821 1,00027183 GLUT2 Pancreas.8w 7,0071995 -0,1061375 1,076342704GLUT2 Pancreas.8w 7,5548725 0,523422 0,695719663 0,88603118 GLUT2 Liver.3w 1,835598 -0,9821735 1,975439277GLUT2 Liver.3w 2,2478615 0,978531 0,507496226 1,24146775 GLUT2 Liver.8w 1,7739315 -1,0717585 2,101993925GLUT2 Liver.8w 1,4284045 -1,3679315 2,58100243 2,34149818 GLUT2 BAT.3w 8,6292885 -0,45732 1,372988936GLUT2 BAT.3w 9,491362 0,4529885 0,730528012 1,05175847 GLUT2 BAT.8w 10,002615 0,940084 0,521202533GLUT2 BAT.8w 10,256172 1,206265 0,433389168 0,47729585
Aixídoncs,alesmostresonelsnombressiguinmajorsque1l’expressióhauràpujatialesmostres
quesiguinmenorsl’expressióhauràbaixat.
37
Elgràficsegüentpermetanalitzarmilloraquestsresultats:
Gràfic 31
Canvis en l’expressió de les mostres
Analitzantaquestgràficobservemquetoteslesmostresde3w(tressetmanes)s’aproximenalalínia
verda situada al valor � mentre que les de 8 setmanes no.
Observantlagràfica,podríempensarquehihacanvisenlaexpressiódelsgensdelsratolinsdedi-
ferentedat,peròsianalitzeml’intervald’errordelresultatjanohopodemafirmartantclarament.
Malgrataixò,podríemdirquel’adiponectina al pàncrees i el glut2alfetgepresentenunatendència
aaugmentarenelsratolinsde8setmanes,mentrequeelglut2alteixitadipóstéunatendènciaa
disminuir.
D’altrabanda,sitenimencomptealtrescriteriscomlaespecificaciócel•lularpodemobteniruna
gràficad’aquestestil:
Gràfic 32
Mostres corregides per l’exemplar amb més expressió gènica
38
En aquesta gràfica s’ha considerat només les mostres dels ratolins de 3 setmanes que més
s’expressaven.Recordemque la columnaque sempreestigui al voltantde1 seràaquellaper la
qualhecorregitlesmostres(elBAT 3w i el fetge 3w,tenintencomptequealfetgetenimunmarge
d’errormoltgraniesperaixòquenoestàsituatexactamental’1).Enaquestcas,heobservatque
elteixitadipóséselquetélaexpressiód’adiponectinamésalta,encontrastambelfetgequeté
una gran expressió de Glut2.Aquestesdatestenenlògica,jaqueelteixitadipósésonessituenels
adipòcitsialfetges’efectuenentremoltesaltresreaccions,lasíntesideglucosa(recordemqueel
glut2ésunaespèciedesensordelaglucosa).
Ésinteressantelqueensaportaaquestataula,jaqueenspermetveurelaexpressióaunnivellge-
neral.Perexemplepodemobservarqueencaraquel’adiponectinaalpàncreess’hagipràcticament
doblat,aquestcreixementnoensésdegransignificatdinslatotalitatdelesnostresmostres.De
fet,hemsuposatqueaquestcanvihaestatdegutaunerroral’horad’extreureelpàncreesdelratolí
enqüestió.Recordemqueelpàncreesestàformatenalgunespartsirecobertpelteixitadipós,iés
possibleque,al’horadeprepararlesmostres,se’nhagicolatalgunfragment.
Finalment,desprésd’analitzaraquestagràficadetalladament,observemqueelmarged’erroren-
trelesmostresésmoltgraniaixòensimpedeixtrobarunarespostaclaraalsobjectiusplantejats.
Observemtambéqueelsmajorscanvisestrobenenunapujadad’adiponectina al teixit adipós i de
glut2alfetge,seguidad’unampliconjuntd’altrescanviïs.
Analitzemdoncs,laraód’aquestscanvis.
Recordemqueaquestsratolins(totspertanyentsaunamateixacamadaassegurant-nosaixíd’una
majorsimilitudgenètica),hanestatvivintenlesmateixescondicionsjaqueelqueesvolobservarés
l’efectedefactorsexternsenelcodigenètic.Defet,aixònohaestatbenbeaixí,jaqueinevitable-
mentlasevadietahacanviat:apartirdeles3setmaneselsratolinsjanomamendelamare,sinó
quepassenamenjarunpinsoespecialitzat.D’aquestamanera,unesmostrescorrespondranauns
ratolinsalimentatsúnicamentamblletielsaltresalimentatsjaambpinso.
Aquest canvi en la dieta ens produeix dos canvis d’expressió transcendentals. Per una banda,
l’expressió de glut2 al fetge s’hapràcticamentdoblatals ratolinsde8 setmanes jaqueelpinso
ésricenglucosaielfetgeésundelsprincipalsllocsd’emmagatzematgedelaglucosa,ésperaixò
queaquestahapujat.Tambéhemapreciatunapetitabaixadadeglut2alteixitadipósmarró,que
comjahemexplicatenunprincipiésdegranimportànciaenelsnounats,peròqueamesuraque
l’individu es va fent gran va disminuint. Per tant, podemexplicar la baixadadeglut2 al fetge a
aquestacausa.Finalment,tambéapreciemunapujadad’adiponectinaalteixitadipós,aixòésdegut
almerfetqueamesuraqueelsratolinsvancreixent,vanadoptantmésreservesenergètiquesque
s’emmagatzemenalsadipòcitscosaqueprodueixunlleugercreixementd’adiponectina.
39
7- CONCLUSIONS
Elsexperimentsrealitzatsilainvestigacióteòricaefectuadaempermetrancontestaralapregunta
principaldeltreball:Afectal’ambientalsnostresgens?
Enconcretidesprésd’efectuaraquesttreball,hepogutapreciarque,sibésemblaquel’expressió
delsgensquecodifiquenlesproteïnesGLUT2alfetgeiADIPOQalpàncrees,haginaugmentaten
elsratolinsalimentatsambpinsoapartirdela3asetmanad’edat(ratolinsde8setmanes),aquest
augmentnoéssignificatiusiestenenenconsideracióelsmargesd’errordelesdadesilapocaquan-
titatdemostresobtingudes.Pertant,noespotafirmaral100%quel’expressiód’aquestsgenshagi
augmentat amb el canvi de dieta dels ratolins.
D’aquestamanera, isivolguéssimferunestudimésrigorós,seriaconvenientampliarelnúmero
deratolinsielsmargesd’edat(perobservarcoml’edatéssignificativaalparlardegens).També
haguésestatinteressantobservarratolinsquehanestatcriatsendiferentscondicions(compotser
ladieta,l’exercicifísic,etc).
Calafegirqueenexperimentsd’aquestescaracterístiquess’hand’efectuarapartirdegransquan-
titatsd’individusidediferentstipus,pertald’obtenirresultatsmésconcloents.Ésimportanttenir
encompteuncriteriquejonoemvaigmarcar,iéseldedetallaroespecificarméselsparàmetres,
jaqueperexemple,enaquesttreball,elsratolinssempreestrobavenenlesmateixescondicionsi
laúnicavariablequehivahavervaserladeladieta(quedefet,vaseronvaigapreciarelsmajors
canvis d’expressió gènica).
Aixídoncs,elmeutreball,comjaesvaespecificarenunprincipi,ésunapetitamostradelqueés
unprojectecientíficactualilesdificultatsimetodologiapròpies,concretamentuntreballsobrela
epigenètica.Unaciènciaque,comhepogutcomprovarésmoltpunteraperòal’horaindefinidaon
s’estanefectuantmoltstreballsrelacionatsambl’ambient ielsgensaunnivellmésconcretque
aquest treball.
40
8- BIBLIOGRAFIA
SCISHOW:Breureportatgeenangléssobrelaepigenètica
www.youtube.com/watch?v=#7152A1
UTAHUniversity:Webeducativasobrelaepigenètica
learn.genetics.utah.edu
Websobreinvestigacióepigenèticamoltpuntera
www.epigenesys.eu/
Articleencastellàsobrel’influenciadel’ambientalsnostresgenshttp://www.somosmultiples.
es/blog/2012/11/23/los-gemelos-identicos-victimas-de-sus-genes-o-producto-del-entorno/
Quèésl’epigenètica?Exemples
http://theconversation.com/explainer-what-is-epigenetics-13877
Aplicacionsdel’epigenèticaenlaoncologia
http://www.madrimasd.org/informacionidi/noticias/noticia.asp?id=34033
Articleenanglèssobrelesdiferenciesepigenètiquesenbessonsunivitel•lins
http://www.pnas.org/content/102/30/10604.long
PCR a temps real. Explicació
http://www.ilm.pf/PCRtempsreel
Epigenèticairegulaciógènica
http://science.howstuffworks.com/life/genetic/epigenetics.htm
Article“Laregulacióndelaevolución”SeanB.Carrol,BenjaminPrud’hommeiNicolasGompel
Article“Laepigenètica”MarcelinaParrizas
Article“Reacciónencadenadelapolimerasaisecuenciación”MauricioRealpe,NoraAlmaFierro,
Arturo Panduro
“Lacèlula”Cooper’sGeoffreyM.Cooper
4�
9- ÍNDEX D’IMATGES
-Figura1:Procésdel’expressiógènica(deDNAaproteïnes)
-Figura2:Nivellsd’empaquetament
-Figura3:Grupmetil
-Figura4:DiferènciesenlacompactaciódelDNAsegonsgrupmetilogrupacetil.
-Figura5:Genactivat-Grupacetil–Lacèl·lulaemetfluorescència
-Figura6:Gendesactivat–Grupmetilè–Lacèl·lulanoemetfluorescència
-Figura7:FuncionamentdelsmicroRNA
-Figura8:Cromosomesdebessonsdediferentsedats
-Taula9:Diferentsinfluènciesambientalsdediferentstretsdelserhumà
-Figures10i11:SulfuraraniDisulfurdeal·lil
-Figura12:Herènciatransgeneracional
-Taula13:Esquemadelesmostresobtingudes
-Imatge14:SeparaciódelRNAdisoltenelcloroform
-Imatge15:Eppendorferdecolumna
-Imatge16:Geld’agarosaenelsdenominatspous
-Figures17i18:Mostres3ratolinssetmanesi8setmanes
-Figura19:Procésdelareaccióencadenadelapolimerasa
-Figura20:RamificacionsdeDNAdiana
-Gràfic21:Gràficdel’ampliaciódeDNAdelesmostres
-Taula22:DiferentsCtdediferentsmostresefectuades
-Taula23:Resultatsdel’anàlisiestequiomètric
-Imatge24:ElectroforèsideRNAideal
-Gràfic25:CorbadeP16
-Gràfic26:CorbadeIL6
-Taula27:Duplicats,mitjanesidesviaciódelesmostresdelaPCR
-Taula28:ΔCtdelesmostresdelaPCR
-Taula29:Mostrescorregidesperl’exemplarde3setmanes
-Gràfic30:Canvisenl’expressiódelesmostres
-Gràfic31:Mostrescorregidesperl’exemplarambmésexpressiógènica
top related