TREBALL DE RECERCA

UN ESTUDI EPIGENÈTIC:

CARLA CASTIGNANI VILADOMIUDIRIGIT PER MONTSERRAT BOLÓS

2n DE BATXILLERAT 1

INSTITUT MONTSERRAT

6/11/13

LA INFLUÈNCIA DE L’AMBIENTA L’HERÈNCIA GENÈTICA

Voldria agraïr en primer lloc a la meva tutora l’entusiasme mostrat desde el primer moment

i pel seu acompanyament durant aquest treball de recerca. A la Dra. Novials per obrir-me

les portes dels laboratoris IDIBAPS. I molt especialment a la Dra. Parrizas pel seu afecte i

disponibilitat a l’hora d’ajudar-me i resoldre dubtes.

�

ÍNDEX GENERAL

�-INTRODUCCIÓ

2-OBJECTIUS

3-MARC TEÒRIC

3.1Introduccióalagenètica

3.2 Regulació gènica

3.2.� Regulació transcripcional

3.2.�.a Seqüència del DNA

3.2.1.bEstructuradelacromatina

3.2.1.b-1MetilaciódelDNA

3.2.1.b-2Modificacionsdeleshistones

3.2.2 Regulació post-transcripcional

3.2.2.a Micro RNA

4-QUÈ ÉS LA EPIGENÈTICA?

5-METODOLOGIA DEL TREBALL

5.� Extracció del teixit del ratolí

5.2 Obtenció de les mostres

5.3 Homogeneïtzació

5.4 Extracció del RNA

5.5 Valoració del RNA (pureses)

5.6 Valoració del RNA (integritat de la molècula)

5.7 Transcripció inversa (RT)

5.8 Reacció en cadena de la polimerasa (PCR a temps real)

6- RESULTATS

6.� Resultats valoració del RNA

6.�.� Puresa de la molècula

6.�.2 Integritat de la molècula

6.2 Valoració dels resultats de la PCR a temps real

7- CONCLUSIONS

8- BIBLIOGRAFIA

9- ÍNDEX D’IMATGES

pàg.2

pàg.3

pàg.4

pàg.4

pàg.6

pàg.6

pàg.7

pàg.8

pàg.8

pàg.�0

pàg.��

pàg.��

pàg.�2

pàg.�6

pàg.�6

pàg.�6

pàg.�7

pàg.�7

pàg.�9

pàg.�9

pàg.22

pàg.22

pàg.29

pàg.29

pàg.29

pàg.30

pàg.32

pàg.39

pàg.40

pàg.4�

2

1- INTRODUCCIÓ

Eltemad’aquesttreballs’haanatconsolidantapartir,d’unabanda,delmeuinterèsenelsestudis

genèticsi,del’altra,del’oportunitatqueemvadonarlamevatutoradecontactarambelcentrede

recercaIDIBAPS,onpodiaferuntreballpràctic.

LadirectoradelIDIBAPS,laDra.Novials,ensvaacollird’unamaneramoltgenerosaiensvasug-

gerirferuntreballenl’àmbitdelaepigenètica.Hepoguttreballarcomaestudiantenpràctiques

enl’IDIBAPSdesdefinalsd’abrilfinsamitjansdejuliol.L’IDIBAPSemvaassignarcomatutorala

Parrizas,doctoraenbiologia,quehatingutlapaciènciad’ajudar-meiassessorar-meentot.Haestat

JuntamentamblaDra.Parrizasquevàremacordarferuntreballques’ajustésalesmevespossibili-

tatsperòal’horafosinteressant.

Al’inicid’aquesttreball,jonodisposavadelsconeixementsnidelsrecursospertreballarlliurement.

Per tant, vaig començara cercar informació sobrequèés laepigenètica iquèestudia.Després,

ambl’ajutdelamevatutora,laDra.Parrizas,vaiganaraprenenttotalametodologiadeltreballen

genètica.Defet,aquesttreballésunapetitamostraaescalareduïdadelstipusd’investigacionsque

s’estan duent a terme actualment sobre l’ambient i els gens.

Finalment,isensepràcticamentadonar-me’n,m’haviaanatmarcantunsobjectiussecundarisque

esdevindrienessencialsal’horadeferaquesttreball,comconèixernovestècniquesdelaboratori

comlareaccióencadenadelapolimerasa(PCR),l’anàlisigenèticofinsitot,unaciènciamoltinno-

vadoracoméslaepigenètica,queésdedicaaestudiarl’efectedefactorsexternssobreelsnostres

gens.

Personalment,aquesttreballm’haestatútilperentendremillorelfuncionamentd’unlaboratori,

peròtambéperpoderaccediraunconeixementquenormalmentnohaguéspogutaccedir.Hepo-

gutaprendrecoms’efectuauntreballd’investigaciócientíficaactualment(fetqueemserviràsens

dubteenunfutur).Opinotambéqueaquesttreballm’hafetveurelaimportànciaqueestàadop-

tantlaepigenèticaisobretotfinsaquinpuntenspotajudaracombatremalaltiesoaprevenir-les.

3

2- OBJECTIUS

L’objectiugeneraldeltreballésdeterminarsil’expressiódecertsgensesveumodificadaperfactors

ambientals,enaquestcascontretperuncanvidedieta.

Eltreballconsisteixendeterminarsihihacanvienl’expressiógènicadecertsteixitsd’unsratolins

de3setmanes,alimentatsúnicamentamblletmaterna,ambunsde8setmanes,quehanestat

alimentatsambpinsoapartirdela3asetmana.

Aquesttreballs’emmarcadinsl’àmbitdelsestudisenepigenèticaquetéperobjectiugeneralelde

determinarsielsfactorsambientals–enelnostrecasladieta-modifiquenl’expressiódelsgens.

Unaltredelsobjectiusd’aquesttreballésconèixer,d’unabanda,elcampdelaepigenèticacomun

delsàmbitsd’investigacióbiomolecularactualimoltpunteri,del’altra,lametodologiaques’utilitza

enunlaboratorid’investigaciópertald’observarl’expressiód’ungen.

4

3- MARC TEÒRIC

3.� INTRODUCCIÓ A LA GENÈTICA

Entotselsorganismeselmaterialgenèticdetoteslessevescèl·lulesésidènticiestrobacontingut

enelnuclienformadeDNAcodificatenunaseqüènciadequatrenucleòtids(adenina,timina,ci-

tosinaiguanina)conegudacomàciddesoxiribonucleic(DNA).Aquestamolèculatéunaestructura

molt significativa:unadoble cadenahelicoïdal denucleòtidsen laqual cadaund’ells s’aparella

específicamentambunaltre(adeninaambtimina,citosinaambguanina).

Sónalgunesd’aquestesseqüènciesdelDNAlesqueconstitueixenelsgens(elgenomahumàestà

constituït per unes 3000megabasesde les quals nomésel 5% codifiquenunaproteïna, és a dir

s’expressenalacèl·lula),launitatfonamentaldel’herència.Percomplirlasevafunció,elsgenshan

desertranscrits,donantllocaunamolèculad’àcidribonucleic(RNA),unacadenasenzilladenu-

cleòtidstranscritaapartirdelDNA,peròambunacomposiciólleugeramentdiferent,jaqueconté

uracilenllocdetimina.Aquestprocésanomenattranscripcióesduatermeal’interiordelnuclide

lacèl·lula.

Cadagen,atravésdelRNA,seràtraduïtaunaproteïna.Aquestprocésanomenat“traducció”,dut

atermealsribosomes,s’efectuaseguintuncodisegonselqualcadacombinaciódetresnucleòtids

(un“codó”)corresponaunaminoàciddinsd’unacadenaproteica(ésadirunaproteïna).

Figura 1

Procés de l’expressió gènica (de DNA a proteïnes)

5

Perònototselsgenss’expressenalmateixtempsnientoteslescèl·lules.Defet,cadatipuscel·lular

eucariotaexpressanomésunafracciódelsgensqueté,alvoltantdel20%.Ésadir,nomésel20%

delsgensquecontél’ADNestranscriuaARNidesprésestradueixenproteïnes.

Aixídoncs,exceptuantelsgensconstitutius(gensques’expressenentoteslescèl·lulesdel’organisme

i codifiquen proteïnes que són essencials per al seu funcionament general) tots els altres gens

s’expressenonodepenentdelafunciódelacèl·lulaenunteixitparticular.Aquestfetéslògic,ja

queelcossempretendeixaeconomitzarinotindriacapsentitque,perexemple,unaneuronasin-

tetitzésunaproteïnaencarregadadeltransportdelaglucosa,jaquelaneuronanorealitzaaquesta

funció.

Pertant,lacomplexitatbiològicadepènmenysdelnombredegensquedelaformacomaquests

s’expressen.Enconseqüència,avuiendias’estàdestinantgransinvestigacionssobrecomestàre-

gulada l’expressió dels gens.

D’altrabanda,ésimportanttenirencomptequeenelshumans,elDNAmesuraaproximadament

uns dos metres de longitud (uns 3.200.000.000 parells de bases nitrogenades) però es troba encap-

sulat dins un nucli que consta d’uns pocs micròmetres de diàmetre. És per això que el DNA reque-

reixunempaquetamentocompactacióimportantiqueesduatermegràciesaunesproteïnes,les

histones,constituentaixílacromatina.

Existeixendiferentsnivellsd’empaquetament,diferenciant-seen:

1-Primernivelld’empaquetament:Fibradecromatina.

Lafibradecromatinaocollaretdeperlesestàformadapelsanomenatsnucleosomes,que

sónvuithistonesenrotlladesenunfragmentdeDNA.

2-Segonnivelld’empaquetament:Solenoide.

Esformaperl’enrotllamentsobresimateixadelafibracondensadadecromatina.Aixòpro-

vocal’escurçamentdecincvegadesaproximadamentlalongituddelcollaretdeperles.

3-Tercernivelld’empaquetament:Dominisestructuralsenformadebucle.

Lafibradesolenoideformaunasèriedebuclesquequedenestabilitzatsperdeterminades

proteïnes.

4-Nivellssuperiorsd’empaquetaments:

Aquestésl’últimnivelld’empaquetamentinosempreespresenta,depènsobretotdelmo-

mentenqueestrobalacèl·lula(enlametafasesobretot).Estariaconstituïtbàsicamentpels

cromosomes,ésadirperl’empaquetamenttotaldelDNA.Uncromosomatétantsols5,5um

delongitudiconté4cmdefibradeDNA.Pertant,elDNAocupaunalongitud7000vegades

inferior.

6

Primer nivell d’empaquetament

Segon nivell d’empaquetament

Tercer nivell d’empaquetament

Cromosoma

Figura 2

3.2- REGULACIÓ GÈNICA

Enaquesttreball,enscentraremen lescèl·luleseucariotes, tenintencompteque l’estudi l’hem

efectuatsobreunsratolins.Aixídoncs,elsmecanismesderegulaciógènicadelescèl·luleseuca-

riotessónmoltméscomplexesquelesprocariotesielspodemclassificarentresnivells.Elprimer

consisteixen la seqüènciadenucleòtidsde lamolèculadeDNAen si. El segonnivell depènde

l’estructuradelacromatinailaregulacióepigenètica(aquestnivellrespondriapertoteslesproteï-

nesqueenvoltenelDNAilainfluenciad’aquestessobrelamateixacadena).Finalment,eltercer

nivelleltrobemenlaregulaciópost-transcripcional,ésadirqueestrobadurantelprocésdeRNA

a proteïnes.

3.2.� REGULACIÓ TRANSCRIPCIONAL

Comjaheexplicatabans,latranscripcióéselprocéspelquals’obtéunamolèculadeRNAapartir

d’unadeDNA.Aquestprocésésmolt important, jaqueéselprocésquedeterminaràon iquan

s’expressaungen.Defet,lamajoriadegensdelescèl·luleseucariotesestanmajoritàriamentregu-

lats a nivell transcripcional.

7

3.2.�.a SEQUÈNCIA DEL DNA

Ésbàsicentendreque,elgenésunaseqüènciamoltpetita,comparadaambl’enormitatdelDNA.

Aixídoncs,existeixenseqüènciesqueaprimeravistaenspodensemblarintranscendents,jaque

nocodifiquencapproteïna,però resultenbàsiquesper l’expressiódelgenenqüestió.Aquestes

seqüències són les encarregades del control de la transcripció del gen.

Els promotors:

Unpromotoresdefineixcomaunaseqüènciadenucleòtids(generalmentd’unsquantscentenars)

que serveixen de punt de reconeixement per a la unió de la RNA polimerasa (enzim encarregat de

sintetitzarRNAapartirdelDNA,ésadir,d’efectuarlatranscripcióensi).Elspromotorsrepresenten

laregiónecessàriaperiniciarlatranscripció,ésadirensserveixencomasenyald’inici,iestanloca-

litzadesaunadistànciafixaimmediatamentadjacentsalsgensqueregulen.

Els intensificadors

Amésdelesregionspromotores,latranscripcióestàreguladaperseqüènciesdeDNAaddicionals

anomenades intensificadors.Aquestes regions interaccionenambproteïnes reguladores ipoden

incrementarl’eficiènciadelainiciaciódelatranscripcióopodenactivarelpromotor.Sónsenyals

d’activacióadistànciaqueespodentrobarenqualsevolllocdelaseqüènciadeDNA(potestarlo-

calitzatabans,desprésodinsdelgenqueregula),ésadiractuendeformaindependentalaseva

orientació o distància a la que es trobin.

Elsintensificadorsesconsiderenl’elementreguladormésabundant,representantpràcticamentun

10%delgenomahumà.

Lesseqüènciespromotoressónessencialsperalatranscripció,mentrequeelsintensificadorsno

hosón.Elsintensificadorspodenestimularelsnivellsdetranscripcióacertadistància,mentreque

això no passa amb els promotors.

Els silenciadors

Els silenciadors són seqüències de DNA que disminueixen la taxa de transcripció d’un gen quan son

reconeguts per una proteïna de transcripció.

8

2.�.2.b ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

L’empaquetamentrealitzatperleshistones,prèviamentexplicatalprincipidel’apartat,ésl’encarregat

deregularl’estructuradelDNAil’accésdefactorsdetranscripcióalacadenadelDNA.Conseqüent-

ment,ungenestranscriuràdepenentjanodelasevaseqüènciasinódelnivelld’empaquetament

enqueestrobi.Laepigenèticaés,doncs,laciènciaqueestudial’estructuraexternadelDNAiles

seves mutacions.

Mecanismesepigenètics:

ElsmecanismesepigenèticsinclouenlametilaciódelDNA,lesmodificacionsdeleshistonesilare-

gulaciópost-traduccionalexercidapelsRNAsnocodificants(microRNA).Aquestsmecanismessón

els encarregats de controlar l’epigenoma i l’expressió dels gens.

3.2.�.b.� Metilació del DNA

LametilaciódelDNAésundelsmecanismesepigenèticsmésestudiats.Téunpaperfonamentalen

l’activacióoinactivaciódecertsgens.

Figura 3

Grup metil

Ungrupquímicanomenatmetil(CH3)s’uneixalesbasesnitrogenadesdelaCitosinaolaGuanina

(unidesentresi)id’algunamaneraimpedeixlaexpressiód’aquellgencompactant-lomoltifent-lo

difícilmentaccessiblepelsfactorsdetranscripció.

9

Figura 4

Diferències en la compactació del DNA segons grup metil o grup acetil.

D’altrabanda,elgrupacetil(-CO-CH3)actuaunint-sealeshistonesperòamblafunciócontraria

queelgrupmetil,deslligarelDNA,fer-lomésllegiblepelsfactorsdetranscripcióiconseqüentment

permetrel’expressiódelgenenqüestió.

Perexemple,s’hacomprovatqueungenanomenatGFPsintetitzaunaproteïnaquedónafluores-

cènciaauntipusdemeduses.Aixídoncs,imaginantqueaquestacèl·lulapertanyaquestamedusa,

nosaltrespodemcontrolarlafluorescènciadelacèl·lulafentelgenfàcilmentaccessibleoinacces-

sible.

Grupacetil

Figura 5 Gen activat - Grup acetil – La cèl·lula emet fluorescència

Grupmetil

Figura 6 Gen desactivat – Grup metilè – La cèl·lula no emet fluorescència

�0

3.2.1.b.2 Modificacions de les histones

RecordemqueleshistonessónlesproteïnesquevanunidesalDNAiqueenregulenlasevaestruc-

tura.Aquestess’uneixende8en8formantelsanomenatsnucleosomes.D’aquestamanera,leshis-

tonestambéinflueixenenlacompactaciódelacromatina.Defet,aleshistonesselipodenadherir

diferentsgrupsquímicsoproteïnes,quecanviïnlaestructurad’aquesta.

AnteriormenthemexplicatlametilaciódeDNA,ésadirlauniódegrupsmetilalacadenadeDNA.

Tanmateix,aquestsgrupsmetiloelsgrupsacetiltambéespodenenganxaraleshistonesambla

mateixafunciódecompactacióodeoberturadelDNA.

Unexempledemodificaciódeleshistonesésl’adherènciad’unaminoàcidanomenatlisinaambcà-

rregapositivaquecompactal’estructuradelDNAlaqualcàrreganegativa.Recordemquecàrregues

oposades s’atrauen.

LA EPIGENÈTICA ÉS REVERSIBLE?

Actualment es dona molta importància a la reversibilitat

delaepigenètica,jaquepotserclauenlacurademalal-

tiesambunfortcomponentepigenètic,comelcàncer.

S’haobservatals laboratorisqueenuncerttipusde ra-

tolins que tenen el gen que expressa el color del cabell

(agoutí) fortament regulat per la metilació del DNA, si

l’alimentavenambnutrientsricsengrupsmetil,estorna-

vendecolormarró,peròquesidespréselshiaplicaven

unadietaricaambgrupsacetil,tornavenalseucolorori-

ginal,colorcru.

D’aquestamaneraisabentqueelcàncerésunaduplicació

cel·lulardescontrolada, s’handetectat gensque regulen

laduplicaciócel·lularisis’investiguéscompodemregular

aquests gens es podria evitar l’expressió de gens malignes

o tumorals.

��

3.2.2 REGULACIÓ POST-TRANSCRIPCIONAL

3.2.� Micro RNA o RNA no codificant

UnmicroRNAésunRNAmonocatenarid’uns20o25nucleòtids,ésadirmoltpetitcomparatamb

lalongituddelDNAodelRNAmateix,queregulal’expressiógènicaanivellpost-transcripcional.Els

microRNAsónuntipusdeRNAno-codificant,quenocodifiquencapproteïnaitenenunmecanisme

moltsenzill:s’uneixenaunRNAsi-codificant,inhibint-loievitantques’expressi.

Figura 7

Funcionament dels microRNA

�2

4- QUÈ ÉS LA EPIGENÈTICA?

Laepigenèticaéslaciènciaqueestudiacoml’ambientilahistòriadel’individuafectenal’expressió

delsgens.S’atribueixlacreaciódeltermeaConradWaddingtonl’any1942comqueladefineixcom

“labrancadelabiologiaqueestudialesinteraccionscausalsentreelsgensielsseusproductes,que

donenllocalfenotip”.Tanmateix,novaserfinsapartirdel1990queesvacomençaracomprendre

quelaseqüènciadenucleòtidsdelDNAnohoeratotivancomençaraaparèixerinvestigacionsamb

l’objectiudeentendreiconèixermillorl’estructuradelDNA.Apartirdellavors,s’hanefectuatmol-

tesinvestigacionssobrelaregulaciódel’expressiógènicaidecoml’ambientpotmodificar-la.

Finsitot,avuidia,encaranoexisteixunacorduniversalsobrefinsaquinpuntlesinfluènciesgenèti-

ques i ambientals estan relacionades i com ens veiem modelats per aquestes.

EXEMPLES D’EPIGENÈTICA

Comjas’haditabans,actualments’estanduentatermemoltes investigacions idegranvarietat

relacionadesamblaepigenètica.Unexemplemoltgràficsobrelaepigenèticaestrobaenl’estudi

debessonsunivitel·lins,elsqualstenenelmateixcodigenètic.Malgratquedepetitspuguinsem-

blar-nosidènticsiavegadesenssiguidifícildistingir-los,quanarribenalaterceraedatsovinthan

adoptatunfísicdiferento,finsitot,malaltiesdiferents.Aixòésdegutalfetqueelsbessonsnohan

viscuttota lavida junts,hantingutestilsdevidadiferents.Perexemple,unpotserhacomençat

afumardesdemoltjoveihatingutunavidasedentària,encanvi,l’altreharealitzatexercicifísic

constantaixícomunadietaequilibrada,elmésprobableésqueenarribarals80anys,tinguinun

aspectecompletamentdiferent.

Lasegüentil·lustracióensmostraelscromosomesd’unsbessonsdetresanysambunsde50anys.

Alaprimerail·lustració,apareixengranstaquesdecolorgroc,quesónlessenyalsepigenètiques

queteneniguals.Mentrequealasegonaimatge,apareixentaquesverdesivermelles,significant

lessenyalsepigenètiquesdiferents.D’aquestamanera,observemque,encaraquecontinuïntenint

lamateixainformaciógenètica,havariatcompletamentlasevaexpressiódelsgens,ésadir,lain-

formacióepigenètica.

�3

Figura 8

Cromosomes de bessons de diferents edats

Investigacionsdutesatermeactualmentensdemostrenquehihaunasèriedetretsocaracterísti-

quesdelserhumàenlesqualslainfluènciadel’ambientésmésomenysdecisiva.Lasegüenttaula

ensposademanifestunasèriedemalaltieso tretsendiferentstipusdebessons, lescolumnes

blanquescorresponentsabessonsunivitel·linsilesgrisesclaretabessonsdiferentsgenèticament.

Aqueststretshanestatordenatsdemajorinfluenciagènica(perexemplel’alturaol’habilitatdelle-

gir)finsalamenorinfluenciagènica,pertantmajorinfluenciaepigenètica(comperexemplel’ictus

ol’artritisreumatoide).

Taula 9 Diferents influencies ambientals de diferents trets del ser humà

�4

Per il·lustraraixò, siobservem l’esquizofrèniaenbessons,podemdirque lamalaltiaenbessons

univitel·linsapareixentotsdosgermansenun60%delscasos,mentrequenomesenun10o15%

delsbessonsnounivitel·linsdesenvolupenlamalaltiatotsdos.Aixòsignificaquel’esquizofrèniaté

unaltcomponentgenètic,perònoésúnicamentlagenèticaelfactordecisiu,jaquel’altre40%res-

tant,onnomésundelsbessonsladesenvolupa,ésdegudaafactorsambientals.

Sabemquel’ambienti l’estildevidaqueportemafectaalsnostresgens,perònosempreésfàcil

demostrar-ho.Malgrataixò,undelsfactorsambientalsmésfàcilsd’estudiarallaboratoriésladie-

ta,peraixò,alllargdelsanyss’hananatrealitzantmoltsestudisepigenèticsqueestudienlaseva

influència.Elmenjarquemengemesdegradaennutrients,queentrenenelsistemametabòlici

arribenalescèl·lules.S’haobservatallaboratoriqueunmenjarricengrupsmetil,comlavitamina

B12olaB6queestrobaperexempleencarn,fetge,llet,vegetalsonouspotmetilarsegonsquins

gens.Tambés’haobservatquecertsalimentscomperexempleelbròquil,queésricenunnutrient

anomenatsulfuraran,aixícoml’all,ricendisulfurdeal·lil,causaunincrementenl’acetilaciódeles

histonesdegensanti-cancerígens.

Figura 10

Sulfuraran

Figura 11

Disulfur de al·lil.

�5

ELS SENYALS EPIGENÈTICS SÓN HERETABLES?

Aquestapreguntasel’hanfetmoltesvegadesmoltesvegadesmilersd’investigadors

queestudienlaepigenètica.Tanmateix,lesrespostesencaranosónclaresisovintes

considerenméscomaopinionsquenopascomafetsdemostrables.

Detotamanera,lahistòriaensproporcionaexemplesquedonensuportalaideaque

sónheretables.Durantel1944i1945,hivahaveraHolandaunaetapacaracteritzada

perlafaltad’alimentsirecursos.Aixídoncs,lesdonesqueestavenembarassadesen

aquellperíodevandonarallumaunsfillsdèbils,ambbaixpesiambmalaltiestant

cardiovasculars,d’hipertensióofinsitotdiabetis.

Figura 12

Herència transgeneracional

Elsinvestigadorsexpliquenaquestfetcoml’herènciatransgeneracional,jaque,durant

l’embaràsd’unadona,el fetus i lescèl•lulesreproductivesd’aquestesveuenexpo-

sadesamutacionsepigenètiques.Aixídoncs, lesrepercussionsd’unadietabaixaen

nutrientscoméselcasanteriormentexplicatpodenserexplicadesfinsa la tercera

generació.

Malgrataixò,existeixenteoriesqueafirmenquelessenyalsepigenètiquesadquirides

durantelcursdelavidas’heretenencaraquenosesapbenbécom.Pràcticamentcom

lesteoriesLamarckianes,queafirmavenqueelscaràctersadquiritss’heretaven.

�6

5- METODOLOGIA

Lametodologia seguidaperavaluar l’expressiógènicaendiversos teixitsd’uns ratolinsés la se-

güent:

5.� EXTRACCIÓ DELS TEIXITS

Aquestpasesfamitjançant la injecciód’unasubstànciaanestesiantcompotsereldiacepan. En

segonlloc,esdislocaalratolíambungestràpidifort,separantaixíelcapdelcos.Finalment,amb

l’ajutd’unbisturís’obreelratolí,s’extreuenelsteixitsdesitjatsiescongelenràpidament.Aquestpas

nol’hedutatermejopersonalment,jaquealslaboratorishihacertespersonesespecialitzadesen

duratermeaquestafeina.

5.2 OBTENCIÓ DE LES MOSTRES

Uncophempreparatlesmostresalsependorfers,classifiquemlesmostresdelasegüentmanera

per tal de mantenir un ordre clar.

RATOLINS

3 setmanes 8 setmanes

Ratolí 1 Ratolí 2 Ratolí 1 Ratolí 2

Pàncrees

(Pancreas1.3w)

Pàncrees

(Pancreas2.3w)

Pàncrees

(Pancreas1.8w)

Pàncrees

(Pancreas2.8w)

Fetge

(Liver1.3w)

Fetge

(Liver2.3w)

Fetge

(Liver1.8w)

Fetge

(Liver2.8w)

Teixit adipós marró

BAT(1.3w)

Teixit adipós marró

BAT(2.3w)

Teixit adipós marró

BAT(1.8w)

Teixit adipós marró

BAT(2.8w)

Taula 13

Esquema de les mostres obtingudes

�7

5.3 HOMOGENEÏTZACIÓ

L’homogeneïtzacióéselprocésques’haderealitzarpertaldegarantirquelesmostresqueanalit-

zaremestiguinenunamateixareferència.D’aquestamaneraensasseguremquequalsevolmostra

analitzadad’aquest teixittingui lesmateixes característiquesqueunaaltra i siguin comparables

proporcionadament.Aquestprocésespotrealitzardemoltesmaneres,però,enaquestcas,s’ha

preferitelmètodedelacongelacióitrituració,jaqueéselmésràpidieficaç.Elnitrogenlíquid�és

nitrogen pur en estat líquid que es troba a una temperatura igual o menor que la seva temperatura

d’ebullició(-195,8ºC)ienspermetcongelarqualsevolmaterialmoltràpidamenticonvertir-loenun

cosfràgil.Aixídoncs,ambl’ajutd’unmorteri,abocantprèviamentnitrogenlíquidsobrelesmos-

tresdeteixit,s’hatrituratselteixitscongelatsconvertint-losenpols.Méstard,s’hancol·locatenun

ependorfer2 a baixa temperatura.

5.4 EXTRACCIÓ DEL RNA

EnspodríempreguntarperquèhemvolgutextreureelRNAinoelDNAsielquevolemésanalitzar

elmaterialgenèticilasevaexpressió.PeròhemderecordarqueelRNAéselresultatd’unprocés

anomenattranscripcióiéselquevariaencadacèl·lulajaquedepèndel’expressiód’aquesta.Con-

seqüentment,notindriacapsentiranalitzarelDNAjaquelaseqüènciaésexactamentigualatotes

lescèl·lules.

L’extracciódeRNAesrealitzamitjançantelcloroformcomadissolvent.Aquestaextraccióesrealitza

en un ependorfer decolumna,quedónanomalmètodeutilitzat:“extraccióencolumna”.

Abansderealitzarl’extraccióambcloroform,esdesnaturalitzenelsteixitsambfenol(elfenolésun

dissolventorgànicicolorant,quedesnaturalitzaelteixit,ésadir,canvialasevaestructuraqueve

donadaperfactorscomlatemperatura,elpH,olapolaritatdeldissolvent)

iescentrifugalamostrapertaldebarrejar-hototbéimillorarl’eficàcia.Desprésdedeixar-horepo-

sardurant5minutsatemperaturaambient,s’obtéunasolucióambRNA,DNAiproteïnes.

Pertald’extreure’nelRNAhiafegim,almateixeppendorfer,140μldecloroformihotornemacen-

trifugarperò,aquestcop,15minpertaldesepararlasoluciósegonslesdensitats.Elcloroformés

1NITROGENLÍQUID:Elnitrogenlíquidésnitrogenpurenestatlíquidqueestrobaaunatemperaturaigualomenorquelasevatemperaturad’ebullició(-195,8ºC)ienspermetcongelarqualsevolmaterialmoltràpidamenticonvertir-loenuncosfràgil.2EPENDORFER:recipientdeplàstictotalmentesterilitzatambunatapaonpodemdipositarsolucions

�8

unaltredissolvent,molthidrofòbic3,comelRNAisobretotinsolubleenelfenol.D’aquestamanera,

elRNAesdissoldràenelcloroform,lesproteïnesquedaranalfonsjuntamentambelfenolielDNA

quedaràalmigdelsdosdissolventsjaquenoesdissol.

Imatge 14

En aquesta foto observem com, amb l’ajuda d’una pipeta separem el RNA disolt en el cloroform.

Acontinuació,s’agafaambunapipetalapartdelcloroformdel’eppendorfer,ambmoltdecompte

denocontaminarlamostraambDNAosoluciódefenoliproteïnes.

DisposemelRNAenunaltreeppendorferihiafegim1’5partsdelvolumdelasolucióiniciald’etanol

queenspermetran,alpassegüent,separarambmésfacilitatelRNAdelasolució.

Finalmenthodipositemenunaltreeppendorferdiferent,anomenatdecolumna.Aquesteppen-

dorferésespecíficperaquestafunció,extreureelDNAoRNA.Aixídoncs,estàcompostperdos

recipients,undinsdel’altre.S’utilitzaespecíficamentperapurificarARNoADNd’unasolució,ies

basa en el mètode d’elució4.Aixídoncs,elrecipientpetittéunaespèciederesinaanomenadasilica

que,gràciesalintercanviiònicdecàrregues,faquelesmolèculess’enganxinaella,comuncolador.

Aixídoncs,mentrenosaltrespassemelcloroformambelRNAaquestesquedaràenganxatalare-

sina,peròenpassar-hiaiguadesprésdelRNAbaixaràipodremtenirunasoluciópuradeRNAamb

aigua.

3HIDROFÒBIC:Anomenemunasubstànciahidrofòbicaquanaquestaesrepeladel’aiguaonoespotmesclarambella.

4ELUCIÓ:Laelucióésuntermeusatenquímicaanalíticaiorgànicaperdescriureelprocésd’extracciód’unmateriald’unaltremitjançantelrentatambundissolvent

Cloroform+RNA

DNA

Fenol+Proteïnes

�9

Imatge 15

Eppendorfer de columna

5.5 VALORACIÓ DEL RNA (puresa)

Uncops’haextretelRNA,s’hadecomprovarquelamostranos’hagicontaminatambdissolvents

coml’etanoloel fenolquetrencarienelsRNA(recordemquesónmolt fràgils).Perduraterme

aquestpas,utilitzemelmètodedelaespectrofotometria.

L’espectrofotòmetreésuninstrumentqueenspermetmesurar,enfunciódelalongitudd’ona,la

quantitatdellumabsorbidaenunadissolució,queésproporcionalalaquantitatdesolutqueconté

i que mesurem com a concentració de solut.

5.6 VALORACIÓ DEL RNA (integritat de la molècula)

LavaloraciódelaintegritatdelamolèculadeRNAs’efectuaactualmentmitjançantprocessosauto-

matitzats.Malgrataixò,enaquesttreballs’haefectuataquestprocésmanualmentpertald’entendre

millorelprocediment.Aquestprocéss’anomenaelectroforesi.

Laelectroforesienspermetsepararmolèculesenfunciódelseutamany,formaielectronegativitat

ensersotmesesaunadiferènciadepotencialelèctric.

Perferl’electroforesiesnecessitaunmediporós,peronpuguemferpassarlesmolèculesdeRNAa

través.Enaquestcashemutilitzatagarosa5,queestàenformadelíquidconcentrat.Acontinuació

s’escalfal’agarosais’hiafegeixunasoluciótampó(buffer)ques’anomenaTBE,queensmantéelpH,

5AGAROSA:Polisacàridderivatdel’agar(unaalgaques’utilitzaencuinacomaespessantjaquenotégust).

20

iuncolorant.Recordemqueaquestmedihadesertotalmentinert,ésadirquenoreaccioniamb

lesmolècules,poróspertaldequehipuguinpassariambpropietatsuniformespertaldepoder

avaluarproporcionalmenteldesplaçamentdecadamolècula.

Uncopaquestasoluciós’haescalfat,s’abocaaunmotlleon,alrefredar-ses’aniràsolidificant.S’hi

posemtambéunestriques’anomena“peineta”,queenspermetràferlaformad’unsorificisdins

delgelperonhiabocaremlasoluciódeRNA.

Imatge 16

Gel d’agarosa en els denominats pous

D’altrabanda,s’afegeixblaudemetiléalesmostresdeRNApertalque,desprésalposaraquestes

mostresa llumultravioleta, lespuguemveureambmésclaredat.Tambés’hiafegeixunasolució

tampó(buffer)decàrrega.Elsàcidsnucleicstenenpocamassa.Aixídoncs,uncopelssituéssima

cadaorificis’escaparienisurarien.Aquestbufferdecàrregaestàformatperglicerol,ambunagran

densitatperòunacapacitatmínimaperreaccionarambaltressubstàncies(ésadir,inerta).

Uncops’hadipositatcadasoluciómostraalseupou(elsanomenatsforatsfetsposteriormentamb

la“peineta”)hiapliquemuncampelèctric,detalmaneraque,lesmolèculesdeRNA,alestarca-

rregadesnegativament,esdesplaçarancapalpolpositiu.Conseqüentment,aquellesquesónmés

lleugeresiméspetitesarribaranmésllunyadiferènciad’aquellesambmésmassamolecular.

2�

Apliquemaquestscampselèctricsdurantuneshores,i,méstard,traiemelgeld’agarosamoltdeli-

cadamentielcol·loquemaunamàquinaderaigsultravioletesqueenspermetràanalitzarelresul-

tat.ObservemaixíelsdesplaçamentsdelsRNAs.

Elnostreresultatdelsraigsultravioleteséselsegüent:

Figures 17 i 18

Mostres 3 ratolins setmanes Mostres 8 ratolins setmanes

22

5.7 TRANSCRIPCIÓ INVERSA (RT)

Laretrotranscripcióotranscripcióinversaéselprocésqueefectuempertaldeconvertiraquelles

seqüènciesdeRNAquehemobtingutenDNA,jaqueésmésestable(recordemqueelDNAconté

timinainouracil,queésmésestable).ElDNAresultantdelaretrotranscripiciós’anomenaDNAc

(complementari).

Perefectuaraquestprocés,calmantenirconstantmenttoteslessubstànciesques’utilitzenentem-

peraturesmoltbaixes,jaquesónmoltsensiblesiespodrienfermalbé.Aixòs’aconsegueixenvoltant

degellasolucióomixmentrehitreballem.

Espreparaunasolucióomixquecontétantenzims(retrotranscriptasa),combasesnitrogenades

(seqüències aleatòries de bases nitrogenades anomenades random primers que s’adhereixen al

RNA i permetenque l’enzim comenci aduplicar la seqüència) o, fins i tot, proteïnes iminerals.

S’introdueixlamostraaaquestasolucióiseliaplicauncicletermalmoltespecíficdurantpràcti-

camentdueshoresenunamàquinaanomenadaRT.LamàquinadelaRTtéunagrancapacitatde

efectuargranscanvisdetemperaturaenuntempsmoltpetitgràciesal’efectePeltier,quepermet

tantrefredarcomescalfarelstubsdelamàquinainvertintelcorrentelèctric.

Elcicleconsisteixenelssegüentspassos:

Unsprimers10mina25ºC(éslatemperaturaidealperquèelRNAéssepariielsprimerss’hipu-

guinunir).Després,idurantdueshores,s’estàaunatemperaturade37ºC(temperaturaidealper

alfuncionamentdelaenzimdelaretrotranscriptasa,quefaràtotelprocésdetranscriureelRNAa

DNAc).Finalmentdurant5mina85ºC(comjasabemelRNAésmoltfràgiliatemperaturesalteses

degrada,s’aprofitaaquestapropietatperdegradar-loiobtenirnomésDNA)iuncoplareaccióha

estatfinalitzadaeldipositema4ºCpertalqueesconservimillorfinsquenos’hagid’utilitzar.

5.8 PCR A TEMPS REAL

Lareaccióencadenadelapolimerasa(conegudacomPCR,lessiglesanglesesdepolymerase chain

reaction)ésunatècnicadebiologiamolecularl’objectiudelaqualésobtenirungrannombrede

còpiesd’unfragmentd’ADNespecíficapartird’unaquantitatmínima.ElsegmentdeDNAaamplifi-

car-sepottenirdesde50finsamilsdenucleòtidsdelongitud.Aquestsistemad’ampliaciódeDNA

vaserdescobertamitjansdeladècadadels70is’haanatperfeccionantfinsal’apariciód’unesmà-

quinesutilitzadesal’actualitatqueefectuenl’anomenadaPCRatempsreal,queenspermetavaluar

lareaccióatempscontinu.

23

Lamàquinatéunfuncionamentmoltsenzill,jaqueellaensiesuntermociclador.Potfergranscan-

visdetemperaturaenuntempsmínimgràciesal’efectePeltier(aligualquelamàquinadelaRT).

Aquestamàquinadoncs,efectuaciclesonvacanviantlatemperatura,seguintunpatró.Acadacicle

observemaquestesetapes:

1- DesnaturalitzaciódelDNA:

Apliquemunatemperaturad’entre92i96ºCdurantuns5-10minpertaldequeladoble

hèlicedelacadenaessepariielsprimersoencebadorss’uneixinalessevesrespectives

cadenes.

2- Alineaciódeencebadorsoprimers:

Esredueixlatemperaturaa50o60ºCpertalque,uncoplescadenesjaestanseparades,

els primerss’hipuguinajuntar.Aquestaetapaduramoltspocsminuts(nosaltresl’hemfet

durar � min).

3- Extensió:

Uncopelsprimersjaestanenganxatsalessevesrespectivescadenescomplementaries,

l’enzimTaqpolimerasacomençaadoblartotalacadenaapartirdel’encebador.Aquest

procésesduatermeaunatemperaturad’entre70i75ºCdurantuntempsde5min.

Figura 19

Procés de la reacció en cadena de la polimerasa

24

Alfinaldecadacicle,elmaterialgenèticdesitjats’hauràduplicat.Malgrataixò,perl’amplificaciói

visualitzaciód’unaseqüènciaespecificaòptimaesrequereixende25a40cicles.

Figura 20

Imaginant que cada ramificació en aquest esquema és un cicle, al 6è cicle ja hi hauran unes 64 copies del DNA diana

Enaquesttreballs’hautilitzat laPCR,nonomésperampliarcertssectorsde lacadenadeDNA,

sinótambéperobservarcomaquestsmateixossectors(corresponentsacertsgensquenosaltresja

tenimidentificats)apareixenendiferentsquantitatsencadascunadelesdiferentsmostres,obser-

vantaixíladiferentexpressiógenètica(ésadirdediferentsgens)enlesdiferentsmostresdeteixits

analitzats.

Al’horadeprepararlaPCRipertald’obtenirunsresultatsmésfiables,s’hapreparatunduplicat

decadamostraresultantdelaRT.Aquestessolucionshandecontenirlamateixaconcentracióde

materialgenèticpertaldetenirunsresultatsproporcionals.Ésperaixòqueaalguness’hanhagut

de diluir anteriorment.

Acadamostra,totseguintelprotocolseliafegeixrespectivament5μld’unasoluciótampó(buffer),

quecontédesoxiribonucleicstrifosfatats,ésadirbasesnitrogenades(ATP,CTP,TTPiGTP),queens

servirandenucleòtidspertaldeformarlacadenacomplementària,tambécontémineralscomMg+

oK+ienzims(ésadir,laTAQpolimerasa,encarregadadefercomençarlareacció).Enaquestasolu-

ciótambéveincorporadaunasondaTaqmanqueenspermetràvalorarlafluorescència.

25

LA SONDA TAQMAN

La sondaTaqmanésundelsmecanismesutilitzatsperquantificar la quantitatdemate-

rial genèticobtingudaacadaciclede laPCR.Per talde feraixò, lamateixamàquinade

laPCResguiaper ladetecciód’unsenyalfluorescentproduïdaproporcionalmentdurant

l’amplificaciódelmateixproductedePCR.

AquestasondaTaqmanéslaqueenspropor-

cionaràel senyalfluorescent, sempredirec-

tament proporcional a la quantitat deDNA

dianaexistent,ésadir laquantitatdeDNA

quevolemamplificar.

La sonda Taqman es una cadena de nucleò-

tidsdelimitadaenunextremperunfluoro-

crom,encarregatd’emetrefluorescència i a

l’altre extrem per un segrestador o quencher.

Aixídoncs,mentreelfluorocromielsegres-

tador estan a la sonda, aquesta no emetrà

captipusdefluorescència,jaqueelsegresta-

dorinhibeixalfluorocromd’emetrecaptipus

defluorescència.

Malgrataixò,irecordemqueaquestasondaestàenganxadaalacadenad’ADNquevolem

duplicar,quanlaTaqpolimerasaarribialpuntonestasituadaaquestasonda,aquesta la

trencarà,permetentaixíqueelfluorocromemetifluorescència.Finalment,laquantitatde

fluorescènciaalliberadadurantcadacicled’amplificacióésproporcionala laquantitatde

producte generat en el mateix cicle .

Aixídoncs,uncoplamàquinahaefectuattotselsciclesnecessaris,ensproporcionauna

gràficaonal’eixdelesxapareixenelscicles(de0a40)ial’eixdelesylaquantitatdefluo-

rescència detectada.

Apartd’aquestasoluciótampótambélihemafegitelsprimersoencebadors,quesónoligonucleò-

tids(ésadirpetitesseqüènciesdeDNA)d’entre18o30bases.Aquestsencebadorscorresponen

alacadenacomplementàriad’unasecciódelprincipiofinaldelgenquevolemampliariobservar.

26

Pertant,sivolemobservar5gensdiferentss’haurandepreparar5solucionsdiferents(totesamb

lamateixabase,peròdiferentprimer).Talcomelseunomindica,elprimeréselprecursordela

reaccióencadenadelapolimerasa,seguitperlaTAQpolimerasa,queésl’encarregadad’efectuarla

majorpartdelareaccióensi.

Elsgensobjected’aquestestudis’hanseleccionattenintencomptequevolíemobservarelcanvi

d’expressiógènicaambl’edat.Pertanthemseleccionatunsgensquesuposàvemqueambl’edatva-

riarieniunsaltresqueno.Tambéhemseleccionatgensparticularsdecadaundelsteixitsestudiats,

perobservarunamicaladiversitatcel·lular.

Siesvolavaluarsihihacanvisenl’expressiógènica,enscalungenpatróquenocanvimailaseva

expressiópertaldecomparar-loambelsaltres.Ésadir,ungenconstitutiu6. Aquest gen s’anomena

actina(ACTB),icodificaposteriormentenunaproteïnaestructuralfonamentalenelcitoesqueletde

lescèl·lulesdelsorganismes.Conseqüentment,apareixatoteslescèl·lulesdel’organisme.

Abandadelgenquecodificalaactina,seleccionatcomagenconstitutiu,elsgensobjected’estudii

quecodifiquenlessegüentsproteïnessón:

ADIPOQ:L’adiponectinaésungenquesintetitzaunaproteïnaespecíficadelteixitadipós,quepar-

ticipaenelmetabolismedelaglucosaidelsàcidsgrassosiestàcomprovatqueaugmentalasensi-

bilitat a la insulina.

GLUT2:Aquestaésunadelesproteïnesencarregadesdeltransportdeglucosa,defetunadeles

méseficients,iensajudaamantenir-laenunsnivellsadequats,emmagatzemant-laquanelsnivells

alasangsónmoltaltsoutilitzant-laquanesnecessiti.Enspotservirtambéde“sensordeglucosa”

jaquelatrobemonhiapareixengransquantitatsdeglucosa.

IL6:Lainterleuquinasisésunaproteïnaambfuncionsantiinflamatòries,queensserveixdedefensa

dinselnostrecosisobretotfafuncionsdeneteja(decèl·lulesjamortes,perexemple).

P16:Aquestgenésunantioncogèn,quesintetitzaposteriormentunaproteïnasupressoradetu-

mors.Mutacionsenaquestgensovintdonenllocadiversoscàncers,sobretotmelanomes.

6GENCONSTITIU:Genquesempres’estàexpressantcausaqueésrequeritperalcorrectefuncionamentimanteniment

delesfuncionscel·lularscomtambéenelsprocessosmetabòlicsd’unorganisme.

27

Finalment,totamàquinadelaPCRentempsrealesbasaenunprincipimoltbàsiciéseldedetectar

laquantitatdefluorescènciaemesaalfinaldecadacicle.Uncopelprocéshaestatefectuat,lamà-

quina(quejaveambunprogramariinstal·lat)ensproporcionaungràficd’aquestestiloncadauna

d’aquestescorbescorresponaungenanalitzatdinsdediferentsmostres.

Gràfic 21

Gràfic de l’ampliació de ADN de les mostres.

Enaquestgràfic,al’eixdelesxapareixenelscicles(de0a40)ial’eixdelesylaquantitatdefluo-

rescènciadetectada.Podemobservarquetoteslescorbestenenunpatrósimilar:Normalmentels

primers15o25ciclesnosónunacorbaclara,anomenadadefons.Aixòesdegutaquelaquantitat

defluorescènciaemesaencaranoésmoltclara,ésmoltpetitajaquel’amplificaciórealitzadafins

almomenttambéesdebaixaquantitat.Apartird’aquestmoment,idepenentdelamostra,elDNA

escomençaaduplicardemaneraregulardetalmaneraquealfinaldecadacicleelmaterialgenètic

desitjats’hadoblat.Conseqüentment,lacorbadonaràllocaunaequacióexponencialcorresponent

ay=2xonxéselnombredeciclesiyéslaquantitatdeDNA.Alfinal,lacorbaadoptaràunapendent

mésdisminuïdafinsalpuntques’anul·larà.Aixòésdegutal’exhaurimentdenucleòtidsalamostra

i conseqüentment a l’impediment de crear cadenes de noves.

28

Uncophemobtingutaquestesdadeslamàquinadónacomavalordereferènciaunvalordefluores-

cènciaemesaqueanomenemCtollindariquecorresponmésomenysalameitatdelafaseexpo-

nencialdelescorbes.D’aquestamaneradistingiremsempreunamateixaquantitatdefluorescència

quecorrespondràaunnúmerodecicle(semprediferent).

Taula 22

Diferents Ct de diferents mostres efectuades

Perexemplesilamàquinaensproporcionaunagràficad’aquestestilpodremobservarquelesmos-

tresquetinguinunCtmésbaixsónlesquetindranunamajorexpressiógènicadelgenenqüestió,

jaqueperarribaralamateixaquantitatdefluorescènciahannecessitatmenyscicles,ipertant,i

haviaunaquantitatinicialdeDNAcmésgran.

29

6- RESULTATS

Els resultats de l’estudi de l’expressió gènica de certs gens ve exposada a les següents pàgines.

6.� VALORACIÓ DEL RNA

6.�.� PURESES DE LA MOLÈCULA

El resultat obtingut de l’anàlisi espectrofotomètric està exposat a la següent taula, en la que

s’especifiquenalaprimeracolumnalaconcentraciódeRNAdecadamostradeteixitexpressadaen

ng/μl,enlasegonacolumnalaquantitatd’àcidsnucleicsexpressadaenunitatsd’absorbància,en

laterceracolumnalaconcentraciódeproteïnesexpressadatambéenunitatsd’absorbànciaifinal-

mentalaúltimacolumnalarelacióquehihaentreelRNAilesproteïnes.

Taula 23

Resultats de l’anàlisi estequiomètric

LataulaensposademanifestquelaquantitatdeRNAvariasegonseltipusdeteixit.Observemque,

generalmentelfetgeielpàncreesacostumenatenirmésRNA,entreuns1000i3000ngdeRNA

perμldesolució(exceptuantlamostradelsegonpàncreesde8setmanes,Pancreas2.8w,queha

resultaten554encontrastalprimerpàncreesqueenté3423.Aixídoncssuposemquehihahagut

alguntipusd’error,d’aquestamanera,menyspreemaquestamostra).Encanvi,elBAT,ésadirel

teixit adipós marró7,acostumaatenirgeneralmentunaquantitatbastantpetitadeRNA.Aixòés

degutalfetquelescèl·lulesd’aquestteixitsónmésgrans(recordemquealteixitadipóss’higuar-

dentoteslesreservesdelcoscompodrienserelsgreixos)i,d’aquestamanera,enunmateixvolum

obtindremmenornombredematerialgenètic.

7TEIXITADIPÓSMARRÓ:Lafunciódelteixitadipósmarróésgenerarcalorapartirdereserveslipídiques,ésespecialmentimportantenmamífersdemidapetitaiennounatsdemoltesaltresespèciesdemamíferenelmantenimentdelaseva

temperatura corporal.

30

Sicontinuemobservantlataulaanterior,veuremquelasegonaiterceracolumnesdedadesenca-

pçaladespelsnomsdeA260iA280,quecorresponenaunafreqüènciadelesonesdelallum,que

posteriormenthaestatcomprovatquecorresponenrespectivamentalsàcidsnucleicsialesproteï-

nes.Ambduescolumnesdedadespotsemblarquenotinguingairesentit,jaquenosegueixencap

patróespecíficadiferènciadelacolumnadelaconcentració,malgrataixò,aquestesxifressónmolt

importants,perquèensajudenadecidirsilasolucióquehemobtingutestànetainocontaminada

ambdissolventsoaltressubstàncies.Diremqueelnostreexemplarestàmésomenysnetipurde

RNAsilarelaciódeRNAamblesproteïnesesmantéalvoltantde2.Observemaixíquemésomenys

toteslessolucionsesregeixenperaquestanorma,ambunintervalquevadesdeunmàximde2.14

iunmínim1.99.Pertant,lesmostresespodenconsiderarvàlides.

6.�.2 INTEGRITAT DE LA MOLÈCULA

Quanalaintegritatdelamolècula,elresultatdel’anàlisielectroforèticéselsegüent:

Figura 24

Mostres 3 ratolins setmanes Mostres 8 ratolins setmanes

Pernormageneral,quananalitzemelRNAapareixensempretresbandesmésmarcades,cadauna

d’aquestesmarquescorresponaungrupmésnombrósdemolèculesdeRNAamblesmateixesca-

racterístiquesdepesitamany.Enteoria,pertaldecomprovarquelaintegritatdelesnostresmos-

tresésbonalaprimerabandahauriadeserdedobleintensitatquelasegonailasegonabanda,a

unadistànciamésgranhauriadesermésdifuminada.Aixòésdegutalsimplefetquehihaeldoble

de molècules de RNA d’un que de l’altre.

3�

Cada una d’aquestes tres bandes correspon a un RNA ribosòmic8,laprimerabandaal28s,lasegona

al �8s i la tercera al 5s.

Imatge 25

Electroforèsi de RNA ideal

Siobservemlesmostresobtingudesal’anàlisielectroforètic,non’hihacapquehagisortitespecial-

mentíntegra,jaque,obélesbandespresentenlamateixaintensitatobélasegonabandaésmés

intensaquelaprimeraobépràcticamentnoesdistingeixen,cosaquesignificaqueelgraudede-

gradaciódelamolèculaseràmàximjaquesignificaràquelesmolèculeshanestattrencadesitotes

tenenmidesipesosdiferents.

Com podem observar si contrastem les bandes que corresponen als teixits dels ratolins de tres set-

manesamblesdelsratolinsde8setmanesveuremquehanquedatmésbendefinideslesmostres

delsratolinsde3setmanes.Aixòpotserdegutadosfactors,alareutilitzaciódelgeldel’electroforesi

perunabandaialacontaminaciódelamostraperl’altra,degudaalaimprecisióal’horad’extreure

elRNAoacausadediferentsdissolventsquehantrencatelRNA(recordemqueésmoltfràgil).

8RNARIBOSÒMICS:RNAsintetitzatsperlacèl•lulaqueapareixenambgranquantitat,encarregatdedescodificarRNAmissatgeraaminoàcids(procésanomenattraducció)juntamentambelRNAdetransferència.

32

6.2 VALORACIÓ DELS RESULTATS DE LA PCR

D’entretoteslesmostresanalitzadesn’hihaduesquehanestatmenystingudesd’entrada:lesdel

P16ilaIL6jaquenomostravenpràcticamentexpressiógènicailamàquinadelaPCRnohaviapogut

delimitar un Ct o cicle llindar exacte degut a la imprecisió de la part exponencial de les corbes.

Gràfic 26

Corba de P16

Gràfic 27

Corba de IL6

33

Uncopdescartadesaquestesduesmostres,elsresultatsobtingutsesmostrenalasegüenttaula:

Taula 28

Duplicats, mitjanes i desviació de les mostres de la PCR

Detector MostraCt1

(duplicat1)Ct2

(duplicat2) Mitja DesviacióACTB Pancreas1.3w 22,79975 22,907587 22,8536685 0,076252274ACTB Pancreas2.3w 22,754595 22,988987 22,871791 0,165740173ACTB Pancreas1.8w 23,356678 23,548515 23,4525965 0,135649244ACTB Pancreas2.8w 29,34604 29,559711 29,4528755 0,151088213

ACTB Liver1.3w 19,937523 20,201689 20,069606 0,18679357ACTB Liver2.3w 19,91288 19,532467 19,7226735 0,268992612ACTB Liver1.8w 22,02496 21,918354 21,971657 0,075381826ACTB Liver2.8w 22,543043 22,650488 22,5967655 0,075975088

ACTB BAT1.3w 20,51133 19,92522 20,218275 0,414442356ACTB BAT2.3w 20,517088 19,936037 20,2265625 0,410865102ACTB BAT1.8w 21,716288 21,245993 21,4811405 0,332548784ACTB BAT2.8w 22,412436 22,175957 22,2941965 0,167215905

ADIPOQ Pancreas1.3w 27,768198 27,877384 27,822791 0,077206161ADIPOQ Pancreas2.3w 27,416065 28,402145 27,909105 0,697263855ADIPOQ Pancreas1.8w 28,066978 28,515564 28,291271 0,317198203ADIPOQ Pancreas2.8w 32,772305 33,695827 33,234066 0,653028669

ADIPOQ Liver1.3w 33,556885 32,784252 33,1705685 0,546334034ADIPOQ Liver2.3w 32,770874 33,21623 32,993552 0,314914248ADIPOQ Liver1.8w 31,179636 31,150621 31,1651285 0,020516703ADIPOQ Liver2.8w 36,031986 - 36,031986 -

ADIPOQ BAT1.3w 20,878447 20,90818 20,8933135 0,021024406ADIPOQ BAT2.3w 20,201986 20,584654 20,39332 0,270587138ADIPOQ BAT1.8w 20,367727 21,982145 21,174936 1,141565915ADIPOQ BAT2.8w - 22,653812 22,653812 -

GLUT2 Pancreas1.3w 29,82613 30,084942 29,955536 0,18300772 GLUT2 Pancreas2.3w 29,934889 30,147522 30,0412055 0,150354236GLUT2 Pancreas1.8w 30,582697 30,336895 30,459796 0,173808261GLUT2 Pancreas2.8w - 37,007748 37,007748 -

GLUT2 Liver1.3w 21,883585 21,926823 21,905204 0,030573883GLUT2 Liver2.3w 21,970535 25,037712 23,5041235 2,168821656GLUT2 Liver1.8w 23,746319 23,744858 23,7455885 0,001033083GLUT2 Liver2.8w 24,300716 23,749624 24,02517 0,38968089

GLUT2 BAT1.3w 28,700047 28,99508 28,8475635 0,208619835GLUT2 BAT2.3w 29,601664 29,834185 29,7179245 0,164417176GLUT2 BAT1.8w 31,214537 31,752974 31,4837555 0,380732454GLUT2 BAT2.8w 32,613457 32,48728 32,5503685 0,089220612

34

Enaquestataula,s’indicaalaprimeracolumnaelgenqueestemanalitzant(Actina,Adiponectinai

Glut2).Alasegonacolumnas’assenyalaeltipusdemostraqueesconsidera.

Finalment,recordemqueperferlaPCRhemfetunduplicatdecadamostradeteixit,conseqüent-

ment,elsseusciclesllindarsesveuenreflectitsenaquestagràficaambelnomdeCt1iCt2(situats

alaterceraiquartacolumna).Ésimportanttambétenirencompteelfetquealgunesvegadesno

l’hemfetperquèse’nshaoblidatopassatperaltaixídoncsaquestescasellesestaranmarcadesamb

un guió.

Alacinquenacolumnas’hadeterminatelvalormigdelsciclesllindarsdelsdosduplicatsialasisena

columnas’expressaladesviacióestàndard(distànciaquehihaentrecadamostraielvalormig).Una

desviaciómoltgran,significaunafaltadeprecisióoerroral’horadeprepararlaPCR.Aixídoncs,

d’algunamaneradescartaremtambéaquestesmostresolestindremencompteambreservesa

l’horadefermitgesocomparar-lesambaltresmostres.Aquestesmostress’hanmarcatambver-

mell.

Primerament,icomjahavíemditenunprincipicompararemelsgensdelaadiponectina(adipoq) i

la glucosa (glut2)ambl’actina(actb).

Elsegüentpasefectuatpertaldeferlavaloraciódelsresultatsesmostralataulasegüent,onhi

apareixpercadageniteixitelΔCt.ElΔCtésladiferènciaentreelCTmigdecadamostraanalitzada

idecadateixitambeldelaactinacorresponent.Perentendre’nsmillor,estractarestarelCtdel

glut2 del pancrees1.3w amb el Ct de l’actina del pancrees1.3w.Siaquestnombreresultanegatiuo

zerovoldirqueelgenenaquellamostras’haexpressatmésquelaactina.Sielnombreéspositiu

voldirquenos’haexpressattant.

35

Taula 29

Δ Ct de les mostres de la PCR

Detector Mostra CtADIPOQ Pancreas.3w 4,9691225ADIPOQ Pancreas.3w 5,037314ADIPOQ Pancreas.8w 4,8386745ADIPOQ Pancreas.8w 3,7811905 ADIPOQ Liver.3w 13,1009625ADIPOQ Liver.3w 13,2708785ADIPOQ Liver.8w 9,1934715ADIPOQ Liver.8w 13,4352205 ADIPOQ BAT.3w 0,6750385ADIPOQ BAT.3w 0,1667575ADIPOQ BAT.8w -0,3062045ADIPOQ BAT.8w 0,3596155 GLUT2 Pancreas.3w 7,1018675GLUT2 Pancreas.3w 7,1694145GLUT2 Pancreas.8w 7,0071995GLUT2 Pancreas.8w 7,5548725 GLUT2 Liver.3w 1,835598GLUT2 Liver.3w 2,2478615GLUT2 Liver.8w 1,7739315GLUT2 Liver.8w 1,4284045 GLUT2 BAT.3w 8,6292885GLUT2 BAT.3w 9,491362GLUT2 BAT.8w 10,002615GLUT2 BAT.8w 10,256172

D’aquesta manera, podem observar amb claredat la diferenciació cel•lular. Per exemple,

l’adiponectinaenteixitscomelteixitadipóstéunaexpressióiguald’altaquel’actina(peraixòelΔ

Cts’acostaa0)peròmoltbaixaenteixitscomelfetgeoelpàncrees(observemqueperexempleal

pàncreeselΔCtésalvoltantde13).

36

Perestudiarsihihavariaciódel’expressiógènicaenteixitsderatolinsdediferentedats,determi-

nemelΔΔCt,totrestant,percadamostra,elCtmitjàde8setmanesdelCtmitjadelesmostresde

3 setmanes.

ElΔΔCtésunnombrequeensaportapocainformació,jaqueésdifícild’interpretar.Aixídoncs,en

llocdelΔΔCtesconsiderael2-ΔΔCt.D’aquestamanera,irecordantquelesmostresde3setmanes

s’aproparana0jaquehihemrestatlamitjadelesmostresde3setmanes,utilitzaremlapropietat

que20=1.Pertant,lesmostresdetressetmanesocontrolsseranpràcticament1,encanvilesaltres

variaransegonshagivariatl’expressiógènica.

Taula 30

Mostres corregides per l’exemplar de 3 setmanes

Detector Mostra Ct Ct 2 -ΔΔ Ct MitjaADIPOQ Pancreas.3w 4,9691225 -0,040061 1,028157298ADIPOQ Pancreas.3w 5,037314 0,031477 0,978418101 1,0032877 ADIPOQ Pancreas.8w 4,8386745 -0,1285915 1,093225866ADIPOQ Pancreas.8w 3,7811905 -1,18898 2,279914939 1,6865704 ADIPOQ Liver.3w 13,1009625 -0,077983 1,05554128ADIPOQ Liver.3w 13,2708785 0,0812965 0,945207839 1,00037456 ADIPOQ Liver.8w 9,1934715 -4,014426 16,16079203ADIPOQ Liver.8w 13,4352205 0,290074 0,817860107 8,48932607 ADIPOQ BAT.3w 0,6750385 0,2348675 0,849763039ADIPOQ BAT.3w 0,1667575 -0,2431055 1,183537567 1,0166503 ADIPOQ BAT.8w -0,3062045 -0,7068105 1,632191688ADIPOQ BAT.8w 0,3596155 -0,054965 1,038833901 1,33551279 GLUT2 Pancreas.3w 7,1018675 -0,0406075 1,028546843GLUT2 Pancreas.3w 7,1694145 0,0409765 0,971996821 1,00027183 GLUT2 Pancreas.8w 7,0071995 -0,1061375 1,076342704GLUT2 Pancreas.8w 7,5548725 0,523422 0,695719663 0,88603118 GLUT2 Liver.3w 1,835598 -0,9821735 1,975439277GLUT2 Liver.3w 2,2478615 0,978531 0,507496226 1,24146775 GLUT2 Liver.8w 1,7739315 -1,0717585 2,101993925GLUT2 Liver.8w 1,4284045 -1,3679315 2,58100243 2,34149818 GLUT2 BAT.3w 8,6292885 -0,45732 1,372988936GLUT2 BAT.3w 9,491362 0,4529885 0,730528012 1,05175847 GLUT2 BAT.8w 10,002615 0,940084 0,521202533GLUT2 BAT.8w 10,256172 1,206265 0,433389168 0,47729585

Aixídoncs,alesmostresonelsnombressiguinmajorsque1l’expressióhauràpujatialesmostres

quesiguinmenorsl’expressióhauràbaixat.

37

Elgràficsegüentpermetanalitzarmilloraquestsresultats:

Gràfic 31

Canvis en l’expressió de les mostres

Analitzantaquestgràficobservemquetoteslesmostresde3w(tressetmanes)s’aproximenalalínia

verda situada al valor � mentre que les de 8 setmanes no.

Observantlagràfica,podríempensarquehihacanvisenlaexpressiódelsgensdelsratolinsdedi-

ferentedat,peròsianalitzeml’intervald’errordelresultatjanohopodemafirmartantclarament.

Malgrataixò,podríemdirquel’adiponectina al pàncrees i el glut2alfetgepresentenunatendència

aaugmentarenelsratolinsde8setmanes,mentrequeelglut2alteixitadipóstéunatendènciaa

disminuir.

D’altrabanda,sitenimencomptealtrescriteriscomlaespecificaciócel•lularpodemobteniruna

gràficad’aquestestil:

Gràfic 32

Mostres corregides per l’exemplar amb més expressió gènica

38

En aquesta gràfica s’ha considerat només les mostres dels ratolins de 3 setmanes que més

s’expressaven.Recordemque la columnaque sempreestigui al voltantde1 seràaquellaper la

qualhecorregitlesmostres(elBAT 3w i el fetge 3w,tenintencomptequealfetgetenimunmarge

d’errormoltgraniesperaixòquenoestàsituatexactamental’1).Enaquestcas,heobservatque

elteixitadipóséselquetélaexpressiód’adiponectinamésalta,encontrastambelfetgequeté

una gran expressió de Glut2.Aquestesdatestenenlògica,jaqueelteixitadipósésonessituenels

adipòcitsialfetges’efectuenentremoltesaltresreaccions,lasíntesideglucosa(recordemqueel

glut2ésunaespèciedesensordelaglucosa).

Ésinteressantelqueensaportaaquestataula,jaqueenspermetveurelaexpressióaunnivellge-

neral.Perexemplepodemobservarqueencaraquel’adiponectinaalpàncreess’hagipràcticament

doblat,aquestcreixementnoensésdegransignificatdinslatotalitatdelesnostresmostres.De

fet,hemsuposatqueaquestcanvihaestatdegutaunerroral’horad’extreureelpàncreesdelratolí

enqüestió.Recordemqueelpàncreesestàformatenalgunespartsirecobertpelteixitadipós,iés

possibleque,al’horadeprepararlesmostres,se’nhagicolatalgunfragment.

Finalment,desprésd’analitzaraquestagràficadetalladament,observemqueelmarged’erroren-

trelesmostresésmoltgraniaixòensimpedeixtrobarunarespostaclaraalsobjectiusplantejats.

Observemtambéqueelsmajorscanvisestrobenenunapujadad’adiponectina al teixit adipós i de

glut2alfetge,seguidad’unampliconjuntd’altrescanviïs.

Analitzemdoncs,laraód’aquestscanvis.

Recordemqueaquestsratolins(totspertanyentsaunamateixacamadaassegurant-nosaixíd’una

majorsimilitudgenètica),hanestatvivintenlesmateixescondicionsjaqueelqueesvolobservarés

l’efectedefactorsexternsenelcodigenètic.Defet,aixònohaestatbenbeaixí,jaqueinevitable-

mentlasevadietahacanviat:apartirdeles3setmaneselsratolinsjanomamendelamare,sinó

quepassenamenjarunpinsoespecialitzat.D’aquestamanera,unesmostrescorrespondranauns

ratolinsalimentatsúnicamentamblletielsaltresalimentatsjaambpinso.

Aquest canvi en la dieta ens produeix dos canvis d’expressió transcendentals. Per una banda,

l’expressió de glut2 al fetge s’hapràcticamentdoblatals ratolinsde8 setmanes jaqueelpinso

ésricenglucosaielfetgeésundelsprincipalsllocsd’emmagatzematgedelaglucosa,ésperaixò

queaquestahapujat.Tambéhemapreciatunapetitabaixadadeglut2alteixitadipósmarró,que

comjahemexplicatenunprincipiésdegranimportànciaenelsnounats,peròqueamesuraque

l’individu es va fent gran va disminuint. Per tant, podemexplicar la baixadadeglut2 al fetge a

aquestacausa.Finalment,tambéapreciemunapujadad’adiponectinaalteixitadipós,aixòésdegut

almerfetqueamesuraqueelsratolinsvancreixent,vanadoptantmésreservesenergètiquesque

s’emmagatzemenalsadipòcitscosaqueprodueixunlleugercreixementd’adiponectina.

39

7- CONCLUSIONS

Elsexperimentsrealitzatsilainvestigacióteòricaefectuadaempermetrancontestaralapregunta

principaldeltreball:Afectal’ambientalsnostresgens?

Enconcretidesprésd’efectuaraquesttreball,hepogutapreciarque,sibésemblaquel’expressió

delsgensquecodifiquenlesproteïnesGLUT2alfetgeiADIPOQalpàncrees,haginaugmentaten

elsratolinsalimentatsambpinsoapartirdela3asetmanad’edat(ratolinsde8setmanes),aquest

augmentnoéssignificatiusiestenenenconsideracióelsmargesd’errordelesdadesilapocaquan-

titatdemostresobtingudes.Pertant,noespotafirmaral100%quel’expressiód’aquestsgenshagi

augmentat amb el canvi de dieta dels ratolins.

D’aquestamanera, isivolguéssimferunestudimésrigorós,seriaconvenientampliarelnúmero

deratolinsielsmargesd’edat(perobservarcoml’edatéssignificativaalparlardegens).També

haguésestatinteressantobservarratolinsquehanestatcriatsendiferentscondicions(compotser

ladieta,l’exercicifísic,etc).

Calafegirqueenexperimentsd’aquestescaracterístiquess’hand’efectuarapartirdegransquan-

titatsd’individusidediferentstipus,pertald’obtenirresultatsmésconcloents.Ésimportanttenir

encompteuncriteriquejonoemvaigmarcar,iéseldedetallaroespecificarméselsparàmetres,

jaqueperexemple,enaquesttreball,elsratolinssempreestrobavenenlesmateixescondicionsi

laúnicavariablequehivahavervaserladeladieta(quedefet,vaseronvaigapreciarelsmajors

canvis d’expressió gènica).

Aixídoncs,elmeutreball,comjaesvaespecificarenunprincipi,ésunapetitamostradelqueés

unprojectecientíficactualilesdificultatsimetodologiapròpies,concretamentuntreballsobrela

epigenètica.Unaciènciaque,comhepogutcomprovarésmoltpunteraperòal’horaindefinidaon

s’estanefectuantmoltstreballsrelacionatsambl’ambient ielsgensaunnivellmésconcretque

aquest treball.

40

8- BIBLIOGRAFIA

SCISHOW:Breureportatgeenangléssobrelaepigenètica

www.youtube.com/watch?v=#7152A1

UTAHUniversity:Webeducativasobrelaepigenètica

learn.genetics.utah.edu

Websobreinvestigacióepigenèticamoltpuntera

www.epigenesys.eu/

Articleencastellàsobrel’influenciadel’ambientalsnostresgenshttp://www.somosmultiples.

es/blog/2012/11/23/los-gemelos-identicos-victimas-de-sus-genes-o-producto-del-entorno/

Quèésl’epigenètica?Exemples

http://theconversation.com/explainer-what-is-epigenetics-13877

Aplicacionsdel’epigenèticaenlaoncologia

http://www.madrimasd.org/informacionidi/noticias/noticia.asp?id=34033

Articleenanglèssobrelesdiferenciesepigenètiquesenbessonsunivitel•lins

http://www.pnas.org/content/102/30/10604.long

PCR a temps real. Explicació

http://www.ilm.pf/PCRtempsreel

Epigenèticairegulaciógènica

http://science.howstuffworks.com/life/genetic/epigenetics.htm

Article“Laregulacióndelaevolución”SeanB.Carrol,BenjaminPrud’hommeiNicolasGompel

Article“Laepigenètica”MarcelinaParrizas

Article“Reacciónencadenadelapolimerasaisecuenciación”MauricioRealpe,NoraAlmaFierro,

Arturo Panduro

“Lacèlula”Cooper’sGeoffreyM.Cooper

4�

9- ÍNDEX D’IMATGES

-Figura1:Procésdel’expressiógènica(deDNAaproteïnes)

-Figura2:Nivellsd’empaquetament

-Figura3:Grupmetil

-Figura4:DiferènciesenlacompactaciódelDNAsegonsgrupmetilogrupacetil.

-Figura5:Genactivat-Grupacetil–Lacèl·lulaemetfluorescència

-Figura6:Gendesactivat–Grupmetilè–Lacèl·lulanoemetfluorescència

-Figura7:FuncionamentdelsmicroRNA

-Figura8:Cromosomesdebessonsdediferentsedats

-Taula9:Diferentsinfluènciesambientalsdediferentstretsdelserhumà

-Figures10i11:SulfuraraniDisulfurdeal·lil

-Figura12:Herènciatransgeneracional

-Taula13:Esquemadelesmostresobtingudes

-Imatge14:SeparaciódelRNAdisoltenelcloroform

-Imatge15:Eppendorferdecolumna

-Imatge16:Geld’agarosaenelsdenominatspous

-Figures17i18:Mostres3ratolinssetmanesi8setmanes

-Figura19:Procésdelareaccióencadenadelapolimerasa

-Figura20:RamificacionsdeDNAdiana

-Gràfic21:Gràficdel’ampliaciódeDNAdelesmostres

-Taula22:DiferentsCtdediferentsmostresefectuades

-Taula23:Resultatsdel’anàlisiestequiomètric

-Imatge24:ElectroforèsideRNAideal

-Gràfic25:CorbadeP16

-Gràfic26:CorbadeIL6

-Taula27:Duplicats,mitjanesidesviaciódelesmostresdelaPCR

-Taula28:ΔCtdelesmostresdelaPCR

-Taula29:Mostrescorregidesperl’exemplarde3setmanes

-Gràfic30:Canvisenl’expressiódelesmostres

-Gràfic31:Mostrescorregidesperl’exemplarambmésexpressiógènica