Ön ayırma ve konsantre etme teknikleri

Ön Ayırma ve Konsantre Etme Teknikleri

Ayça Akçay

Ekstraksiyon

• İzole edilecek organel veya molekülü, içinde yer aldığı hücreden çıkarma işlemidir.

• Organellerin çoğu ve birçok biyomolekül, biyolojik aktivitelerini kolayca kaybedebildiklerinden, ılımlı koşullar altında ekstrakte edilmelidirler.

Homojenizasyon

• Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapılarının parçalanıp yok edilmesidir.

• Homojenizatör denen aletler ile yapılır ve sonuçta homojenat diye adlandırılan bir karışım elde edilir.

Homojenizasyon

• Homojenizasyon için, çalışılacak organın kıyılmış şekli ve uygun bir çözelti, homojenizatörün uygun boyutlardaki cam tüpü içine konur.

• Cihaz çalıştırılınca cam tüp içinde bir piston döner. Pistonun düzenli dönüşü, hücreler üzerinde mekanik bir güç oluşturarak hücreleri parçalar; açığa çıkan hücre içeriği ortama karışarak homojenat oluşturur.

• Homojenat, bütünlüğü bozulmamış birçok organel ve molekül içerir.

Homojenizasyon

Ultrasantrifügasyon

• Yer çekimi ivmesinin binlerce katına ulaşan çekim alanlarında büyük moleküllerin sedimente olarak (çökerek) ayrılmalarına dayanan yöntemdir.

• Ultrasantrifüj denen cihazlar ile gerçekleştirilir.

Diferansiyel Santrifügasyon

• Bir homojenatın içerdiği yapılar, diferansiyel santrifügasyon yapmak suretiyle oldukça saf olarak izole edilebilirler.

Sukroz Gradyan Santrifügasyon

• Maddelerin yoğunluk faklılıklarına göre santrifüjlenerek ayrılması işlemidir.

• Bir plastik tüp içinde sukroz çözeltisinin değişik konsantrasyonları ile farklı yoğunluklarda bölgeler oluşturulur; bileşenlerine ayrılacak karışım tüpün en üstüne konup santrifüjlendiğinde karışımın bileşenleri, yoğunluklarına uygun bölgelere yerleşirler ve böylece birbirlerinden ayrılmış olurlar.

Sukroz Gradyan Santrifügasyon

Sukroz Gradyan Santrifügasyon

Çöktürme YöntemleriTuz ile Çöktürme• Protein çözeltisine çok miktarda nötral tuz ilave

edildiğinde, proteinlerin genellikle iç kısımlarında yer alan hidrofobik gruplar etrafındaki su molekülleri, tuz iyonları tarafından uzaklaştırılır; bu durumda hidrofobik grupların birbirleri ile olan etkileşimleri artar ve proteinler çökerler. Bu olaya salting out denir.

• Protein çözeltisinde hidrofobik alanları büyük ve daha fazla olan proteinler, hidrofobik alanları küçük ve daha az olanlarınkine göre daha çabuk birbirleri ile etkileşerek çökerler.

Çöktürme Yöntemleri

Organik Çözücüler ile Çöktürme• Sulu protein çözeltilerine etil alkol ve aseton gibi bazı

organik çözücülerin eklenmesi proteinleri çökeltir.• Organik çözücünün ilavesi çözeltinin diaelektrik

sabitini ve dolayısıyla çözme kuvvetini düşürmektedir. Böylece proteinin çözünürlüğü azaltılmış olur ve elektrostatik çekimler etkisi ile agregasyon meydana gelebilir.

Çöktürme Yöntemleri

Organik Çözücüler ile Çöktürme• Çökme, pH değeri proteinin pI değerine yakın olunca

daha kolay bir şekilde meydana gelmektedir.• Daha büyük proteinler daha düşük organik çözücü

konsantrasyonlarında çökerler.• Çöktürmenin 0°C ve altında yapılması önerilmektedir. • Organik çözücülerle çöktürmede genellikle

denatürasyon görülmez.

Çöktürme Yöntemleri

Organik Çözücüler ile Çöktürme

Çöktürme Yöntemleri

Organik Polimerler ile Çöktürme• Çöktürme mekanizması organik çözücülerle çöktürme

mekanizması ile benzerdir. Bununla birlikte daha düşük konsantrasyonlar gerektirmektedir (genellikle %20’den daha düşük).

• Daha yüksek konsantrasyonlar viskoz çözelti oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu da çökeltinin geri kazanılmasını zorlaştırmaktadır.

• Polimerin molekül ağırlığı 4000’den daha büyük olmalıdır.• PEG (polietilen glikol) en çok kullanılan organik polimerdir.

Çöktürme Yöntemleri

pH Değişimi ile Çöktürme• Çözeltinin pH değerini proteinin izoelektrik noktasına (pI)

yakın ya da eşit duruma getirmektir. Bu işleme izoelektrik çöktürme denir.

• İzoelektrik noktada protein yüzeyindeki negatif ve pozitif yükler birbirlerine eşit olacaklardır ve benzer moleküller arasında artık elektrostatik itmeler oluşmayacaktır. Bu moleküller arasında belki elektrostatik çekimler oluşacak ve bu da proteinlerin çökmesi ile sonuçlanacaktır.

Çöktürme Yöntemleri

pH Değişimi ile Çöktürme• Genellikle istenen proteinden çok istenmeyen

proteinleri çöktürmek için kullanılır, çünkü çöktürme sırasında denatürasyon ve aktivite kaybı meydana gelebilir. Bunun sebebi de elektrostatik çekimler nedeni ile proteinin üç boyutlu yapısının bozulmasıdır.

Çöktürme Yöntemleri

Isı ile Çöktürme• Yüksek sıcaklıklar, proteindeki konformasyonu

sağlayan bağları kırar ve birleşmiş çözücü moleküllerinin serbest kalmasını sağlar. Bu da detanürasyona sebep olur.

• Farklı proteinler için denatürasyon ve çökelme sıcaklığı da farklıdır.

Diyaliz

• Yarı geçirgen membranlar kullanarak, bir karışımdaki küçük moleküllerin kolloid denen büyük moleküllerden difüzyon yoluyla ayrılması işlemidir.

• Diyaliz, sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder.

Diyaliz

Ultrafiltrasyon

• Yarı geçirgen membranlar kullanılarak, bir karışımdaki küçük moleküllerin büyük moleküllerden filtrasyon yoluyla ayrılması işlemidir.

• Prensip olarak diyalize benzer.• Ultrafiltrasyon tüpünün alt kısmında yarı geçirgen bir

membran bulunur (gözenek büyüklüğü 0,01-0,1 µm).• Üstten uygulanan basınçlı azot gazı ile çözücü ve

küçük moleküller membran dışına çıkar.

Ultrafiltrasyon

Mikrofiltrasyon

• Ultrafiltrasyon ile aynıdır; yalnızca kullanılan membranın gözenek büyüklüğü farklıdır.

• Gözenek büyüklüğü 0,1-10 µm arasında değişmektedir.

Liyofilizasyon• Maddenin kurutulması için süblimasyon adı verilen bir

süreçten geçen koruma tekniğidir. • Süblimasyon maddenin katı (buz) halden gaz (su buharı)

haline, maddenin sıvı hali atlanarak yani buzun erimesine imkan olmaksızın geçişidir.

• Ürünlerin içinde bulunan su en başta dondurulur ve bu haldeyken süblimasyonla uzaklaştırılır.

• Buz haline gelmiş su, düşük basınç ortamında, belli belirsiz bir sıcaklık artışı durumunda doğrudan buharlaşır. Böylelikle kurumanın elde edilmesi için yüksek sıcaklıklara ihtiyaç kalmaz.

Kaynaklar

• Organik Kimya ve Biyokimyaya Giriş, Prof. Dr. Mustafa Altınışık, Tıp Fakültesi Ders Notları.

• MEGEP, Gıda Teknolojisi, Proteinlerin Özellikleri, 2006, Ankara.

• Protein İzolasyon ve Saflaştırılması, Prof. Dr. Figen Zihnioğlu, Fen Fakültesi Ders Notları.

Dinlediğiniz için teşekkür ederim!