cinética e inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)

Universidad de La Serena

Facultad de Ciencias

Departamento de Biología

Laboratorio Bioquímica General

Ingeniería en Alimentos

Alumna: Natalia Vargas Guzmán

Profesora: Carla Maturana Valdivia

I Semestre 2013

La concentración de sustrato determina la actividad enzimática

medida como la velocidad de la catálisis enzimática. Si la

concentración de la enzima se mantiene saturada, la

producción de producto será a una velocidad máxima.

Gráfica Michaelis-Menten: Ecuación Michaelis-Menten:

Gráfica Lineweaver-Burk:

Ecuación Lineweaver-Burk:

Gráfica Eadie-Hofstee:

Ecuación Eadie-Hofstee:

Gráfica Hanes-Woolf:

Ecuación Hanes-Woolf:

Velocidad de reacción

enzimática

Inhibidores

Irreversible Reversible

Competitiva

No competitiva

Acompetitiva

Activadores

La forma de representar la

inhibición gráficamente es con la doble reciproca

En la inhibición competitiva, el inhibidor

compite con el sustrato por el sitio activo.

Km Aument

a

Vmax Constant

e

En la inhibición no competitiva el inhibidor

se une a la enzima en otro lado, no es su

sitio activo

Km

Vmax

Constant

e

Disminuy

e

En la inhibición acompetitiva el inhibidor se

une al complejo enzima-sustrato ya

conformado.

Cambio

proporcional en Km

y Vmax

Objetivos:

- Estudiar la influencia de la concentración de sustrato en

la velocidad de una reacción enzimática.

- Calcular la constante de Michaelis-Menten.

Fundamento: Determinar de la actividad enzimática de

una preparación de β-fructofuranosidasa en presencia

de diferentes concentraciones de sacarosa como

sustrato.

Materiales:• 8 tubos de ensayo

• Pipeta

• Baño termorregulador a 27°C

• Espectrofotómetro

• 8 Cubetas de espectrofotómetro

Reactivos:• Solución Glucosa-Fructosa 0,01M

• Soluciones de sacarosa (distintas concentraciones)

• Reactivo DNS (inhibe o detiene la act. Enzimática)

• Buffer acetato

• Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un producto 5 moles/min.

Procedimientos:

1. Disponer serie de 6 tubos de ensayo con concentración creciente de

sacarosa.

2. Luego agregar :

- 1,5 mL Buffer acetato

- 0,5 mL solución enzima 1/2000.

3. Equilibrar a 27°C por 3 minutos (Agregar sacarosa 1 mL).

4. Dejar en baño a 27°C por 40 minutos.

5. Agregar 2 mL de DNS, enfriar.

6. Agregar 15 mL de Agua destilada

7. Medir absorbancia (540nm).

Resultados y ConclusionesPara calcular la concentración de glucosa usaremos la ecuación de la

recta obtenida por la curva de calibración:

y = 0,183x - 0,0085r² = 0,9992

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Ab

sorb

an

cia

a 5

40

nm

Concentración Glucosa (mM)

Curva de calibración Glucosa-Fructosa por el Método DNS

Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085[Glucosa] = Abs+0,0085

0,183

Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085[Glucosa] = Abs+0,0085

0,183

Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa.

Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada

tubo:

C1 x V1 = C2 x V2

Concentración del tubo 1:

0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL

C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción

Para calcular la velocidad de la reacción:

V= [glucosa] tiempo de reacción: 40

minutos

tiempo reacción

Tabla: Valores obtenidos

Tubo[sacarosa]

M

Absorbanci

a

[Sacarosa

en reacción]

M

[Glucosa] Velocidad de

reacción

(M/min)

1 0,45 2,950,15 16,1 0,40

2 0,3 3,07 0,1 16,8 0,42

3 0,2 3,010,066 16,49 0,41

4 0,1 2,04 0,033 11,2 0,28

5 0,05 1,420,0166 7,8 0,19

6 0,03 1,14 0,01 6,27 0,15

P 0,45 0,570,15 3,17 0,079

[sacarosa] MVelocidad de reacción

(M/min)

0,45 0,40

0,3 0,42

0,2 0,41

0,1 0,28

0,05 0,19

0,03 0,15

Tabla datos gráfico Michaelis-Menten

Vmax

Km= Vmax

2

Vmax = 0,21

(M/min)

2

Km = 0,02 M

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16

Ve

loci

dad

(M/m

in)

Concentración sacarosa (M)

Grafico Michaelis-Menten: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la

-fructofuranosidasa

Km

Vmax

Vmax2

y = 0,0484x + 2,0082R² = 0,9818

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120

1/v

(M

/min

)

1/[S] (M)

Grafico Lineweaver-Burk: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la

-fructofuranosidasa

1/s 1/v

6,67 2,5

10 2,38

15,15 2,44

30,30 3,57

60,24 5,26

100 6,67

Tabla datos gráfico Lineweaver-Burk

y = 0,0484x + 2,0082

1 = 2,0082 (M/min)

Vmax

Km = 0,0484

Vmax

Vmax = 0,4979 (M/min)

1 = 41,49 (M)

Km

Km = 0,0241 (M)

v/s v2,67 0,44,2 0,42

6,21 0,418,48 0,28

11,45 0,1915 0,15

Tabla datos gráfico Eadie-Hofstee:

y = -0,0245x + 0,5043

Km = 0,0245 (M) Vmax = 0,5043 (M/min)

Grafico Vmax (M/min) Km (M)

Michaelis-Menten 0,42 0,02

Lineweaver-Burk 0,49 0,024

Eadie-Hofstee 0,50 0,024

Observamos que los resultados obtenidos son

muy similares, gracias a los diferentes gráficos

podemos calcular la actividad enzimática y su

valores de Km y Vmax.

A mi parecer el gráfico mas eficiente es el de

Lineweaver-Burk ya que la actividad enzimática representada de forma lineal facilita los cálculos.

Objetivos:

- Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la

velocidad de una reacción enzimática.

Fundamento: Determinar la velocidad de la hidrólisis de

sacarosa a diferentes concentraciones por la β-

fructofuranosidasa en presencia de una concentración

constante de yodo acetato.

Materiales:

• 14 tubos de ensayo

• Pipeta

Reactivos:

• Yodo acetato 0,001M

• Solución de Glucosa - Fructosa 0,01M

• Solución de sacarosa a diferentes concentraciones

• Reactivo DNS (inhibe o detiene la actividad enzimática)

• Buffer acetato pH=4,7 0,05 M

• Solución extracto β-fructofuranosidasa

Procedimientos:

Luego agregar:

- 1 mL Buffer acetato

Equilibrar a 27°C por 3 minutos.

Agregar 0,5 mL solución enzima 1/250.

Dejar en baño a 27°C por 5 minutos.

Agregar 2 mL de DNS a 100°C por 5 minutos (enfriar).

Agregar 15 mL de Agua destilada

Medir absorbancia (540nm).

Con inhibidor

Sin inhibidor

Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085

[Glucosa] = Abs+0,0085

0,183

Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa.

Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada

tubo:

C1 x V1 = C2 x V2

Concentración del tubo 1:

0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL

C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción

Para calcular la velocidad de la reacción:

V= [glucosa] tiempo de reacción: 40

minutos

tiempo reacción

Resultados y Conclusiones

Haremos los mismos procedimientos pero ahora calcularemos velocidad con y sin inhibidor

Tabla valores

obtenidosSIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR

Tub

o

[sa

ca

ros

a]

M [Sacaros

a en

reacción

] M

Abs

[Glucosa

]

M

Velocida

d

(M/min)

Abs

[Glucos

a]

M

Velocida

d

(M/min)

10,45 0,15 2,46 13,51 2,70 2,95 9,85 1,97

20,3 0,1 2,05 11,25 2,25 3,07 8,10 1,62

3 0,2 0,066 1,67 9,19 1,83 3,01 6,88 1,37

40,1 0,033 0,87 4,77 0,95 2,04 4,67 0,93

5 0,05 0,0166 0,56 3,10 0,62 1,42 3,12 0,62

60,03 0,01 0,45 2,48 0,49 1,14 2,30 0,46

[Sacarosa] M Velocidad C.I.

M/min

0,15 1,97

0,1 1,62

0,066 1,37

0,033 0,93

0,0166 0,62

0,01 0,46

[Sacarosa] M Velocidad S.I.

M/min

0,15 2,70

0,1 2,25

0,066 1,83

0,033 0,95

0,0166 0,62

0,01 0,49

Tablas para gráfico Michaelis-Menten

CON INHIBIDORSIN INHIBIDOR

Vmax = 2,7 (M/min)

Vmax = 1,35 (M/min)

2

Km = 0,04 (M)

Vmax = 1,97 (M/min)

Vmax = 0,985 (M/min)

2

Km = 0,028 (M)

Vmax = Km

2

1/[S] M 1/v S.I.

(M/min)

6,67 0,507

10 0,617

16,67 0,729

33,33 1,075

62,5 1,613

100 2,174

1/[S] M 1/v C.I.

(M/min)

6,67 0,370

10 0,444

16,67 0,546

33,33 1,052

62,5 1,612

100 2,040

Tablas para gráfico Lineweaver-Burk

SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR

Km = 0,0186

Vmax

1 = 0,3016 (M/min)

Vmax

1 x 1 = 1

Vmax 0,0186 Km

1 = 16,21 (M)

Km

Km = 0,0178

Vmax

1 = 0,4385 (M/min)

Vmax

1 x 1 = 1

Vmax 0,0178 Km

1 = 24,63 (M)

Km

Gráfico Michaelis-Menten:

Vmax (M/min) Km (M)

Sin inhibidor 2,70 0,040

Con inhibidor 1,97 0,028

Observamos que en presencia del Inhibidor yodo

acetato , la Vmax y Km disminuye. Estamos en

presencia de un inhibidor acompetitivo ya que el

resultado es un cambio proporcional en la Vmax y Km

Gráfico Lineweaver-Burk:

Vmax (M/min) Km (M)

Sin inhibidor 3,32 0,061

Con inhibidor 2,28 0,040