1

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS KATEDRA

Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų

nustatymas eksperimentinių gyvūnų organuose Baigiamasis magistro darbas

Darbą atliko: VI kr.stud. Goda Laucaitytė

Vadovas: prof. dr. Artūras Kašauskas

Konsultantė: prof. dr. Ilona Sadauskienė

2018, KAUNAS

2

TURINYS

1. SANTRAUKA ..................................................................................................................................... 3

2. SUMMARY ......................................................................................................................................... 4

3. INTERESŲ KONFLIKTAS ................................................................................................................ 5

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ...................................................................................................... 5

5. SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 6

6. SĄVOKOS ........................................................................................................................................... 6

7. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 7

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................. 8

9. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................ 8

9.1 Oksidacinis stresas .......................................................................................................................... 8

9.2 Aktyvios deguonies formos ............................................................................................................ 9

9.3 Oksidacinio streso biologinis vaidmuo lipidams, baltymams ir DNR ......................................... 10

9.4 Geležis ir aktyvios deguonies formos ........................................................................................... 11

9.5 Aliuminis ir jo sukeliamos pažaidos ............................................................................................ 12

9.6 Oksidacinio streso molekuliniai žymenys ir jų nustatymo būdai ................................................. 13

9.6.1 Karbonilinės grupės baltymuose ........................................................................................... 13

9.6.2 Lipidų peroksidacijos produktai ............................................................................................ 13

9.6.3 DNR pažaidų aptikimas ........................................................................................................ 14

10. TYRIMO METODIKA .................................................................................................................... 14

10.1 Tyrimo objektas ir reagentai ....................................................................................................... 14

10.2 Tyrimo metodai .......................................................................................................................... 15

10.2.1 Metalų poveikio laboratorinių gyvūnų organams tyrimo modelis ...................................... 15

10.2.2 Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymas .................................................... 15

10.2.3 MDA koncentracijos nustatymas ........................................................................................ 17

10.2.4 DNR elektroforezė .............................................................................................................. 17

10.3 Duomenų patikimumo vertinimas .............................................................................................. 18

11. REZULTATAI ................................................................................................................................. 18

12. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................................... 21

13. IŠVADOS ......................................................................................................................................... 22

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS ............................................................................................................ 23

PRIEDAI ................................................................................................................................................ 27

1. Priedas Nr. 1 .................................................................................................................................. 27

2. Tezės pristatytos Lietuvos neuromoskslų asociacijos konferencijoje 2017 m. gegužės 1 d. ......... 28

3

1. SANTRAUKA

VI kr. stud. Goda Laucaitytė

Baigiamasis magistrinis darbas „Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų nustatymas

eksperimentinių gyvūnų organuose“

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kaunas, 2018.

Šiame darbe buvo tiriama aliuminio ir geležies jonų įtaka aktyvių deguonies formų (ADF)

susidarymui ir galima baltymų, lipidų ir DNR pažaida veikiant šių metalų jonais pelių organų

homogentus in vitro. Tam buvo nustatytas baltymų ir lipidų oksidacijos produktų kiekis ir atlikta DNR

elektroforezė.

Darbo tikslas: Įvertinti aktyvių deguonies formų sukeliamas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių

pažaidas pelių organuose.

Tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai: nustatyti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas

baltymų pažaidas pelių organuose; įvertinti aliuminio ir geležies jonų indukuotų aktyvių deguonies

formų įtaką lipidų peroksidacijai pelių organuose; ištirti aliuminio ir geležies jonų sukeliamų DNR

pažaidų lygį pelių organuose

Tyrimo metodai. Tyrime buvo naudojami laboratorinių pelių organų (kepenų ir smegenų)

homogenatai, kurie buvo paveikti aliuminio ir geležies jonais tam tikrą laiką. Oksidacinio streso sukeltos

pažaidos baltymams buvo vertinamos naudojant karbonilines grupes kaip baltymų oksidacijos

molekulinį žymenį. Tuo tarpu vertinant oksidacinio streso sukeltą lipidų peroksidaciją molekuliniu

žymeniu pasirinktas malondialdehidas (MDA). DNR pažaidų vertinimui atlikta elektroforezė agarozės

gelyje.

Gauti rezultatai parodė, kad AlCl3 neturėjo įtakos karbonilinių grupių susidarymui

baltymuose, bei lipidų peroksidacijos produkto MDA susidarymui pelių organų homogenatuose.

Naudojant FeCl3, karbonilinių grupių kiekis bei MDA kiekis pelių organų homogenatuose reikšmingai

padidėjo lyginant su kontrole. DNR, išskirtų iš pelės kepenų ir paveiktų aliuminio druskomis, judėjimo

greitis atliekant elektroforezę sumažėjo lyginant su kontroline grupe, o paveiktos geležies druskomis

DNR struktūros suiro.

Išvados: Aliuminio (III) jonai neturėjo reikšmingos įtakos baltymų ir lipidų pažaidų

susidarymui eksperimentinių pelių organuose, tačiau paveikė išskirtos DNR judėjimą elektroforezės

gelyje. Geležies (III) jonai sukėlė ženklų baltymų ir lipidų oksidacijos produktų padidėjimą ir visiškai

suardė DNR.

4

2. SUMMARY

Master‘s thesis “Identification Of The Damage Induced By Reactive Oxygen Species In

Experimental Animals“ by 6th. year medical student Goda Laucaitytė, Lithuanian University of Health

Sciences, Kaunas, 2018.

In this research the damage of proteins, lipids and nucleic acids caused by reactive oxygen

species (ROS) was evaluated. Oxidative stress which forms such the species was induced by aluminum

and ferric ions in mice organs homogenates in vitro.

Aim of the research. To evaluate the damage of proteins, lipids and nucleic acids induced by

reactive oxygen species.

Tasks of the research. To determine the damage of the proteins caused by aluminum and ferric

ions in mice organs; to evaluate the level of the lipids peroxidation induced by aluminum and ferric ions

in mice organs; to do research on the damage of DNA caused by aluminum and ferric ions in mice

organs.

Methods. In this research homogenates of mice organs (brain and liver) were used. They were

treated with aluminum and ferric ions. Damage of the proteins caused by oxidative stress was identified

by measuring the level of carbonyl groups. Meanwhile the level of lipids peroxidation was evaluated by

detecting the biomarker called malondialdehyde (MDA). Agarose gel electrophoresis was used to detect

the damage of DNA.

The results showed that aluminum ions had no impact neither on the formation of carbonyl

groups in the proteins, neither on the formation of MDA (lipids peroxidation product) in mice organs

homogenates. However, higher level of proteins carbonyl groups as well as higher level of MDA was

found in mice organs homogenates treated with ferric ions compared to control. DNAs which were

extracted from mice organs homogenates and treated with aluminum ions were migrating slower in

agarose gel electrophoresis field compared to control, meanwhile DNAs treated with ferric ions had

collapsed.

Conclusions: Aluminum (III) ions didn‘t cause the damage of the proteins and the lipids in

mice organs, but affected the speed of the migration of DNA in agarose gel electrophoresis field.

Ferric (III) ions made damage to lipids and proteins and caused the destruction of DNA.

5

3. INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir

veterinarijos tarnybos 2014-12-10 išvada Nr. 11 gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais

(leidimo Nr. G2-19). Leidimo kopija pridedama prie priedų.

6

5. SANTRUMPOS

ADF – aktyviosios deguonies formos

DNR – deoksiribonukleorūgštis

RNR – ribonukleorūgštis

TBR – tiobarbitūro rūgštis

CO – karbonilinės baltymų grupės

2,4-DNFH – 2,4-dinitrofenilhidrazinas

DNF – dinitrofenilhidrazonas

UV – ultravioletiniai spinduliai

SOD – superoksido dismutazė

CAT – katalazė

4-HNE – 4-hidroksinonenalis

MDA – malondialdehidas

8-OH-G – 8-hidroksiguaninas

TChR – trichloracto rūgštis

6. SĄVOKOS

Apoptozė – genetiškai užprogramuota, reguliuojama ląstelių mirtis

Mitoptozė – programuota mitochondrijų mirtis

Hemochromatozė – geležies perteklius organizme

7

7. ĮVADAS

Neigiamo balanso tarp aktyvių deguonies formų (ADF) atsiradimo organizme ir ląstelės

antioksidacinės sistemos gebėjimo efektyviai šias kenksmingas formas detoksikuoti pasekmė yra

oksidacinis stresas [1]. Įvairūs aplinkos dirgikliai, tokie kaip chemikalai, UV spinduliuotė, jonizuojanti

radiacija, sunkieji metalai bei organizmo endogeniniai procesai sukelia aktyvių deguonies formų

susidarymą, kurios savo ruožtu atakuoja ląstelės komponentus: lipidus [2], baltymus [3] ir DNR [4].

Veikiant aliuminio ar geležies metalų jonams susidaro aktyvios deguonies formos, kurios visų

pirma pažeidžia ląstelės lipidus. Vykstant lipidų peroksidacijai, aktyvios deguonies formos jungiasi prie

dvigubojo polinesočiųjų riebalų rūgščių ryšio ir susidaro lipidų hidroperoksidai. Kaip antrieji oksidacijos

produktai susiformuoja įvairūs aldehidai, tarp jų ir malondialdehidas (MDA). Tai yra mutageninis ir

citotoksiškas junginys, kuris plačiai naudojamas kaip molekulinis žymuo lipidų peroksidacijai nustatyti.

Šio junginio koncentraciją galima apskaičiuoti reakcijoje su tiobarbitūro rūgštimi (TBR), panaudojus

spektrofotometrijos metodą [2].

Kiti svarbūs žymenys, atspindintys ADF sukeltas organizmo pažaidas, yra baltymų oksidacijos

tarpiniai produktai. Vyksta proteinų oksidacija, dėl kurios susiformuoja proteinų karbonilinės (CO)

grupės. Pastarąsias galima naudoti kaip molekulinį žymenį oksidacinio streso lygiui apskaičiuoti. Tai

yra labai patogus žymuo, kurį dėl ankstyvo susiformavimo ir stabilumo lengva aptikti. Reakcijoje su 2,4

dinitrofenilhidrazinu (2,4-DNFH) susiformuoja dinitrofenilhidrazonas (DNF), kurio kiekis

skaičiuojamas spektrofotometrijos metodu ties 370 nm ilgio banga [3].

Ląstelės DNR taip pat yra jautri oksidaciniam stresui. DNR yra pažeidžiama įvairiai. Aktyvios

deguonies formos atakuoja DNR azotines bazes tokias kaip guaninas. Susiformuoja 8-hidroksiguaninas

(8-OH-G) arba jo nukleozidinė forma. Sutrikdoma DNR replikacija, transkripcija, transliacija ir tai lemia

mutacijas bei ląstelės kancerogeniškumą. Vienas iš būdų ląstelės DNR fragmentacijai nustatyti yra

elektroforezės metodas [4].

Atliktame tyrime su pelių organais (kepenimis ir smegenimis) vertinamos aliuminio ir geležies

jonų indukuoto oksidacinio streso sukeltos pažaidos baltymams, lipidams bei DNR, pritaikomi

biocheminiai metodai šioms pažaidoms įvertinti. Rezultatai suteikia žinių apie oksidacinio streso poveikį

organizmui bei jo lygio nustatymo metodus.

8

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Aktyvios deguonies formos reikšmingai veikia ląsteles sukeldamos baltymų, lipidų ir DNR

pažaidas. Metalų jonai yra svarbūs faktoriai turintys įtakos ADF susidarymui ir jų sukeliamų pažaidų

lygiui. Todėl šiame darbe siekiama įvertinti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas oksidacines pažaidas

pelių organuose. Šiam tikslui įgyvendinti vertinamas pažaidų metu susidariusių metabolitų

(molekulinių žymenų) kiekis.

Tikslas: Įvertinti aktyvių deguonies formų sukeliamas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių pažaidas

pelių organuose

Uždaviniai:

1. Nustatyti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas baltymų pažaidas pelių organuose.

2. Įvertinti aliuminio ir geležies jonų indukuotų aktyvių deguonies formų įtaką lipidų

peroksidacijai pelių organuose.

3. Ištirti aliuminio ir geležies jonų sukeliamų DNR pažaidų lygį pelių organuose.

9. LITERATŪROS APŽVALGA

9.1 Oksidacinis stresas

Visiems žinoma, kad molekulinis deguonis O2 nuo pat jo pasirodymo atmosferoje, prieš

maždaug 2,3 milijardus metų, yra neatsiejamas mūsų planetos elementas, būtinas gyvybiniams

procesams. Jis yra galutinis elektronų akceptorius substratų oksidacijos metu [5]. Antra vertus, O2 gali

sukelti ir kitus oksidacinius procesus, pažeidžiančius svarbiausias biologines molekules: DNR, lipidus

ir baltymus. Oksidacinis stresas atspindi disbalansą tarp ADF atsiradimo ir ląstelės biologinės sistemos

sugebėjimo efektyviai detoksikuoti šiuos radikalus arba atstatyti atsiradusias pažaidas [1,6,7]. Visi gyvi

organizmai produkuoja ADF veikiant įvairiems endogeniniams ir egzogeniniams faktoriams. Tokiais

faktoriais gali būti aerobinis kvėpavimas, fagocitozė, toksinai, oro tarša, cigarečių dūmai, alkoholis,

alergenai, jonizuojanti spinduliuotė, metalų jonai, trauma, elektromagnetinis laukas, infekcijos,

uždegiminiai procesai ir kt. [6,8]. ADF yra labai aktyvios molekulės, visos aktyvesnės už molekulinį

deguonį ir gali pažeisti įvairias ląstelių struktūras ir taip paveikti ląstelės funkcijas bei nulemti jų mirtį.

Šių oksidantų mažinimas yra kritiškai svarbus normaliai organizmo veiklai, ląstelių gyvybingumui ir

normaliam jų dauginimuisi. Žmogaus organizmas su oksidaciniu stresu kovoja pasitelkdamas turimas

antioksidacines sistemas, kurias sudaro fermentiniai ir nefermentiniai antioksidantai. Jie blokuoja

žalingas ADF ir išlaiko oksidacinę pusiausvyrą [9]. Tačiau, išsekus organizmo antioksidacinėms

sistemoms arba esant ADF pertekliui, šis balansas gali būti sutrikdytas ir užsitesęs oksidacinis stresas

sąlygoti ligas ir būkles tokias kaip vėžys, senėjimas, Alzheimerio liga, Parkinsonsono liga, cukrinis

9

diabetas, aterosklerozė, hipertenzija, reumatoidinis artritas, išemija, idiopatinė plaučių fibrozė, lėtinė

obstrukcinė plaučių liga, astma ir kt. [1,6,8-12].

9.2 Aktyvios deguonies formos

Radikalu vadinama bet kuri atomų ar molekulių rūšis, kurios valentiniame sluoksnyje yra

vienas ar daugiau nesuporuotų elektronų. ADF taip pat yra radikalai, reaktyvios cheminės medžiagos

sudėtyje turinčios deguonį. Jos susiformuoja kaip tarpiniai produktai normalaus deguonies metabolizmo

metu [10].

Molekulinis deguonis (O2) turi unikalią elektronų konfiguraciją ir taip pat yra radikalas.

Prijungus vieną elektroną prie molekulinio deguonies (redukcijos reakcija) susidaro superoksido anijono

radikalas (O2•-), kuris skatina formuotis kitas ADF ir yra laikomas pirmine ADF. Dažniausiai O2

•-

susidaro elektronų pernašos grandinėse mitochondrijose, nukrypus elektronams nuo grandinės tarpinių

komponentų deguonies link [10].

O2 + e− → O2•-

Superoksido anijono radikalas yra oksidantas, turintis neryškių redukcinių savybių, gali

reaguoti su baltymais ir pažeisti jų funkcijas, pvz., pakeisti fermentų aktyvumą [9,10].

Kita svarbi paminėti ADF yra vandenilio peroksidas (H2O2) kuris pats nebūdamas radikalu,

dalyvauja kitų radikalų susidaryme, pasižymi silpnomis oksidacinėmis savybėmis ir pažeidžia

biologines molekules, turinčias –SH grupes ar FeS. Superoksido dismutazė (SOD) detoksikuoja O2•-

radikalą, vieną pagrindinių prooksidantų ląstelėje, sudarydama vandenilio peroksidą ir O2 [5,10]:

2H• + 2O2•- –(SOD)→ H2O2 + O2

Vandenilio peroksidas toliau redukuojamas iki vandens, dėl to, kad būtų išvengta labai

reaktyvios ADF susiformavimo – hidroksido radikalo (OH•). Tai vyksta dalyvaujant fermentui katalazei

(CAT) [5, 10].

2H2O2 –(CAT)→ 2H2O + O2

Jeigu ląstelėje yra metalų jonų (pvz. Fe3+), H2O2 gali būti paverčiamas hidroksido radikalais

vykstant Haber-Weiss ir Fentono reakcijoms. 1894 m. Fentonas (Fenton) pastebėjo, kad geležies druskos

labai didina H2O2 oksidacinį poveikį, o Haberis (Haber) ir Veisas (Weiss) 1934 m. nustatė reakciją [13]:

Harber-Weiss Fe3+ + O2• → Fe2+ + O2

Fentono Fe2+ + H2O2 → Fe3+ +OH- + OH•

Hidroksido radikalas (OH•) yra pats aktyviausias iš visų žinomų oksidatorių. Ypač aktyvus OH•

pažeidžia artimiausius baltymus, DNR, lipidus. Kitos ADF gali būti naudingos fiziologiniams ląstelės

procesams, tačiau OH• yra tik žalingas [9,6,8].

10

9.3 Oksidacinio streso biologinis vaidmuo lipidams, baltymams ir DNR

Mažomis koncentracijomis ADF atlieka svarbų vaidmenį kaip signalinės molekulės ir yra

žalingos tik esant per dideliam jų kiekiui. Laisvieji radikalai svarbūs daugeliui fiziologinių ląstelės

vyksmų [11]:

1. Veikia kaip signalinės molekulės (genų aktyvavimas, ląstelės augimas, cheminių reakcijų

moduliavimas ląstelėje ir kt.);

2. Moduliuoja prostaglandinų biosintezę;

3. Dalyvauja mitoptozėje;

4. Saugo audinius nuo pažeidimo išplitimo esant uždegiminiam komponentui;

5. Dalyvauja apoptozėje.

Normaliomis sąlygomis ADF koncentracija ląstelėje turi būti maža, tuomet jos atlieka savo

biologinę funkciją. Tačiau sutrikus ADF pusiausvyrai ir išsivysčius oksidaciniam stresui yra

pažeidžiamos organizmo ląstelės, audiniai ir vystosi patologinės būklės bei ligos. Kaip jau minėta

anksčiau, oksidaciniam stresui yra jautrios visos ląstelės struktūros: baltymai, lipidai ir DNR [1,6-12].

Pirmiausiai ADF oksiduoja lipidus, vyksta lipidų peroksidacija, kurios metu susidarę junginiai

pasižymi mutageniniu bei citotoksiniu poveikiu [2,9]. Lipidų peroksidacija tai procesas, kurio metu

oksidantai atakuoja lipiduose esančius dvigubuosius ryšius tarp anglies atomų, ypač esančių

polinesočiosiose riebalų rūgštyse [6,10]. Priklausomai nuo individualių ląstelės savybių ji gali išgyventi

arba įsivyravusi lipidų peroksidacija gali nulemti ląstelės žūtį ir taip skatinti įvairių patologinių būklių

organizme išsivystymą [2,9,14].

Visas lipidų peroksidacijos procesas susideda iš trijų etapų: pradėties (angl. k. − initiation),

sklidimo (angl. k. − propagation) ir baigmės (angl. k. − termination) [2,14,15]. Pirmiausia veikiama

arachidoninė rūgštis, kuri yra viena iš labiausiai paplitusių nesočiųjų membranos riebalų rūgščių [3].

Pradėties stadijoje, veikiant oksidantams (R•), atimamas H atomas iš nesočiosios riebalų rūgšties,

susiformuoja lipidinis radikalas (L•). Dauginimo stadijoje šis radiklas pakartotinai reaguoja su

deguonimi ir formuojamas lipidinis peroksiradikalas (LOO•), pastarasis pritraukia vandenilio atomus iš

kitų lipidų molekulių vėl formuojant L•, o pats virsta hidroperoksidu (LOOH). Užvedama grandininė

reakcija, kuri vykta tol, kol neprasideda baigmės stadija. Šioje stadijoje, antioksidantai, pavyzdžiui

vitaminas E, atiduoda vandenilio atomą lipidoperoksi-radikalo molekulei [2,10,14].

Pagrindinis pirminis lipidų peroksidacijos produktas yra lipido hidroperoksidas (LOOH), o

antriniai – MDA, propanalis, heksanalis, 4-hidroksinonenalis (4-HNE). MDA yra laikomas labiausiai

mutageniniu lipidų peroksidacijos produktu, o 4-HNE labiausiai toksiniu [2].

Baltymų oksidacija yra kitas oksidacinio streso sukeliamas procesas, priklausomas jau ne tik

nuo O2, bet ir nuo susiformavusių radikalų, susidarančių oksiduojantis lipidams [3]. Molekuliniu

požiūriu baltymų oksidacijos rezultatu gali būti daug įvairių cheminių modifikacijų nuo molekulės

11

skilimo ar baltymų persikryžiavimo iki aminorūgščių grandinės subtilių modifikacijų [10,16]. Baltymų

oksidacinė modifikacija pasireiškia arba jų agregacija ir molekulinės masės padidėjimu, arba

fragmentacija ir skilimu į mažesnius polipeptidus. Tokie pakitę baltymai greičiau suyra, pakinta jų

elektrinis krūvis. Taip pat oksidacinės pažaidos gali suformuoti naujas reaktyvias chemines grupes,

tokius kaip aldehidus arba ketonus, palikti neįprastus peptidinius galus N ar C terminalėse [9,17]. Dėl

tokios gausos sukeliamų pokyčių, visi tyrimai nagrinėjantys baltymų oksidacijos pasėkmes

susikoncentruoja į vienintelės modifikacijos aptikimą, pavyzdžiui cisteino ar tirozino oksidacijos, arba

tarpinių produktų poklasio, kaip baltymų karbonilinių (CO) grupių [3]. Šie tyrimai yra nuoseklūs,

reikšmingi žingsniai siekiant išsiaiškinti oksidacijos procesus ir jų efektus, tačiau iki šiol nėra metodo

išaiškinti bendrą baltymų oksidacijos procesų vaizdą [3,16,17].

Taip pat ADF gali sukelti įvairias DNR modifikacijas, pavyzdžiui bazių degradaciją, vienos ar

abiejų grandinių pertraukimą, purino, pirimidino bazių mutacijas, delecijas ar translokacijas [4,9,11].

Todėl ne vien tiesiogiai veikiančios ADF tampa ligų etiologiniu veiksniu, tačiau ir DNR pažeidimas

lemia esminius biologinius pokyčius nulemiančius tam tikrų ligų išsivystymą. Padidėjęs mutageninio 8-

OH-G susiformavimo lygis yra nustatomas senstančiose ir vėžinėse ląstelėse [6,18]. Taip pat, H2O2

sukelta oksidacinė DNR pažaida sukelia mikrosatelitų nestabilumą, kuris yra asocijuojamas su

kolorektaliniu vėžiu [19,20]. Daugelis modifikacijų yra glaudžiai susijusių su karcinogeneze, senėjimu,

neurodegeneracinėmis, kardiovaskulinėmis ir autoimuninėmis ligomis. 8-OH-G yra plačiausiai ištirta,

oksidacinio streso metu atsirandanti DNR pažaida ir gali būti naudojama kaip molekulinis žymuo

kancerogenezės procese [4,6,18].

9.4 Geležis ir aktyvios deguonies formos

Geležis, kaip ir deguonis yra būtinas elementas organizmo išgyvenimui. Visos organizmo

ląstelės tiesiogiai ar netiesiogiai yra veikiamos ląstelinio geležies metabolizmo [13,20]. Geležis gali

asocijuotis su baltymais, prisijungti prie deguonies, pernešti elektronus ir katalizuoti reakcijas. Taip pat

tai yra esminis hemoglobino, mioglobino, citochromų komponentas, dalyvauja metabolinėse reakcijose,

tokiose kaip O2 pernaša, elektronų pernaša, oksidacinio fosforilinimo, ksenobiotikų metabolizme,

ląstelių augime, DNR sintezėje, apoptozės, uždegimo, genų raiškos reguliavime. CNS geležis reikalinga

mielogenezės procesams ir mielino išlaikymui oligodendrocituose, taip pat kaip kofaktorius

neurotransmiterių dopamino, norepinefrino, serotonino sintezėje [21,22]. Taigi geležis dalyvauja

daugelyje biologinių procesų ir fundamentalių biocheminių reakcijų visose ląstelėse. Tokių reakcijų

reguliavimas gali būti teigiamas, palaikantis ląstelinį aktyvumą, būtiną jų gyvybingumui išlaikyti.

Tačiau geležis pasižymi ir neigiamu poveikiu – sukelia žalingų ADF susiformavimą [20].

Normaliai potenciali geležies jonų žala yra minimali, dėl jos sudaromų kompleksų su pernašos

baltymais transferinu ir feritinu, kurie sumažina nekontroliuojamą deguonies ir geležies sąveiką bei ADF

12

formavimąsi. Tačiau, bet koks kiekis laisvos geležies skatina formuotis ADF [22]. Prie oksidacinio

streso formavimosi geležis prisideda keliais būdais ir svarbiausias jų – anksčiau minėta Fentono reakcija,

kurios metu susidaro pavojingi, reaktyvūs hidroksido radikalai [5,13,20]. Todėl nenuostabu, kad geležies

homeostazė organizme yra griežtai kontroliuojama, kad būtų išvengta pavojingų junginių formavimosi

keliančio didelę žalą ląstelėms ir audiniams [5,13].

Dėl specifinių geležies sekrecijos mechanizmų trūkumo, nenormaliai gausios geležimi dietos

ar nuolatinių kraujo transfuzijų išsivysto hemochromatozė [12]. Kaip skelbia geležies sutrikimų

institutas, JAV, padidėjęs geležies kiekis organizme padidina riziką susirgti kepenų ligomis, miokardo

infarktu ar širdies nepakankamumu, cukriniu diabetu, osteoartritu, osteoporoze, metaboliniu sindromu,

hipotiroidizmu, hipogonadizmu ir neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio,

Huntingtono, epilepsija [5,23,24]. Viename tyrime (Madeiros ir kt.) [24] buvo nagrinėjamas ryšys tarp

geležies, oksidacinio streso ir Parkinsono ligos. Nustatyta, kad Parkinsono liga sergančių ligonių

juodojoje medžiagoje yra susikaupusios daugiau geležies lyginant su kontrole, kas lemia oksidacinį

stresą ir uždegimą čia esančiuose dopaminerginiuose neuronuose [24]. Taip pat yra įrodymų, kad

geležies koncentracija organizme didėja su amžiumi, dėl geležies homeostazės sutrikimo [25]. Atliktame

tyrime (Servais ir kt.), kuriame buvo tirtas geležies kaupimasis žiurkių mitochondrijose, nustatyta, kad

intraląstelinės geležies padaugėja 233 % žiurkėms senstant, ir dėl to oksiduotos RNR kiekis padidėja 83

% [26]. Taip pat įtakos geležies kaupimuisi turi menopauzė. Po menopauzės moterims yra nustatomos

didesnės feritino koncentracijos [25]. Feritinas izoliuoja potencialiai reaktyvią geležį ir yra ląsteles

apsaugantis. Tačiau fagocitozės būdu feritinas patenka į ląstelę, lizosomos jį degraduoja ir tuomet gali

būti išlaisvinama geležis. Tai lemia ADF produkciją citozolyje. Geležis ir oksidacinis stresas kaip

manoma turi reikšmės odos sausumui, storėjimui ir raukšlėjimuisi menopauzės metu [25].

9.5 Aliuminis ir jo sukeliamos pažaidos

Aliuminis tai cheminis elementas, kurio simbolis yra Al, o atominis numeris periodinėje

elementų lentelėje - 13. Tai minkštas, nemagnetinis metalas, kuris sudaro apie 8 proc. žemės plutos

masės. Jis randamas daugiau nei 270 mineralų sudėtyje. Nepaisant jo naudos aplinkai, nei viena žinoma

gyvybės forma žemėje gyvybiniuose procesuose nenaudoja aliuminio druskų [27]. Taigi, nors aliuminis

ir yra vienas plačiausiai paplitusių metalų žemėje, bet iki šiol nėra žinomos jokios jo biologinės

funkcijos.

Aliuminis yra plačiai paplitęs aplinkoje, įeina į kai kurių antiperspirantų, antacidinių vaistų

sudėtį, gali būti gaunamas su vandeniu, per aliuminio įrankius, maisto pakuotes ir kt. Labai didelėmis

dozėmis aliuminis gali pereiti kraujo – smegenų barjerą ir čia būti itin kenksmingas organizmui.

Nedidelė dalis žmonių yra alergiški aliuminiui ir gali kentėti nuo kontaktinio dermatito, virškinimo

13

sutrikimų, vėmimo ar kitų simptomų esant kontaktui su aliuminiu per odą ar sistemiškai. Nustatyta, kad

aliuminio toksiškumas pasireiškia vartojant daugiau nei 40 mg/kg/d aliuminio [28].

Aliuminis yra laikomas reliatyviai žemo redoksiškumo elementu, tačiau jis gali sukelti

oksidacinį stresą veikiant paprastiems mechanizmams. Jis gali prisijungti prie neigiamai įkrautų

fosfolipidų, kurių sudėtyje yra polinesočiųjų riebalų rūgščių jautrių ADF. Aliuminis skatina geležies

inicijuojamą lipidų peroksidaciją Fentono reakcijų metu, tai lemia Fe3+ jonų formavimąsi ir ADF

produkciją. Superoksidas O2•- yra neutralizuojamas Al3+ jonų formuojant Al-O2

•- kompleksą, kuris

didina oksidacinę O2•- talpą [29]. Kaip jau minėta anksčiau, susiformavusios ADF taip pat sukelia

ląstelių pažaidą oksiduodamos aminorūgštis baltymuose, susidarant karbonilinėms grupėms. Viena

studija (Kowalczyk ir kt.) parodė, kad ilgalaikis (3 mėn) vandens su AlCl3 (80 mg/l) davimas žiurkėms,

reikšmingai padidino karbonilinių grupių koncentraciją žiurkių eritrocitų hemolizate [29]. Kitame tyrime

(Abubakar ir kt.) eksperimentinėms žiurkėms buvo taikoma dieta su aliuminio laktatu ir nustatyta

didesnė ADF produkcija kepenų homogenate lyginant su kontrole [30]. Studija (Yuan ir kt.) tyrusi

aliuminio įtaka ADF formavimuisi ir jų pažaidas skirtingose smegenų vietose nustatė padidėjusį lipidų

peroksidacijos produktų kiekį hipokampe, vidurinėse smegenyse, smegenėlėse ir smegenų kamiene [31].

9.6 Oksidacinio streso molekuliniai žymenys ir jų nustatymo būdai

9.6.1 Karbonilinės grupės baltymuose

Vykstant baltymų oksidacijai formuojasi karbonilinės (CO) grupės (aldehidai ir ketonai). Šios

struktūros yra chemiškai stabilios, dėl to yra palanku jas aptikti, vertinant baltymų oksidacijos procesą,

kartu ir nustatant oksidacinio streso lygį. Šiuo metu praktikoje yra naudojama daug skirtingų

biocheminių testų šioms karbonilinėms grupėms aptikti [3]. Vienas iš populiariausių metodų yra 2,4-

DNFH reakcija su karbonilinėmis grupėmis apskaičiuojant jų kiekį spektrofotometrijos metodu ties 370

nm banga. Šis būdas tinka įvertinti baltymų oksidaciją plazmoje, audinių homogenate, ląstelių ekstrakte.

Baltymų koncentracija tiriamajame mėginyje neturėtų būti didesnė nei 5 mg/ml. Metodas naudojamas

oksidacinio streso lygiui nustatyti smegenų audinyje, pacientų sergančių Alzheimerio liga ar amiotrofine

šonine skleroze po jų mirties, diabetu sergančiųjų kraujo plazmoje ir akies kamerų skystyje, artritu

sergančiųjų kraujo plazmoje ar sinoviniame skystyje, ar pacientų sergančiųjų cistine fibroze kraujyje

[3,32].

9.6.2 Lipidų peroksidacijos produktai

Kaip jau minėta anksčiau, lipidų peroksidacija tai procesas, kurio metu oksidantai veikia lipidų

dvigubuosius ryšius, ypač polinesočiųjų riebalų rūgščių [2]. Glikolipidai, fosfolipidai ir cholesterolis yra

pagrindiniai oksidacinio streso taikiniai. Susidarę peroksidacijos produktai gali būti naudojami kaip

molekuliniai žymenys. MDA yra plačiai naudojamas kaip patogiausias žymuo lipidų peroksidacijai

14

nustatyti, dėl paprastos reakcijos su TBR. TBR testas yra paremtas reaktyvumo su MDA principu, kurio

kiekis nustatomas spektrofotometrijos būdų ties 540 nm banga [3,33,34].

Oksidacinio lygio nustatymui baltymų karbonilinių grupių kiekio matavimas turi pranašumų

lyginant su lipidų peroksidacijos produktų nustatymu vien dėl to, kad baltymai oksiduojasi greitai, o

susidarę produktai išlieka stabilūs ilgesnį laiką, tuo tarpu lipidų peroksidacijos produktai organizme

detoksikuojami per keletą minučių [3].

9.6.3 DNR pažaidų aptikimas

Išmatuoti DNR pažaidas ląstelėje yra sudėtinga analitinė užduotis, kadangi pažeidimo lygis yra

reliatyviai mažas ir reprezentuoja mažiau nei 1 modifikaciją milijonui normalių bazių. Pažaidoms aptikti

yra naudojami tiek tiesioginiai, tiek netiesioginiai metodai [4]. Tiesioginiai būdai yra pagrįsti analitine

chemija, kuomet DNR yra išskiriama iš ląstelės, hidrolizuojama iki monomerinių vienetų ir tuomet

specifiniais aptikimo metodais (sudėtinė skysčių chromatografija su elektrocheminiu aptikimu (HPLC-

ECD), sudėtinė dujų chromatografija su masių spektrofotometrija (GC-MS), skysčių chromatografija su

masių spektrofotometrija (HPLC-MS/MS)) kiekybiškai apskaičiuojamos DNR pažaidos. Kiti būdai yra

vadinami netiesioginiais, arba biocheminiais [4,18]. Pradžioje buvo bandoma panaudoti specifinius

antikūnus prieš pirimidino dimerus, tačiau metodas pasirodė nepakankamai tikslus. Pagrindiniu

netiesioginiu DNR pažaidų aptikimo metodu šiuo metu yra laikoma elekroforezė [4]. Nukleorūgščių

elektroforezė paprastai vykdoma agarozės gelyje. Proceso metu DNR ar RNR molekulės yra atskiriamos

pagal dydį. Taikant modifikuotą elektroforezės metodą, vadinamą pulsuojančio lauko gelio

elektroforeze (angl. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), pagal dydį išskiriami dideli DNR

fragmentai (pvz., chromosomos). Lengviausias ir daugiausia paplitęs metodas yra nukleorūgščių

horizontali elektroforezė agarozės gelyje. Dvigrandės linijinės DNR molekulės juda gelyje greičiu, kuris

yra atvirkščiai proporcingas jų molekulinės masės logaritmui. Tai yra, kuo molekulė mažesnė, tuo

greičiau ji juda gelyje [35].

10. TYRIMO METODIKA

10.1 Tyrimo objektas ir reagentai

Eksperimentai atlikti su nelinijinėmis 4-6 savaičių amžiaus baltosiomis laboratorinėmis

pelėmis, sveriančiomis 20-25 g. Moksliniai tyrimai atlikti remiantis Lietuvos Respublikos gyvūnų

globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) 14 straipsniu, Valstybinės

veterinarijos tarnybos 1998 m. gruodžio 31 d. įsakymu Nr. 4-361 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo,

dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr.

4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ bei sveikatos apsaugos ministro

1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių

15

(eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“, o taip pat Europos etikos komiteto darbui su laboratoriniais

gyvūnais nustatytų reikalavimų. Darbui su laboratoriniais gyvūnais gautas leidimas, kurį išdavė Lietuvos

laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos

(leidimo Nr. G2-19, 1 priedas).

Eksperimentams naudotos laboratorinės pelės iš LSMU VA vivariumo, kurios atsivežtos ir 7

dienas laikytos karantino sąlygomis. Patinai ir patelės laikyti atskiruose narveliuose, sudarant optimalias

laikymo sąlygas: patalpų temperatūra ~20°C, santykinė oro drėgmė 55±10 %, natūralus šviesos

(diena/naktis, 12/12) režimas. Pakratams naudotos medienos drožlės ir šienas, kuriuos kiekvieną dieną

keitėme švariais. Pelės šertos „Kauno grūdų“ pilnaverčiu maistu graužikams ir girdytos vandentiekio

vandeniu ad libitum.

Eksperimentams naudojome šiuos reagentus: tiobarbituro rūgštis (TBR), AlCl3, FeCl3 – firmos

„Sigma“ (JAV); kalio chloridas (KCl), druskos rūgštis (HCl) – firmos „Merck“ (Vokietija); natrio

chloridas (NaCl) – firmos „Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChR) – Rusija, 2,4-

dinitrofenilhidrazino (2,4-DNFH), guanidinas, Tris-HCl, natrio chloridas (NaCl), etilendiamino

tetraacto rūgštis (EDTA), 80 % fenolio tirpalas, 10 % natrio dodecilsulfato (NDS) tirpalas. Tirpalams

gaminti naudotas dejonizuotas vanduo.

10.2 Tyrimo metodai

10.2.1 Metalų poveikio laboratorinių gyvūnų organams tyrimo modelis

Vienas iš pagrindinių cheminių reagentų toksiškumo gyviems gyvūnams įvertinimo būdų yra

jų vidutinės mirtinos dozės (LD50) nustatymas. Tai yra minimali reagento koncentracija, nuo kurios

paros laikotarpyje žūva 50 % visų bandomųjų gyvūnų. LD50 išreiškiama miligramais reagento, tenkančio

vienam eksperimentinio gyvūno kūno masės kilogramui. Eksperimentai parodė, kad LD50 AlCl3 atitinka

50 mg Al3+ vienam kg kūno masės. Kadangi tyrimai atlikti su kontrolinių laboratorinių pelių organais,

naudojamų metalų tirpalų koncentracijos modifikuotos, kad būtų sukeltas ūmus oksidacinis poveikis in

vitro. Buvo naudoti 1 M AlCl3 ir 1 M FeCl3 tirpalai.

10.2.2 Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymas

Baltymų karbonilinių grupių koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudojome Levine ir

bendraautorių pasiūlytą metodiką [36]. Iš pradžių buvo paruošti tyrimui reikalingi reagentai: audinių

homogenatas, 0,1 M fosfatinis buferis (pH 7,4), 10 mM 2,4-dinitrofenilhidrazino (2,4-DNFH) paruošto

2,5 M HCl, 20 % ir 10% trichloracto rūgšties (TChA), 6 M guanidinas, 1 M aliuminio (III) chloridas

(AlCl3) ir 1 M geležies (III) chloridas (FeCl3).

Laboratorinių pelių kepenys pasvertos ir homogenizuotos fosfatiniame buferyje, kurio tūris 5

kartus didesnis nei homogenizuotų kepenų masė ir mišinys inkubuotas 15 min 37˚C temperatūroje.

16

Baltymų koncentracija mišinyje pamatuota Warburg-Christian metodu [37]. Mišinys praskiestas

fosfatiniu buferiu tiek, kad baltymų koncentracija būtų mažesnė nei 10 mg/ml.

Į mėgintuvėlius išpilstyta po 0,3 ml homogenato, tada 0,1 M fosfatinio buferio iki 1 ml ir

paruošti tiriamieji bei kontroliniai mėginiai. Į tiriamuosius mėginius pridėti skirtingi kiekiai 1 M AlCl3

ar 1 M FeCl3. Mėgintuvėliai inkubuoti 37˚C temperatūroje 2 val. arba 24 val. Homogenato ir veikiamos

metalo druskos tūrių santykiai mėginyje bei inkubacijos laikas skirtingų bandymų metu pavaizduoti 1

lentelėje.

I lentelė. Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymo bandymų sąlygos

I

band.,

Nr. Al/Fe H:M

Ink.

(val.)

II

band.,

Nr. Al/Fe H:M

Ink.

(val.)

III

band.,

Nr. Al/Fe H:M

Ink.

(val.)

1 k k k 1 k k k 1 k k k

2 k k k 2 k k k 2 k k k

3 AlCl3 1:1 2 3 k k k 3 k k k

4 FeCl3 1:1 2 4 FeCl3 1:1 2 4 AlCl3 1:1 2

5 AlCl3 1:1 24 5 FeCl3 1:1 2 5 AlCl3 1:1 2

6 FeCl3 1:1 24 6 FeCl3 1:1 2 6 AlCl3 1:1 2

7 AlCl3 3:1 2 7 FeCl3 1:1 24 7 AlCl3

1:1 24

8 FeCl3 3:1 2 8 FeCl3 1:1 24 8 AlCl3

1:1 24

9 AlCl3 3:1 24 9 FeCl3 1:2 24 9 AlCl3

1:2 24

10 FeCl3 3:1 24 10 FeCl3 1:2 2 10 AlCl3 1:2 2

11 FeCl3 1:2 2 11 AlCl3 1:2 2

12 FeCl3 1:2 2 12 AlCl3 1:2 2

13 FeCl3 1:2 24 13 AlCl3 1:2 24

14 FeCl3 1:2 24 14 AlCl3 1:2 24

k – kontrolė, H:M – tūrio santykis tarp homogenato ir veikiamo metalo druskos, band,. – bandymas, Nr. – mėgintuvėlio

numeris, ink. – inkubacijos laikas valandomis.

Po nustatyto laiko į tiriamuosius mėginius ir vieną kontrolinį mėginį pridėta 4 ml 10 mM 2,4-

DNFH, paruošto 2,5 M HCl. Į kitą kontrolinį mėginį tik 4 ml 2,5 M HCl. Visi mėgintuvėliai inkubuoti

1 val. kambario temperatūroje, tamsoje, pamaišant kas 15 min.

Po valandos į visus mėgintuvėlius pridėta po 5 ml šaltos 20 % TchA baltymų nusodinimui ir

mėginiai šaldyti ledo vonioje 15 min. Baltymo nuosėdos surinktos centrifuguojant 15 min 10000

aps./min greičiu. Iš mėgintuvėlių nupiltas supernatantas, o likusios baltymų nuosėdos tirpintos 6 M

guanino tirpale ir inkubuotos 1 val 37˚C temperatūroje, nuolatos maišant.

Optinis tankis apskaičiuotas 370 nm bangoje. Laisvų karbonilinių grupių kiekis (nmol)

skaičiuojamas pagal molinės ekstinkcijos koeficintą: 22,000 cm-1 x M-1. Perskaičiuojama miligramui

baltymo (nmol/mg).

17

10.2.3 MDA koncentracijos nustatymas

MDA koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudota Uchiyama ir bendraautorių pasiūlyta

metodika [38]. Pradžioje paruošti tyrimui reikalingi reagentai: audinių homogenatas, 50 % trichloracto

rūgštis (TChA), 1,2 % KCl tirpalas, 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,35, tirpalas, 35 % TChR tirpalas, 0,75

% 2-tiobarbituro rūgšties (TBR) tirpalas, 0,5 % TBR tirpalas, 10 % TChR tirpalas

Audinių homogenatas buvo ruošiamas audinių smulkintuvu, pradžioje pasvėrus laboratorinių

pelių kepenis ar smegenis ir pridėjus 4 kartus didesnį tūrį (lyginant su organo mase) šalto 1,2 % KCl.

Gautas homogenatas išskirstytas į mėgintuvėlius po 0,2 ml, įpilta 0,1 M fosfatinio buferio (pH

7,35) iki 1 ml ir paruošti tiriamieji bei kontroliniai mėginiai. Į tiriamuosius mėginius pridėta 1 ml 1 M

AlCl3 ar 1 ml 1M FeCl3, mėgintuvėliai inkubuoti 2val 37 ˚C temperatūroje.

Po nustatyto laiko į tiriamuosius bei kontrolinį mėginius pridėta 0,5 ml 35 % TChR tirpalo, 1

ml 0,75 % TBR vandeninio tirpalo ir visi mėgintuvėliai inkubuoti 1 val. 37 0C vandens vonioje,

retkarčiais supurtant.

Po inkubacijos visi mėgintuvėliai dar 15 min. laikyti verdančio vandens vonioje. Po to 10 min.

atšaldyti ledo vonioje. Į atšaldytus mišinius pridėjus 1 ml 35 % TchA, jie buvo centrifuguojami 10 min.

5000 aps./min greičių.

Po centrifugavimo spektrofotometriškai pamatuota supernatanto sugertis ties 532 nm banga.

Prietaiso nulio nustatymui buvo ruošiamas kontrolinis mėginys, kuriame vietoje 0,2 ml audinių

homogenato buvo įpilta 0,2 ml 1,2 % KCl tirpalo.

MDA koncentracija apskaičiuota pagal formulę: C = A/M, kur M – molinės ekstinkcijos

koeficientas, lygus 1,56x105 mol-1cm-1, A – supernatanto sugerties reikšmė ties 532 nm banga.

10.2.4 DNR elektroforezė

Pradžioje iš laboratorinės pelės kepenų buvo išskirta DNR. Šis procesas atliktas pagal DNR

išskyrimo protokolą [39]. Šiam etapui buvo paruošti reikalingi tirpalai: 1 M Tris-HCl (pH 8,0); 1 M

Tris-HCl (pH 7,0); buferis A (0,25 M Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM natrio chloridas (NaCl); 25 mM

etilendiamino tetraacto rūgštis (EDTA)); buferis B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0; 1 mM EDTA), 80 % fenolio

tirpalas., 10 % natrio dodecilsulfato (NDS) tirpalas.

Paimtos laboratorinės pelės kepenys, sveriančios 1g, kurios prieš tai buvo užšaldytos 70 0C

temperatūroje 24 valandas. Atšaldytas audinys buvo susmulkintas iki miltelių konsistencijos

porcelianinėje grūstuvėje, kuri iš anksto taip pat buvo šaldyta 70 0C temperatūroje 24 valandas.

Gauti susmulkinto audinio milteliai buvo atsargiai surinkti ir pernešti į centrifūginį mėgintuvėlį

bei užpilti 8,2 ml buferio A. Į šį homogenatą buvo pridėta 1,8 ml 10 % NDS, kad galutinė koncentracija

būtų lygi 1 %. Tada homogenatas buvo lizuotas 10 min. kambario temperatūroje.

18

Po to buvo pridėta toks pat tūris fenolio-chloroformo mišinio (6,8 ml:6,8 ml), mišinys

energingai purtytas 1-2 min, o paskui centrifuguotas 10000 g pagreičiu 5 min. Atsiskyrusi vandens

fazė buvo atsargiai nuimta naudojant 1 ml pipetę su siauru antgaliu.

Ištirpusi šioje fazėje DNR buvo nusodinta pridedant lygų tūrį izopropilo spirito. Kad DNR

nusėdimas būtų pilnas, mišinys 2 val. buvo laikomas –20˚C temperatūroje. Po 2 val. DNR nuosėdos

buvo surinktos centrifuguojant 10000 g pagreičiu 5 min. Galiausiai gautos DNR nuosėdos ištirpintos

1,7 ml buferio B ir laikytos kambario temperatūroje.

Po 16val. paimta 800 µl buferio su ištirpinta DNR ir pridėjus 3200 µl vandens, mišinys

praskiestas 5 kartus. Tada plokštelė su agarozės geliu įdedama į horizontalios elektroforezės aparatą.

Visi 20 µl talpos šulinėliai užpildyti tokiais mišinių kiekiais:

1, 4 ir 12 šulinėliuose įnešta po 20 µl buferio (kuriame yra dažų leidžiančių elektroforezės metu

stebėti DNR molekulių judėjimą elektros lauke);

2 ir 3 – 2,5 µl paruošto DNR mišinio ir 17,5 µl buferio;

5 – 5 µl DNR mišinio ir 15 µl buferio;

6 – 10 µl DNR standarto (DNR Ladder) ir 10 µl buferio;

7 – 10 µl DNR mišinio ir 10 µl buferio;

8 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M AlCl3 15min ir 10 µl buferio;

9 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M AlCl3 30min ir 10 µl buferio;

10 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M FeCl3 15min ir 10 µl buferio;

11 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M FeCl3 30min ir 10 µl buferio.

Šulinėlius užpildžius pradėta elektroforezė. Jai pasibaigus DNR fragmentų pasiskirstymas

gelyje vertintas ant stalelio su UV lempa.

10.3 Duomenų patikimumo vertinimas

Gauti duomenys analizuoti IBM SPSS 23 paketu. Duomenų patikimumas vertintas pagal

neparametrinį Mann-Whitney U testą skirtą dviem nepriklausomoms imtims lyginti. Skirtumai laikyti

statistiškai reikšmingais, kai reikšmingumo lygmuo p 0,05.

11. REZULTATAI

Baltymų karbonilinių grupių koncentracijų palyginimui atlikti 3 bandymai (sąlygos nurodytos

1 lentelėje) su skirtingų laboratorinių pelių kepenų preparatais. Pirmajame bandyme metalais veiktuose

mišiniuose nustatyta 78 nmol/mg karbonilinių grupių koncentracija. Rezultatai statistiškai nesiskyrė

lyginant su koncentracija kontroliniame mišinyje - 75 nmol/mg. Tačiau mišinius paveiktus skirtingu

metalu vertinant atskirai, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kontrolės (75 nmol/mg) ir

mišinio veikto FeCl3 – 88 nmol/mg (1 pav.). Didžiausia karbonilinių grupių koncentracija (98 nmol/mg)

19

nustatyta mėginyje, kuriame homogenato ir FeCl3 mišinys buvo santykiu 1:1, homogenatą veikiant

FeCl3 2 val.

1 pav. Karbonilinių grupių koncentracija (nmol/mg) pelės kepenų homogenate paveikto metalais

K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * - statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe

Antrajame bandyme statistiškai reikšmingai skyrėsi karbonilinių grupių koncentracija tarp

kontrolės - 98 nmol/mg ir mišinio veikto FeCl3 - 128 nmol/mg, o didžiausia karbonilinių grupių

koncentracija (142 nmol/mg) nustatyta mėginyje, kuriame homogenato ir FeCl3 mišinys buvo santykiu

1:1, metalas veikė homogenatą 24 val. Trečiajame bandyme karbonilinių grupių koncentracija

kontroliniame mėginyje (41 nmol/mg) ir mišinyje veiktame AlCl3 (43 nmol/mg) statistiškai reikšmingai

nesiskyrė. Visuose bandymuose lyginant mišinius su skirtingu homogenato ir veikiamos metalo druskos

santykiu, komponentų santykis karbonilinių grupių koncentracijai įtakos neturėjo. Taip pat nei vienas

bandymas neparodė oksidacinio streso lygio statistiškai reikšmingo skirtumo tarp mišinių inkubuotų

metalais skirtingą laiko tarpą (2 arba 24 val.).

Vertinant MDA koncentraciją atlikti du bandymai su laboratorinės pelės kepenų ir smegenų

preparatais. Kepenų homogenate, veiktu FeCl3, MDA koncentracija buvo 3 kartus didesnė lyginant su

kontroliniu mėginiu (p<0,05). AlCl3 tokio poveikio nesukėlė ir reikšmingo skirtumo tarp tiriamo ir

kontrolinio mėginių nebuvo (2 pav.). Panašūs rezultatai gauti ir su smegenų homogenatu. Jį veikiant

FeCl3 nustatyta MDA koncentracija buvo 3,5 kartus didesnė lyginant su kontroliniu mėginiu (p<0,05).

Kontrolę lyginant su homogenatu veiktu AlCl3 MDA koncentracijų skirtumo nenustatyta (3 pav.).

2 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse paveiktose AlCl3 arba FeCl3

K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * - statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe

75,668,6

*88,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

K Al Fe

*

0

100

200

300

400

K Al Fe

20

MDA koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (0,540 nmol/l) prilyginta 100%

3 pav. Malondialdehido koncentracija pelių smegenyse paveiktose AlCl3 arba FeCl3

K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrole

MDA koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (0,719 nmol/l) prilyginta 100%

DNR paveiktų metalų druskomis fragmentų pasiskirstymas pavaizduotas nuotraukoje (4 pav.).

Stebint agarozės gelį ant stalelio su UV lempa buvo matoma tvarkingai iš 6 šulinėlio išsidėsčiusi

standartinė DNR (DNR ladder). 1, 4 ir 12 šulinėliuose buvo įneštas tik buferis, todėl po jais nematoma

nieko. Po 2, 3, 5 ir 7 šulinėliais matomos panašaus ilgio (lyginant su DNR standartu) juostelės, tačiau

nefragmentuotos, labiausiai tikėtina, jog dėl per didelės koncentracijos. Po 8 ir 9 šulinėliais matomos

per pus trumpesnio ilgio juostelės. Po 10 ir 11 šulinėliais nematoma nieko.

*

0

50

100

150

200

250

300

350

400

K Al Fe

21

4 pav. Kontrolinių DNR, ir DNR paveiktų metalų druskomis fragmentų pasiskirstymas

atliekant elektroforeze agarozės gelyje.

1, 4, 12 šulinėliuose – tik buferis; 2 ir 3 šulinėliuose – 2,5 µl paruošto DNR mišinio ir 17, 5 µl buferio;

5 – 5 µl DNR mišinio ir 15 µl buferio; 6 – 10 µl DNR standarto (DNR Ladder) ir 10 µl buferio; 7 – 10

µl DNR mišinio ir 10 µl buferio; 8 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M AlCl3 15 min ir 10 µl buferio; 9

– 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M AlCl3 30min ir 10 µl buferio; 10 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M

FeCl3 15 min ir 10 µl buferio; 11 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M FeCl3 30 min ir 10 µl buferio.

12. REZULTATŲ APTARIMAS

Vykstant organizmo gyvybiniams procesams ir dėl išorinių faktorių organizme susidaro

aktyvios deguonies formos [1,7-9]. Manoma, kad kai kurių patologijų priežastimis kaip tik ir yra ADF

poveikis ląstelėms [7,12]. Įvairūs autoriai nurodo, kad ADF sukelia baltymų, lipidų ir nukleorūgščių

pažaidas, kas ir gali būti įvairių susirgimų priežastimi [6-12,17,19,23]. Žinoma, kad įvairių metalų jonai

daro įtaką aktyvių deguonies formų, o tuo pačiu ir organizmo makromolekulių pažaidų atsiradimui

[6,13,22]. Yra tyrimų, kuriuose nurodyta, kad geležis bei aliuminis sukelia lipidų, baltymų ir

nukleorūgščių pažaidas eksperimentinių gyvūnų organuose atliekant eksperimentus in vivo [29-31,40-

42,44-48].

Savo darbe tyriau galimas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių pažaidas pelių organuose in vitro,

paveikus juos aliuminio ar geležies druskomis. Gauti rezultatai rodo, kad Al3+ jonai neturėjo reikšmingos

įtakos lipidų peroksidacijai ir veikiant jais pelių kepenų ir smegenų homogenatus reikšmingas MDA

lygio skirtumas lyginant su kontrole nenustatytas. Tuo tarpu žinoma, kad eksperimentinius gyvūnus

veikiant aliuminio druskomis in vivo matomi akivaizdūs molekulinio žymens padidėjimai [29,31,40,41].

Taip pat gautuose rezultatuose matoma, kad Al3+ jonai nesukėlė reikšmingo skirtumo karbonilinių

grupių susidarymui, paveikus pelių kepenų homogenatą panaudojus skirtingus aliuminio druskų tūrius

bei parenkus skirtingą inkubacijos laiką. Ankstesni tyrimai in vivo parodė, kad eksperimentinių gyvūnų

girdymas aliuminio druskomis nulėmė karbonilinių grupių lygio padidėjimą tiriant jų kraują ir organus

[29,41]. Gautų rezultatų ir pasaulinių tyrimų duomenų neatitikimą galima būtų paaiškinti metodikų,

tyrimo objektų ar aliuminio druskų naudojimo skirtumais. Gali būti, kad metalo jonas stipriau veikia

fermentų dalyvaujančių baltymų skaldymo procese funkciją nei patį baltymą, todėl in vitro nestebimas

toks poveikis, kuris įprastai nustatomas in vivo. Tuo tarpu ištyrus poveikį DNR rezultatuose nėra matoma

didesnės DNR, veiktos Al3+ jonais, fragmentacijos lyginant su kontroline grupe, kaip nurodoma

ankstesnių pasaulinių tyrimų duomenyse su laboratorinėmis pelėmis in vivo [43]. Tai galėjo įvykti dėl

per didelės išskirtos DNR koncentracijos mišinyje. Tačiau rezultatai parodė, kad DNR paveikta Al3+

22

jonais agarozės gelyje judėjo akivaizdžiai lėčiau lyginant su kontroline grupe, todėl galima teigti, kad

įvyko DNR struktūrinių pokyčių lėmusių lėtesnę DNR migraciją.

Eksperimentuose panaudojus Fe3+ jonus, buvo pastebėtas labai ženklus baltymų karbonilinių

grupių susidarymo ir lipidų peroksidacijos molekulinio žymens MDA padidėjimas lyginant su

kontrolinėmis grupėmis. Gauti rezultatai neprieštarauja anksčiau atliktiems tyrimamas su laboratoriniais

gyvūnais, kuriuose nustatytas tų pačių oksidacinio streso molekulinių žymenų padidėjimas esant

geležies pertekliui [44-47]. Rezultatai parodė, kad nebuvo jokio reikšmingo skirtumo tarp mėginių

veiktų geležies druskomis 2 ir 24 valandas. Galima daryti prielaidą, kad mano eksperimente, tiek lipidų,

tiek baltymų oksidacija įvyko per pirmąsias 2val pelių organų homogenatus paveikus geležies

druskomis. Atlikus DNR elektroforezę po šulinėliais, kuriuose buvo mėginiai veikti geležies druskomis

nematoma nieko, taip galėjo nutikti dėl to, jog parinkta geležies druskos koncentracija suardė visą DNR

ir buvo negalima stebėti jos fragmentacijos. Tuo tarpu publikuotose straipsniuose autoriai nurodo, jog

geležies junginių perteklius eksperimentiniuose gyvūnuose sukelia DNR fragmentaciją, ko priežastis yra

susidariusių ADF poveikis [46,48]. Toks neatitikimas galimas dėl panaudotos per didelės FeCl3

koncentracijos ar per ilgo veikimo laiko.

13. IŠVADOS

1. Al3+ jonai neturėjo įtakos karbonilo grupių susidarymui pelių kepenų baltymuose, tuo tarpu

naudojant Fe3+ jonus, karbonilinių grupių kiekis pelių kepenyse ženkliai padidėjo.

2. Al3+ jonai neturėjo įtakos lipidų peroksidacijos produkto MDA susidarymui pelių kepenyse.

Naudojant Fe3+ jonus, MDA kiekis reikšmingai padidėjo pelių kepenyse ir smegenyse.

3. Paveikus DNR, išskirtų iš pelės kepenų, Al3+ jonais matomas lėtesnis DNR judėjimas

elektroforezės lauke, tuo tarpu panaudojus Fe3+ jonus DNR buvo suardyta ir nematoma agarozės gelyje.

23

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Sies H. Oxidative stress. London: Academic Press; 1991, p 506.

2. Ayala A, Muñoz M, Argüelles S. Lipid Peroxidation: Production, Metabolism, and Signaling

Mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal. Oxid Med Cell Longev. 2014;1-31

3. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl groups as

biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta. 2003;329(1-2):23-38.

4. Nikitaki Z, Hellweg C, Georgakilas A, Ravanat J. Stress-induced DNA damage biomarkers:

applications and limitations. Frontiers in Chemistry. 2015;3:35.

5. Galaris D, Pantopoulos K. Oxidative Stress and Iron Homeostasis: Mechanistic and Health

Aspects. Crit Rev Clin Lab Sci. 2008;45(1):1-23.

6. A.M. Adly A. Oxidative Stress and Disease: An Updated Review. J Immunol Res. 2010;3(2):129-

45.

7. Di Meo S, Reed T, Venditti P, Victor V. Harmful and Beneficial Role of ROS. Oxid Med Cell

Longev. 2016;1-3.

8. Beckman KB, Ames BN. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev. 1998;78:547-81

9. Birben E, Sahiner U, Sackesen C, Erzurum S, Kalayci O. Oxidative Stress and Antioxidant

Defense. World Allergy Organization Journal. 2012;5(1):9-19.

10. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in

normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 2006;39(1):44-50.

11. Reuter S, Gupta S, Chaturvedi M, Aggarwal B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: How

are they linked?. Redox Biol. 2010;49(11):1603-16.

12. Di Meo S, Reed T, Venditti P, Victor V. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and

Pathological Conditions. Oxid Med Cell Longev. 2016; doi.: 10.1155/2016/1245049.

13. Valko M, Morris H, Cronin M. Metals, Toxicity and Oxidative Stress. Curr Med Chem.

2005;12(10):1161-208.

14. Repetto M, Semprine J, Boveris A. Lipid Peroxidation: Chemical Mechanism, Biological

Implications and Analytical Determination. Lipid Peroxidation. 2012; doi.org/10.5772/45943.

15. Vasilaki A, McMillan D. Lipid Peroxidation. Encyclopedia of Cancer. 2011;2054-5.

16. Barelli S, Canellini G, Thadikkaran L, Crettaz D, Quadroni M, Rossier J et al. Oxidation of

proteins: Basic principles and perspectives for blood proteomics. Proteomics Clin Appl.

2008;2(2):142-57.

17. Berlett B, Stadtman E. Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress. Journal of

Biological Chemistry. 1997;272(33):20313-16.

24

18. Sung C, Hsu Y, Chen C, Lin Y, Wu C. Oxidative Stress and Nucleic Acid Oxidation in Patients

with Chronic Kidney Disease. Oxid Med Cell Longev. 2013;1-15.

19. Lee J, Son Y, Pratheeshkumar P, Shi X. Oxidative stress and metal carcinogenesis. Redox Biol.

2012;53(4):742-57.

20. Angelova D, Brown D. Iron, Aging, and Neurodegeneration. Metals. 2015;5(4):2070-92.

21. Bresgen N, Eckl P. Oxidative Stress and the Homeodynamics of Iron Metabolism. Biomolecules.

2015;5(4):808-47.

22. Udipi S, Ghugre P, Gokhale C. Iron, Oxidative Stress and Health, Oxidative Stress - Molecular

Mechanisms and Biological Effects, Dr. Volodymyr Lushchak (Ed.), ISBN: 978-953-51-0554-1.

2012. InTech, Prieinama: https://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-molecular-

mechanisms-and-biological-effects

23. Uttara B, Singh A, Zamboni P, Mahajan R. Oxidative Stress and Neurodegenerative Diseases: A

Review of Upstream and Downstream Antioxidant Therapeutic Options. Curr Neuropharmacol.

2009;7(1):65-74.

24. Iron Overload [Internetas]. idi. 2018. Prieinama: http://www.irondisorders.org/iron-overload

25. Medeiros M, Schumacher-Schuh A, Cardoso A, Bochi G, Baldissarelli J, Kegler A et al. Iron and

Oxidative Stress in Parkinson’s Disease: An Observational Study of Injury Biomarkers. PLOS

ONE. 2016; doi.org/10.1371/journal.pone.0146129.

26. Seo AY, Xu J, Servais S, et al. Mitochondrial iron accumulation with age and functional

consequences. Aging cell. 2008;7(5):706-16.

27. Frank W, Haupin W, Vogt H, Bruno M, Thonstad J, Dawless R et al. Aluminum. Ullmann's

Encyclopedia of Industrial Chemistry. 2009; doi.org/10.1002/14356007.a01_459.pub2.

28. Exley C. Human exposure to aluminium. Environ Sci Process Impacts. 2013;15(10):1807-16.

29. Kowalczyk E et al. Effect of long-term aluminium chloride intoxication on selected biochemical

parameters and oxidative-antioxidative balance in experimental animals. Polish Journal of

Environmental Studies. 2004;13(1):41–3.

30. Abubakar M, Taylor A, Ferns G. Aluminium administration is associated with enhanced hepatic

oxidant stress that may be offset by dietary vitamin E in the rat. Int J Exp Pathol. 2003;84(1):49-

54.

31. Yuan C, Lee Y, Hsu G. Aluminum overload increases oxidative stress in four functional brain

areas of neonatal rats. Biomed J. 2012;19(1):19-51.

32. Hensley K, Floyd R. Methods in biological oxidative stress. Totowa, N.J.: Humana Press; 2010.

33. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell

culture: how should you do it and what do the results mean?. Br J Clin Pharmacol.

2004;142(2):231-55.

25

34. Bresgen N, Eckl P. Oxidative Stress and the Homeodynamics of Iron Metabolism. Biomolecules.

2015;5(4):808-47.

35. Kaufmann M. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Molecular Bacteriology. 1998;15:33-50.

36. Levine R, Garland D, Oliver C, Amici A, Climent I, Lenz A et al. Determination of carbonyl

content in oxidatively modified proteins. Oxygen Radicals in Biological Systems Part B: Oxygen

Radicals and Antioxidants. 1990;464-78.

37. Burgess R, Deutscher M. Guide to protein purification. San Diego, Calif: Academic Press/

Elsevier; 2009. Prieinama: http://www.academia.edu/27325090/Guide_to_Protein_Purification-

Methods_in_Enzymology

38. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric

acid test. Anal Biochem. 1978;86:271–8.

39. Inovatyvūs mokymosi metodai ir naujausios technologijos gamtos mokslų bakalaurų rengimui.

EVOLIUCIJA IR POPULIACIJŲ GENETIKA Laboratorinis darbas Populiacinis DNR

polimorfizmas. 2004;2-3.

40. Cheraghi E, Golkar A, Roshanaei K, Alani B. Aluminium-Induced Oxidative Stress, Apoptosis

and Alterations in Testicular Tissue and Sperm Quality in Wistar Rats: Ameliorative Effects of

Curcumin. International Journal of Fertility & Sterility. 2017;11(3):166-75.

41. El-Sayed M, El-Habibi Wafa M, El-Kholy Hana M. Aluminium-induced brain oxidative stress in

male rats and the possible ameliorating role of omega-3. The Egyptian Society of Experimental

Biology. 2011;7(2):329-42.

42. Zhuang T, Han H, Yang Z. Iron, Oxidative Stress and Gestational Diabetes. Nutrients.

2014;6(9):3968-80.

43. Chen X, Deng W, Liu Y, Lv Q. Study of antagonism of citric acid on aluminum-induced toxicity

in mice testis cells. Eur J Pharmacol. 2014;10(4):443-50.

44. Elseweidy M, El-Baky A. Effect of dietery iron overload in rat brain: Oxidative stress,

neurotransmitter level and serum metal ion in relation to neurodegnerative disorders. J Biosci.

2008;46:855-8.

45. Nahdi, A., Hammami, I., Kouidhi, W. et al. Protective effects of crude garlic by reducing iron-

mediated oxidative stress, proliferation and autophagy in rats. J Mol Histol. 2010;41:233-45.

46. Allameha A, Asghar A et al. Iron Overload Induced Apoptotic Cell Death in Isolated Rat

Hepatocytes Mediated by Reactive Oxygen Species. Iranian Journal of Pharmaceutical Research.

2008;7(2):115-21

47. Ajith T. Ameliorating reactive oxygen species-induced in vitro lipid peroxidation in brain, liver,

mitochondria and DNA damage by Zingiber officinale Roscoe. Indian Journal of Clinical

Biochemistry. 2010;25(1):67-73.

26

48. Chtourou Y, Fetoui H, Gdoura R. Protective Effects of Naringenin on Iron-Overload-Induced

Cerebral Cortex Neurotoxicity Correlated with Oxidative Stress. Biol Trace Elem Res.

2014;158(3):376-83.

27

PRIEDAI

1. Priedas Nr. 1

28

2. Tezės pristatytos Lietuvos neuromoskslų asociacijos konferencijoje 2017 m. gegužės

1 d.