AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE BACTERIAS FOSFATO

SOLUBILIZADORAS A PARTIR DE SUELO PARA USO AGRICOLA DE LA PROVINCIA DEL NAPO

INTRODUCCION

En los suelos tropicales los bajos niveles de fosforo no están disponibles para el crecimiento de las plantas lo que condicionan la productividad de los cultivos; especialmente en las regiones a temperaturas altas como El Chaco, por lo que es muy poco soluble..

El problema radica en los sustratos que son fuente de fósforo y que deben pasar a hacer fuente disponible, pasando de fósforo orgánico a inorgánico, por que las plantas solo pueden tomarlos como ión ortofosfato, esto se logra mediante hidrólisis por enzimas fosfatasas, pues el fósforo soluble es un nutriente limitado en un ecosistema natural..

Localización de la zona de estudio

Provincia del Napo

La muestra del suelo se tomo en la provincia del Napo en la zona del Chaco, el sector de estudio abarca 1 hectárea y va a ser destinada para uso agrícola.

MARCO TEORICO

IMPORTANCIA DEL FOSFORO

Luego del Nitrógeno, el Fósforo es un fertilizante esencial para el desarrollo y el crecimiento de las plantas como para microorganismos. El fósforo soluble es un nutriente limitado para producción de biomasa en un ecosistema natural.Dependiendo del tipo de suelo, se puede decir que entre un 50-60% corresponde a la fracción orgánica, mientras que el resto se encuentra en forma inorgánica. 

Las plantas absorben el fósforo en forma inorgánica en estado soluble, pero cuando se introduce al suelo, más del 90% de esta pasa rápidamente a formas solubles no disponibles.

De esta manera, gran parte de los fertilizantes fosfatados que se aplican no son utilizados por las plantas, sino que se almacenan en el suelo. Las plantas deben absorber el elemento del suelo, donde se encuentra en muy baja concentración.

Estos índices bajos del nutriente se deben a que el fósforo soluble reacciona con iones como el calcio, el hierro o aluminio que provocan su precipitación o fijación, disminuyendo su disponibilidad para los vegetales.

IMPORTANCIA DEL pH

La disponibilidad del Fósforo depende del pH del suelo, porque solo puede ser tomado como ion ortofosfato, para esto el pH óptimo es alrededor de 6.5 pues la precipitación de los fosfatos de aluminio y calcio disminuye.

El pH del medio es importante para el crecimiento de los microorganismos, la mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro

OBJETIVOS

Objetivo General

Aislar y seleccionar microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de un suelo para uso agrícola de la provincia del Napo.

Objetivos Específicos

Aislar en medios de cultivo: SMRS y un medio diseñado, microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de suelo para uso agrícola de la provincia del Napo.

Diseñar un medio de cultivo con una solución de fosfato.

Evaluar la actividad fosfatasa mediante la técnica p- nitrofenilfosfato

MARCO METODOLOGICO

Se toma 5 muestras, cada una de 500 g, mediante muestreo aleatorio simple; se depositan en bolsas plásticas selladas. Se almacenan a temperatura ambiente para su transporte y luego se conservan bajo condiciones de refrigeración a 4˚C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Toma de la muestra

Determinación de pH

Se realiza la medición de pH de las muestras de suelo por el método de pasta de saturación según el ICONTEC.

Procesamiento de la muestra

10g suelo90 ml agua de peptona0.5g goma arábiga0.5g CaHPO4.2H2O

10-1 10-2 10-4 10-610-8

4.5mL 4.95mL 4.95mL 4.95mL 4.95mLAgua de peptona

0.5 mL 0.05mL 0.05mL 0.05mL

Siembra por extensiónPor duplicado

SELECCIÓN DE CEPAS POR HALO DE SOLUBILIZACION

Pre enriquecimiento y Aislamiento

150 rpm35 °C72 horas

30˚C ; 2 a 7 días

Caracterización Macro y Microscópica de la colonias La identificación macroscópica de las colonias se realiza teniendo en cuenta características como tamaño, color y textura, se identifica la morfología microscópica realizando tinción Gram y tinción azul algodón de lactofenol.

Se modifico la formulación del medio SMRS reemplazando el fosfato tricálcico por una solución de fosfato, utilizando goma arábiga y CaHPO4.2H2O

Mejoramiento y Diseño del Medio

TABLA I. Medio De SMRS REACTIVO

CANTIDAD (g/l)

Glucosa 10.0Fosfato tricálcico 5.0Cloruro de sodio 0.2Sulfato de amonio 0.5Sulfato de magnesio 0.3Extracto de levadura 0.5Cloruro de potasio 0.2Sulfato de Hierro

0.004

TABLA II. Medio Diseñado

REACTIVO CANTIDAD (g/l)

Glucosa 10.0Solución de fosfatoCloruro de sodio 0.2Sulfato de amonio 0.5Sulfato de magnesio 0.3Extracto de levadura 0.5Cloruro de potasio 0.2Sulfato de Hierro 0.002Sulfato de manganeso 0.004Cloranfenicol 0.1

Medios de Cultivo

Determinación de actividad enzimática. Método p-nitrofenil fosfatoSe basa en el uso del sustrato p-nitro fenil fosfato el que es hidrolizado por fosfatasas para obtener HPO4.

La actividad de la fosfatasa basta con ajustar el pH del medio, el sustrato es incoloro y por acción de la fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a partir del cual se genera p-nitrofenolato que produce color amarillo.  

Medir a 450 nm con un espectrofotómetro, es un indicador del nivel en el que el sustrato es hidrolizado por la fosfatasa. (Técnica)

RESULTADOS

CEPA CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

Cepa 1 (BSP1)

Cocos Gram positivos Colonias lisas, bordes irregulares, blancas

Cepa 2 (BSP2

Cocos Gram positivos Colonias lisas, estrellada, blancas

Cepa 3 Cocos Gram negativos Colonias lisas, redondas, amarillas

BACTERIASCaracterísticas macro y microscópica de las cepas aisladas

De las cuales únicamente se conservaron 2 cepas pues mostraron mayor actividad enzimática.HONGOSCaracterísticas macro y microscópica de las cepas aisladas.CEPA CARACTERISTICAS

MICROSCOPICASCARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

Cepa 1 Mucor Tienen hifas tabiculares y conidioforas cuya cabeza está localizada en el extremo de un hifa, compuesta por una vesícula rodeada por una corona de fiálides en forma de botella directamente insertadas sobre la vesícula.[8] De las fiálides se desprenden las esporas

Blancos, bordes definidos,

Cepa 2 Chysosporium: conidiosporas muchas con hifas hialinas vegetativas y ramificadas irregularmente

Lilas,

Cepa 3

Acremonium: conidias elipsoidales que se acumulan en los extremos de fiálides largas y finas; clamidosporas ovales. Surgen ramas laterales de la hifa.

Blancos,

Cepa 4

Aspergillus conidias oscuras formando un racimo de esporas; los conidióforos aparecen de color pardo amarillento claro y septos tabiques gruesos.

Verdes,

Cepa 5

Cladosporium: hongo filamentoso con conidióforos con cadenas ramificadas de conidios elipsoides de extremos redondeados.

Café verdosa

HORA ABSConcentració

nUP (µmol/min L) ABS Concentración UP (µmol/min L) ABS Concentración UP (µmol/min L)

aspergillus umol/ml aspergillus mucor umol/ml mucor mucor umol/ml Mucor

0 0.041 0.053 0.879 0.030 0.040 0.674 0.010 0.018 0.302

0.5 0.077 0.093 1.550 0.050 0.063 1.047 0.050 0.063 1.047

1 0.098 0.116 1.941 0.087 0.104 1.736 0.068 0.083 1.379

1.5 0.111 0.131 2.183 0.099 0.118 1.960 0.098 0.116 1.932

2 0.120 0.141 2.351 0.100 0.119 1.978 0.113 0.133 2.221

4 0.147 0.171 2.854 0.103 0.122 2.034 0.128 0.150 2.500

6 0.160 0.186 3.096 0.140 0.163 2.724 0.150 0.175 2.910

8 0.245 0.281 4.680 0.225 0.258 4.307 0.240 0.275 4.587

10 0.357 0.406 6.766 0.100 0.119 1.978 0.290 0.331 5.518

PreservaciónHONGOS Se conservaron aquellas cepas que presentaron mayor actividad enzimáticaAspergillusMucorCladosporiumEn crioviales en agua esteril a temperatura de refrigeración BACTERIASSe conservaron: En crioviales en BHI con el 20% de glicerol 

CONSLUSIONESA partir del suelo de la región del Chaco provincia del Napo fue posible aislar 3 cepas de hongos y 2 cepas bacterianas.El medio diseñado puede ser alternativa para el aislamiento y desarrollo de bacterias fosfato solubilizadoras.Se determino la actividad de los Hongos, el Aspergillus tiene 6.766 UP (µmol/min L), en tanto los otros dos géneros Mucor y Cladosporium presentaron una actividad menor. 1.978 UP (µmol/min L) y 5.518 UP (µmol/min L).

En tanto en las bacterias la mayor actividad enzimática se consiguió con la bacteria SP1 con un valor de 4.475 UP (µmol/min L), en tanto la bacteria SP2 tiene un valor de 1.978 UP (µmol/min L); siendo la más eficiente la bacteria SP1Al comparar los resultados de actividad enzimática se determino que los hongos aislados tienen mejor actividad frente a las bacterias, pues los valores obtenidos son más altos.RECOMENDACIOESRealizar identificación bioquímica de hongos y bacterias aislada

FIGURA I. Cepas Aisladas de Hongos Solubilizadores de Fosfato.

En un análisis previo de fósforo en el suelo se obtuvo 159.23 mg/kg de fósforo total; 4.08 mg/kg de fósforo soluble, por lo tanto 155.15 mg/kg corresponde al fósforo insoluble lo que representa a una alta cantidad de fósforo que no puede ser aprovechado por las plantas para crecer..

  1.Pesar aprox. 500 g de suelo.

2.Colocar en un recipiente apropiado y añada agua destilada en pequeñas cantidades, mezclar bien después de cada adición hasta lograr su saturación (sin quedar agua libre en la superficie del suelo).

3.Proceda a tomar la lectura del pH en el potenciómetro, introduciendo con cuidado el electrodo.

En la pasta del suelo Saturado

Método p-nitrofenil fosfatoCurva patrón de p – nitro fenol 

Preparar una solución de p – nitro fenil de 1 umol/ml en buffer fosfato pH 7.0 a partir de esta y utilizando la ecuación C1V1 = C2V2 Medir a 450 nm en un espectrofotómetro, colocando 3 ml del blanco y 3 ml de cada concentración, realizar lecturas por triplicado. Realizar regresión lineal donde r > 0.9.Concentraciones para la curva de calibración 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 µmol/ml