SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgANDICE 1. REA DE APLICAO 2. SIGNIFICADO DIAGNSTICO 3. SERION ELISA classic PRINCPIO DE TESTE 4. CONTEDO E COMPOSIO DO KIT DE TESTE 5. MATERIAIS COMPLEMENTARES NECESSRIOS 6. ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES 7. EXECUO DO SERION ELISA classic 7.1 Instrues gerais 7.2 Preparao e armazenamento das amostras 7.3 Preparao dos reagentes 7.4 Resumo do teste 7.5 Execuo do teste 8. AVALIAO DO TESTE 8.1 Quantificao a um ponto de acordo com o mtodo 4PL 8.2 Critrios de validade do teste 8.3 Avaliao SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgA (quantitativo) 8.4 Interpretao dos resultados 9. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO 9.1 Preciso 9.2 Sensibilidade e especificidade 10. MEDIDAS DE SEGURANA 10.1 Advertncias e medidas de precauo 10.2 Eliminao de resduos 11. LITERATURA verso actual N. V 11. 04/12-1 (verso anterior V 10. 04/03-1)

portugus

1

SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgA Teste imunolgico enzimtico para a determinao de anticorpos humanos (IgG/IgA) - S para o diagnstico in vitro Adenovrus Kit IgG (quantitativo) Adenovrus Kit IgA (quantitativo) Artigo N: Artigo N: ESR128G ESR128A

Testes avaliados: Dade Behring BEP III / BEP 2000, DSX, mo 1. REA DE APLICAO Os SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgA so testes quantitativos e qualitativos para a determinao de anticorpos humanos no soro ou no plasma contra todos os serotipos patognicos humanos de adenovrus. As provas de IgG/IgA permitem assim a utilizao de diagnstico diferencial, ou a comprovao de uma doena respiratria aguda. 2. SIGNIFICADO DO DIAGNSTICO Na dcada de 50 do sculo passado, os adenovrus eram descritos como agentes que persistiam de forma latente nas amgdalas e no tecido adenide, assim como agentes patognicos de infeces agudas das vias respiratrias. Os adenovrus causam doenas em inmeros sistemas orgnicos (aparelho respiratrio, tracto gastrointestinal, olhos e tracto urogenital).

1. Porta de entrada 2. Doena: Conjuntivite, Faringite, Gastroenterite; 3. Porta de sada Fig. 1: Patognese de doenas por adenovrus portugus 2

(Fonte: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch067.htm)

Na tabela seguinte apresentam-se as doenas mais importantes, bem como os seus sintomas.Sistema de rgos Sintoma Isolado mais frequente 1, 2, 3, 5, 7 3, 4, 7, 21 5 3, 7 8, 19, 37 40, 41 1, 2, 3, 5 2, 19, 37

Vias respiratrias superiores Vias respiratrias inferiores Sndroma 'Pertussis' Olho

Faringite Bronquite (Pneumonia) Tosse por surtos, febre, vmitos Febre faringoconjuntival, Queratoconjuntivite Gastrenterite, Linfadenite mesentrica Cervicite, uretrite

Via gastrintestinal (frequente nos lactentes) Tracto urogenital

Os adenovrus pertencem famlia dos adenoviridae e so vrus cuja informao gentica est presente como cadeia dupla de DNA. Os seus capsdeos no se encontram envoltos por uma capa lipdica, participando assim directamente na interaco com as clulas hospedeiras. Os adenovrus de maior importncia patogentica no homem dividem-se em, pelo menos, 47 subtipos diferentes; os subtipos 1 a 8, bem como os 40 e 41 so os mais frequentemente isolados no ser humano. Devido grande variedade de doenas clnicas e sintomas causados por estes vrus, os processos de comprovao de antignios, e particularmente de anticorpos, adquirem um significado considervel no diagnstico diferencial. As infeces por adenovrus podem ser verificadas por meio da criao de agentes patognicos ou da prova directa, assim como atravs da resposta imunolgica humoral. No diagnstico de rotina, as tcnicas serolgicas, principalmente a reaco de fixao do complemento (RFC) e os testes enzimticos imunolgicos (mtodo ELISA), esto muito divulgadas. Em regra so utilizadas preparaes de vrus, que transportam eptopos especficos do gnero. Do ponto de vista clnico, deixou de ser necessria a comprovao dos subtipos nas infeces respiratrias. Na populao normal constata-se um alto nvel de seropositividade, causado por infeces ocorridas cedo na infncia, bem como por infeces repetidas, e por subtipos diferentes. No caso duma infeco aguda por adenovrus, comprovam-se, nos mtodos serolgicos clssicos, aumentos significativos de ttulos nos pares de soros colhidos a intervalos de oito a dez dias. Devido ao desenvolvimento de procedimentos padro como o teste ELISA, particularmente quantificveis, a avaliao de soros individuais adquire maior importncia. portugus 3

3. SERION ELISA classic PRINCPIO DO TESTE Na tcnica ELISA indirecta as tiras de microtitulao so revestidas com o respectivo antignio. Os anticorpos especficos existentes na amostra do doente ligam-se a estes antignios imobilizados numa fase slida. Para tornar visvel a reaco serolgica, so introduzidos anticorpos de confirmao marcados com fosfatase alcalina, especficos para as imunoglobulinas humanas da amostra do doente, ligadas ao antignio no caso positivo. Mediante a adio de substrato (paranitrofenilfosfato), obtm-se uma reaco de enzima-substrato, originando um produto final de colorao amarela. A intensidade da colorao amarela medida por fotometria, e proporcional ao teor de anticorpos especficos.

portugus

4

4. CONTEDO E COMPOSIO DO KIT DE TESTE Componentes do teste e composioTiras de microtitulao, separveis, com 8 poos individuais revestidas por antignio, cada (total de 96), 1 moldura de microplaca O material de revestimento est inactivado Soro padro (pronto a utilizar) Soro humano em tampo de fosfato com protena, negativo para Ac-anti-VIH, Ag anti-HBs (vrus-hepatite B antignio de superfcie) e Ac anti-HCV; agente de conservao: < 0,1% azida de sdio corante: amaranto O Soro de controlo negativo (pronto a utilizar) Soro humano em tampo de fosfato com protena, negativo para Ac anti-VIH, Ag anti-HBs (vrus hepatite B antignio de superfcie) e Ac anti-HCV; agente de conservao: < 0,1% azida de sdio corante: verde Lissamina V Conjugado anti-humano IgG, IgA, IgM (pronto a utilizar) Anticorpo de cabra, policlonal, dirigido contra IgG, IgA, IgM humanas, conjugado com fosfatase alcalina, estabilizado em soluo estabilizadora de protena Agente de conservao: metilisotiazolona a 0,01% bromonitrodioxano a 0,01% Concentrado de soluo de lavagem (suficiente para 1000 ml) Soluo de cloreto de sdio com Tween 20, 30 mM Tris Agente de conservao: azida de sdio a < 0,1% Tampo de diluio Tampo de fosfato com protena e Tween 20; agente de conservao: azida de sdio a < 0,1% Sal de sdio azul bromofenol 0,01 g/l Soluo de paragem 1,2 N lixvia de soda Substrato (pronto a utilizar) Para-nitrofenilfosfato, tampo isento de solventes Agente de conservao: < 0,1% azida de sdio (Uma colorao fraca amarela do substrato fechado possvel. Isso no representa uma reduo da qualidade!) Certificado de controlo de qualidade com curva padro e tabela de valores (Quantificao dos anticorpos em UI/ml ou U/ml)

unidades / volume12

2 x 2 ml

2 ml

13 ml

33,3 ml

2 x 50 ml

15 ml

13 ml

1

portugus

5

5. MATERIAIS COMPLEMENTARES NECESSRIOS Equipamento de laboratrio corrente -

Para a confirmao de IgM: SERION Rf-Absorbens (Artigo N Z200/20 ml) Fotmetro espectral para placas de microtitulao com filtro, comprimento da onda 405 nm, comprimento da onda de referncia recomendada na gama de 620 nm a 690 nm (por ex. 650 nm) Incubadora 37C Cmara hmida gua destilada

-

6. ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTESReagente Tiras de microtitulao (Antignio) Armazenamento Aps a abertura a 2 a 8C na presena de agente dissecante, e fechado Deve-se precaver para que os poos no utilizadas sejam armazenadas secas e estanques a ar na sacola de fecho de presso de folha composta de alumnio. Aps a abertura com 2 a 8 C Durabilidade 4 semanas

Soros de controlo / soros padro

Conjugado

Solues prontas para a utilizao a 2 a 8C Evitar contaminaes (pontas de pipeta esterilizadas!)

Tampo de diluio

Aps a abertura a 2 a 8C Rejeitar as solues turvas. No aberto

at ao limite de validade; 24 meses a partir da data de fabricao at ao limite de validade 28 meses a partir da data de fabricao 24 meses at ao limite de validade 36 meses a partir da data de fabricao at ao limite de validade 2 semanas 1 semana

Soluo de lavagem

Concentrado, aps abertura a 2 a 8 C Diluio de utilizao com 2 a 8 C Diluio de utilizao temperatura ambiente Limpar regularmente os recipientes para a diluio de utilizao! Rejeitar as solues turvas! Solues prontas para a utilizao a 2 a 8C, armazenamento protegido da luz! Evitar a contaminao! Rejeitar em caso de colorao amarela mais forte (extino contra gua destilada > 0,25). Aps a abertura, temperatura ambiente

Substrato

At ao limite de validade 24 meses a partir da data de fabricao At ao limite de validade

Soluo de paragem

portugus

6

7. EXECUO DO SERION ELISA classic 7.1 Instrues gerais Utilizar exclusivamente os reagentes SERION ELISA classic, uma vez que esto optimizados no sistema, e no os substituir por reagentes de outros fabricantes. Os soros padro e os soros controlo esto ajustados em lotes especficos para o kit de teste e no podem ser utilizados noutros lotes. O tampo de diluio, a soluo de lavagem e a soluo substrato podero ser utilizados em todos os testes SERION ELISA classic, independentemente dos lotes e dos kits. Para cada classe de imunoglobulina existem trs concentraes diferentes de conjugado: BAIXA, MDIA, ALTA A classificao consta de cada etiqueta, conforme descrito a seguir: p.ex.: IgG + conjugado IgG de baixa concentrao IgG ++ conjugado IgG de mdia concentrao IgG +++ conjugadoIgG de alta concentrao

Em raros casos faz-se necessrio o emprego do conjugado especial, a fim de assegurar a compatibilidade da qualidade dos nossos produtos. Os conjugados especiais so produzidos em lotes separados e no apresentam o sinal +. Por esse motivo, os conjugados especiais no podem ser substitudos por outros conjugados. Favor observar com ateno os avisos registados nas etiquetas! Em estado fechado, todos os componentes do teste ELISA classic podero ser utilizados at o seu limite de validade (vide as indicaes da etiqueta), desde que sejam armazenados correctamente. Os reagentes no devero ser utilizados para alm do limite da validade. Consultar igualmente o ponto 6 ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES. A diluio incorrecta dos reagentes poder causar uma perda da sensibilidade. Os reagentes de teste devero ser protegidos contra a luz clara durante o armazenamento e a incubao. Aps a utilizao devem ser bem fechados, a fim de evitar que sequem ou sejam contaminados. A sacola de fecho de presso para os poos da placa de microttulos somente pode ser cortada nos lugares previstos e marcados com entalhes. Em caso de danificao da sacola de folha de alumnio ou de fechamento incompleto da sacola para a guarda dos poos no utilizveis, estas no devem ser mais usadas para a operao de teste. Todos os reagentes de teste devero estar temperatura ambiente antes do incio do teste. Para evitar a contaminao, empregar sempre tcnicas asspticas para extrair as alquotas de reagentes. Para evitar falsos resultados positivos, a ponta da pipeta nunca dever tocar, nem molhar, o bordo superior dos poos durante a pipetagem do conjugado. Ao fechar os frascos, dever ser tomada ateno para que seja de novo usada a tampa do respectivo frasco. portugus 7

A reprodutibilidade dos resultados depende, de entre outros factores, da mistura cuidadosa dos reagentes preparados. Antes de retirar os soros de controlo e o conjugado, os recipientes devero ser bem agitados. Antes da pipetagem devem-se misturar bem, com um monomisturador (por ex. Vortex), as diluies de amostras. Observar uma pipetagem cuidadosa e a observao dos tempos e temperaturas de incubao prescritos. Grandes diferenas de tempo entre a pipetagem do primeiro e do ltimo poo na adio de amostras/soros de controlo, conjugado e substrato levam a tempos de incubao prvia diferentes, o que poder influenciar consideravelmente a preciso e a reprodutibilidade dos valores medidos. S o cumprimento rigoroso das disposies de trabalho SERION ELISA classic garante resultados correctos. O teste s poder ser avaliado se os valores de validade especficos do lote do certificado de controlo de qualidade contido no kit forem observados. Uma lavagem correcta evita testes inespecficos: As instrues de utilizao dos aparelhos de lavagem utilizados devero ser observadas. Nos testes SERION ELISA classic, so utilizados poos de fundo plano. O enchimento uniforme dos poos com soluo de lavagem importante, bem como a sua remoo total aps a lavagem (so possveis efeitos de diluio incontrolveis). Evitar a formao de espuma! No arranhar o revestimento dos poos! 7.2 Preparao e armazenamento das amostras Amostras lipmicas, hemolticas ou ictricas (soro ou plasma) s devero ser utilizadas sob reserva, embora no tenha sido verificada qualquer influncia negativa nos nossos exames. No devero ser aproveitadas amostras contaminadas por bactrias. So adequadas as amostras de soro ou de plasma (EDTA, citrato, heparina) colectadas de acordo com os mtodos laboratoriais padronizados. As amostras no devero ser inactivadas termicamente. 7.2.1 Diluio das amostras Antes do incio do teste, diluir as amostras ( V1 ) em tampo de diluio ( V2 ): IgA V1 + V2 = 1+500 em em 10 l 1000 l 50 l 200 l de amostra do doente de tampo de diluio (= 1+100) da primeira diluio de amostra do doente (= 1+4)

em

portugus

8

IgG V1 + V2 = 1+2000 em em 10 l de amostra do doente 1000 l de tampo de diluio (= 1+100) 50 l da primeira diluio 1000 l de amostra do doente (= 1+20)

em

Aps cada diluio, e antes de cada etapa de pipetagem, devem as amostras ser bem misturadas com um monomisturador (por ex. Vortex) a fim de se obter uma soluo homognea. Interferncia do factor reumatide Os anticorpos de factor reumatide so predominantemente anticorpos da classe IgM, que se fixam de preferncia aos imunocomplexos IgG. Devido a estes factores reumatides, a prova especfica de anticorpos IgM pode produzir falsos resultados positivos. Alm disso, existe a possibilidade de os anticorpos IgM, de ligao mais fraca, especficos do micrbio patognico serem suplantados pelos anticorpos IgG, de ligao mais forte. Um despiste IgM pode assim originar um falso resultado negativo. Por esta razo, necessrio submeter as amostras para a determinao de IgM a um tratamento preliminar com absorvente de factor reumatide (absorvente SERION de factor reumatide, artigo n Z200 (20 ml/100 determinaes)). 7.2.2 Armazenamento das amostras As amostras dos doentes no devero ser armazenadas durante mais de 7 dias a 2 a 8 C. possvel armazenar as amostras durante mais tempo a -20C. Evitar um descongelamento e recongelamento repetido. As amostras diludas podero ser guardadas entre 2 a 8 C durante uma semana.

portugus

9

7.3

Preparao dos reagentes

7.3.1 Tiras de microtitulao As tiras de microtitulao ou os poos so embaladas juntamente com um agente dissecante. Retirar os poos no mais utilizadas do batente de fixao e colocar novamente na sacola de fecho de presso que ser fechado estanque a ar, pressionando-se no lugar previsto para isso. 7.3.2 Soros de controlo / Soros padro Os soros de controlo e os soros padro esto prontos a utilizar e no devero ser mais diludos. Podem ser utilizados directamente no teste. Por cada teste devero ser, independentemente do nmero das tiras de microtitulao utilizadas, includos soros de controlo em determinaes simples, cutt-off, ou soros padro em determinao dupla. No tratar os soros de controlo com absorvente de factor reumatide! 7.3.3 Conjugado anti-IgG-, IgM- ou IgA-AP-humano (pronto a utilizar) No misturar os conjugados de lotes diferentes. Eles foram optimizados para cada lote. Os conjugados podem ser trocados conforme descrito no tpico 7.1. Evitar a contaminao de conjugados prontos para a utilizao (favor derramar quantidade suficiente para teste num recipiente secundrio a fim de evitar pipetagens repetidas do frasco original).

7.3.4 Soluo de lavagem Diluir o concentrado de soluo de lavagem (V1) 1:30 com gua destilada a um volume final (V2). Exemplo: Concentrado de soluo de lavagem (V1) 33,3 ml 1,0 ml Volume final (V2) 1000 ml 30 ml

7.3.5 Tampo de diluio para amostras (pronto a utilizar) 7.3.6 Substrato (pronto a utilizar) Para evitar a contaminao devero ser usadas luvas. Para retirar a soluo substrato, utilizar somente pipetas esterilizadas! 7.3.7 Soluo de paragem (pronta a utilizar)

portugus

10

7.4 Resumo do teste Adenovrus IgG/IgA quantitativo Diluio das amostras (Amostras dos doentes) IgG: 1+2000 IgA: 1+500 Adio das amostras diludas e dos soros de controlo / padro prontos a ser utilizados (100 l)

INCUBAO 60 min./ 37C cmara hmida

LAVAGEM Adio da soluo de conjugado (100 l)

INCUBAO 30 min./ 37C cmara hmida

LAVAGEM Adio da soluo de substrato (100 l)

INCUBAO 30 min./ 37C cmara hmida

Adio da soluo de paragem (100 l)

MEDIO DA ABSORO a 405 nm

portugus

11

7.5 Realizao do teste 1. Colocar o nmero necessrio de poos na moldura de microplaca e preparar a folha de protocolo. Pipetar 100 l das amostras diludas, ou dos controlos prontos para a utilizao, cada, nos poos das tiras de microtitulao necessitadas. Deixar um poo livre para o valor vazio do substrato, por ex.: IgG /IgA quantitativo poos de antignioPoo A1 Poo B1 Poo C1 Poo D1 Poo E1 Valor vazio do substrato Controlo negativo Soro padro Soro padro Doente 1....

2.

3. 4.

Incubao das amostras durante 60 minutos (+/- 5 min.) a 37C (+/- 1C) em cmara hmida. No final do tempo de incubao, lavar os poos (com aparelho de lavagem ou mo): - Aspirar ou esvaziar o lquido de incubao dos poos - Encher 300 l de soluo de lavagem em cada poo - Aspirar ou esvaziar a soluo de lavagem - Repetir o processo 3 x (isto , lavar 4 x, no total) - Esvaziar a placa, batendo-a sobre panos de papel Adio de conjugado Pipetar 100 l do conjugado IgG/IgM/IgA pronto a utilizar nas respectivos poos (sem valor vazio do substrato). Incubao do conjugado durante 30 minutos (+/- 1 min.) * a 37C (+/- 1C) em cmara hmida. Lavar os poos no final do tempo de incubao (como acima). Adio de substrato Pipetar 100 l de soluo de substrato pronta a utilizar em cada um dos poos (tambm valor vazio do substrato). Incubao de substrato durante 30 minutos (+/- 1 min.) * a 37C (+/- 1C) em cmara hmida.

5.

6. 7. 8.

9.

10. Paragem da reaco Pipetar 100 l de soluo de paragem em todas os poos, agitar levemente a placa de microtitulao para misturar. 11. Medio de extino Dentro de 60 min. a 405 nm contra o valor vazio do substrato, comprimento da onda de referncia entre gamas 620 nm e 690 nm (por ex. 650 nm).

Leve em considerao que, sob condies de trabalho especiais, poder ser necessrio ajustar os tempos de incubao internos do laboratrio.

*

portugus

12

8. AVALIAO DO TESTE SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgA (quantitativo) 8.1 Quantificao de um ponto de acordo com o mtodo-4PL As funes no lineares que ajustam as curvas sigmoidais directamente sem outras transformaes escala OD fornecem a maior exactido possvel na atribuio de sinais de medio a valores quantitativos. A determinao da concentrao dos anticorpos no SERION ELISA classic realiza-se de acordo com o Modelo-4-Parameter logistic-log (4PL), cuja funo matemtica descrita pela frmula seguinte:

D-A OD = A + 1 + e B(C em conc.)

Os parmetros A, B, C e D representam exactamente o decurso da curva e definem 1. a assimptota inferior Parmetro A 2. a subida da curva Parmetro B 3. o ponto de inflexo da curva Parmetro C 4. a assimptota superior Parmetro D A Institut Virion\Serion GmbH (Wrzburg) averigua as curvas padro para cada lote de kit em vrios testes, sob observao de condies ptimas. Os elevados custos e tempo dispendidos na construo da curva padro so assim poupados ao utilizador. Para avaliar os testes, em cada embalagem de teste entregue ao utilizador uma curva padro especfica para o lote, como grfico, e uma tabela de valores. Um software de avaliao correspondente posto disposio, quando desejado. Para compensar variaes de testes, e para poder verificar a qualidade do teste realizado, adiciona-se o assim denominado soro padro. No controlo final de qualidade, so atribudos a este soro de controlo um valor terico e uma rea de validade, cujos limites possibilitam uma avaliao segura e fivel dos resultados do teste. O soro padro no tem a funo de um soro de controlo positivo e pode tambm ser avaliado como marginal ou negativo em testes ELISA individuais.

portugus

13

8.2 Critrios de validade do teste-

O valor vazio do substrato dever ter um valor OD < 0,25. O controlo negativo dever ser considerado negativo na avaliao do teste. Nas provas quantitativas SERION ELISA classic, o valor mdio OD do soro padro dever encontrar-se dentro da rea de validade indicada no certificado de controlo de qualidade especfico para o lote, aps a deduo do valor vazio do substrato. Nas provas qualitativas SERION ELISA classic, o valor mdio OD do controlo positivo dever encontrar-se dentro da rea de validade indicada no certificado de controlo de qualidade especfico para o lote, aps a deduo do valor vazio do substrato. A variao dos valores OD no dever ser maior que 20%.

-

-

Se estes critrios no forem satisfeitos, o teste ser invlido e dever ser repetido. 8.3 Avaliao SERION ELISA classic Adenovrus IgG/IgA (quantitativo) 8.3.1 Avaliao no automatizada Para a avaliao do teste, esto presentes a curva padro e a tabela de valores, com as quais a actividade de anticorpo correspondente poder ser atribuda a cada valor OD existente na preparao do teste. Na tabela de avaliao est indicado o valor terico do soro padro, assim como a sua gama de validade. O valor vazio do substrato (em branco) dever ser descontado de todos os resultados de medio antes das avaliaes. Mtodo 1: Avaliao qualitativa Para a determinao da rea cut-off em OD, multiplica-se o valor mdio do OD padro pelo valor numrico indicado no certificado de qualidade (vide as frmulas para os sistemas de avaliao especiais), por ex.: OD = 0,502 x valor mdio (PADRO) no limite superior de cut-off OD = 0,352 x valor mdio (PADRO) no limite inferior de cut-off Se, por exemplo, for medido um valor mdio de extino do controlo padro de 0,64, obtm-se uma rea cut-off de 0,225-0,321.

Mtodo 2: Determinao progressiva das actividades de anticorpos, por meio de curva padro. As variaes de testes que ocorrem diariamente nos diferentes laboratrios (assim chamada variao Interensaio) so compensadas atravs da multiplicao do valor de medio actual das amostras dos doentes pelo factor de correco F:

Valor OD terico (do soro padro) F= Valor OD dirio (do soro padro) portugus 14

Este procedimento necessrio para adaptar ou normalizar o nvel de medio actual curva padro especfica do lote. Primeiro as variaes dirias devero ser corrigidas por meio do clculo de um factor: 1. 2. Calcular um valor mdio dos 2 valores de extino do padro e verificar se o valor se encontra na gama de validade indicada. Clculo do factor "F": O valor terico do padro, que indicado, dever ser dividido pelo valor mdio da extino: F = Valor terico extino padro / Valor mdio extino padro. 3. 4. Todos os valores de medio das amostras dos doentes so multiplicados por "F". Atravs dos valores de medio corrigidos, podem ser lidas as actividades de anticorpos em UI/ml ou U/ml, com base na curva padro.

Avaliao do SERION ELISA classic Adenovrus IgG para crianas: Resultado positivo do teste: Resultado marginal do teste: Resultado negativo do teste: > 10 8 - 10 13 10-13 < 10 U/ml U/ml U/ml

Avaliao do SERION ELISA classic Adenovrus IgA para crianas: Resultado positivo do teste: Resultado marginal do teste: Resultado negativo do teste: > 10 8-10 < 8 U/ml U/ml U/ml

Avaliao do SERION ELISA classic Adenovrus IgA para adultos: Resultado positivo do teste: Resultado marginal do teste: Resultado negativo do teste: > 14 11-14 < 11 U/ml U/ml U/ml

Em caso de um resultado limite, o teste dever ser repetido paralelamente com uma amostra nova colhida com um intervalo de 1 a 2 semanas (par de soro). 8.3.2 Avaliao automtica do teste com o software SERION easy base 4PL / SERION evaluate Pela entrada dos 4 parmetros e do valor terico do soro padro, as actividades dos anticorpos so calculadas pelo programa de avaliao, aps a medio da placa de teste. Se um valor se encontrar fora da zona de validade, as seguintes mensagens de erro podero ser indicadas pelo software SERION easy base 4PL: Os padres esto fora da rea de tolerncia; e/ou: Os padres divergem por mais de 20%. A mensagem de erro do software SERION evaluate s indicada em lngua inglesa: Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more than 20% in following groups: Group 1-24. Nestes casos, o teste invlido, devendo ser repetido. Os parmetros e o valor terico s devero ser mudados em caso de troca do lote (os parmetros e o valor terico esto indicados na tabela de valores). A entrada correcta destes dados especficos do lote poder ser verificada, por meio das UI/ml ou U/ml atribudos ao soro padro. O valor mdio das unidades resultante dever corresponder ao valor de unidade indicado no certificado especfico do lote. Uma correco do valor de medio efectuada automaticamente. Na impresso dos valores de medio aparecer:

portugus

16

Designao da amostra Valor OD UI/ml ou U/ml Avaliao

8.4 Interpretao dos resultados No ponto 8.3.1 esto indicados os valores limite para a determinao da concentrao de anticorpos anti-adenovrus IgG e IgA em crianas e adultos. Se as concentraes ultrapassarem os valores limite, deve-se admitir a existncia duma infeco aguda. Se as concentraes se encontrarem dentro dos valores limite, no se pode excluir a possibilidade de haver uma infeco. S pode haver uma certeza, quando num exame de uma preparao paralela for analisado o teor de anticorpos de duas amostras de soro, obrigatoriamente colhidas com um intervalo de vrias semanas. Valores de medio abaixo do valor limite excluem uma infeco aguda. Para a avaliao dos valores limtrofes, foram analisadas 250 amostras de soros de doadores de sangue no seleccionados e 38 (IgG), respectivamente 34 (IgA) amostras de soros de crianas. No caso do adenovrus IgG SERION ELISA classic, 94% (87%) dos resultados das amostras de soro dos adultos (crianas) foram negativos, 1,2% (5,3%) foram limtrofes e 3,9% (7,9%) foram positivos. No teste IgA, os respectivos resultados foram 94% (85%), 2,3% (5,9%) e 3,8% (8,8%). 9. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO 9.1 Preciso A preciso intraserial foi averiguada com soros de reactividade diferente em preparao mltipla (n = 20) dentro de uma placa revestida com antignio. Para a determinao da preciso interserial, foram testadas amostras de soro com reactividades diferentes, em 10 preparaes realizadas independentemente. Coeficiente de variao (VK) = Diferena padro x 100 Valor mdio

SERION ELISA classic Adenovrus IgA: Extino mdia (OD) Amostra marginal positiva fortem. pos. 0,338 0,456 0,676 Intraensaio (VK%) 7,8 5,2 7,1

portugus

17

9.2 Sensibilidade e especificidade Para determinar a sensibilidade e a especificidade do adenovrus ELISA Igl foram analisados 170 soros individuais de pessoas em idades compreendidas entre 1 e 78 anos, assim como 156 pares de soros de pessoas com idades compreendidas entre 1 e 80 anos com o adenovrus ELISA IgG em comparao com a reaco de ligao do complemento. A correlao das 482 amostras de soros em ambos os sistemas de teste foi boa. 97,3 % dos soros apresentaram resultados equivalentes. SERION ELISA classic Adenovrus Teste IgG Sensibilidade Especificidade 96,7 % 97,8 %

A RLC no detecta anticporpos IgA. Todavia, foram calculadas a sensibilidade e a especificidade em comparao com a RLC, presumindo que a produo de anticorpos IgA aps uma infeco e a produo de anticorpos ligadores de complemento ocorram simultaneamente. Ambos os sistemas de teste apresentam boa correlao: das 90 amostras de soro, 80 tiveram os mesmos resultados. Com excepo das amostras de soro limtrofes, o clculo da sensibilidade foi de 80% e o da especificidade de 90,1%. A sensibilidade um pouco mais baixa do ELISA, em comparao com a RLC, deve-se principalmente s amostras de soro, que foram avaliadas pela RLC como sendo fracamente positivas (o ttulo esteve um passo acima do ttulo limtrofe). Esses ttulos fracos podem resultar de situaes ps-infeces. No teste Adenovrus SERION ELISA classic, tais amostras geralmente so avaliadas como sendo negativas. Num outro estudo foi comparado o adenovrus SERION ELISA classic IgG com outro adenovrus disponvel no mercado, o adenovrus ELISA IgG (ELISA A). Neste estudo foram comparados 88 soros com o conhecido resultado da RLC (Reaco de Ligao do Complemento) . Estes resultados encontram-se resumidos na tabela que se segue. Resultados Adenovrus SERION ELISA classic positivo no valor negativo limite 40 16 12 0 0 1 0 0 19

Resultados ELISA A

positivo no valor limite negativo

12 amostras de soro com resultados ELISA A positivo, deram resultados negativos com o Adenovrus IgG ELISA classic. Com RLC, 11 dessas amostras de soro foram negativas ou limtrofes. A 12 amostra foi fracamente positiva. Portanto, ELISA A pode incluir uma seropositividade da populao saudvel. portugus 18

portugus

19

10. MEDIDAS DE SEGURANA 10.1 Advertncias e medidas de precauo O SERION ELISA classic destina-se a ser utilizado unicamente por pessoal especializado, que domine por completo as tcnicas de trabalho. manipulao dos reagentes de teste e das amostras dos doentes aplicam-se as regras de laboratrio reconhecidas:-

A embalagem de teste contm soros humanos. Embora todos os soros de controlo sejam negativos para HBs-Ag, Ac-anti-HCV e Ac anti-VIH, eles devero ser considerados potencialmente infecciosos. No pipetar com a boca. Nas reas onde se trabalha com reagentes de teste ou com amostras de doentes, no dever ser permitido comer, beber ou fumar. Na manipulao de reagentes de teste e de amostras de doentes, deve-se utilizar bata de laboratrio, luvas descartveis e culos de proteco, a fim de evitar o contacto directo. A seguir, lavar muito bem as mos. As amostras dos doentes e todos os materiais potencialmente infecciosos devero ser descontaminados aps a realizao do teste. Guardar os reagentes fora do alcance de crianas. Soluo de paragem: custica (C); R34: causa cauterizaes, utilizar culos de proteco, luvas e bata de laboratrio

-

-

-

-

10.2 Eliminao de resduos Observe por favor as respectivas disposies legais vigentes!

portugus

20

11. LITERATURA 1. Hierholzer, J. C. und Tannock, G. A. Adenoviruses. in Rose, N. R., Friedman, H. und Fahey, J. L. (Eds.) Manual of Clinical Laboratory Immunology. American Society for Microbiology, 3rd ed. (1986) 527-531. Koc, J., Wigand, R. und Weil, M. The efficiency of various laboratory methods for the diagnosis of adenovirus conjunctivitis. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg (1987) 263: 607-615. Sullivan, C. J. und Jordan, M. C. Diagnosis of viral pneumonia. Semin Respir Infect (1988) 3: 148-161. Thiele, M., Okano, M. und Purtilo, D. T. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) for detecting antibodies in sera of patients with adenovirus infection. J Virol Methods (1989) 23: 321-332.

2.

3.

4.

portugus

21