บทที่ 3 -...

27

บทท 3 อปกรณและวธการ

3.1 อปกรณการทดลอง

3.1.1 สารเคม สารเคม Lot number บรษท

Ammonium sulphate, (NH4)2SO4 101217 Merk Citric acid C2270 Sigma Dihydrogen phosphate, KH2PO4 4873 Merk Dimethyl sulfoxide, DMSO 802912 GIBCO Disodium phosphate monohydrate, Na2HPO4.12H2O 30414 Riedel-de Haen 17β-Estradiol 21K1267 Sigma Ethanal 65434 Scharlau Gelatin K4988770 Merk Glycine 2022722 Fisher Hydrochloric acid 1789 Scharlau O-phynylene-diamine-HCl, OPD 80972 Zymed lab Polyethylene sorbitan monolaurate, Tween 80 H0306 Sigma Potassium chloride, KCl 31248 Riedel-de Haen Progesterone 61K0286 Sigma Sodium chloride, NaCl K29287204 Merk Sodium hydrogen carbonate, NaHCO3 612 Merk Sodium hydroxide K19742898 Merk Sulfuric acid, H2SO4 - J.T.Baker

28

3.1.2. อปกรณและเครองมอ

อปกรณและเครองมอ โมเดล บรษท ประเทศ Immunowash 1575 BIO-RAD ฝรงเศส Micropipet (20, 100, 200, 1000 μl) Pipetman Gilson ฝรงเศส

Microplate 96 wells Nunc-immuno® Nalge Nunc เดนมารกInternational

Microplate reader 2010 Anthos ออสเตรย pH meter 678 EP/K สวสเซอรแลนด Refrigerated centrifuge 6930 Kubota ญปน Spectrophotometer UV-visible DU Beckman อเมรกา Vortex mixer K-500 GE Labinco อเมรกา

Hi Trap® Protein G HP 17-0404-01 GE-Healthcar สวเดน Hotplate Stirrer LMS-1003 Lab Tech เกาหล เขมเยบผา 10 Milwards ไทย กรรไกรตดผา 04 Barbarian Head ไทย ดายเยบผา - - ไทย ผา organza - ทรงชย ไทย

3.1.3. สตวทดลอง แพะลกผสม ซาเนน × แองโกลนเบยน (Cross-breed Saanen × Anglo Nubian Goats) เพศเมย อาย 8-24 เดอน จานวน 13 ตว จากภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม 3.2. แผนการดาเนนงาน ในการศกษาครงนไดทาการพฒนาอปกรณเหนยวนาการเปนสดในแพะ โดยแบงการทดลองออกเปน 2 การทดลองคอ การทดลองท 1 ในหองปฏบตการ (In vitro) และการทดลองท 2 ในสตวทดลอง (In vivo)

29

3.3. การวเคราะหฮอรโมนโปรเจสเทอโรน (Progesterone, P4)

3.3.1. การทาใหแอนตบอดบรสทธ (purification) นาโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ P4 (โคลน 4B2) ทผลตโดย นางสาว มลลกา

กาภศร ทตกตะกอนไดจากนาเลยงเซลลเกบไวในตแช -20 องศาเซลเซยส มาทาใหบรสทธดวย

column Hi Trap®Protein G (ภาพท 3-1) ใช syringe เตมสารละลาย binding buffer ลงในคอลมน ปรมาตร 10 มลลลตร ดนของเหลวผานคอลมนดวยอตราหยด 1 มลลลตรตอ 5 นาท แลวนาสารผสมระหวาง แอนตบอด 10 มลลลตร และสารละลาย binding buffer 10 มลลลตร เตมผานลงในคอลมนจนหมด แลวลางคอลมนดวยสารละลาย binding buffer อกครงหนง และเตมสารละลาย elution buffer 10 มลลลตร เกบสารละลายทไดใน vial ทเตมสาร neutralization buffer 70 ไมโครลตร เกบสารละลายนประมาณ 20 vials vials ละประมาณ 500 ไมโครลตร เตม 20 เปอรเซนต ethanol 10 มลลลตร เพอลางคอลมนแลวเกบคอลมนไวท -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะนามาใชใหม นาสารละลายเกบไววดคาดดกลนแสงท 492 นาโนเมตร ดวยวธ ELISA แลวรวมสารละลายทมคาดดกลนแสงท < 3 นาโนเมตร เขาดวยกน จากนนวดคาดดกลนแสงท 280 นาโนเมตร ดวยเครอง spectrophotometer เพอคานวณความเขมขนของโปรตนจากสตร

ความเขมขนของโปรตนในสารละลาย = คาดดกลนแสงทความยาวคลน 280 nm. mg/ml 1.4

ภาพท 3-1. แสดงวธการใชคอลมน Hi Trap® Protein G ในขนตอนการทาใหแอนตบอดบรสทธ.

30

3.3.2. การหาอตราเจอจางท เหมาะสมของโมโนโคลนอลแอนตบอดตอฮอร โมน โปรเจสเทอโรน (MAbP4) และ ฮอรโมนโปรเจสเทอโรนตดเอนไซม horseradish peroxidase (P4-HRP) โดยวธเอนไซมลงคอมมโนซอรเบนทแอสเซ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

เคลอบเพลทดวย MAbP4 เจอจาง 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350 และ 1:400 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 คน (ประมาณ 16 ชวโมง) ลางเพลทดวยสารละลายสาหรบการลางโดยใชเครองลาง Immunowash โปรแกรม TSE3 เตม เจลาตนทละลายในสารละลายสาหรบการเคลอบทมความเขมขน 3 เปอรเซนต ปรมาตร 200 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง ลางเพลท เตม P4-HRP เจอจาง 1:450,000, 1:475,000, 1:500,000 ปรมาตร 10 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 1.30 ชวโมง ลางเพลท เตมสารละลายททาใหเกดส 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองในทมด เปนเวลา 20 นาท ทาการหยดปฏกรยาดวย 4N H2SO4 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม นาไปอานคาการดดกลนแสงท 492 นาโนเมตร ดวยเครอง Microplate reader (ภาพท 3-2)

3.3.3. การหากราฟมาตรฐาน

เคลอบเพลทดวย MAbP4 เจอจาง 1:250 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 คน (ประมาณ 16 ชวโมง) ลางเพลทดวยสารละลายสาหรบการลางโดยใชเครองลาง Immunowash โปรแกรม TSE3 เตมเจลาตนทละลายในสารละลายสาหรบการเคลอบทมความเขมขน 3 เปอรเซนต ปรมาตร 200 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง ลางเพลท เตมสารละลายมาตรฐาน P4 0, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 และ1,000 พโคกรมตอ 50 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองเปนเวลา 1.30 ชวโมง เตม P4-HRP เจอจาง 1:475,000 ปรมาตร 10 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 1.30 ชวโมง ลางเพลท เตมสารละลายททาใหเกดส 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองในทมดเปนเวลา 20 นาท ทาการหยดปฏกรยาดวย 4N H2SO4 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม นาไปอานคาการดดกลนแสงท 492 นาโนเมตรดวยเครอง Microplate reader (ภาพท 3-3)

3.3.4. การวเคราะหปรมาณฮอรโมนโปรเจสเทอโรนในพลาสมาโดยวธ competitive ELISA

เคลอบเพลทดวย MAbP4 เจอจาง 1:250 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 คน (ประมาณ 16 ชวโมง) ลางเพลทดวยสารละลายสาหรบการลางโดยใชเครองลาง Immunowash โปรแกรม TSE3 เตมเจลาตนทละลายในสารละลายสาหรบการเคลอบทมความเขมขน 3 เปอรเซนต ปรมาตร 200 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง

31

เคลอบเพลทดวย MAbP4 100 μl/well ท 4 °C นานขามคน

ลางเพลทดวย washing buffer โปรแกรม TSE3

เตม 3 เปอรเซนต gelatin 200 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1 ชวโมง


เตม P4-HRP 10 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1.30 ชวโมง


เตม substrate บมไวทอณหภมหองในทมด รอปฏกรยาเกดส 20 นาท

เตม 4N H2SO4 10 μl/well เพอหยดปฏกรยา

วดคาการดดกลนแสงท 492 นาโนเมตร ดวยเครอง Microplate reader

ภาพท 3-2. แสดงการหาอตราเจอจางทเหมาะสมของ MAbP4 และ P4- HRP ดวยวธ ELISA.

32

เคลอบเพลทดวย MAbP4 100 μl/well ท 4 °C นานขามคน


เตม 3 % gelatin 200 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1 ชวโมง


เตมตวอยางพลาสมาหรอ P4 มาตรฐาน 50 μl/well บมไวทอณหภมหอง

นาน 1.30 ชวโมง

เตม P4-HRP 10 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1.30 ชวโมง



เตม 4N H2SO4 เพอหยดปฏกรยา


ภาพท 3-3. แสดงการหากราฟมาตรฐานและการวดปรมาณฮอรโมนโปรเจสเทอโรนในพลาสมาโดยวธ competitive ELISA.

33

3.4. การวเคราะหฮอรโมนเอสโทรเจน (Estrogen, E2) 3.4.1. การวเคราะหหาปรมาณฮอรโมนเอสโทรเจนในพลาสมาโดยวธ competitive ELISA

นาโมโนโคลนอลแอนตบอดตอเอสโทรเจน (MAbE2 ) (โคลน 4B9 1E4) ทผลตโดย นางสาว รชนวรรณ เขจรวงศ ซงทราบอตราเจอจางทเหมาะสมของ MAbE2 และ E2-HRP แลว คออตราเจอจางของ MAbE2 คอ 1:64 และ E2-HRP คอ 1:800 โดยเคลอบเพลทดวย MAbE2 เจอจาง 1:64 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 คน (ประมาณ 16 ชวโมง) ลางเพลทดวยสารละลายสาหรบการลางโดยใชเครองลาง Immunowash โปรแกรม TSE3 เตมเจลาตนทละลายในสารละลายสาหรบการเคลอบทมความเขมขน 2 เปอรเซนต ปรมาตร 200 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 1 ชวโมง ลางเพลท เตมตวอยางพลาสมาหรอ E2 มาตรฐาน ปรมาตร 20 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหองเปนเวลา 1.30 ชวโมง เตม E2-HRP เจอจาง 1:800 ปรมาตร 10 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 1.30 ชวโมง ลางเพลท เตมสารละลายททาใหเกดส 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภมหอง ในทมด เปนเวลา 20 นาท ทาการหยดปฏกรยาดวย 4N H2SO4 ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม นาไปอานคาการดดกลนแสงท 492 นาโนเมตร ดวยเครอง Microplate reader (ภาพท 3-4)

34

เคลอบเพลทดวย MAbE2 100 μl/well ท 4 °C นานขามคน


เตม 2 % gelatin 200 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1 ชวโมง


เตมตวอยางพลาสมาหรอ E2 มาตรฐาน 20 μl/well บมไวทอณหภมหอง

นาน 1.30 ชวโมง

เตม E2-HRP 10 μl/well บมไวทอณหภมหองนาน 1.30 ชวโมง



เตม 4N H2SO4 เพอหยดปฏกรยา


ภาพท 3-4. แสดงการวดปรมาณฮอรโมนเอสโทรเจนในพลาสมาโดยวธ competitive ELISA.

35

3.5. การทดลองท 1 ในหองปฏบตการ (In vitro) 3.51. การออกแบบและการประดษฐอปกรณเหนยวนาการเปนสด

กรรมวธผลตอปกรณสอดชองคลอดเพอควบคมการเปนสดพรอมกนในแพะ มลกษณะพเศษทการขนรปอปกรณดวยผาซบใน (organza) (ภาพท 3-5) และใชชานออยเปนวสดดดซบ P4 ใชเอนตกปลาเปนสวนหางและสวนปกทาจากซลโคนเพอใหปกมความแขงแรงขนและไมทาใหอปกรณหลดออกมากอนเวลาสนสดการทดลอง การศกษาครงนไดออกแบบอปกรณเปน 3 แบบ คอแบบท 1 เปนรปทรงกระบอกทบรรจชานออยไวภายใน แบบท 2 เปนรปตววายโดยสวนของปกและลาตวบรรจดวยชานออย และแบบท 3 เปนรปตววายโดยสวนปกทาจากซลโคนและสวนลาตวบรรจดวยชานออย (ภาพท 3-6)

ภาพท 3-5. อปกรณในการประดษฐอปกรณเหนยวนาการเปนสดแบบสอดชองคลอดในแพะ.

ลาตวความยาว 6 cm

ปกคว

ามยาว 6

cm ลาตวความยาว 6 cm

ปกคว

ามยาว 6

cm

ลาตวความยาว 6 cm

A B C ภาพท 3-6. อปกรณเหนยวนาการเปนสดแบบท 1 เปนทรงกระบอกบรรจชานออยไวภายใน (A) แบบท 2 เปนรปตววายโดยสวนของปกและลาตวบรรจดวยชานออย (B ) และแบบท 3 เปน รปตววายโดยสวนปกทาจากซลโคนและสวนลาตวบรรจดวยชานออย (C).

36

ในขนตอนการออกแบบและการขนรปอปกรณเหนยวนาการเปนสดโดยการออกแบบอปกรณใหมลกษณะเหมอนตววาย (Y) สวนปกมความยาว 6 เซนตเมตร โดยวดความยาวจากปกซายมาหาปกขวา (ตารางท 3-1 และภาพท 3-7) และลาตวมความยาว 6 เซนตเมตร (วดความยาวจากปกดานบนมาถงลาตวดานลาง) วาดแบบตววายลงบนกระดาษแขงแลวรางแบบทไดลงบนเนอผาซบใน (organza) ซงเปนผาทมผ สมผสลนและเจาะสวนปลายของตววายโดยวดใหมความยาวจาก

รางไวในการ

องเยบรรจชา น

เซนตเมตร าประก

วจากสวนทายขนมา 1 เซนตเมตรเพอไวสาหรบประกอบสวนหางและเยบตามแบบทเยบตามแบบนจะเยบเฉพาะสวนของลาตวและปกดานลางทงซายและขวาแตสวนดานบนของปกไมต เพอความสะดวกในการประกอบปกดวยซลโคน สวนทายสดของลาตวกไมตองเยบเพอทจะบ นออยเขาไปดานในของลาตว หลงจากเยบเสรจแลวใหกลบรอยเยบเขาดานใ สาหรบการออกแบบปกโดยการปนซลโคนใหมความหนา 1 เซนตเมตร และยาว 6 เซนตเมตรแบงสวนโคนไวประมาณ 0.5 เซนตเมตร แลวแบงกลางของแทงซลโคนตามยาวใหแยกออกจากกนและจดใหเปนรปตววาย แลวนาสวนปกทไดไปนงทอณหภม 121 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง และนาไปอบทอณหภม 100 องศาเซลเซยส อก 24 ชวโมง การอบอกครงจะทาใหไดแทงซลโคนทมความแขงแรงมากขน เมอไดสวนปกแลวจงนามาเยบประกอบเขากบสวนของลาตวและนาชานออยมาบรรจใสดานในของสวนลาตวโดยอดชานออยใหแนนจนเตมใชชานออยปรมาณ 0.7 กรม ชานออยทนามาใชในการทดลองนไดผานการลอนดวยตระแกรงเบอร 16 ทาใหไดชานออยทมขนาดใกลเคยงกน (ภาพท 3-8) เมอบรรจชานออยเตมแลวใหเยบปดแลวนาเอนตกปลาทมความยาว 17ม อบเขากบสวนทายของลาตวโดยการสอดเสนเอนเขาไปบรเวณทเจาะรไวและเยบเสนเอนใหตดอยกบตวอปกรณ แลวนาตวอปกรณทเสรจสมบรณแลวไปนงเพอฆาเชอโรคทอณหภม 121 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท แลวนามาอบใหแหงทอณหภม 70 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง ขนตอนการประดษฐอปกรณเหนยวนาการเปนสดแสดงในภาพท 3-9

37

ตารางท 3-1. แสดงลกษณะทางกายภาพของอปกรณเหนยวนาการเปนสดทประดษฐขนเอง

ณลกษณะ ปรมาตร าหนกชานออย (กรม) 0.7 าหนกฮอรโมนโปรเจสเทอโรน (มลลกรม) 300 าหนกซลโคน (กรม) 2.4 วามยาวปก (เซนตเมตร) 6 วามยาวลาตว (เซนตเมตร) 6 วามยาวหาง (เซนตเมตร) 17

คนนนคคคนาหนกรวมทงหมดของอปกรณ (กรม)(เฉลย + SE (n)) 3.59 + 0.03 (n=20)

ภาพท 3-7. อปกรณสอดชองคล ารเปนสดทประดษฐขนเอง.

สวนลาตว 6 cm

อดเพอเหนยวนาก

สวนปก 6 cm

สวนหาง 17 cm

38

ภาพท 3-8. การลอนชานออยผานตะแกรงเบอร 16.

1. วาดแบบลงบนผา 2. เยบตามแบบทวาด เวนบรเวณปกดานบนและ

องเยบ

ดานลางลาตวยงไมต

ภาพท 3-9. ขนตอนในการประดษฐอปกรณเหนยวนาการเปนสดแบ ลอดในแพะ.

1 2 และเจาะรไวใสหาง

3. เยบเกบชายผาใหเรยบรอย นเพอ

เตรยมประกอบสวนซลโคน

รอย แลวมาเยบประกอบเขาดาน บนและบรรจชานออยทาง

4. และบรรจชานออย

กลบรอยเยบเขาดานใ

3 4

5. นาซลโคนทปนเรยบ

ดานลาง 6. ตกปลาไดอปกรณทสมบรณประกอบสวนหางดวยเอน 5 6

บสอดชองค

39

3.5.2. คณลกษณะของชานออย ง

ทอแคปลลา มลกษณะเปนรปหกเหลยม (ภาพท 3-10) ซงประกอบดวยทอแคปลลารทมเสนผาศ านวนมากเรยงขนานกนตามความยาวของลาตนออย ทอแคปลลารประกอ

เมอนาชานออยมาสองดวยกลองจลทรรรศนอเลกตรอนพบภาพตดตามขวางขอร

นยกลางทอ 0.3-0.5 ไมครอน จบขนจากสารประเภทเซลลโลส ลกนน และเฮมเซลลโลสเปนสวนใหญ นอกนน

เปนสวนประกอบอนๆ ในปรมาณเลกนอย (โดยทสวนประกอบเฮมเซลลโลสมอย 30-35 % นาหนกของสวนประกอบทงหมด) ลกษณะผนงทอแคปลลารมความยดหยน ทาใหมความสามารถในการดดซบของเหลวเขาไปอยภายในไดเปนอยางด และสามารถปลอยออกเมอมแรงกด บบหรออด เปนตน จากคณสมบตดงกลาวจงไดนาชานออยทมทอแคปลารนมาใชเปนวสดดดซบฮอรโมนโปรเจสเตอโรนในการประดษฐอปกรณเหนยวนาการเปนสดในครงน

ภาพท 3-10. ภาพตดตามขวางของทอแคปลลารทสองดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอน.

40

3.5.3. การบรรจฮอรโมนโปรเจสเทอโรนในอปกรณเหนยวนาการเปนสด ชง P4 300 มลลกรม ละลายในเอธานอล 5 มลลลตรและใชกระบอกฉดยาอนซลนนาด 1 มลลลตร ดงสารละลาย P4 และแทงเขมลงบนตวอปกรณตรงบรเวณทายของลาตว (ภาพท

3-11) คอ กทางดานทายไปาทางด

ขย ๆ ปลอยสารละลาย P4 ลงในชานออยโดยสารละลาย P4 จะคอย ๆ ซมจา

ห านปกของอปกรณ การบรรจ P4 หนงครงใชสารละลาย P4 ประมาณ 1.5 มลลลตร ชานออยภายในจะอมตวพอด หลงจากชานออยอมตวแลวใหนาไปอบท 70 องศาเซลเซยสนาน 30 นาท แลวนาอปกรณมาซบสารละลาย P4 จนครบปรมาณ 5 มลลลตร เมอซบสารละลาย P4 ครบ 5 มลลลตรแลวอบอปกรณท 70 องศาเซลเซยส 24 ชวโมงและเกบไวท -20 องศาเซลเซยสจนกวาจะนาอปกรณมาใชงาน

ภาพท 3-11. วธการบรรจสารละลายฮอรโมนโปรเจสเทอโรนลงในอปกรณเหนยวนาการเปนสด.

41

3.5.4. การวดปรมาณการปลอยฮอรโมนโปรเจสเทอโรนในหองปฏบตการ นาอปกรณทบรรจ P4 แลวมาแชในสารละลายนาเกลอ 0.912 % NaCl 1000 มลลลตร วบคมอณหภมท 37 องศาเซลเซยส และปนสารละลายใหเขากนกอนเกบตวอยางดวยเครอง Stirrer

1 มลลลตร บงเวล

คทความเรว 100 rpm เปนเวลา 30 นาท (ภาพท 3-12) เกบสารละลาย P4 วนละ 5 ครงๆละแ าในการเกบสารละลาย P4 เปนชวโมงท 1, 3, 6, 9 และชงโมงท 24 ของการแชอปกรณของทกวนเปนเวลา 10 วน ปรบปรมาตรสารละลาย P4 ตามการปสสาวะจรงของแพะ โดยแพะนาหนกตว 20 กโลกรมปสสาวะวนละ 384 มลลลตร/วน การปรบปรมาตรทาโดยดดสารละลายออกแลวแทนทสารละลายดวยนาเกลอ ชวโมงท 1 เปลยนสารละลาย P4 เทากบ 16 มลลลตร ชวโมงท 3 เปลยนสารละลาย P4 เทากบ 32 มลลลตร ชวโมงท 6 เปลยนสารละลาย P4 เทากบ 48 มลลลตร ชวโมงท 9 เปลยนสารละลาย P4 เทากบ 48 มลลลตร และชวโมงท 24 เปลยนสารละลาย P4 เทากบ 240 มลลลตร

ภาพท 3-12. การแชอปกรณเหนยวนาการเปนสดทประดษฐเอง (ซาย) และอปกรณเหนยวนาการ

เปนสดทางการคา (CIDR-G®) (ขวา) ในสารละลายนาเกลอเพอวดปรมาณการปลอฮอรโมนโปรเจสเทอโรนในหองปฏบตการ.

ย

42

3.6. นเบยน จานวน 13 ตว แบงการทดลองอกเปน ม ประกอบดวย

เหนยวนาการเปนสด (2 ตว)

กรณเหนยวนาการเปนสดทางการคา (CIDR-G ®) (5 ตว)

สมใหอยในกลมท 1 จานวน 2 ตว กลมท 2 จานวน 5 ตว และกลมท 3 านวน 6 โมนเอสโทรเจนดวยวธ -Test โ

ตองทาความสะอาดระบอกสงอปกรณทกครงหลงจากทสอดใหแพะในแตละตวโดยแชในนายาฆาเชอ ทาความะอาดป ดอปกรณทกครง นาตวอปกรณสอดเขาไปในกระบอกสง (ภาพท 3-3) ทาเ

บไวอณหภ

3.6. การทดลองท 2 ในสตวทดลอง (In vivo) 1.แผนการทดลอง ใชแพะพนธลกผสม ซาแนน-แองโกล

อ 3 กล กลมท 1. กลมควบคมไมสอดอปกรณ

กลมท 2. กลมทสอดอป กลมท 3. กลมทสอดอปกรณเหนยวนาการเปนสดทประดษฐขนเอง (6 ตว) โดยแพะทง 13 ตวนถกจ ตว และวเคราะหความแตกตางของฮอรโมนโปรเจสเทอโรนและฮอรT ดยใชโปรแกรมสาเรจรปทางสถต SPSS for Windows version 12 3.6.2.วธการทดลอง 1. ทาการสอดอปกรณเหนยวนาการเปนสดเขาไปในชองคลอดของแพะทดลองในกลมท 2 และกลมท 3 เปนเวลานาน 10 วน ขนตอนในการสอดอปกรณกส ากชองคลอดกอนสอ1 จลหลอลนทกระบอกสงและปากชองคลอด ตอจากนนกสอดกระบอกสงเขาไปในชองคลอดและคอย ๆ ดนตวอปกรณเขาไปในชองคลอดแลวดงกระบอกสงอปกรณออกมาจากชองคลอด สงเกตการคงอยของอปกรณไดจากสายทหอยออกมาทางปากชองคลอดและนอกจากนนสายทหอยมานยงเปนทสาหรบดงอปกรณออกจากชองคลอดเวลาทสนสดการทดลองดวย 2. เกบตวอยางเลอดของแพะทกตว โดยทาการเกบเลอดจากตาแหนงเสนเลอดดาทคอ (ภาพท 3-14) จานวน 2 มลลลตร ใสหลอดทดลองทเตมสารปองกนเลอดแขงตว EDTA 0.5 โมล 200 ไมโครลตร นาเลอดทไดมาปนแยกพลาสมา (plasma) ดวยเครองปนแยกทความเรว 1,500 g นาน 20 นาท แยกเอาพลาสมาทอยสวนบนใสหลอดทดลองพลาสตกขนาด 1.5 มลลลตรและเกท ม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะวเคราะหระดบ P4 และ E2 ในครงแรกเกบเลอดกอนทาการสอดอปกรณควบคมการเปนสด และเกบเลอดทกๆวนตลอดททาการสอดอปกรณเหนยวนาการเปนสดและสงเกตอาการเปนสดรวม 15 วน โดยทาการเกบเลอดในชวงเวลาเดยวกน

3. วดปรมาณ P4 และ E2 ในพลาสมาดวยเทคนค ELISA 4. การตรวจการเปนสดและการผสมพนธ หลงจากการเหนยวนาการเปนสดของแพะทงหมด และจะทาการเฝาสงเกตการเปนสดของแพะชวง 5 วนหลงจากถอดอปกรณ โดยทา

43

การตรวจ . และ 15:00-17:00 น. ทาการเปนสดวนละ 2 ครง ๆ ละ 2 ชวโมง คอชวงเวลา 07:00-09:00 นการผสมพนธเมอพบวาแพะแสดงการเปนสด สามารถสรปวธการทดลองไดตาม ภาพท 3-15

1. นา Intravaginal Deviceใสลงในกระบอกสง 2. สอดกระบอกสงเขาไปในชองคลอดของแพะ ละดน Intravaginal Device ออกจากกระบอกส แ ง

สวนหางของ Intravaginal Device 3. หลงจากดงกระบอกสงออก Intravaginal Device คงอยในชองคลอดสงเกตจากสวนหางของ Intravaginal

Device

ภาพท 3-13. ขนตอนในการสอด Intravaginal Device เขาชองคลอดแพะทดลอง.

44

ภาพท 3-14. การเกบตวอยางเลอดจากเสนเลอดดาทคอ (Jugular vein) ของแพะ.

สอด Intravaginal device

D0

10 วน 5 วน

ถอด Intravaginal device ผสมพนธ

Heat detection D15

D10

ภาพท 3-15. ขนตอนการทดลองการจดการผสมพนธแพะภายหลงจากการเหนยวนาการเปนสด ดวยอปกรณเหนยวนาการเปนสด.

ภาพสรปขนตอนการเหนยวนาการเปนสด โดยทาการสอดอปกรณเหนยวนาเปนสดเขาชองคลอดของแพะทดลองเปนเวลา 10 วน เกบเลอดครงแรกกอนทาการสอดอปกรณเหนยวนาการเปนสด โดยวนแรกทสอดคอวนท 0 (D0) และทาการเกบเลอดตลอดระยะเวลาทมการสอดอปกรณเหนยวนาการเปนสดไวในชองคลอด และถอดอปกรณเหนยวนาเปนสดในวนท 10 (D10) หลงจากถอดอปกรณเหนยวนาการเปนสดออกไปแลว 24 ชวโมง เฝาสงเกตการเปนสดในชวง 5 วน โดยทาการตรวจการเปนสดวนละ 2 ครงๆละ 2 ชวโมง และผสมพนธ เมอพบวาแพะแสดงอาการเปนสด

บทที่ 3 -...

Documents