A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában

NTPDázok: ektonukleotidázok, melyek az extracelluláris nukleotidok gamma és béta foszfátját különböző sebességgel hidrolizálják

aktivitásuk befolyásolja a P2 receptorok általi jelátvitelt

jelentős szerepük a vaszkulatúrában

Az NTPDázok nemcsak terminálják (P2Y2) vagy aktiválják a P2 (P2Y1, P2Y3, P2Y12 és P2Y6) a különböző P2 receptorokat és aktiválják az adenozin receptorokat is

NTPDase1 (CD39, 78 kd) megakadályozza az ADP- kiváltotta

vérlemezke összecsapzódástJellemző: endothel, endocardium és simaizom/szívizom sejtekben

posztranszlációs módosulás után a kaveolákban dúsul fel Fő ektonukleotidáz a vaszkuláris és trofoblaszt szövetekben.

glikoszfingolipidek + hosszú, egyenes zsírsavláncú lipidek

normál lipidek

kaveolin

GPI kapcsolt enzimek és receptorok

palmitilált SCR kinázok

kaveolához kötődő, jelátvitelben szereplő transzmembrán receptorok

Kaveola

Van-e kolokalizáció a P2Y1 és/vagy P2Y2 receptorokkal egy olyan szövetben, ahol az NTPDáz1 bizonyítottan az elsődleges ektonukleotidáz?

P2Y1 P2Y2 Humán placenta

CD39-cytotrophoblast

CD39- syncytiotrophoblast

CD39- P2Y1

Szövet: humán placenta, endothelsejt

P2Y1- EC

Tokuyasu eljárás (1980)– ultrakriosztátos metszeteken végzett immunreakcióElőnyei: gyors (fixálástól EM vizsgálatig 1 nap elég lehet)

a szöveteket elég PA-del fixálni intracelluláris antigének könnyebb

kimutatásatöbbszörös immunarany jelölés

lehetőségeHátrány: ultrakriosztát kell (feltét az ultramikrotómhoz)

folyékony nitrogén kell (sok) kés (lehet üveg vagy gyémánt, de metszeni

tudni kell)szöveti kép „más” (az új módszer

jelentősen javítja a minőséget)

kis blokkméret

Általános eljárás:Perfúziós vagy immerziós fixálás majd a fixáló kimosása~ 2 mm3 térfogatú szöveti blokk kivágásaCseppben (3X) végzett krioprotekció (2.1 M szaccharóz /PBS / 0.2 M glicin) 15-30 percMetszés : -120 ° C-on (gyémántkés) vagy -90 ° C (üvegkés) metszetek felvétele: 1:1 2.3 M szaccharóz -2 % metilcellulóz cseppel ráhelyezni szenezett, formvarhártyás rácsraAz immunreakció cseppeken történik, a metszeteket sosem szabad kiszáradni hagyni. Az eljárás megeygezik a szokványos immunnal (blokkolás, inkubálások, mosások - idő mindössze kb 2 óra) utófixálás: 1% GAKontrasztozás: 9 rész 2% metilcellulóz : 1 rész 3 % uranilacetát 5 °C

Toshihiro Takizawa, Clark L. Anderson, and John M. RobinsonA New Method to Enhance Contrast of Ultrathin Cryosections for Immunoelectron MicroscopyThe Journal of Histochemistry & CytochemistryVolume 51(1): 31–39, 2003http://www.jhc.org

Humán placenta

A módosítás előnye: nagyobb kontraszt, szebb szöveti kép (itt pozítív festés, a klassszikus eljárásnál negatív festés van)

Eljárás2 óra 4 % PA - kakodilát puffer, mosás, beágyazás 10% zselatinba (kakodilát pufferben) ezt vágják pici blokkokra és itatják át szaccharózzal (kakodilát puffer) . Metszés.A metszeteket 0.75% zselatin–2.0 M szaccharóz vagy (1% metilcellulóz –1.15 M szaccharóz cseppekkel viszik és 0.25% polilizines üveg fedőlemezekre vagy formvarhártyás, szenezett EM rácsokra. Amennyiben az oldatban 0.05% Na-azid is van, 4°C-on tárolható az immunfestésig

Utófixálás: 1–2% ozmium tetroxide 0.1 M kakodilát pufferben,

pH 7.4, 15 perc, RT , mosás

Beágyazás : a polivinil alkohol (PVA)-technika módosított változata :

0.8% UA–1.6% PVA , 15 perc, gyors PVA mosás

Kontrasztfestés: 0.0015% ólomcitrát - 2% PVA 15 perc RT

A felesleg leitatása, szárítás...

Másik lehetőség : utófixálás 2% ozmium tetroxide – 1.6% K-ferrocianid / 0.1 M kakodilát puffer, pH 7.4, 15 prec

utófixálás : 2% ozmium tetroxid – 1.6% K-ferrocianiddalHumán placenta (JHC, 51(1): 31–39, 2003)