a pathogÉn autoantitestek szerepe És kimutatÁsa...
TRANSCRIPT
A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA
SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN
PH.D. ÉRTEKEZÉS
SALLAI KRISZTINA KATALIN
TÉMAVEZETŐ: PROF. GERGELY PÉTER
SZIGORLATI BIZOTTSÁG TAGJAI: PROF. FEKETE BÉLA
DR. PRECHL JÓZSEF
DR. BARTHA KATALIN
HIVATALOS BÍRÁLÓK: DR. KISS EMESE
DR. KOLEV KRASZIMIR
2006
BUDAPEST
SEMMELWEIS EGYETEM, DOKTORI ISKOLA
MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
2
ÖSSZEFOGLALÓ
A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az
egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest
termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek
kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok
megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok
még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és
értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az
SLE rutin diagnosztikájában.
Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek
jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus
nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum
antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az
SLE-s populációban és ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok
bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az
ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5)
annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek
és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek,
elsősorban az SLE kezelésében.
Eredményeim szerint, bár az SLE-s betegek szérumában szignifikánsan csökkent a
DNáz enzim aktivitása, ez nem áll összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a
betegség során kialakuló vesekárosodással, viszont negatív korrelációt mutat a betegek
antinukleoszóma antitest szintjével. A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer
gyakoribbnak találtam a trombózis incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva.
Kimutattam, hogy SLE-ben – az öröklött tényezők mérsékelt befolyása mellett -
elsősorban a betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid
antitestek okozzák a kiemelkedő tromboembóliás rizikót. Az Fc receptorokra
vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint peptidkonjugátumokkal
kiválthatók monocita effektor funkciók, azonban konjugálatlan, szabad formában a
peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-okhoz való kötődését, sem a
sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló hatással voltak a TNFα termelésre.
3
SUMMARY
Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder characterized by a systemic
inflammatory state and the presence of a wide range of pathogenic autoantibodies. My
research focused on the detection and characterization of these autoantibodies, since
many details about their development and their pathogenic effects are still unclear. My
work also included the evaluation of laboratory tests which might help the diagnosis,
disease activity or prediction about the outcome of the SLE.
The aims of my work were: 1) to measure serum DNase activity in the SLE population
with the aim of evaluating the significance of DNase activity in the development of
SLE, especially in lupus nephritis; 2) to study the association between the DNase
activity and the production of antinucleosome antibodies; 3) to examine the presence of
antiphospholipid antibodies in SLE, and their role in the development of
thromboembolic episodes; 4) to examine the role of other, SLE independent
thromboembolic risk factors, and evaluate the clinical value of thrombophilia screen in
SLE; 5) to analyze the inhibitory effect of synthetic peptides from the Fc region of the
antibodies on the Fcγ receptor mediated effector functions of human monocytes, and
evaluate the possible use of these in the treatment of SLE.
My results confirm that patients with SLE have reduced serum DNase activity, but the
enzyme activity doesn’t show association with disease activity or organ involvements
such as lupus glomerulonephritis, but it negatively correlates with serum
antinucleosome antibody concentration. According my results, the incidence of
thromboembolism is about 10-fold higher in SLE that that of the normal population, and
the antiphospholipid antibodies play the primary role in the development of thromboses
in SLE. Other, inherited risk factors seem to be of lesser importance. The IgG Fc
peptides, although in conjugates they could trigger macrophage effector functions via
the FcRs, were unable to inhibit the binding of immuncomplex-bound antibodies to the
receptors, nor could inhibit the IL-6 cytokine production induced by the antibodies.
4
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6
BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 8
AZ SLE KLINIKAI HÁTTERE 8 AZ SLE KIALAKULÁSÁNAK MOLEKULÁRIS HÁTTERE 11 AZ ANTI-DNS ÉS ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK JELENŐSÉGE 11 DNÁZ SZEREPE AZ ANTITESTEK KIALAKULÁSÁBAN 12 GENETIKAI HAJLAMOSÍTÓ TÉNYEZŐK 13 MBL ÉS POLIMORFIZMUSAI 14 FC RECEPTOROK 15 FOKOZOTT TROMBÓZISKÉSZSÉG SLE-BEN 16 AZ ALVADÁSI RENDSZER ÁTTEKINTÉSE 16 FŐBB TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK 18 Antitrombin deficiencia 19 A protein C – protein S rendszer defektusai 19 APC rezisztencia és a Leiden-mutáció 20 A protrombin G20210A mutáció 20 Emelkedett VIII-as faktor szint 21 Emelkedett homocisztein szint 22 SZERZETT TROMBOFÍLIÁS TÉNYEZŐK, AVAGY A TROMBÓZIS KIALAKULÁSÁT SEGÍTŐ ÁLLAPOTOK 23 A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában 23 Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában 23
CÉLKITŰZÉSEK 26
MÓDSZEREK 27
A VIZSGÁLT BETEGCSOPORT 27 A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE A VIZSGÁLATOKHOZ 27 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ÉS ANTI-DNS ANTITESTEK SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 27 DNÁZ AKTIVITÁS MÉRÉS 28 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK SZINTJÉNEK MÉRÉSE ELISA MÓDSZERREL 28 A FOSZFOLIPID-SPECIFIKUS LA MÉRÉSE KOAGULÁCIÓS MÓDSZERREL 29 A TERMÉSZETES ANTICOAGULÁNS FEHÉRJÉK SZINTJEINEK MÉRÉSE 29 AZ APCR MEGHATÁROZÁSA 30 A LEIDEN MUTÁCIÓ ÉS A PROTROMBIN MUTÁCIÓ DETEKTÁLÁSA 30 AZ V-ÖS FAKTOR VIZSGÁLATA DNS SZEKVENÁLÁSSAL 31 A VIII-AS FAKTOR SZINTJÉNEK MÉRÉSE 31 A VON WILLEBRAND FAKTOR SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 32 HOMOCISZTEIN SZINT MÉRÉS 32 A SZINTETIKUS PEPTIDEK ÉS PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉSRE GYAKOROLT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA 32 FCR-OK ÉS A PEPTIDEK KÖZTI KÖTŐDÉS VIZSGÁLATA 33 STATISZTIKAI ANALÍZIS 34
5
EREDMÉNYEK 35
A NUKLEOSZÓMA ELLENI ANTITESTEK ÉS A DNÁZ AKTIVITÁS SLE-BEN 35 DNÁZ ENZIMAKTIVITÁS AZ SLE-S BETEGCSOPORTBAN 35 ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK (ANCSA) SLE-BEN 37 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK KAPCSOLATA AZ ANTI-DSDNS ANTITESTEKKEL ÉS A DNÁZ ENZIMAKTIVITÁSSAL 39 A DNÁZ AKTIVITÁS SZEREPE AZ SLE KÖVETÉSÉBEN 41 KÖVETÉSES VIZSGÁLATOK 42 A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK BEKÖVETKEZTÉNEK ÉS A TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK A KAPCSOLATA SLE-S BETEGKNÉL 45 A TROMBÓZIS INCIDENCIÁJA SLE-BEN 45 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 46 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ÉS A TROMBÓZIS KOCKÁZATÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE 47 EGYÉB, ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 50 FV Leiden és FII G20210A mutációk 50 Szerzett APCR vizsgálata 51 Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS) 53 FVIII és vWF szintek 53 Homocisztein szint 53 AZ ÖRÖKLÖTT RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK KAPCSOLATA A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK KIALAKULÁSÁVAL 54 FV Leiden és FII G20210A mutációk 54 Természetes anticoaguláns fehérjék 54 FVIII és vWF 54 Homocisztein szint 56 AZ APAK ÉS AZ ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS KOCKÁZATI TÉNYEZŐK EGYÜTTES HATÁSA 56 AZ FCR-OK GÁTLÁSÁNAK VIZSGÁLATA 58 A PEPTIDEK KÖTŐDÉSE AZ FC RECEPTOROKHOZ 59 IC-KÖTÉS GÁTLÁSA 59 PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉST INDUKÁLÓ HATÁSA 60 MONOMER PEPTIDEK GÁTLÓ HATÁSA 61
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 62
ÖSSZEFOGLALÁS 69
IRODALOMJEGYZÉK 71
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 82
6
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
ACR American College of Reumatology
ADCC antitest-függő sejtes citotoxicitás
ANCSA antinukleoszóma-antitest
APA antifoszfolipid antitest
APC aktivált protein C
aPTI (=aPTT) aktivált parciális tromboplasztin idő
AT antitrombin
ß2-GPI ß-2-glikoprotein I
C4BP C4 kötő fehérje
Cal cardiolipin
CBA kollagén kötő aktivitás
CBS cisztationin-ß-szintetáz
CI konfidencia intervallum
DNáz dezoxi-ribonukleáz
DNS dezoxi-ribonukleinsav
dNTP dezoxi-nukleotid
ECLAM European Consensus Lupus Activity Measurement
EKG elektro-kardiogram
ELISA enzimkötött immunszorbens technika
Fc „fragment crystallizable”
FcR Fc receptor
FITC fluoreszcein-izo-tiocianát
FPIA fluoreszcens polarizációs immuntechnika
FII II-es alvadási faktor (protrombin)
FX X-es alvadási faktor
FXa aktivált FX
GN glomerulonefritis
HLA humán leukocita antigén
ICAM intercellular cell adhesion molecule
IgG immunglobulin G
7
IL interleukin
IU nemzetközi egység
LA lupus antikoaguláns
MBL mannóz-kötő lektin
MHC fő hisztokompatibilitási komplex
MTHFR metil-tetrahidrofolát-reduktáz
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid
NK natural killer cell
OR odds ratio
PAI plazminogén aktivátor inhibitor
PC protein C
PCR polimeráz láncreakció
PhL foszfolipid
Ph-Ser foszfatidil-szerin
PS protein S
PT protrombin idő
RR relative risk
rpm percenkénti fordulatszám
SAH S-adenozil-homocisztein
SLAM Systemic Lupus Activity Measure
SLE szisztémás lupus erythematosus
SLEDAI SLE disease activity index
TF szöveti faktor
TFPI TF pathway inhibitor
TNFα tumor nekrózis faktor α
t-PA szöveti-típusú plazminogén aktivátor
u-PA urokináz-típusú plazminogén aktivátor
UCTD nem differenciált kötőszöveti betegség
VCAM vascular cell adhesion molecule
vWF von Willebrand faktor
8
BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS
Az SLE klinikai háttere
A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség. Az immunrendszer
szabályozásában több ponton fellépő zavar miatt a szervezet egyes saját struktúrái elleni
antitestképződés indul, amelyet szisztémás gyulladás kísér.
Nevének eredete a betegség jellegzetes bőrtüneteire vezethető vissza. Lupus vulgarisnak
nevezték korábban a tuberkulózis egyik változatát, mivel farkasmarásra emlékeztető
nyomokat hagyott az arcon. Ettől különböztették meg 1851-ben az erythemákat kiváltó
lupus erythematosust, amelynek szisztémás tüneteit később Kaposi Mór írta le.
Az SLE prevalenciája Európában 100.000 főre vetítve 40-70, éves incidenciája pedig 1-
5/100.000 fő [1-4]. Ezekből az adatokból is kitűnik, hogy a betegség mortalitása nem
magas, a betegek 5 éves túlélése 90 % felett van. A betegségre jellemző, hogy a férfi-nő
arány a megbetegedettek közt 1:8-10-hez, valamint, hogy a színesbőrű népesség
körében magasabb az előfordulása [5, 6]. Szintén érdemes megemlíteni, hogy a
betegség kezdete leggyakrabban a fiatal felnőttkorra tehető, ritkább a pubertáskor előtti
és az 55 év felett jelentkező lupus.
A betegség kialakulásához sok tényező együttes hatása vezethet. Azonosítottak olyan
géneket (pl. HLA izotípusok, IgG-Fc- valamint komplementreceptorok), amelyek egyes
1. ábra: Az SLE kialakulásában szerepet játszó tényezők. A genetikai háttér mellett környezeti hatások is hozzájárulnak a betegség megjelenéséhez.
hormonokfertőzések
antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás
stressz
HLA izotípuskomplement–citokin és Fc
receptor-MBL-gének
genetikai prediszpozíció
környezeti tényezők
SLEhormonokfertőzések
antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás
stressz
HLA izotípuskomplement–citokin és Fc
receptor-MBL-gének
genetikai prediszpozíció
környezeti tényezők
SLEhormonokfertőzések
antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás
stressz
HLA izotípuskomplement–citokin és Fc
receptor-MBL-gének
genetikai prediszpozíció
környezeti tényezők
SLE
9
variánsai hajlamosítanak autoimmun betegségekre, vagy éppen az SLE-re. A genetikai
prediszponáltság azonban önmagában nem elég. A környezeti tényezők közül az UV-
sugárzás, egyes gyógyszerek (pl. hidralazin, prokainamid, α-metil-dopa) [7, 8], és
fertőzések (pl. Eppstein-Barr vírus) [9-13] is lehetnek a betegség közvetlen kiváltói.
Hozzájárul a fentiekhez egyfajta hormonális hatás is: nem véletlen a betegek közti női
dominancia, vagy az sem, hogy a lupuszosoknál gyakran tapasztalható állapotromlás a
terhesség alatt, ösztrogéntartalmú gyógyszerek szedésekor, vagy éppen a premenstruális
időszakban [14-18].
Sokszínűsége miatt az SLE diagnózisa a legtöbb esetben nem egyszerű. Az általános
tünetek – láz, fáradékonyság, nyirokcsomó-duzzanat, gyorsult süllyedés – mellett
gyakran jelentkezik leukopénia, artritis, bőrtünetek (1. táblázat). (A betegség egyik
jelképe világszerte a pillangó, amely a betegek kis hányadának orrán és orcáján
jelentkező, valóban pillangóra emlékeztető vöröses bőrjelenségre utal.) Kisebb
1. táblázat: Az SLE manifesztációinak gyakorisága a betegek körében.
százalékban már a diagnózis idejére kialakult a betegnél vesekárosodás, idegrendszeri
tünet, trombózis. Néhány laboratóriumi paraméter megváltozása is alátámaszthatja a
lupus diagnózisát. A gyakorlatban az American College of Rheumatology (ACR) által
Szervi manifesztáció Érintettek aránya
arthralgia vagy arthritis 95 %
bőrérintettség 80 %
hematológiai tünetek (anémia, leukopénia) 60-90 %
lázas állapotok 50-70 %
veseérintettség 30-60 %
idegrendszeri tünetek 30-50 %
fényérzékenység 30 %
mellkasi fájdalom 20-45 %
hajhullás 15-30 %
szekunder antifoszfolipid szindróma 20 %
10
kialakított kritériumrendszer 11 pontja közül legalább négy együttes teljesülése esetén
mondható ki az SLE fennállása [19](2. táblázat).
2. táblázat: A szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnosztikai kritériumai [19]. A fenti 11 közül négy igazolódása esetén mondható ki a betegség diagnózisa.
1. Vespertilio (pillangó-erythema): lapos vagy kiemelkedő bőrpír az orron és az
orcákon, ami nem terjed rá a nasolabiális redőre.
2. Discoid bőrjelenség: kiemelkedő erythemás foltok, tapadó keratotikus hámlással
és follikuláris dugókkal, a régebbi léziókban atrófiás hegesedéssel
3. Fényérzékenység: a napfényre adott szokatlan bőrreació
4. Orális fekélyek: többnyire fájdalmatlan orális vagy nazofaringeális
fekélyképződés
5. Arthritis: nem destruáló arthritis két vagy több perifériális izületben, fájdalom,
duzzanat és izületi folyadék jelenléte jellemzi
6. Serositis: pleuritis és/vagy pericarditis dörzszörejjel, folyadékkal vagy EKG-val
alátámasztva
7. Vesebetegség: napi 0,5 g-ot meghaladó állandó proteinuria és/vagy szemcsés
cylinderek a vizeletben
8. Neurológiai tünetek: nem gyógyszer vagy anyagcserezavar indukálta görcsök
és/vagy psychosis
9. Hematológiai tünetek (a következők bármelyike): hemolitikus anémia
reticulocytosissal, leukopénia, limfopénia, vagy trombocitopénia
10. Immunológiai eltérések (bármelyik): kóros anti-DNS antitest szint, anti-Sm
pozitivitás vagy cardiolipin pozitivitás
11. ANA pozitivitás
A betegség aktivitása időben váltakozó. Hosszú tünetmentes periódusok után is újra
jelentkezhet exacerbáció. A betegség aktivitásának megítélésekor a beteg klinikai
állapota a döntő. Emellett laboratóriumi leletek is segítenek az immunrendszer
aktiváltsági állapotának megítélésében. Mivel a betegség többféle formában jelentkezik,
és lefolyása egyénenként változó, nincs olyan paraméter, amely minden beteg esetében
egyértelműen segítené a betegségaktivitás megítélését. Éppen ezért dolgozták ki az SLE
11
aktivitását objektíven jellemezni célzó indexeket, amelyek közül mi az egyik
legelterjedtebbet, a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index)
pontrendszert [20] használtuk vizsgálataink során. Eszerint különböző pontértékeket
számítunk az egyes tünetekre, majd ezek összessége adja meg a betegség aktivitásának
mértékét.
8 pontot számítunk az alábbi tünetekre: akut görcsök, pszichózis, vasculitis,
retinavasculitis okozta látászavar, agyidegtünetek, lupus fejfájás, cerebrovasculáris
léziók, „organic brain” szindróma.
4 pontot számítunk a következőkre: arthritis legalább két izületben, myositis,
haematuria, pyuria, napi 0,5 g-ot meghaladó proteinuria, szemcsés vagy vörös vértestes
cylinduria.
2 pontot számítunk az alábbiakra: Pleuritis, pericarditis, nyálkahártyafekély, alopecia,
friss exanthema, alacsony komplement szint, magas anti-DNS szint.
Végül 1 pontot jelentenek: láz, trombocitopenia, leukopenia.
Mivel a kezelés elsősorban a beteg pillanatnyi állapotától függ, remisszióban teljesen
elhagyható, míg az aktív lupus ellen esetenként csak igen agresszív terápiával lehet
hatásos.
Az exacerbációk közeledtének, valamint a későbbi szervi manifesztációk
kialakulásának az előrejelzése fontos, megoldás előtt álló feladat a kutatók számára.
Az SLE kialakulásának molekuláris háttere
A betegség tüneteinek többségét a nagy mennyiségben képződő autoantitestek
antigénekkel képzett komplexei okozta károsodások váltják ki. Az antitestek közül a
kromatin elemeit, a kettősszálú DNS-t, a hisztonfehérjéket, vagy az ezekből kialakuló
összetett struktúrákat, a nukleoszómákat felismerő antitestek kiemelkedő jelentősséggel
bírnak a betegség kialakulását illetően [21-23].
Az anti-DNS és antinukleoszóma antitestek jelenősége
Az anti-DNS antitestek jelenlétének vizsgálata a betegség diagnózisának felállításakor
és a betegségaktivitás követésekor is elengedhetetlen [21, 24, 25]. Újabb tanulmányok
12
emellett felhívják a kutatók és klinikusok figyelmét az antinukleoszóma antitestek
(ANCSA) diagnosztikai jelentőségére is [26-28]. Ezek az antitestek antigénjüket
felismerve vele immunkomplexet képeznek, majd a veseglomerulusokban lerakódva a
szervben szöveti károsodást okozhatnak [29, 30]. Az immunkomplexek által kiváltott
glomerulonephritis (GN) az SLE-s betegek 30-60 %-át érinti [31-33].
Leírták, hogy kísérleti állatokban a T-sejtes válasz gátlása nemcsak az anti-DNS szintet
csökkenti, hanem a lupus nephritis kialakulását is gátolja. Azt is kimutatták, hogy az
SLE-ben megjelenő anti-DNS antitestek többnyire nagy affinitású, IgG izotípusú
ellenanyagok, amelyek termelődése T-sejt függő. Ezzel bizonyították, hogy az
autoantitestek képzése antigén által indukált, T-sejt dependens úton indul [34-37].
DNáz szerepe az antitestek kialakulásában
Az apoptotizált sejtek eltávolításának defektusa az elhalt sejtekből felszabaduló
nagymennyiségű sejttörmelék, köztük kromatin komponensek keringésben való
felgyülemlése révén előidézheti az autoantitestek termelését, és az SLE kialakulását [38,
39].
A hasnyálmirigy által termelt DNáz I, és a lép által termelt DNáz II enzimek elhasítják a
nukleoszómák kettősszálú DNS láncait, ezzel elősegítik a keringő kromatinállomány
lebontását, eltávolítását. A DNáz I egy 30,4 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely
kation-kötő szekretoros endonukleázként hasítja a DNS-t, szekvencia-specifikusan [40].
A DNáz II szintén glikoprotein, molekulatömege 45kDa [41]. Savas pH-optimumának
megfelelően a sejtmagon kívül a lizoszómákban és néhány szekrétumban jelenik meg.
Régóta ismert az elgondolás, amely szerint a DNáz I enzim csökkent működése szerepet
játszhat az SLE és az SLE-ben jelentkező lupus nephritis kialakulásában [42, 43]. Ezt a
feltevést több kísérlet is alátámasztja.
DNáz I deficiens egerek vizsgálata azt mutatta, hogy a kísérleti állatokban SLE-hez
hasonló betegség alakult ki: antinukleáris antitest pozitivitással, magas anti-DNS
szinttel, illetve a veseglomerulusokban megfigyelhető immunkomplex-lerakódással
[44]. Ezek a hatások eltérő mértékben, a DNáz I szinttől függően jelentkeztek az
egereken. Egy másik kutatócsoport eredményei szerint, az SLE-s egereknek adott
intravénás DNáz injekciót követően csökkent az állatokban az autoimmun válasz
erőssége [45].
13
Egy közel 40 éve tett megfigyelés szerint a borjú DNáz I enzimmel történő kezelés
emberekben is visszaszorítja a DNS és rokon struktúrák antigén jellegét; valamint, hogy
a kezelés hatására a betegek egy részének anti-DNS szintje csökkent, illetve klinikai
állapota javult [46]. A borjú DNáz immunogén hatása miatt rekombináns humán
enzimmel folytatódtak a kísérletek. Azonban a bíztató egérkísérletek [45] ellenére sem
sikerült a rekombináns humán DNázzal hatásosan visszaszorítani az autoimmun
folyamatokat [47].
Japán kutatók két betegben is azonosították az A172G báziscserével járó mutációt a
DNASE I gén 2. exonjában [48]. A betegek, akiknek genomjában ez a mutáció
heterozigóta formában jelen volt, alacsony DNáz I enzimaktivitással és az SLE-s
csoportban mértnél is szignifikánsan magasabb anti-DNS szinttel rendelkeztek, de nem
mutatták semmilyen, a mutációval összefüggésbe hozható egyedi manifesztációját a
betegségnek.
Genetikai hajlamosító tényezők
A családfa és ikervizsgálatok, valamint a közelmúlt genetikai vizsgálatainak tapasztalata
szerint az SLE kialakulásának hátterében nem állhat kizárólag egy gén, hanem több gén
is rendelkezik olyan variánssal, amelyek együttállása a betegségre hajlamosító
genotípust alakíthat ki [49-52]. Egyes becslések szerint legalább négy genetikai
defektus, vagy hajlamosító allél szükséges ahhoz, hogy a betegség fenotípusosan is
megjelenjen [53]. Igaz azonban az is, hogy egyes ritka mutációk (például a
komplementrendszer korai elemeinek deficienciájához vezetők) homozigóta formában
önmagukban is a lupuszhoz hasonló tünetegyüttes megjelenéséhez vezethetnek [54, 55].
Az SLE-re hajlamosító genetikai eltéréseket az érintett fehérjék funkciója szerint három
fő csoportba oszthatjuk: Az első csoportban olyan genetikai polimorfizmusok vagy
mutációk szerepelnek, amelyek hatásaként sérül a szervezet fiziológiás sejttörmelék-
eltávolító rendszere. Példaként említhetjük az MBL, a C1q és más komplementfehérjék,
valamint egyes enzimek génjének defektusait. A második halmazba kerülnek azok a
gének, amelyek eltérései - termékeik immunreguláló szerepénél fogva – hozzájárulnak
az immunológiai tolerancia áttöréséhez. Ilyen genetikai eltérések a Fas, Fas-ligand
mutációi. A harmadik csoportban azokat a géneket találjuk, amelyek változatai a
betegség lefolyására, szervi manifesztációira vannak hatással.
14
Többen is vizsgálták az SLE összefüggését az MHC géncsalád polimorf elemeivel [56,
57]. Az MHC II DR2 és DR3 allélek 2-5-szörös relatív kockázatot hordoznak az SLE
kialakulására, ezen felül kimutattak bizonyos összefüggést a fenti allélek és egyes SLE-
re jellemző - ribonukleoproteinek és kromatinelemek ellen irányuló - autoantitestek
megjelenése között is [58]. Az MHC III géncsalád egyes - a korai
komplementfehérjéket kódoló - elemeinek deficienciája súlyos autoimmun folyamatok
beindulását eredményezheti. Ennek az lehet az oka, hogy a komplementrendszer fontos
szerepet tölt be az immunkomplexek eltávolításában, amely funkció kiesése esetén a
felszaporodó komplexek gyulladásos, hiperszenzitivitási reakciókat okozhatnak.
MBL és polimorfizmusai
Az MBL (mannose binding lectin) molekula szerkezetileg a komplement rendszer C1q
komponenséhez hasonlítható. A két fehérje funkciójában is találunk azonosságokat. Az
MBL képes felismerni a különböző mikroorganizmusok – baktériumok, gombák -
felszínén található mannóztartalmú membránmotívumokat. A kórokozókhoz való
kötődéssel aktiválják a komplementrendszer lektin-dependens útvonalát, ezzel
elősegítik a patogén komplement általi lízisét vagy azt, hogy a makrofágok - opszonizált
fagócitózis útján – hatékonyan elpusztítsák a mannózmotívumokkal rendelkező
kórokozót.
Az MBL fehérje szintje egyénenként változó, alakulását nagyban befolyásolja az MBL
gén 1-es exonjában található három ismert polimorfizmus valamelyikének jelenléte,
vagy a gén promóter régiójában leírt három polimorfizmus megjelenése [59]. Ezek
mindegyike a plazmában a vad genotípusú egyénekénél alacsonyabb MBL
koncentrációt eredményez. Leírták, hogy az alacsonyabb MBL koncentráció
hajlamosíthat az SLE-re [60]. Ennek hátterében több folyamat is állhat. Egyrészt, az
MBL megfelelő mennyiségének hiányában lassabban megy végbe az apoptotikus
sejttörmelék eltávolítása, a felhalmozódó sejtalkotók pedig – az arra hajlamos egyének
szervezetében – antigénként beindítják a különféle autoantitestek képződését. Másrészt,
csökkent MBL szint mellett a szervezet hajlamosabb a bakteriális és virális fertőzésekre,
amelyek – szintén az SLE-re prediszponált egyének esetében - közvetlen kiváltói
lehetnek a betegségnek. Újabb tanulmányok vizsgálják a csökkent termelést
15
eredményező polimorfikus MBL allélek összefüggéseit az anti-C1q, illetve az
antifoszfolipid antitestek termelődésével [61, 62].
Fc receptorok
Az ellenanyag molekulák Fc alegységének megkötésére képes receptorok (FcR [63]) a
legtöbb hemopoetikus eredetű sejten megtalálhatóak. Osztályozásuk Ig
izotípuspreferenciájuk szerint történik; szerkezetük, és ezzel összefüggésben funkciójuk
alapján pedig aktiváló vagy gátló Fc receptorokat különböztetünk meg [64, 65]. A
legtöbb esetben a sejtek felszínén egyidejűleg gátló és aktiváló receptorok is
megjelennek.
Az IgG izotípusú ellenanyagokat felismerő FcγR-ok a nagy affinitású FcγRI kivételével
gyengén kötik az IgG-t, ezért a szabad antitest nem, kizárólag az immunkomplexben
szereplő, ezáltal megváltozott térszerkezetű ellenanyag molekulák kötődnek a
receptorhoz, és váltanak ki végrehajtó funkciót.
Az FcR-ok által közvetített effektor funkciók a receptortól, és az azt kifejező sejttípustól
függően sokfélék lehetnek [65]. Aktiváló FcR-on keresztül kiváltható az NK sejtek
antitest-függő citotoxikus reakciója (ADCC), serkenthető a makrofág sejtek fagocitáló
képessége, és indukálható gyulladásoscitokin-termelésük. A gátló jellegű FcγRII fontos
szerepet tölt be B-sejtek antigéntermelésének szabályozásában.
Az FcγRIIa génjében leírt polimorfizmus a molekula 131-es pozíciójában egy aminosav
cseréjéhez vezet. Ismert, hogy a kizárólag H131 FcγRIIa molekulákat hordozó sejtek
sokkal hatékonyabban képesek az IgG2 megkötésére, míg az R131 FcγRIIa-val
rendelkezők kevésbé. Hasonlóan, az FcγRIIIa gén polimorfizmusának köszönhető F158
FcγR-ok az IgG 1-es, 3-as, és 4-es alosztályába tartozó molekulákat kötik kisebb
affinitással, mint a V158 FcγR-ok.
Az MBL molekulához hasonlóan az FcγR-ok Ig-kötést befolyásoló polimorfizmusairól
is leírták, hogy hozzájárulnak az autoimmun folyamatok kialakulásához [66-68].
Ezeknek a megfigyeléseknek a magyarázata az lehet, hogy a csökkent ellenanyag kötés
az immunkomplexek eltávolításának defektusát okozhatja, ezzel hozzájárulhat
hiperszenzitivitási reakciók kialakulásához.
Az FcR-ok gyulladásos folyamatok közvetítésében betöltött szerepének tárgyalásakor ki
kell hangsúlyoznunk az eltérő funkciójú receptorok egyensúlyának fontosságát. Az
16
aktiváló FcγRIII receptor bizonyítottan részt vesz az immunkomplex-mediált
gyulladásos, szövetkárosító folyamatokban [69]. Az FcγRIIb, az egyetlen ismert gátló
receptor viszont intracelluláris jelátviteli utakon képes gátolni az FcγRIII aktivációját
[70]. Leírták, hogy míg az FcγRIIb konstitutív módon kifejeződik a
veseglomerulusokban, az FcγRI és FcγRIII fiziológiás körülmények között nem.
Vannak azonban olyan mediátorok (pl. IFNγ), amelyek hatására az aktiváló receptorok
megjelennek a sejtfelszínen, a gátló FcγRIIb mennyisége viszont lecsökken. Ez a
folyamat végül heves gyulladásos reakcióhoz, ezzel pedig vesekárosodáshoz vezet.
Egy másik példa szerint azok a transzgenikus egerek, amelyek a humán FcγRIIa-t a
humán sejtekre fiziológiásan jellemző mennyiságben kifejezték, trombocitaaktivációt
előidéző ellenanyag beadására trombocitopéniával reagáltak, míg a vad típusú -
FcγRIIa-t nem expresszáló - egerek csak kis mértékben, a jelátvitel gátoltsága miatt nem
aktiválható FcγRI és FcγRIII receptorokkal sem rendelkező egerek pedig egyáltalán
nem mutattak trombocitopéniára utaló tüneteket. Azok az FcγRIIa transzgenikus egerek
pedig, amelyek működőképes FcγRI és FcγRIII fehérjékkel is rendelkeztek,
trombocitaaktivációt követően néhány órával trombózis és sokkreakció következtében
elpusztultak [71].
Fokozott trombóziskészség SLE-ben
Az alvadási rendszer áttekintése
A véralvadási és fibrinolitikus rendszerek helyes működése segít fenntartani a
létfontosságú keringést ereinkben. Amennyiben a rendszer valamelyik eleme nem
megfelelően működik, a fennálló kényes egyensúly eltolódik, felléphet egyrészt
vérzékenység, amely vérveszteségen és szöveti károsodáson keresztül vezethet
életveszélyes állapotokhoz, vagy felléphet fokozott alvadékonyság, amely az érpályák
elzárása révén fontos területek, szervek funkciójának kiesését okozhatja.
Az alvadás megindulása in vivo az intravasálisan fiziológiás körülmények között nem,
vagy csak nyomokban jelenlévő szöveti faktor (TF) megjelenésével kezdődik. A TF
transzmembrán glikoprotein, amely megtalálható a nagyobb ereket körülvevő adventitia
réteg sejtjein, epitélsejteken illetve egy esetleges érsérülést követő károsodásnak
fokozottan kitett helyeken (pl. agy, veseglomerulusok), de nyugalmi állapotban
17
hiányzik a plazmával érintkező endotélium és a vér alakos elemeinek felszínéről. Az
érfal sérülése, vagy a monocita sejtek aktivációja következtében TF kerül kapcsolatba a
plazmával, megköti és aktiválja az ott keringő VII-es alvadási faktort. A VII-es faktor
aktivált enzimalakja (FVIIa) foszfolipid membránfelszín jelenlétében, a TF-hez kötötten
képes hasítani, és ezzel aktiválni a IX-es és X-es alvadási faktorokat, azok pedig kis
mennyiségben egymást. Az FXa foszfolipid felszín és Ca2+-ionok jelenléte mellett
képes a protrombin (II-es faktor) kis mennyiségének aktiválására. Az így keletkezett
trombin (FIIa) beindít egy másik utat: hasítással aktiválja a XI-es faktort, amely
autokatalízise mellett a IX-es faktort aktiválja nagy mennyiségben. Emellett a trombin
és az FXa is aktiválni képes a VIII-as faktort, amely így kofaktorként a FIXa-hoz
kötődve, a foszfolipid felszínnel és a Ca2+-ionokkal kialakítja a X-es faktor
aktiválásának leghatákonyabb komplexét, az angolból átvett szóval „tenase”-komplexet.
Az így nagy mennyiségben keletkezett FXa, az előzőekhez hasonlóan foszfolipidekkel,
Ca2+-ionokkal, és kofaktorával, az FVa-val a protrombint nagy mennyiségben
trombinná hasító protrombináz komplexet képzi. Az eddigi folyamatok mind oda
vezetnek, hogy a keletkező trombin a plazmában keringő fibrinogént (I-es faktort)
hasítva, fibrin keletkezéséhez, annak H-hidakkal történő összekapcsolódásához, így egy
laza fibrinháló kialakulásához vezet, amit végül az aktivált XIII-as faktor stabilizál.
2. ábra: A véralvadási rendszer főbb folyamatainak áttekintése
FIXaFIX
FX FXa
TF-FVIIa
FVIICa2+ + PhL
Ca2+ + PhL
- FVIIIa
- FVa
FII FIIa
FXIa FXI
FXIIa FXII
FI
fibrin + FXIIIaFIXaFIX FIXaFIX
FX FXaFX FXa
TF-FVIIa
FVII
TF-FVIIa
FVIICa2+ + PhL
Ca2+ + PhL
- FVIIIa
- FVa
FII FIIaFII FIIa
FXIa FXIFXIa FXI
FXIIa FXIIFXIIa FXII
FI
fibrin + FXIIIa
18
Az alvadási kaszkád beindulásával egyidőben megkezdődik az antikoaguláns hatású
fehérjék aktiválódása is. A TFPI (tissue factor pathway inhibitor) FXa-val képzett
komplexe a TF és FVIIa komplexéhez köt, és azok működését, a IX-es és X-es faktorok
aktivációját gátolja. Az FXa-nak és a trombinnak több inhibitora is ismert, így az α1-
antitripszin, az α2-makroglobulin, vagy a heparin-kofaktor II. A leghatékonyabb gátlást
azonban az antitrombin (AT) fejti ki a statikus, vagyis a keletkező trombin
mennyiségétől függetlenül jelenlévő inhibitorok közül. Az antitrombin, amely önmaga
is szerin-proteáz, igen hatékony szerin-proteáz inhibitor („serpin”); kofaktoraival, a
heparán-szulfát-proteoglikánokkal illetve az antikoaguláns kezelés során is alkalmazott
heparinszármazékokkal, a trombin, az FXa és az FIXa enzimek inaktiválásáért felelős.
Mennyiségi vagy minőségi elégtelensége fokozott alvadékonysághoz vezet. Hasonlóan
jelentős természetes antikoaguláns fehérje az aktivált protein C (APC) és kofaktora a
protein S (PS). A protein C (PC) az endotél sejtek felszínén található EPCR-hez
(endoteliális PC receptorhoz) kötődve kerül kapcsolatba az őt aktiváló, sejtfelszíni
trombomodulinhoz kötődő trombinnal. Aktivációja után, kofaktorának a PS-nek
segítségével a tenáz és protrombináz komplexekben szereplő FVIIIa-t és FVa-t hasítja,
ezzel több nagyságrenddel csökkenti a trombinképződés sebességét. A PC, vagy a PS
hiánya erősen hozzájárul a trombózis kialakulásához.
Ezen felül, a fibrinképződés mellett azonnal megjelenik annak plazmin által történő
bontása is. A plazmin a plazminogénből keletkezik a szöveti- valamint az urokináz
típusú plazminogén aktivátorok (t-PA és u-PA) segítségével; feladata a fibrin hasításán
felül az extracelluláris mátrix bontásáért felelős mátrix metalloproteázok (pl.
kollegenáz, zselatináz) aktiválása is. A plazminogén, más néven fibrinolitikus
rendszerben részletes ismertetése e dolgozatnak nem célja, illő azonban
megjegyeznünk, hogy a működésében részt vesz több inhibitor is, amelyeknek
defektusa különböző mértékű vérzékenységet okoz.
Főbb tromboembóliás rizikófaktorok
Az alvadási és fibrinolitikus rendszer komplex és igen jól szabályozott. Ennek
következménye, hogy csak kivételesen ritka esetekben vezet egyetlen, a rendszert érintő
defektus trombózis kialakulásához. Számos örökletes, és szerzett állapotot írtak le,
19
amelyekről bebizonyosodott, hogy kisebb-nagyobb mértékben hozzájárulnak a
tromboembóliás események bekövetkeztéhez.
Antitrombin deficiencia
Az elsőként, az 1960-as évek közepén felismert örökletes trombózisra hajlamosító
tényező az antitrombin (AT) deficienciája volt [72]. Az AT képzésének mennyiségi
zavarai, vagy a funkciót érintő mutációk ma is a trombofíliás állapotok ismert kiváltói
közül a legsúlyosabbak közé tartoznak. Ma úgy tudjuk, hogy az AT teljes hiánya, amely
homozigóta AT mutációk következményeként állhat elő, a legtöbb esetben az élettel
összeegyeztethetetlen, viszont leírtak már homozigóta mutációt az AT heparin-kötő
helyén [73, 74], amely az AT funkciójának részleges elvesztésével jár. Heterozigóta
formában számos AT mutáció ismert, ezek a lakosság 0,02-0,20 %-át érintik [75, 76], a
trombofíliás eseteknek pedig mintegy 5 %-ában megtalálhatók [77, 78].
Az AT, amely maga is a szerin-proteáz emzimcsaládba tartozik, egyben szerin-proteáz
inhibitor („szerpin”) is, vagyis a szerin-proteáz aktivitású alvadási faktorokat, legelső
sorban a trombint, az aktivált X-es és IX-es faktorokat hasítja. Ebben természetes
kofaktorai a heparán-szulfát-proteoglikánok, illetve farmakológiai kofaktorai, a heparin
és ennek származékai segítik. Mutációk ismertek az AT aktív centrumában, valamint a
heparin-kötő helyen, ezek heterozigóta formában is fokozott trombóziskészséget
okoznak [79, 80].
A protein C – protein S rendszer defektusai
Az 1980-as években írták le először egy másik természetes antikoaguláns fehérjének, a
protein C-nek (PC) és kofaktorának, a protein S-nek (PS) az örökletes zavarát, mint
trombózisra erősen hajlamosító tényezőket [81-84]. Azóta mindkét fehérjének több mint
száz polimorf változatát megismertük [85-89]; ezek a teljes népesség mintegy 0,1-0,3
%-ában megtalálhatók [90, 91]. Súlyosabb esetekben, homozigóta vagy kettős
heterozigóta formában a PC vagy a PS hiánya vagy funkcionális deficienciája már
újszülöttkorban tromboembóliás események bekövetkeztéhez vezethet [92].
Az aktivált PC (APC) az aktivált V-ös és VIII-as faktorok inaktiválását végzi. Az FVa-t
a 306-os, 506-os, és a 679-es pozícióban lévő argininek mellett hasítja el. Az R679
melletti hasítás nem járul hozzá az FVa funkcióvesztéséhez, az R506 melletti hasítás
20
részleges inaktivációt eredményez, míg az R306 melletti hasítás az FVa aktivitásának
teljes elvesztéséhez vezet [93].
APC rezisztencia és a Leiden-mutáció
Az 1990-es évek elején derült fény az aktivált V-ös faktor APC elleni rezisztenciájának
hátterében álló eltérésre, vagyis az FV génben bekövetkezett G1691A báziscserének
köszönhetően a fehérje 506-os pozíciójában a vad típusú arginin helyett egy glutamin
megjelenésére [94]. Ezzel az eltéréssel - amelyet felfedezésének helyéről „Leiden-
mutáció”-nak neveznek - az FVa APC általi hasítása, vagyis inaktiválása jelentősen, ám
nem teljes mértékben lecsökken, vagyis egy igen fontos reguláló lépés marad ki a
folyamatból. Ez fokozott alvadékképződéshez, így visszatérő, elsősorban a mélyvénákat
érintő trombózisok kialakulásához vezet [95-97]. A Leiden-mutációt hordozó allél a
teljes európai népesség 3-7 %-ában [97-99], Magyarországon a lakosság 6-10 %-ában
megtalálható [100-102]; érdekesség, hogy az ázsiai népesség körében a Leiden-allél
előfordulása rendkívül ritka [103-105].
Az FVIIIa-t az APC az R336-os és R562-es pozíciókban hasítja. Érdekes megjegyezni,
hogy a vad típusú FV jelenléte szignifikáns mértékben segíti az FVIIIa APC általi
hasítását, azonban a Leiden-mutációt hordozó gén termékeként keletkező FV ezt a
funkciót nem képes betölteni, vagyis egy második úton is elősegíti az alvadékképződést.
APC rezisztenciát, és így fokozott alvadékonyságot okoz - az FV R506Q változatához
hasonlóan - az FV „Cambridge-mutáció” [93], amely a 306-os pozícióban bekövetkező
arginin treonin aminosavcserét eredményezi. Ez azonban, ellentétben a Leiden-
mutációval, igen ritka [106].
Ismertté vált, hogy az APC kofaktora, a PS elsősorban az FVa R306-os hasításához
szükséges; konformációs változást eredményez az APC-n, így segíti annak aktív
centrumát a szubsztráthoz közelebb kerülni. Emellett, a PS az FXa-hoz, az aktivált V-ös
és a VIII-as faktorokhoz kötve gátolja a protrombin-trombin átalakulást, ezzel is kifejtve
antikoaguláns hatását.
A protrombin G20210A mutáció
Az enzimatikusan aktív trombin mennyiségét szabályozzák fent említett inhibitorai, de
azt, hogy alapvetően mennyi keletkezik, döntően befolyásolja a protrombin gén
promóter régiója is. A promóter régióban található, 1996-ban leírt G20210A mutáció
21
hatására, a mutáns allélt heterozigóta formában hordozók plazmájában kb. 30%-kal
magasabb lesz a protrombin szintje [107]. Ez több trombin keletkezését
eredményezheti, és ezzel fokozott alvadékonysághoz vezethet. Ez a mutáció a
magyarországi népesség 2,5-5 %-ában mutatható ki [100]; az eddig ismertetett
defektusokénál mérsékeltebb – heterozigóta formában mintegy 2-3 szoros - kockázatot
hordoz [107, 108]. Önmagában jellemzően még homozigóta formában sem vezet
trombózis kialakulásához, azonban megemeli mind a vénás, mind az artériás
trombózisok bekövetkezésének valószínűségét. A protrombin gén más változatairól is
leírták, hogy hozzájárulnak a protrombin szint megemeléséhez. Például, a 13-as
intronban található A19911G polimorfizmus esetében megfigyelték, hogy a homozigóta
G allélt hordozók plazmájában 7 %-kal magasabb a protrombin szintje, mint a
homozigóta A alléllal rendelkezőkében [109]. Bár összefüggést találtak a trombózis
megnövekedett kockázata és a GG genotípus között, ennek jelentősége elmarad a
korábban említett kockázati tényezőkétől.
Emelkedett VIII-as faktor szint
Hasonlóan a protrombin, azaz a II-es faktor fokozott termelődéshez, más alvadási
faktorok emelkedett szintjéről is megállapították, hogy hozzájárulnak a koagulációs
rendszer egyensúlyának az alvadékonyság irányába történő eltolódásához.
Leggyakrabban a VIII-as faktor szerepét említi az irodalom [108, 110, 111], de
születtek eredmények, amelyek a IX-es, XI-es, valamint az I-es faktorok magas szintje
és a trombózis mérsékelten (1,5-3-szorosan) emelkedett rizikója közötti kapcsolatot
támasztják alá [108].
Vizsgálatok során kiderült, hogy az emelkedett FVIII szint határozottam, 3-5-szörösre
megemeli – elsősorban a vénás – trombózis kialakulásának relatív kockázatát. Ismert,
hogy a VIII-as faktor a plazmában a von Willebrand faktorhoz (vWF-hez) kötötten
kering, valamint az is, hogy az AB0 vércsoportrendszer szerinti 0-ás vércsoportú
személyek plazmájában mind a vWF, mind az FVIII szintje szignifikánsan alacsonyabb
a többi vércsoportba tartozókénál. Mind a magas vWF szint, mind a nem 0-ás
vércsoport trombózis kialakulásának relatív kockázatával tapasztalt összefüggése a
magasabb FVIII szint hatásának tulajdonítható. Az emelkedett FVIII szint és a fokozott
alvadékonyság közti kapcsolat hátterében több mechanizmus állhat: a nagyobb
mennyiségű FVIII erősebb kofaktor aktivitásával fokozza az FIXa, ezzel a tenáz-
22
komplex X-es faktort aktiváló működését. Mivel az FVIII és az FV mindketten az APC
szubsztrátjai, az FVIII szint emelkedése egyben az FV csökkent inaktivációját is
eredményezi. Az alvadási rendszer kaszkádszerű felépítésének köszönhetően azonban a
tenáz- és protrombináz-komplexek funkciójának lineáris emelkedése exponenciális
fibrinképződést, illetve alvadékonyságot eredményez.
Emelkedett homocisztein szint
A homocisztein (Hcy) szint megemelkedése is állhat trombofíliás állapot hátterében
[112, 113]. A magas Hcy koncentrációt kezdetben az arteriosclerosis és az artériás
trombózisok kialakulásának megnövekedett kockázatával hozták összefüggésbe [114,
115], de mára egyre több adat támasztja alá szerepét a vénás trombózisok
kialakulásában [116, 117]. A Hcy szint emelkedését okozhatja a Hcy-anyagcsere
valamely enzimének öröklött defektusa. Erre ismert példa a metil-tetrahidrofolát-
reduktáz (MTHFR) génjének gyakori C677T polimorfizmusa [118-120], amely az
MTHFR enzim hőre labilis változatának expresszióját, ezzel homozigóta formában az
enzimaktivitás 50 %-os csökkenését eredményezi. Az MTHFR feladata metionin
előállítása a Hcy metilációjával (a reakcióhoz a metilcsoportot az enzim a metil-
tetrahidro-folsav, az MTHF demetilációjával nyeri), így az enzim csökkent működése
Hcy szint enyhe emelkedésével jár. Egy másik enzim, a cisztationin-ß-szintáz (CBS), a
cisztein Hcy-ből történő képzéséért felelős. Az enzim génjének számos mutációja
ismert, amelyek homozigóta formában a CBS teljes hiányát okozhatják, de heterozigóta
genotípus esetén is vezethet akár már fiatal korban artheriosclerosishoz és vénás
trombózisok kialakulásához [121-123]. A mutáció homozigóta formájának előfordulása
azonban igen ritka (1:100.000). A Hcy-szint megemelkedését többnyire mégis a fent
említett enzimek kofaktorainak, a B6 és B12 vitaminnak, valamint az MTHF
szintéziséhez szükséges folsavnak a hiánya okozza.
A hiperhomociszteinémiának a trombózis és a kardiovaszkuláris betegségek
kialakulására gyakorolt hatása több folyamat révén érvényesül [113, 124]. Egyrészt, a
Hcy autooxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkeznek, amelyek az endotélt
károsítják, egyben a keringő trombocitákat és monocitákat aktiválják. Másrészt, a Hcy
gátolja egyes anticoaguláns fehérjék működését: blokkolja az AT kötését a membrán
heparán-szulfát-proteoglikánokhoz; a trombomodulin redukálása révén gátolja a
23
trombin-trombomodulin kapcsolat kialakulását, ezzel a PC aktivációját; módosítja a t-
PA-receptor t-PA kötőhelyét, így gátolva a fiblinolízist.
Szerzett trombofíliás tényezők, avagy a trombózis kialakulását segítő állapotok
A trombózis kockázatát emeli néhány állapot, például terhesség, poszt-menopauzális
hormonpótló vagy orális fogamzásgátló kezelés, infekciók, malignus megbetegedések,
sebészeti beavatkozások, obesitas, amelyeket szerzett rizikófaktoroknak nevezünk. Ezek
közé tartozik a keringő antifoszfolipid antitestek megjelenése is, amely lehet spontán, de
társulhat infekciókhoz, autoimmun betegségekhez is.
Az SLE-re jellemző gyulladás és az antifoszfolipid antitestek protrombotikus hatásának
vélt mechanizmusait érdemes röviden összefoglalni.
A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában
A gyulladás a véralvadás több fázisára is hat, a kezdeti lépésektől egészen a regulációig
[125, 126]. A gyulladásos citokinek mint a TNFa, IL-1, IL-6 beindítják a szöveti faktor
expresszióját és fokozzák a keringő, úgynevezett „blood-born” TF mennyiségét [126-
130]. Ezen kívül, a gyulladásos mediátorok a komplementrendszer aktivációján vagy
fokozott apoptózis előidézésén keresztül hozzájárulnak negatív töltésű foszfolipidek
felszínre kerüléséhez, ami kedvez az alvadási folyamatok beindulásának.
A gyulladásos reakciók során gátlódik a természetes antikoaguláns fehérje, a PC
aktivációja. A C4BP fehérje fokozott expressziója következtében pedig lecsökken a
szabad, funkcionálisan aktív PS mennyisége, hiszen a PS többsége a plazmában a C4BP
szabályozó komplementfehérjéhez kötve kering [131].
Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában
A megfigyelés magyarázatául, miszerint az antifoszfolipid antitestek (APA-k) jelenléte
in vivo hozzájárul a trombózisok kialakulásához, több elmélet is született az elmúlt
években. Többségüket máig sem cáfolták meg, a legvalószínűbb tehát az, hogy az APA-
k kisebb-nagyobb mértékben számos úton hatnak a koagulációs rendszerre, mind az
alvadást elősegítő, mind az azt gátló folyamatok révén, ám összességben az egyensúlyt
az alvadékonyság irányába tolják el [132-135]. Két fő csoportra oszthatjuk az APA-k
koagulációt érintő hatásmechanizmusait: a molekuláris eseményekre ható és a
sejtközvetített hatások csoportjaira.
24
A molekuláris szintű hatások megértéséhez fontos tudni, hogy nyugalmi állapotban a
sejtmembrán kettősrétegének belső rétegében olyan negatív töltésű foszfolipidek
(például foszfatidil-szerin) találhatók, amelyek a sejtek aktiválódásakor a külső felszínre
kerülnek. Ezekhez Ca2+ ionokon keresztül képesek hozzákapcsolódni a Gla-doménnel
rendelkező alvadási faktorok (FVII, FIX, FX, FII) és antikoaguláns fehérjék (PC, PS);
ez a kötés szükséges a felsorolt enzimek működéséhez. Így a véralvadási rendszer több
folyamata - a TF-FVIIa komplex általi FIX és FX aktiváció, az FX tenáz-komplex általi
aktivációja, a protrombináz-komplex által végrehajtott protrombin-trombin átalakítás,
valamint a gátló folyamatok közül a PC aktivációja, majd az APC FVa-t és FVIIIa-t
inaktiváló működése - során elengedhetetlen a foszfolipid felszín jelenléte. Azonban az
antifoszfolipid antitestek is ezeket az anionos felszíneket és a hozzájuk kötődő
fehérjéket ismerik fel, és támadják meg; ezzel pedig gátolják a foszfolipidfüggő
reakcióutakat az alvadási rendszerben.
Kimutatták, hogy a ß-2-glikoprotein I (ß2-GPI) membránfehérje, valamint a hozzá
kötődő APA-k versengenek a szabad foszfolipid felszínért a fent felsorolt
enzimkomplexekkel, ezzek gátolva működésüket [136, 137]. Azt is megfigyelték, hogy
a tisztított ß2-GPI ezen a módon hatékonyabban gátolja a PC aktiválódását és
működését, mint a trombin keletkezéséhez vezető folyamatokat, vagyis a rendszert az
alvadékonyság irányába tolja el.
Az utóbbi évek tanulmányai kiemelik az APA-k és az annexin V kompetíciójának
szerepét a tromboembóliás események pathogenezisében [138]. Az annexin V fehérje
molekulák – amelyeket a placentából és a véredényekből is izoláltak - nagy affinitással
kötnek az anionos foszfolipid felszínhez, azon összekapcsolódnak, és mintegy
kétdimenziós kristályrácsot képezve pajzsként védik az alvadási komplexektől. Így
meggátolják, hogy a különböző folyamatok révén kis mennyiségben felszínre kerülő
anionos foszfolipidek közreműködésével beinduljon az alvadási kaszkád. Az APA-k
foszfolipidekhez való kötődése megbontja az annexin V kristályrácsát, és lecsökkenti
annak alvadásgátló hatását. APA-pozitív betegek placentájából származó sejteken,
trophoblaszt-sejtkultúrákon és mesterséges foszfolipidfelszínen végzett kísérletek
igazolják ezt a működést. Az annexin V-tel való kölcsönhatás megmagyarázza azt is,
miért okoz trombózist az APA-k jelenléte in vivo, és miért gátolja az alvadást in vitro.
In vitro ugyanis - az annexinek távollétében - az APA-k a szabad foszfolipidfelszínt
25
blokkolják az alvadási komplexek elől, viszont nem zavarják meg az annexin
antikoaguláns hatását.
A sejtközvetített folyamatok lényege, hogy a monociták és trombociták membránjához
kötve az antifoszfolipid antitestek képesek beindítani vagy felerősíteni az
intravaszkuláris sejtek aktivációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Aktiválódásuk
során a sejtek szöveti faktort (TF) expresszálnak [139]. A TF egy része az azt termelő
sejtek membránján marad, egy másik hányad azonban kis membránpartikulumokkal,
ún. micropartikulumokkal együtt lefűződik a trombocitáról vagy monocitáról, míg újabb
vizsgálatok szerint kis mennyiségben szolubilis formában is található TF a plazmában.
A TF jelenléte a plazmában keringő FVII aktiválásával beindítja az alvadási kaszkádot,
a trombusképződéshez vezető folyamatokat. Több tanulmány eredményei is
alátámasztják, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenlétében emelkedik a TF expresszió
[140, 141], illetve, hogy a magasabb plazma TF szint korrelál az APA-k jelenlétével, és
a pozitív tromboembóliás kórtörténettel [142, 143]. A korábban trombózist már
elszenvedett SLE-s betegek tisztított IgG antitest frakciója ezt a hatást erősebben
mutatja, mint a trombózisos kórelőzmény nélküli SLE-s betegek antitestei.
Az endotélsejtek APA-kal történő inkubációja során megfigyelték, hogy a sejtek
aktiválódnak, fokozódik a membránjukon a trombociták és leukociták adhézióját segítő
molekulák, például a szelektinek (P- és E-szelektin), ICAM-1 (intercellular cell
adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhezion molecule) expresszója. A TF
mellett emelkedik még a t-PA, vWF és a PAI-1 termelés és szekréció, valamint a
proinflammatórikus citokonek, az IL-1 és IL-6 termelődése is [144].
A trombociták APA általi aktivációja közvetlenül beindítja azokat a jelátviteli
folyamatokat, amelyek következményeként anionos foszfolipidek kerülnek a
vérlemezkék membránjának felszínére, illetve megjelennek a trombocitaaggregációt
közvetítő membránstruktúrák [132], amelyek közül a legfontosabb a GPIIb-IIIa
membránkomplex. Az APA-k köthetnek a trombocitamembrán foszfolipidjeihez és az
ahhoz asszociált fehérjékhez, elsősorban a ß2-GPI-hez az antigénfelismerő Fab-
fragmentumukkal, vagy az Fc fragmentumukkal a vérlemezkék membránján
megtalálható FcγRII receptorhoz. Fontos megjegyezni, hogy így akár fiziológiás vagy
éppen kóros körülmények közt már a trombociták kismértékű aktivációja is további
aktivációhoz és aggregációhoz vezet.
26
CÉLKITŰZÉSEK
Munkám célja az volt, hogy megvizsgáljam az autoantitestek és immunkomplexeik által
okozott szervi károsodások és szisztémás jelenségek hátterét SLE-ben; valamint, hogy
olyan laboratóriumi módszereket keressek, amelyekkel jól jelezhető vagy követhető a
betegség alakulása. Közelebbi céljaim voltak:
• Megvizsgálni a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, felmérni a
DNáz aktivitás jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi
manifesztációinak – elsősorban a lupus nephritis - megjelenésében. Kiértékelni,
mennyire hasznosítható paraméter a DNáz enzimaktivitás a betegek
laboratóriumi követése során.
• Megvizsgálni, milyen összefüggés van a betegek DNáz aktivitása és a szérum
antinukleoszóma antitest szintje között, valamint meghatározni az
antinukleoszóma antitest szint mérésének klinikai jelentőségét.
• Meghatározni az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s populációban
és megvizsgálni ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok
bekövetkeztével.
• Meghatározni az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és
kimutatni az ezek hátterében álló, az SLE-től független, többnyire öröklődő
tromboembóliás kockázati tényezőket, illetve megvizsgálni a trombofília-szűrés
indokoltságát SLE-ben.
• Megvizsgálni annak a lehetőségét, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal
előidézhető-e az immunkomplexek hatása, illetve a receptorok blokkolásával
gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor
funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében.
27
MÓDSZEREK
A vizsgált betegcsoport
A vizsgálatok során összesen 173 SLE-s beteg mintáit használtuk fel tájékoztatásuk
után, belegyezésükkel. Közülük 155-en a Semmelweis Egyetem Immunpathológiai
Járóbeteg-szakrendelésének gondozásában álltak, 10-en az I-es számú
Gyermekgyógyászati Klinikán, 8-an pedig a II-es számú Belgyógyászati Klinikán
részesültek ellátásban. A betegek diagnózisa a Tan és munkatársai által 1982-ben
lefektetett kritériumrendszer [19] alapján történt.
A betegség aktivitását minden esetben a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus
Disease Activity Index) számításával [20] kapott pontokkal jellemeztük.
A DNáz enzim aktivitásával kapcsolatos kísérletekbe 113 SLE-s beteget vontunk be,
tőlük 185 szérummintát vettünk. A betegek közt 105 nő és 8 férfi volt, 13 és 79 év
közötti életkorban, átlagéletkoruk 38,3 ± 14,1 év volt a mintavételek idején. A kísérletek
során 9 nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő beteg (7 nő, 2
férfi; 45,8 ± 11,9 évesek) és további 14 nem autoimmun beteg kontroll (11 nő 3 férfi; 43
± 22,1 évesek) mintáját is megvizsgáltuk.
A tromboembóliás kockázatok elemzéséhez 105 SLE-s beteget vizsgáltunk ki. Köztük
99 nő és 6 férfi volt, 18 és 68 év között, átlagéletkoruk 41,0 ± 11,7 év volt, az SLE
diagnózisának felállításától vizsgálatunkig átlagosan 14,6 ± 9,1 év telt el.
A minták előkészítése a vizsgálatokhoz
A DNáz aktivitás méréshez, illetve a különböző antitestek kimutatásához natív vérből
centrifugálással (4000 rpm 5’) nyert szérumot, az alvadási vizsgálatokhoz nátrium-
citráttal alvadásgátolt, és két centrifugálással trombocitamentesített plazmát, a genetikai
vizsgálatokhoz pedig leukocitákban dús „buffy coatból” tisztított DNS-t használtunk.
Az antinukleoszóma és anti-DNS antitestek szintjének a mérése
Az antitestek szintjének meghatározása enzim-kötött immunszorbens, azaz ELISA
(enzime-linked immunosorbent assay) technikával történt. A mérésekhez kereskedelmi
forgalomban lévő kiteket használtunk (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). Az
immunszorbens módszer az antigén és a specifikus antitest közötti erős, nem-kovalens
28
kölcsönhatás felhasználásán alapszik. A kitekben található polisztirol lemezeken
gyárilag kikötött tisztított antigén (ebben az esetben kettős szálú DNS illetve
nukleoszóma) található. Erre a felületre kikötnek a mintákban található specifikus anti-
DNS és antinukleoszóma antitestek. Miután mosással eltávolítottuk a lemezről a nem
specifikus antitesteket, peroxidáz enzimmel konjugált, humán IgG specifikus, nyúlban
termeltetett antitesteket kötünk a rendszerben maradt specifikus ellenanyagokhoz.
Ezeknek mennyiségét később a peroxidáz enzim által tetra-metil-benzidin szubsztrátból
átalakított színes reakciótermék 405 nm-en fotométerrel leolvasott abszorbanciájából
határozzuk meg. A gyártó leírását követve, hatpontos kalibrációs görbe felhasználásával
végeztük a méréseket. Pozitívnak értékeltük a gyártó által javasolt 20 IU/ml méréshatár
feletti antitest-koncentrációt tartalmazó mintákat.
DNáz aktivitás mérés
A DNáz enzim aktivitását is kereskedelmi forgalomban lévő ELISA elven alapuló kittel
végeztük (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). A módszer lényege röviden
összefoglalva a következő: A polisztirol ELISA lemezekre gyárilag DNáz-szubsztrát
volt kitapasztva. A lemezre rámértük a betegek hígított szérum mintáit, majd egy órán
keresztül 37 ºC-on inkubáltuk a lemezeket. Az inkubációs idő leteltével a lemezen
érintetlenül megmaradt szubsztrát mennyiségét mértük az ELISA módszer elve alapján
peroxidáz enzimmel jelölt a DNáz-szubsztrátra specifikus antitest segítségével. A DNáz
specifikus szubsztrát fogyásából hatpontos kalibrációs görbe segítségével számoltuk ki
a mintákban található DNáz enzim aktivitását. A vizsgálatokat minden minta esetén
legalább két párhuzamos méréssel végeztük. A longitudinális összehasonlításokhoz
felhasznált mintákat egyidőben mértük le, ezzel is kiküszöbölve a mérések közti
variabilitásból adódó hibát.
Az antifoszfolipid antitestek szintjének mérése ELISA módszerrel
Az anti-foszfolipid antitestek szintjének meghatározásához kétféle módszert
használtunk. Szilárdfázisú, ELISA elven alapuló módszerrel mértük a betegek
szérumában található antitestek mennyiségét, míg koagulációs módszert alkalmaztunk a
foszfolipid-specifikus lupus antikoaguláns aktivitás mérésére.
29
A fentiekben már ismertetett ELISA technikával az alábbi antifoszfolipid antitestek
mennyiségi meghatározását végeztük el: egy kevert IgG és IgM izotípusú antitesteket is
detektálni képes szűrőteszt után a pozitív mintákban külön-külön megmértük az IgG és
IgM izotípusú anti-cardiolipin antitestek mennyiségét (anti-CalG, anti-CalM); továbbá
kevert, IgG, IgA és IgM izotípusú antitesteket kimutató szűrőteszttel végeztük az anti-
ß2-glikoprotein I (anti-ß2-GPI), az anti protrombin (anti-FII) és az anti-foszfatidil-szerin
(anti-ph-Ser) ellenanyagok mennyiségi meghatározását (a gyártó minden esetben:
Orgentec GmbH).
A foszfolipid-specifikus LA mérése koagulációs módszerrel
A lupus anticoaguláns (LA) aktivitás vizsgálatához nátrium-citráttal alvadásgátolt, és
ismételt centrifugálással trombocitáktól mentesített plazmákat használtunk. A
mérésekhez egy szűrő és megerősítő vizsgálatokból álló háromlépéses tesztrendszert
dolgoztunk ki. Első lépésként három független szűrőtesztet végeztünk. Azokat a
plazmákat vizsgáltuk tovább, amelyek esetében a három teszt különböző reagenseivel
(dPT 1:200, Innovin, Dade Behring, Németország; PTT-LA, Diagnostica Stago,
Franciaország; dRVVT Screen, Gradipore, USA) elvégzett aktivált parciális
tromboplasztin idő (aPTI) illetve protrombin idő (PT) mérés során legalább egy teszttel
a kontroll 1,1-szeresénél hosszabb időt mértünk. A kiszűrt plazmákat először keveréses
teszttel vizsgáltuk tovább. Amennyiben kevert normál plazmával 1:1 arányban keverve
nem kaptunk normál aPTI értéket, azaz a normál plazma hozzáadása nem korrigálta a
megnyúlást, a foszfolipid neutralizációs tesztekkel (Staclot LA, Diagnostica Stago és
dRVVT Confirm, Gradipore) vizsgáltuk a mintát tovább. Azok a plazmák, amelyek
esetében foszfolipid reagens hozzáadása után normál aPTI-t mértünk, vagyis a
foszfolipidek neutralizálták a lupus anticoaguláns aktivitást, megállapítható volt a
foszfolipid-specifikus lupus anticoaguláns pozitivitás.
A természetes anticoaguláns fehérjék szintjeinek mérése
A protein C (PC), protein S (PS) illetve antitrombin (AT) deficiencia okozta
protrombotikus állapotokat a betegek PC, PS és AT aktivitásának mérésével kívántuk
kiszűrni. A méréseket egy Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük gyárilag
előállított és tisztított PC (Chromogenix, Olaszország), PS (Dade Behring, USA) és AT
30
(Sigma, USA) reagensekkel. A reagensek gyártói által ajánlott alábbi normál
határértékeket jelöltük ki: a PC-re mindkét nemnél 70-149 %, a PS normál tartománya
nőknél: 59-118 %, férfiaknál: 75-130 %, az AT határértékei pedig szintén azonosak
voltak mindkét nem esetén: 50-150 %.
Az APCR meghatározása
Az ötös alvadási faktor (FV) aktivált protein C (APC) elleni rezisztenciájának
hátterében leggyakrabban az FV Leiden mutációja áll. Az általunk használt reagens
(Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milánó, Olaszország) is elsősorban az
ilyen plazmák kiszűrésére volt alkalmas. A méréseket - akárcsak a többi alvadási tesztet
- Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük. A vizsgálat elve a következő: a
betegektől származó plazmákat négyszeres mennyiségű, gyártó által biztosított FV-
hiányos plazmával hígítottuk. Ezt a keveréket 1:1 arányban elegyítettük a gyártó által
megadott, tisztított foszfolipideket és kontakt aktivátort tartalmazó aPTI-reagenssel,
majd CaCl2 hozzáadása meginduló alvadás detektálásával megmértük az aPTI-t. A
mérést megismételtük, de ezúttal a CaCl2 reagens helyett APC-t is tartalmazó CaCl2
reagenssel indítottuk az alvadást. Amennyiben az antikoaguláns hatású aktivált PC
jelentétében nem nyúlt meg kellően az aPTI, az APC elleni rezisztenciát állapíthattunk
meg. Amennyiben a két aPTI aránya 2-nél kisebb volt, az FV Leiden mutációjának
heterozigóta jelenléte volt feltételezhető, amennyiben az arány még az 1,4-et sem
haladta meg, homozigóta FV Leiden genotípusra következtethettünk.
A Leiden mutáció és a protrombin mutáció detektálása
Az V-ös faktor 10-es exonjában található G1691A, és a II-es faktor, másnéven
protrombin génjének promoter régiójában található G20210A báziskicserélődéseknek a
kimutatását DNS olvadási görbe analízissel végeztük, kereskedelmi forgalomban lévő
kitek (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) reagenseivel. A módszer lényege,
hogy a PCR technikával felszaporított V-ös illetve II-es faktor gének vizsgált
szakaszához fluoreszcens festékkel jelölt, specifikus DNS oligonukleotid próbát
hibridizáltunk alacsony hőmérsékleten, majd a reakcióelegy fokozatos melegítése
közben detektáltuk a vizsgált génszakaszokról leváló DNS-próbák – mennyiségükkel
arányos - fluoreszcens jelét. A DNS szálak alacsonyabb hőmérsékleten bekövetkező
31
szétválása, olvadása, a pontatlan összekapcsolódásra, nem teljes komplementaritásra
utalt, ami a detektálni kívánt mutációk jelenlétét igazolta.
Az V-ös faktor vizsgálata DNS szekvenálással
Az V-ös faktor két, az aktivált protein C-vel való reakciójához szükséges argininjét
(Arg 306 és Arg 679) és ezek környezetét vizsgáltuk. Az izolált DNS-ből két szakaszt
PCR reakció során felszaporítottunk. Ehhez a következő reakcióelegyet használtuk 50
µl végső reakciótérfogatban: PCR buffer 1x végkoncentrációban (Eppendorf,
Németország), dNTP mix egyenként 0,2 mM végkoncentrációban, primerek egyenként
0,3 µM végkoncentrációban (Genodia, Magyarország), 2U HotStart Taq-polimeráz
(Eppendorf, Németország), 5 µl tisztított DNS, PCR tisztaságú víz. A felhasznált
primerek szekvenciája a következő volt:
306F: 5’-GGGATGCAGGCTTACATTGAC-3’;
306R: 5’-TTCGCTGGTATTACAGGTGCAT-3’
679F: 5’-GAAGCAAAAAGCTGAGGCTGA-3’
679R: 5’-ACGAATTCAGTGCCATTCTCC-3’
A reakcióhoz az alábbi PCR programot használtuk: 95ºC 10’; 30 x (95ºC 15”, 60ºC 15”,
72ºC 30”); 72ºC 7’.
A PCR termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk, ezzel ellenőrizve a reakció
specifikusságát, majd megtisztítottuk (PCR Purification Kit, Qiagen, Németország). Ezt
követően cycle sequencing reakcióval (Cycle Seq Reaction Kit, Applied Biosystems,
USA) állítottuk elő a különböző hosszúságú fluoreszcensen jelölt oligonukleotidokat,
amelyeket ABI 310 genetikai analizátoron futtattunk.
A szekvenciák elemzéséhez az Applied Biosystems Sequence Scanner szoftverét
használtunk.
A VIII-as faktor szintjének mérése
A plazma VIII-as faktor szinteket fotometrikus úton határoztuk meg. A mérések elve az
alábbi: olyan reakcióközeget biztosítottunk Ca2+, foszfolipidek valamint aktivált IX-es
faktor kellő mennyiségű hozzáadásával, hogy a X-es faktor aktiválásának sebességét
meghatározó tényező a VIII-as faktor mennyisége illetve aktivitása lett, így a keletkező
aktivált FX mennyiségéből - amit kromogén szubsztrátjának (S-2765) hidrolízisekor
32
felszabaduló kromofór csoport színintenzitásának detektálásával követhettünk -
számolhattuk ki a plazma FVIII tartalmát. A plazma FVIII szint normál tartományát 50-
150 %-ban határoztuk meg.
A von Willebrand faktor szintjének a mérése
A von Willebrand faktor mennyiségi meghatározásakor a plazmában található von
Willebrand faktor antigén (vWF:Ag) koncentráció mellett a von Willebrand faktor
kollagén kötési aktivitását (CBA: collagen binding activity) is megmértük. Mindkét
tesztet ELISA módszerrel végeztük. A vWF:Ag szint meghatározásakor a lemezeket
anti-humán-vWF antitesttel érzékenyítettük, a CBA méréséhez pedig kollagénnel.
Ezekhez kötött ki a plazmában található összes vWF illetve a kollagént kötő aktív vWF.
Mindkét esetben anti-humán-vWF-hez konjugált tormaperoxidáz által átalakított
kromogén szubsztráttal, hatpontos kalibrációs görbe segítségével kvantifikáltuk a vWF
szintet. A normál tartomány a standard humán plazmában találhazó vWF:Ag illetve
CBA 50-150 %-a volt.
Homocisztein szint mérés
A plazma homocisztein szintek meghatározása fluoreszcens polarizációt alkalmazó
immuntechnikával (FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay) történt Abbott IMx
immunanalizátor segítségével. A vizsgálat előkészítése során a plazmában található
fehérjékben kötött vagy diszulfid-hídban szereplő homociszteineket di-tio-treitollal
szabad homocisztein alakká redukáljuk, majd az összes homociszteint átalakítjuk S-
adenozil-homociszteinné (SAH) SAH-hidroláz enzim hozzáadásával. A keletkező SAH
mennyiségét aszerint határozzuk meg, hogy milyen erős floureszcens jelet ad a SAH-val
a monoklonális ellenanyaghoz való kötésért versengő fluoreszcensen jelölt reagens. A
kvantitatív meghatározás hatpontos kalibrációs görbe alapján történt.
A szintetikus peptidek és peptidkonjugátumok citokintermelésre gyakorolt
hatásának vizsgálata
A kísérleteket humán monocita eredetű, Monomac sejtvonallal végeztük. Sejttenyésztő
lemez lyukaiba kimértük a vizsgálandó peptidkonjugátumok és a pozitív kontrollként
használt aggregált IgG különböző koncentrációjú oldatainak 100-100 µl-ét. Ehhez
33
lyukanként 200.000 sejtet mértünk. 24 órás 37 ºC-os inkubálás után meghatároztuk a
felülúszók IL-6 és TNFα szintjét.
Megvizsgáltuk azt is, hogy a peptidek monomerjei hogyan befolyásolják a sejtek
aggregált IgG hatására meginduló citokintermelését. Ebben az esetben a sejttenyésztő
lemezre kimért Monomac sejtekhez a monomer peptidek keverékének különböző
koncentrációjú oldatát mértük, majd fél óra inkubálás után adtuk az elegyhez a
citokintermelést indukáló aggregált IgG preparátumot. A peptidkeverék végső
koncentrációja az IgG-hez képest 3-, 15- és 75-szörös moláris felesleg volt. A
citokintermelést a fölülúszókból 1, 2, 4 és 24 óra után határoztuk meg.
A TNFα-termelést WEHI 164 TNF-érzékeny sejtvonal felhasználásával állapítottuk
meg. A sejtek a hozzáadott TNFα-tartalmú felülúszó hatására apoptózist szenvednek, a
citokintartalmat így a túlélő sejtek mennyiségéből határoztuk meg. Az MTT festéket az
élő sejtek mitokondriális enzimei ibolya színű formazán kristályokká alakítják, ezt SDS-
ben feloldva, majd fotometriás úton kvantifikálva megállapítható a sejtpusztulás, azaz a
TNFα mennyisége.
Az IL-6 mennyiségi meghatározását szendvics ELISA módszerrel végeztük. A lemez
érzékenyítése rekombináns anti-humán-IL-6 antitesttel történt (Biosource, USA),
második ellenanyagként pedig biotinált anti-hIL-6-ot (Biosource, USA) használtunk,
amelyhez ExtrAvidin-HRPO konjugátumot (Sigma, USA) adtunk. Végül ennek
enzimatikus aktivitásából számoltuk ki az felülúszók IL-6 szintjét, hatpontos,
rekombináns IL-6 (Biosource, USA) hígításával készült standard sor segítségével.
FcR-ok és a peptidek közti kötődés vizsgálata
A szintetikus peptidek kötődését a monociták Fc receptoraihoz áramlási
citofluorimetriás módszerrel (Beckton-Dickinson FACSCalibur készülék és CellQuest
szoftver) vizsgáltuk. A mérésekhez 500.000 Monomac sejtet használtunk. A
sejtszuszpenziókhoz hozzáadtuk a vizsgálni kívánt biotinos peptidek különböző
koncentrációjú oldatát, majd 30 perces 4 ºC-os inkubálást és mosást követően a
sejtekhez kötődött peptideket FITC-ExtrAvidin konjugátummal jelöltük. Újabb mosás
után a sejtek FITC-konjugátumtól származó fluoreszcenciájának intenzitását lemérve
következtettünk a peptidek és a sejtfelszíni receptorok kapcsolatának erősségére.
34
A gátlásra irányuló méréseink során a jelöletlen peptideket adtunk a sejtekhez, majd
biotinált aggregált IgG-t, és ez utóbbi kötődésének lemérésével állapítottuk meg, hogy a
peptidek milyen mértékben voltak képesek kiszorítani az IgG-t a sejtfelszíni receptorok
kötőhelyeiről.
Statisztikai analízis
A kapott adathalmazokat elsőként leíró statisztikával jellemeztük: átlagot, standard
deviációt számítottunk, illetve ellenőriztük az adathalmazok eloszlását. A normál
eloszlást követő változók csoportjait (pl. DNáz aktivitás) Student-féle t-teszttel
hasonlítottuk össze. A folytonos, de nem normál eloszlást követő változók (pl. az anti-
nukleoszóma antitestek koncentrációja) esetén pedig a nem-paraméteres Mann-Whitney
U-tesztet alkalmaztuk. Szignifikánsnak minősítettük a csoportok közti különbséget,
amennyiben p<0,05 értéket kaptunk.
A különböző változók közti korreláció jellemzésére Spearman-féle rangkorrelációs
koefficienst számítottunk.
A diszkrét változók analíziséhez (pl. az MBL polimorfizmusok vizsgálata) χ2-próbát
végeztünk, amelyhez a küszöbértékeket α=0,05 szignifikanciaszint szerint állapítottuk
meg.
Az éves incidenciák számításakor az események számát osztottuk az eltelt betegévek
számával. A betegévek meghatározásakor a diagnózis felállításától a vizsgálat
időpontjáig vagy a vizsgált esemény (pl. vénás trombózis) bekövetkeztéig eltelt időt
vettük figyelembe.
A kockázati tényezők erejének jellemzésére relatív kockázatot (RR: relative risk) és
esélyhányadost (OR: odds ratio) számítottunk 95 %-os konfidencia intervallumokkal.
Emelkedettnek minősítettük a kockázatot, amennyiben a konfidenciaintervallum minden
eleme 1-nél nagyobb szám volt.
Számításainkat a Microsoft Excel, Statistica 6.0 illetve MedCalc szoftverek segítségével
végeztük.
35
EREDMÉNYEK
A nukleoszóma elleni antitestek és a DNáz aktivitás SLE-ben
DNáz enzimaktivitás az SLE-s betegcsoportban
A SLE betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb DNáz-aktivitást mértünk, mint
a nem autoimmun betegektől származó kontroll szérumokban (3. ábra). A betegek
szérumában 63,75 (± 12,1) % volt a DNáz enzimaktivitás, ami a kórosan alacsony
tartományba esik. Kórosan alacsony, 70% alatti volt 75 betegnek, az SLE-s csoport 66,4
%-ának DNáz aktivitás értéke. Ezzel szemben a nem autoimmun beteg kontrollok
átlagos DNáz aktivitása 81.3 (± 9.25) % volt, és mindössze egy betegnél, ez a csoport
7.1 %-a, tapasztaltunk kórosan alacsony szintet. A kontroll és SLE-s csoport közti
különbség statisztikailag szignifikáns (p<0,001).
A nem differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő betegek csoportjának
DNáz aktivitása 64,9 (±18,2) % volt. Ez az SLE-s csoportéval közel egyezőnek
bizonyult (p=0,854), azonban a nem autoimmun kontroll betegek csoportjától sem
különbözött szignifikánsan (p=0,295).
3. ábra: DNáz enzimaktivitás a három vizsgált betegcsoportban. Az oszlopdiagramról a csoportokban mért átlagos DNáz aktivitás értékeket és szórásokat lehet leolvasni, a pontok pedig az egyes mért értékeket jelölik. Az SLE-s csoport DNáz aktivitása (63,75 ± 12,1 %) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb volt a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (81.3 ± 9.25 %), de nem különbözött (p=0,854) a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (64,9 ± 18,2 %).
20
40
60
80
100
SLE (113) UCTD (9) nem AI (14)
DN
áz a
ktiv
itás %
36
Megvizsgáltuk a betegek DNáz aktivitása és a veseérintettség közti kapcsolatot is (4.
ábra). Az SLE-s betegeket az alábbi három csoportba soroltuk: VA - aktív
vesebetegséggel élők (33 beteg); VB - korábban fellépett, de gyógyult a
vesekárosodásos betegek (18 beteg); VC - veseérintettségtől mentesek (61 beteg). A
három csoport átlagos DNáz aktivitás értékei a következők voltak: VA: 60,95 ± 11,23
%; VB: 63,5 ± 10,32 %; VC: 65,48 ± 13,04 %. Bár tendencia észrevehető, a csoportok
közötti különbség statisztikailag nem jelentős. A VA és VC csoportok, vagyis az aktív
vesebetegek és a veseérintettségtől teljesen mentesek DNáz aktivitása közötti különbség
esetében sem kaptunk szignifikáns eltérést (p=0,082), a két másik összehasonlításban (a
korábban vesebetegek aktívakkal, ill. egészségesekkel történő összevetése) pedig még
kisebb különbségeket kaptunk (VA-VB: p=0,420; ill. VB-VC: p=0,505).
4. ábra: DNáz aktivitás a teljes SLE-s csoportban (SLE; 63,75 ± 12,1 %), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (60,95 ± 11,23 %); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (63,5 ± 10,32 %); VC - veseérintettségtől mentesek (65,48 ± 13,04 %). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.
20
40
60
80
100
SLE SLE-VA SLE-VB SLE-VC
DN
áz a
ktiv
itás %
37
Antinukleoszóma antitestek (ANCSA) SLE-ben
Az SLE-s betegek szérumában magas antinukleoszóma antitest koncentrációt találtunk
(5. ábra). A csoport átlagos értéke 356,3 ± 851 IU/ml volt. A magas szórás érték is
mutatja, hogy igen tág tartományba estek az ANCSA eredmények (0-10.000 IU/ml-ig).
90 beteg (79,6 %) szérum antitest koncentrációja haladta meg a 20 IU/ml-es
küszöbértéket; közülük 58 személynek (51,3 %) az eredménye volt 100 IU/ml-nél is
magasabb, 9-nek (8 %) pedig meghaladta az 1000 IU/ml-es koncentrációt is. A nem
autoimmun kontroll csoportból mindössze egy személynél találtunk kimutatható
mennyiségű antinukleoszóma antitestet, de ennek koncentrációja sem haladta meg a 20
IU/ml-es határértéket, vagyis a kontrollok közül senki sem minősült ANCSA
pozitívnak. A kontroll csoport átlagos ANCSA szintjét 1,44 ± 2,77 IU/ml-ben
határoztuk meg, ami az SLE-s betegcsoportétól jelentősen különbözött (p<0,001).
Az UCTD betegek közül 5-nek (62,5 %) a szérumában találtunk kimutatható
mennyiségű antinukleoszóma antitestet. A csoport átlagos ANCSA titere 39,9 ± 57,7
IU/ml volt, ami az SLE betegcsoporténál szignifikánsan alacsonyabb, a kontroll
csoporténál szignifikánsan magasabb (p<0,01 mindkét esetben).
5. ábra: Antinukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a három vizsgált betegcsoportban, logaritmikus skálán ábrázolva. A csoportokban mért átlagos ANCSA titerek, ezek szórása, és az egyes mért értékek vannak feltüntetve. Az SLE-s csoport ANCSA szintje (356,3 ± 851 IU/ml) szignifikánsan (p<0,01) magasabb volt a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (39,9 ± 57,7 IU/ml) és a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (1,44 ± 2,77 IU/ml).
356,339,91,44
1
10
100
1000
10000
SLE UCTD nem AI
antit
est t
iter (
IU/m
l)
38
Az anti-nukleoszóma antitestek jelenléte és a veseérintettség kapcsolatának
vizsgálatakor összehasonlítottuk az alábbi három csoport feltűntetett ANCSA szintjeit:
VA - aktív vesebetegséggel élők: 247 ± 344 IU/ml; VB - betegek korábban fellépett, de
gyógyult vesekárosodással: 171 ± 183 IU/ml; VC - veseérintettségtől mentesek 459 ±
1120 IU/ml. A csoportok között semmilyen párosításban nem találtunk szignifikáns
különbséget (p>0,05 minden esetben) (6. ábra).
6. ábra: Anti-nukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a teljes SLE-s csoportban (SLE; 356,3 ± 851 IU/ml), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (247 ± 344 IU/ml); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (171 ± 183 IU/ml); VC - veseérintettségtől mentesek (459 ± 1120 IU/ml). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.
1
10
100
1000
10000
SLE SLE-VA SLE-VB SLE-VC
antit
est t
iter (
IU/m
l)
39
Az antinukleoszóma antitestek kapcsolata az anti-dsDNS antitestekkel és a DNáz
enzimaktivitással
Megvizsgáltuk - összesen 212 betegmintában - az ANCSA és anti-DNS antitestek
kapcsolatát egymással. Spearman-féle rangkorrelációs eljárással szignifikánsan erős
összefüggést találtunk (rs=0,744; p<0,001) (7. ábra).
7. ábra: Antinukleoszóma antitest titerek az anti-DNS antitest titerek függvényében, logaritmikus skálán feltüntetve. A két antitest koncentrációja között szignifikáns (p<0,001) korreláció tapasztalható.
Megfigyeltük azt is, hogy a betegek ANCSA pozitivitása nemcsak az anti-DNS
pozitivitással korrelál, hanem a hiszton és kromatin elleni antitestek jelenlétével is.
Szignifikáns eltolódást találtunk ugyanis (khi2-statisztikával p<0,001) az anti-hiszton
illetve anti-kromatin pozitív betegek körében az ANCSA pozitivitás irányába. Ezek
alapján az anti-hiszton vagy anti-kromatin pozitív mintákban nagyobb eséllyel találunk
antinukleoszóma antitestet is. Ez utóbbi összefüggés elsősorban az anti-DNS negatív
minták esetében (RR=2,6 CI95%=1,47-4,6) érvényesül, az anti-DNS pozitív minták
esetében nem jelentős (RR=1,11 CI95%=1,04-1,19).
1
10
100
1000
10000
1 10 100 1000 10000
anti-DNS
anti-
nukl
eosz
óma
40
A DNáz enzimaktivitás statisztikailag szignifikáns negatív korrelációt mutat a
szérumban mérhető ANCSA titer logaritmusával (p<0,01), vagyis az alacsonyabb DNáz
aktivitású betegmintákban nagyságrendekkel magasabb a nukleoszóma elleni antitestek
koncentrációja. Ezzel a megfigyeléssel egybecseng az az eredmény, amely szerint az
ANCSA pozitív betegek DNáz aktivitása szignifikánsan alacsonyabb az ANCSA
negatív betegek enzimaktivitásánál (63,3% ± 13,3% illetve 71,7% ± 13,0%; p<0,001)
(8. ábra). Érdekes, hogy - bár az antinukleoszóma és anti-DNS antitestekre való
pozitivitás egymással erősen korrelál – a fenti összefüggés az anti-DNS antitestek
esetében kevésbé markáns. Az anti-DNS pozitív betegek mintáiban is alacsonyabbnak
találtuk a DNáz enzim aktivitását, mint az anti-DNS negatívakéban (61,4% ± 14,6%
illetve 66,1% ± 13,0%, és ez a különbség is szignifikánsnak mutatkozott (p=0,028), de
kevésbé, mint a nukleoszóma elleni antitestek esetén.
8. ábra: Az ANCSA pozitív és ANCSA negatív betegek DNáz aktivitásának összehasonlítása. ANCSA pozitív betegcsoport enzimaktivitása (63,3% ± 13,3%) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb, mint az ANCSA negatív betegcsoporté (71,7% ± 13,0%).
40
50
60
70
80
90
ANCSA neg ANCSA poz
DN
áz a
ktiv
itás %
41
A DNáz aktivitás szerepe az SLE követésében
Felmerült a kérdés, hogy mennyire jól használható paraméter a DNáz aktivitás változása
a betegség aktivitásának megállapításakor a betegek követése során.
Megvizsgáltuk azt, hogy van-e korreláció a betegek szérumában mért DNáz aktivitás és
a mintavétel időpontjában meghatározott, a betegség aktivitását jellemző SLEDAI
pontértékek között. Nem volt szignifikáns a két változó közti negatív korreláció (rs=-
0,071; p=0,339), csak gyenge tendencia volt észrevehető (9.ábra).
9. ábra: DNáz aktivitás a betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékek függvényében. Nem találtunk valós korrelációt a két változó között (rs=-0,071; p=0,339).
Szemben azzal a megfigyeléssel, hogy a DNáz aktivitás nem korrelál a
betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékkel, az antinukleoszóma és anti-DNS szintek
illetve a SLEDAI közt találtunk összefüggést. Ennek a hátterében az állhat, hogy az
anti-DNS antitestek jelenléte 2 ponttal hozzájárul a SLEDAI alakulásához, éppen ezért
az anti-DNS antitestek és a SLEDAI között talált korreláció (rs=0,494; p<0,001) nem
tekinthető valósnak. Feltehetőleg az ANCSA és a SLEDAI közti szignifikáns korreláció
(rs=0,369; p<0,01) is összefügg a SLEDAI számítási módjába belekalkulált anti-DNS
antitestekkel, hiszen az ANCSA és az anti-DNS antitestek egymással erős korrelációt
mutattak (10. ábra).
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
SLEDAI
DN
áz a
ktiv
itás %
42
10. ábra: Az anti-DNS és ANCSA titerek a SLEDAI függvényében. Mindkét antitest szignifikáns (p<0,01), pozitív korrelációt mutat (rs=0,494 az anti-DNS antitestekkel és rs=0,369 az antinukleoszóma antitestekkel) a betegség aktivitását mérő SLEDAI értékekkel.
Követéses vizsgálatok
Longitudinális vizsgálattal 6 betegünk DNáz aktivitását és antitest-szintjeit követtük
azzal a céllal, hogy megfigyeljük, a teljes csoporttól függetlenül az egyes betegek
esetében hogyan alakulnak egymáshoz és a betegség aktivitásához képest a vizsgált
paraméterek (11. ábra). Nem találtunk olyan beteget, akinek az esetében a DNáz
aktivitás a betegség aktivitásával bármilyen irányú egyértelmű összefüggést mutatott
volna. Az egyik beteg esetében viszont az egymást követő mintákban erős pozitív
korrelációt mértünk a DNáz aktivitás és a két antitest mennyisége közt (rPearson=0,95 az
anti-DNS-sel és rPearson =0,66 az ANCSA-val; „F” beteg a 11. ábrán). Azt is
megfigyeltük, hogy a DNáz aktivitása nem mutatott jelentős ingadozást az azonos
személyektől különböző időpontokban vett szérumokban, az ugyanattól a személytől
származó minták szórása (6 és 9,4 % között) átlagosan 7,7 %-a volt a minták átlagának.
Ellenben, nagyobb változékonyságot tapasztaltunk az anti-DNS és antinukleoszóma
antitestek mennyiségének követése során, az anti-DNS antitestek koncentrációjának
szórása átlagosan 66,25 %-a (22,7-113,3 % közt) volt a beteg átlagos antitest-
1
10
100
1000
10000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
SLEDAI
antit
est-k
once
ntrá
ció
(IU/m
l) anti-nukleoszómaanti-DNS
43
koncentrációjának. A 6 beteg közül 3 személynél tapasztalhattunk nagyságrendbeli
változást az anti-DNS antitestek titerében a követés néhány hónapja alatt.
Megfigyelhető az is, hogy az anti-DNS és ANCSA titerek a legtöbb esetben együtt
változnak. Két olyan betegünk volt a 6-ból, akiknél a követés teljes ideje alatt erősen
pozitív, az anti-DNS értékeket többszörösen meghaladó ANCSA-t mértünk („C” és „D”
beteg a11. ábrán).
Módunkban állt a vizsgálatokba bevont 9 UCTD beteget a vizsgálattól számítva három
évig figyelemmel kísérni. Korábban megállapítottuk, hogy közülük 4 személynek volt
70 % alatti, kóros tartományba eső DNáz aktivitás értéke, egy személynek határérték-
közeli 71 %-os aktivitást mértünk, 4 betegnél pedig normál tartományba eső DNáz
aktivitást mértünk. A betegek közül egy betegnél - akinél korábban kórosan alacsony
(53,8 %) DNáz aktivitást mértünk - fejlődött ki SLE. Két betegnél - a normál aktivitású
csoportból - Sjögren szindrómát diagnosztizálhattunk, a többiek esetében nem alakult ki
az UCTD-től különböző autoimmun kórkép.
44
11. ábra: Hat SLE-s beteg DNáz, komplement (C3, C4), anti-DNS és anti-nukleoszóma szintjeinek, valamint betegségaktivitásuk változása 1-1,5 éves követésük során. A diagrammok x-tengelyén vannak feltüntetve a mintavételi dátumok (év, hónap); a baloldali y-tengelyen található az antitestek titerét jelző skála (a narancs és kék színű oszlopok mutatják a betegek anti-DNS illetve ANCSA szintjeit); a jobboldali y-tengelyen található a DNáz aktivitáshoz (sárga jelzés) és a komplement szinthez (zöld jelek: C3 és C4 szorzatának 1000, illetve egy esetben 100-szorosa) tartozó skála. Az oszlopok feletti bordó számok a mintavételkor megállapított betegségaktivitást jelző SLEDAI pontértékeket mutatják. Nem találtunk korrelációt a DNáz aktivitás és a betegségaktivitás közt, viszont az „F”-beteg esetében erős pozitív korrelációt mutat a DNáz aktivitás és az anti-DNS antitestek szintjének változása.
"A" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
2 444 9
"B" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
644 44
"D" beteg
0
40
80
120
160
200
02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
240 59 0
"F" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
624 48 8
"C" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 03.03. 03.09.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
42 2
"E" beteg
0
40
80
120
160
200
02.10. 03.06. 03.10.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)
102 0
"A" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
2 444 9
"A" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
2 444 9
"B" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
644 44
"B" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.
0
40
80
120
160
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
644 44 644 44
"D" beteg
0
40
80
120
160
200
02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
240 59 0
"D" beteg
0
40
80
120
160
200
02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
240 59 0
"F" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
624 48 8
"F" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
624 48 8
"C" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 03.03. 03.09.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
42 2
"C" beteg
0
400
800
1200
1600
2000
02.09. 03.03. 03.09.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)
42 2
"E" beteg
0
40
80
120
160
200
02.10. 03.06. 03.10.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)
102 0
"E" beteg
0
40
80
120
160
200
02.10. 03.06. 03.10.
0
40
80
120
160
200
anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)
102 0
45
A tromboembóliás események bekövetkeztének és a tromboembóliás
rizikófaktorok jelenlétének a kapcsolata SLE-s betegknél
A trombózis incidenciája SLE-ben
A 105 vizsgált lupuszos beteg közül 22-nek, vagyis 20,95 %-nak szerepel a
kórtörténetében tromboembóliás esemény. Közülük öt személynek volt csak artériás,
14-nek csak vénás trombózisa, három beteg pedig mind artériás, mind vénás epizódon
átesett már.
1335 betegév alatt 22 első tromboembóliás esemény következett be, így a vizsgált
populációban az első trombózis incidenciája 16,5 per 1000 év. A vénás események éves
előfordulása 12,4 per 1000 év volt (12. ábra), vagyis több mint kétszerese az artériás
események incidenciájának, ami 5,4 per 1000 év volt. Az artériás epizódok minden
esetben agyi események voltak, hét beteg esetében agyi mikrotrombózisok, egy betegnél
ismétlődő stroke. A vénás trombózison átesett betegek közül 14 személynek volt
mélyvénás trombózisa, egy kivétellel minden esetben az alsó végtag volt érintett.
Közülük öt betegnél visszatérő DVT-ről van szó. Két másik személynek felületi
thrombophlebitise volt, egy fiatal nő betegnek pedig agyi vénát érintő trombózisa.
12. ábra Az általunk vizsgált SLE-s csoportban előforduló vénás trombózisok éves incidenciájának összehasonlítása az átlagnépességben és egy vegyes etnikumú SLE-s populációban mért adatokkal [145].
0,1-2,5
12,4 13
0
4
8
12
16
20
24
átlagnépesség SLE populációsaját eredmény
SLE populációMok et al
inci
denc
ia10
00 é
vre
0,1-2,5
12,4 13
0
4
8
12
16
20
24
átlagnépesség SLE populációsaját eredmény
SLE populációMok et al
átlagnépesség SLE populációsaját eredmény
SLE populációMok et al
inci
denc
ia10
00 é
vre
46
Az antifoszfolipid antitestek előfordulása a vizsgált populációban
A vizsgált 105 fős SLE-s csoportból 45 beteg mintájában, vagyis a betegek 43,9 %-ánál
mutattuk ki az antifoszfolipid antitestek valamelyik altípusát.
A rutin diagnosztikában leggyakrabban vizsgált anticardiolipin antitest 22 beteg, a
csoport 21 %-ának mintájában volt kimutatható. Közülük 10 személynek csak IgG
típusú antitestje volt, 2 személynek csak IgM, a fennmaradó 10 beteg mintájában pedig
mindkét izotípusú ellenanyag jelen volt. 27 szérumban, vagyis a szérum minták 25,7 %-
ában találtunk anti-ß2-glikoprotein antitestet. 22 beteg szérumában volt anti-protrombin
antitest kimutatható, anti-foszfatidil-szerin antitestet pedig 18 szérumban találtunk. Jól
meghatározható volt a betegek egy 11 fős csoportja, akiknek mintájában kimutatható, de
a küszöbértéket meg nem haladó mennyiségű, foszfatidil-szerin elleni antitestet
detektáltunk. Az ő esetükben ELISA módszerrel semmilyen más antifoszfolipid
antitestet nem tudtunk kimutatni, mintáikat „gyengén pozitív” megjegyzéssel a
negatívak közé soroltuk.
37 plazmában, vagyis a minták 35,2 %-ában találtunk lupus anticoaguláns aktivitást.
Ezek 64,9 %-ában, azaz 24 mintában találtunk ELISA módszerrel is antifoszfolipid
antitesteket.
Megvizsgáltuk az összefüggést a szilárd fázisú és a koagulációs módszerrel kimutatható
antitestek jelenléte között. Azon betegeknél, akiknek a szérumában mind a négyféle
ELISA módszerrel kimutatott antitest jelen volt, 80 %-ban detektáltunk koagulációs
módszerrel lupus anticoagulánst. Azon betegek közül, akiknél háromféle antitestet
találtunk ELISA-val, 77,8 % volt LA pozitív. A kétféle antitestre pozitív betegek
plazmáinak 66,7 %-ban volt jelen LA. Azok közül, akiknél csak egyféle antifoszfolipid
ELISA eredménye lett pozitív, 50 % plazmájában volt kimutatható LA aktivitás. A 11
ELISA módszerrel negatívnak minősített beteg közül, akiknek a szérumában egyedül
alacsony koncentrációjú anti-foszfatidil-szerin antitestet találtunk, négy betegnek
(36,4%-nak) a plazmájában találtunk LA-t. Végül az ELISA módszerrel teljesen negatív
62 beteg közül csupán 10 személynek, azaz 16,1 %-nak a plazmájában volt LA
kimutatható.
A különböző antigénekre specifikus APA ELISA teszt típusok közül egyik sem mutatott
statisztikailag is szignifikáns, egyértelmű összefüggést a LA aktivitással, bár volt eltérés
az egyes tesztek között a lupus antikoagulánssal való együttes megjelenés arányában (3.
47
táblázat). Érdekes megfigyelés, hogy a 9 ELISA módszerrel kizárólag anti-cardiolipin
pozitivitást mutató minta közül 7 betegnél találtunk LA-t, míg az öt csak anti-
protrombin pozitív beteg közül csak egynél. Ezt a különbséget azonban statisztikailag
nem találtuk szignifikánsnak.
n RR (CI95%)* RR (CI95%) a teljes SLE-s csoportban**
LA (%)
RR (CI95%) LA-sal együtt**
a-cardiolipin 22 8,18‡
(2,95-22,71) 4,53‡
(2,26-9,07) 81,8
4,03‡ (2,06-7,86)
a-ß2-glikoprotein I 27 7,78‡
(2,82-21,44) 5,06‡
(2,39-10,71) 74,1
5,10‡ (2,58-10,1)
a-protrombin 18 5,00†
(1,58-15,80) 1,81†
(0,82-3,99) 66,7
2,91† (1,41-5,91)
a-foszfatidil-szerin 22 6,82‡
(2,38-19,52) 3,14†
(1,57-6,30) 77,3
4,31‡ (2,23-8,34)
† p<0,01 ‡ P<0,001 * az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó;
** a teljes SLE-s populáción belüli tromboembóliás kockázat
3. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott négyféle antifoszfolipid antitest (APA) és a lupus antikoaguláns (LA) együttes előfordulása, valamint tromboembóliás kockázatuk LA-tól függetlenül, illetve azzal együtt megjelenve.
Az antifoszfolipid antitestek és a trombózis kockázatának összefüggése
A vizsgált SLE-s betegcsoportban a legjelentősebb thromboembóliás kockázati
tényezőnek a - mind a szilárd fázisú (ELISA), mind a koagulációs módszerrel
kimutatott - antifoszfolipid antitestek (APA) jelenléte bizonyult (13. ábra). A 45 APA
pozitív beteg közül 18, a betegek 40%-a esett már át tromboembóliás eseményen, míg a
60 APA negatív beteg közül csak 4 személy (6,7%).
Az APA negatív csoport esélyhányadosa és relatív kockázata a teljes SLE-s
populációhoz képest szignifikánsan alacsony volt (OR=0,11 CI95%=0,03-0,35; RR=0,17
CI95%=0,06-0,46). Ezzel szemben a legmagasabb kockázatot az ELISA módszerrel
kimutatott antitestek és a LA aktivitás együttes jelenléte jelentette (OR=7,85
CI95%=2,74-22,49; RR=4,28 CI95%=2,12-8,62) (4. táblázat).
48
13. ábra: A trombózison átesett SLE-s betegek aránya négy alcsoportban aszerint, hogy kivizsgálásuk során detektálható volt-e ELISA módszerrel a szérumukban antifoszfolipid antitest (APA), illetve kimutattunk-e koagulációs módszerrel a plazmájukban lupus anticoaguláns aktivitást (LA). Jól látható, hogy a trombózison átesett betegek legnagyobb arányban (52,2 %) azok közt vannak, akiknél APA és LA is jelen volt, míg legkisebb arányban (6,7 %) az antifoszfolipid antitesttől mentes betegek között fordult elő tromboembóliás esemény. A csak LA vagy csak APA pozitív betegek csoportjaiban átmeneti értékeket kaptunk (28,6 illetve 25 %, sorrendben). Nem volt jelentős különbség az artériás és vénás események relatív kockázata között az
APA pozitív betegcsoportban. Például, az ELISA és koagulációs módszerrel is
kimutatott APA pozitív betegek esetében az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők
csoportjában tapasztalthoz képest az artériás és vénás epizódok relatív kockázata közel
azonos (RR=6,25 CI95%=1,3-30,04 illetve RR=7,5 CI95%=2,22-25,35); a csak LA
pozitívak csoportjában pedig az artériás és vénás trombózisok relatív kockázatának
értékei (RR=3,95 CI95%=1,05-14,89 és RR=3,95 CI95%=1,61-9,67) egymástól csak a
konfidencia intervallumban térnek el.
11
10
6
56
8
2
2
21
1
1
1
4
0 10 20 30 40 50 60
trombózismentes betegek
VTE
VTE és ATE
ATE
ELISA - és LA +
ELISA + és LA +
ELISA + és LA -
ELISA - és LA -
49
betegek száma RR (CI95%)* ATE VTE
nincs pozitív APA ELISA
73 3 6
egy pozitív APA ELISA
4 3,75
(0,54-26,19) 1 0
kettő pozitív APA ELISA
9 6,67
(2,02-22,04)) 1 5
három pozitív APA ELISA
9 6,67
(2,02-22,04) 2 3
négy pozitív APA ELISA
10 6,00
(1,78-20,19) 1 3
bármelyik APA ELISA pozitív 32
7,03 (2,55-19,42)
5 11
LA pozitív 37 6,49
(12,35-17,92) 6 12
APA ELISA vagy LA pozitív
24 8,13
(2,94-22,44) 5 9
APA ELISA és LA is negatív
60 1 2 3
* az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó 4. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott antifoszfolipid antitestek előfordulása, tromboembóliás relatív kockázatuk, valamint lupus antikoagulánssal való együttes megjelenésük aránya és relatív TE kockázata.
50
Egyéb, öröklött tromboembóliás rizikófaktorok előfordulása a vizsgált populációban
Az antifoszfolipid antitesteken felül, megvizsgáltuk az SLE-s csoportban más, olyan
faktorok jelenlétét is, amelyek ismert módon a normál populációban is hozzájárulnak
trombózisok illetve trombofíliás állapot kialakulásához.
FV Leiden és FII G20210A mutációk
Ezek közül a leggyakoribb az V-ös faktor Leiden-mutációja révén a faktoron kialakuló
rezisztencia az aktivált protein C hasítása ellen. Az általunk vizsgált 105 fős
betegcsoportban is ez volt a leggyakoribb öröklött defektus, 9 betegnél találtuk meg
heterozigóta, 1 betegnél pedig homozigóta formában. A heterozigóta betegek egyikénél
egy másik ismert mutációt - a protrombin gén promóter régiójában található G20210A
báziskicserélődést - is azonosítottunk, szintén heterozigóta formában. Ez utóbbi,
protrombin mutációt heterozigóta formában még egy másik betegnél is kimutattuk.
14. ábra: Olvadáspont analízis görbéje a Leiden-mutáció kimutatásához. A vad típusú allél szekvenciájára tervezett fluoreszcens próba erősebb kötődést mutat a vele tökéletesen komplementer vad DNS szálhoz, míg gyengébben a Leiden-mutációt hordozó szálhoz. A DNS minták melegítése során a Leiden-szálról alacsonyabb hőmérsékleten válik le és ad jelet a próba. Az ábrán zölddel látható a heterozigóta pozitív kontroll, szürkével a DNS-mentes negatív kontroll, narancs színnel (257-es minta) egy homozigóta Leiden-mutációt hordozó beteg görbéje, vastag kék vonallal pedig (256-os minta) egy vad típusú beteg görbéje.
51
Szerzett APCR vizsgálata
Aktivált PC elleni rezisztenciát mutattunk ki egy olyan betegnél is, akinél a Leiden
mutáció vad típusát találtuk (256-os számú minta a 14. ábrán). DNS szekvenálással
tovább vizsgáltuk a beteg V-ös faktorának további két olyan szakaszát, a 306-os és 679-
es argininek régióit, amelyek szükségesek ahhoz, hogy az APC képes legyen megkötni
és hasítani az V-ös faktort. Nem találtunk mutációt egyik vizsgált szakaszon sem.
15. ábra: DNS-szekvenálás elektroferogrammja az FV vizsgálatához. A baloldali elektroferogrammokon bekeretezett rész a 306-os, a jobboldaliakon jelölt terület a 679-es arginint kódoló bázisokat mutatja (mindkét esetben a reverz szál szekvenciája van feltüntetve). Felül a beteg, alul a vad típusú kontroll szekvenciája látható. A két szekvenciarészlet megegyező.
R306 R679
kontroll
betegminta
52
Ismert, hogy a lupus anticoaguláns jelenléte hozzájárulhat szerzett APC rezisztencia
kialakulásához. Mivel az imént említett beteg plazmájában jelentős mértékű LA
aktivitást mértünk, ennek a jelenségnek tulajdonítottuk az APC elleni rezisztenciát.
Éppen ezért megvizsgáltuk, hogy a többi LA pozitív betegnél is jelentkezik-e a fent
említett hatás. Ebből a vizsgálatból kizártuk azokat a betegeket, akiknél Leiden-
mutációt találtunk, hiszen az ő plazmájukban a mutáció következtében mértünk fokozott
APC rezisztenciát. Összehasonlítottuk tehát a Leiden-mutációra negatív betegek két
csoportjának, a LA negatívaknak és pozitívaknak az APCR értékeit (16. ábra). A LA
negatív csoportba sorolt 59 beteg átlagos APCR aránya 2,46 ± 0,28 volt, a 35 LA
pozitív beteg átlagos aránya pedig 2,39 ± 0,39. A két érték között nincsen szignifikáns
különbség (p=0,344).
16. ábra: APC rezisztenciát (APCR) jelző aPTI hányadosok az SLE-s betegek négy alcsoportjában. A legkisebb hányadost (1,29), azaz a legerősebb APCR-t a homozigóta Leiden mutációt hordozó egyetlen betegnél mértük. A 9 heterozigóta beteg plazmájában mért hányados is szignifikánsan alacsonyabb volt (1,58 ± 0,2; p<0,001), mint a Leiden-mutációt nem hordozók két csoportjáé. A Leiden negatív lupus anticoaguláns (LA) negatív és pozitív betegek hányadosai között nem volt szignifikáns különbség (2,46 ± 0,28 és 2,39 ± 0,39; p=0,344).
1,58
2,46 2,39
1,29
0
1
2
3
Leiden hom. Leiden het. Leiden - és LA - Leiden - és LA +
aPTI
APC
jele
nlét
ében
/ aP
TI A
PC n
élkü
l
53
Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS)
Megmértük a természetes anticoaguláns fehérjék aktivitását a betegek plazmáiban. A
protein C és protein S szintek vizsgálatából kihagytuk azokat a betegeket, akik tartós
coumarin antikoaguláns kezelés alatt álltak, mivel e K-vitamin anyagcserére ható szer
szedése nemcsak a K-vitamin-függő alvadási faktorok, hanem a PC és PS szintén K-
vitamint igénylő szintézisére is hat, így ezeknél a betegeknél csökkent PC és PS
szinteket mérünk. Egy betegnél találtunk kórosan alacsony, 29 %-os PC aktivitást, egy
másik betegnél pedig csökkent, 46 %-os PS aktivitást. Szintén egy betegnél mértünk
mérsékelten alacsony, 48 %-os antitrombin aktivitást.
FVIII és vWF szintek
Megmértük a plazmák VIII-as faktor és von Willebrand faktor szintjét is. 10 beteg
mintájában volt mindkét fehérje szintje és aktivitása emelkedett. 11 olyan mintát
találtunk, amelyben az FVIII aktivitásának emelkedéséhez nem társult emelkedett vWF
antigén szint, illetve aktivitás. Végül, két mintában csak a vWF szintje és aktivitása volt
emelkedett, az FVIII szint nem.
Homocisztein szint
A plazma homocisztein szintek mérésekor 20 mintában, a plazmák 19 %-ában, találtunk
15 µM feletti Hcy értéket. Közülük 6 személynél 20 µM-t is meghaladó értéket
mértünk. Érdekes megjegyezni, hogy a 6 legmagasabb Hcy szinttel rendelkező beteg
között 3 férfi és 3 nő volt. Ez szignifikáns eltolódás a nemek arányában a teljes SLE-s
csoporthoz képest (χ2 próbával p ≤ 0,001), hiszen a vizsgálatban résztvevő SLE-s
betegek mindössze 5,7 %-a férfi.
54
Az öröklött rizikófaktorok jelenlétének kapcsolata a tromboembóliás események
kialakulásával
Az öröklött tromboembóliás kockázati tényezőket vizsgálva az antifoszfolipid antitestek
esetében számítottnál mérsékeltebb hatást tapasztaltunk.
FV Leiden és FII G20210A mutációk
A Leiden-mutáció tromboembóliás kockázatot jelentő hatását csak az antifoszfolipid
negatív SLE-s betegek csoportjában tudtuk kimutatni (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34;
RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), az antifoszfolipid pozitív betegcsoportban nem bizonyult
statisztikailag számottevő tényezőnek (OR=1,36 CI95%=0,17-10,84; RR=1,18
CI95%=0,41-3,39). Érdekes, hogy nem szenvedett el trombózist sem a Leiden mutációra
homozigóta beteg, sem az a személy, akinél heterozigóta formában a Leiden mutáció
mellett a protrombin G20210A mutáció is jelen van. A protrombin G20210A mutációja
ebben a populációban – feltehetően alacsony előfordulása miatt – nem hordozott
statisztikailag is szignifikánsan magas tromboembóliás kockázatot (OR=3,9
CI95%=0,23-65,05; RR=2,45 CI95%=0,58-10,33).
Természetes anticoaguláns fehérjék
Nem szenvedett el trombózist az a három beteg, akiknél valamelyik természetes
antikoaguláns fehérje (PC, PS vagy AT) csökkent aktivitását mértük. Nem volt jelentős
különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás eseményektől mentes
csoport átlagos AT aktivitása közt sem (114,0 % ± 24,9 % illetve 105,1 % ± 33,2 %
sorrendben, p=0,256).
FVIII és vWF
Négy személynek volt trombózisa azon 11 beteg közül, akiknek a plazmájában
emelkedett FVIII és vWF szinteket mértünk. Az FVIII szint akár a von Willebrand
faktorral együtt, vagy attól függetlenül megemelkedett szintje enyhén, statisztikailag
nem szignifikáns mértékben emelkedett kockázatot hordozott (OR=2,3 CI95%=0,79-
6,67; RR=1,87 CI95%=0.87-3.99 az FVIII emelkedése esetén; OR=2,41 CI95%=0,64-
9,14; RR=1,9 CI95%=0,78-4,6 a FVIII és vWF együttes emelkedése esetén). Nem volt
szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás
55
eseményektől mentes csoport átlagos vWF antigén szintje között (118,4 % ± 53,6 %
illetve 98,1 % ± 41,9 % sorrendben, p=0,109).
kockázati tényező trombózisos
csoport n=22
trombózistól mentes csoport
n=83
RR (CI 95%)
lupus antikoaguláns 16
(72.7%) 21
(25.3%) 4.90
(2.10-11.45)
antifoszfolipid antitestek ELISA-val
15 (68.2%)
17 (20.5%)
4.89 (2.21-10.83)
FV Leiden mutáció 4
(18.2%) 6
(7.2%)
n.sz. 2.11
(0.89-5.02)
FII G20210A mutáció 1
(4.5%) 1
(1.2%)
n.sz. 2.45
(0.58-10.33)
emelkedett FVIII és von Willebrand faktor szintek
4 (18.2%)
6 (7.2%)
n.sz. 2.11
(0.89-5.02)
emelkedett homocisztein szint 6
(27.3%) 14
(16.9%)
n.sz. 1.59
(0.71-3.55)
antitrombin deficiencia 0 1 -
alacsony protein C szint 0 1 -
alacsony protein S szint 0 1 -
nincs kimutatott kockázati tényező
1 (4.5%)
35 (42.2%)
0.09 (0.01-0.65)
5. táblázat: A vizsgált tromboembóliás kockázati tényezőkhöz társuló trombózisos esetek száma, valamint a trombózis kialakulására vonatkozó relatív kockázati (RR) értékek 95 %-os konfidencia intervallummal (CI95%).
56
Homocisztein szint
Hat betegnek volt trombózisa a 20 közül, akiknek a plazmájában 15µM feletti Hcy
szintet mértünk. Közülük két személynek volt artériás és vénás tromboembóliás
epizódja is, egy beteg csak artériás, három pedig csak vénás eseményen esett át.
Vizsgálatunk során így a 15 µM feletti Hcy szint nem bizonyult szignifikáns trombózis
kockázati tényezőnek (OR=1,85 CI95%=0,62-5,55; RR=1,59 CI95%=0,71-3,55). Nem volt
szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás
eseményektől mentes csoport átlagos plazma Hcy szintje között sem (12,2 ± 4,3 µM
illetve 11,5 ± 4,6 µM sorrendben, p=0,534).
Az APAk és az öröklött tromboembóliás kockázati tényezők együttes hatása
Felmerül a kérdés, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenléte jelentette magas
tromboembóliás kockázatot hogyan emeli egy második, öröklött kockázati tényező.
Megvizsgáltuk, hogy az antifoszfolipid antitest pozitívak csoportján belül mekkora
kockázatot viselnek az APA mellett Leiden mutációval, emelkedett FVIII vagy Hcy
szinttel élő betegek. A számértékek nem mutattak jelentős kockázatemelkedést (5.
táblázat). Amennyiben az ilyen kombinált eltéréssel rendelkezőknek az APA negatívak
csoportjával szemben mutatott relatív kockázatát hasonlítottuk össze az APA pozitív
csoport ugyanezen értékével, akkor sem találunk jelentős különbséget.
RR (CI95%) az APA pozitív csoporton belül
RR (CI95%) az APA negatív csoporthoz viszonyítva
APA 1 7,03
(2,55-19,42)
APA + FVL 1,3 (0,53-3,18)
7,5 (2,17-25,91)
APA + Hcy 1,35 (0,63-2,86)
7,5 (2,42-23,25)
APA + FVIII és vWF 1,6 (0,70-3,63)
9,0 (2,75-29,49)
6. táblázat: Az antifoszfolipid antitestekhez társuló gyakoribb kockázati tényezők hatása trombózis kialakulásának relatív kockázatára (RR 95 %-os konfidencia intervallummal CI95%). Látható, hogy egyik kombináció esetében sem kapunk az első sorban szereplő, a teljes APA pozitív csoportra vonatkozó értéktől szignifikánsan eltérő kockázatot.
57
A különböző rizikófaktorok között az antifoszfolipid antitestek meghatározó szerepét
mutatja az a tény, hogy az emelkedett Hcy szinttel rendelkező, APA negatív betegek
közük 8,3 %-nak volt trombózisa, míg az emelkedett Hcy szinttel és APA-val
rendelkezők közül 62,5 %-nak. Hasonló különbséget kaptunk a többi rizikófaktorral
rendelkező – az emelkedett plazma FVIII szintű és a Leiden-mutációt hordozó - betegek
esetében is (17. ábra).
17. ábra: A tromboembóliás eseményen már átesett betegek aránya a rizikófaktorok szerinti csoportokban: a Leiden-mutációt hordozók (Leiden), a magas VIII-as faktor (FVIII) illetve magas homocisztein (Hcy) szinttel élők, és – az antifoszfolipid antitesteken (APA-n) kívül - semmilyen kimutatott rizikót nem viselők (-) körében. A kék oszlopok jelzik azt, hogy a rizikófaktor szerinti csoporton belül az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők mekkora hányada szenvedett el már trombózist; mellettük a piros oszlopok ugyanezt az arányt jelzik az antifoszfolipid pozitív betegek körében. A piros és kék oszlopok közti különbség szemléletesen mutatja az antifoszfolipid antitestek hozzájárulását a trombózisok kockázatához. Csak a kék oszlopokat megfigyelve a három rizikótényező (Leiden, Hcy és FVIII) protrombotikus hatásának erősségét hasonlíthatjuk össze.
0
20
40
60
80
Leiden FVIII Hcy -
trom
bózi
son
átes
ette
k ar
ánya
(%) APA negatívak
APA pozitívak
58
Az FcR-ok gátlásának vizsgálata
Az Fc receptorok fontos szerepet töltenek be az antitestek és immunkomplexek
hatásainak - úgy, mint a gyulladásoscitokin-termelés serkentése vagy a
trombocitaaktiváció - közvetítésében az SLE patogenezise során. Későbbi esetleges
terápiás alkalmazás céljával megvizsgáltuk, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal
előidézhetőek-e az immunkomplexek által kiváltott hatások, valamint, hogy monomer
peptidekkel (18. ábra) gátolhatóak-e ugyanezek.
18. ábra Az IgG molekula szerkezete, a vizsgált peptidek elhelyezkedése a molekulán, valamint szekvenciájuk.
RP 255RTPEVTC(Acm)VVVDVSHEDP271
KS 288KTKPREQQYNS298
PV 230PAPELLGGPSV240
könnyűlánc
nehézlánc
FabFab
kapocsrégió
az általunk vizsgált régió
CH2 domén
könnyűlánc
nehézlánc
FabFab
kapocsrégió
az általunk vizsgált régió
CH2 domén
59
A peptidek kötődése az Fc receptorokhoz
Áramlásos citometriás eljárással mértük meg, hogyan kötődnek az IgG Fc régiójából
származó szintetikus peptidek a monociták sejtfelszíni Fc receptoraihoz. A biotinnal
konjugált peptideket FITC-avidines jelöléssel vizsgáltuk. A peptidek szekvenciánként
eltérő mértékben kötöttek a receptorokhoz (19. ábra). A kötődés dózisfüggőnek
mutatkozott.
19. ábra: a biotinált RP, PV és KS peptidek összehasonlítása monocita sejtek Fc receptoraihoz kötődésük szempontjából; legerősebb kötődést a bRP peptid mutatta. x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.
IC-kötés gátlása
Bár kimutattuk a vizsgált Fc régióból származó peptidek receptorhoz való kötődését,
nem sikerült gátolni ezekkel az immunkomplexeket modellező fluoreszcensen jelölt
IgG-aggregátumok monocitákhoz való kötődését, még 125-szörös relatív peptidfelesleg
mellett sem (20. ábra).
negatív kontroll
bRPbPVbKS
IgG kontroll
60
20. ábra: az RP jelű IgG Fc peptid nem gátolja, még 125-szörös feleslegben sem az aggregált IgG sejtfelszíni Fc receptorhoz kötődését; az IgG mennyisége 0,16nmol/500.000 sejt, az RP peptidé az IgG mellett 20, 5, illetve 0,8 nmol volt; x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.
Peptidkonjugátumok citokintermelést indukáló hatása
Megvizsgáltuk, hogy az IgG Fc részéből származó szintetikus peptidkonjugátumok
hogyan hatnak a monociták Fc receptorok által közvetített effektor funkciójára, a
citokintermelésre. A három, az IgG Fc-fragment receptorkötő régiójából származó
szintetikus peptidet biotinnal konjugáltunk, majd ezeket avidinnel kötöttük össze. Az
így kapott konjugátumok - hasonlóan a kötődésvizsgálatok során tapasztaltakhoz –
szekvenciáktól függően eltérő mértékben váltottak ki IL-6 és TNF-α termelést a vizsgált
humán monocita sejtvonalon.
negatív kontroll
IgG kontroll
125xpeptidfelesleg
25xpeptidfelesleg
5xpeptidfelesleg
61
Monomer peptidek gátló hatása
Megvizsgáltuk, hogy a peptidek monomer formában képesek-e versengeni az
komplexben lévő IgG-vel a receptorok kötőhelyeiért, így gátolva az immunkomplexek
citokintermelést indukáló hatását.
Elsőként a három különböző szakasznak megfelelő peptideket vizsgáltuk az aggregált
IgG-vel szemben, a legnagyobb koncentrációban 30-szoros feleslegben. Nem
tapasztaltunk gátló hatást a monocitákon sem az IL-6, sem a TNF-α termelés esetében
sem.
Kipróbáltuk az Fc régió három különböző pontjáról származó peptidek keverékét is, az
aggregált IgG-vel szemben legnagyobb koncentrációban egyenként 75-szörös
feleslegben. Nem tapasztaltunk gátlást a hozzáadott immunkomplexek IL-6-termelést
indukáló hatásával szemben. Sikerült viszont gátolni a peptidkeverékkel a monociták
TNF-α-termelését.
21. ábra: IgG Fc peptidkeverék gátló hatása az immunkomplex által kiválott TNF termelésre a stimulálást követő különböző időpontokban lemérve.
[TNF] mg/ml
2,5·106
2·106
1,5·106
106
5·105
1 óra 2 óra 24 óra
+ kontroll
75x peptidfelesleg
15x peptidfelesleg
3x peptidfelesleg
62
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
A DNáz aktivitással kapcsolatos megfigyeléseink alátámasztják más szerzők korábbi
állításait, miszerint az SLE-s betegek szérumában a DNáz enzim aktivitása alacsonyabb,
mint az egészséges személyek szérumában mérhető enzimaktivitás [42, 146].
Ezt a megállapítást kiegészítettük azzal, hogy a csökkent DNáz aktivitás az SLE-hez
hasonló UCTD tünetegyüttes fellépése során is megfigyelhető. Az UCTD-s betegek 3
éves követése során azt tapasztaltuk, hogy közülük mindössze egy betegnél alakult ki
SLE; ennél a betegnél a korábbi mérések során alacsony DNáz aktivitást mértünk.
Sajnos ez nem elegendő információ ahhoz, hogy eldönthessük, a csökkent DNáz
aktivitás előre jelezheti-e az UCTD betegeknél a későbbi SLE kialakulását.
A csökkent DNáz aktivitás eredetére eddig még nem született pontos magyarázat. Az
egyik elmélet szerint az enzimet kódoló DNASE1 gén 2-es exonjában található mutáció
lenne a felelős az alacsonyabb enzimaktivitásért [48]. E mutáció előfordulási
gyakorisága azonban igen alacsony [146-149], így nem adhat magyarázatot az SLE-s
betegek mintegy kétharmadának a szérumában mérhető csökkent DNáz aktivitásra.
Ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre egy esetleges – valószínűleg antitest
jellegű - enzim-inhibitor kimutatott működéséről. Néhány tanulmány alátámasztja
[150], mások cáfolják [42, 146] egy DNáz ellenes antitestek jelenlétét a betegek
szérumában.
A DNáz enzim fiziológiás funkcióját magyarázó elméletek alapján ésszerű volna azt
feltételezni, hogy az enzim mérsékelt aktivitása hozzájárul az SLE-s betegek esetében
glomerulonephritis kialakulásához. Ennek laboratóriumi alátámasztása volna, ha a
veseérintettséggel küzdő SLE-s betegekben alacsonyabb lenne a DNáz aktivitás.
Méréseink szerint azonban az enzim aktivitása nem különbözik meggyőzően, vagyis
statisztikailag szignifikáns mértékben az aktív vesebeteg és a veseérintettségtől mentes
SLE-s alcsoportok között, azaz vizsgálatunk nem támasztotta alá a DNáz enzim szerepét
a veseérintettség kialakulásának folyamatában. Amennyiben a fenti összefüggés az
enzim aktivitása és a glomerulonephritis kialakulása közt fennállna, és a DNáz
aktivitása genetikai tényezők befolyása miatt volna alacsonyabb, nemcsak az aktív,
hanem a gyógyult vesebeteg csoportban is alacsonyabb DNáz aktivitást kellene
tapasztalnunk. A gyógyult vesebetegek és a veseérintettségtől mentes SLE-s betegek
63
közt azonban még kisebb volt a különbség. Adataink alapján kizárható, hogy az SLE-s
betegek veseérintettségének kialakulását a DNáz enzim genetikai rendellenessége
okozza, vagy jelentős mértékben befolyásolja.
Vizsgálataink során az SLE-s betegek közel 80%-ának szérumában találtunk anti-
nukleoszóma antitesteket. Más tanulmányok eredményei széles tartományban 37,5-100
% szórnak [26, 151-153], de minden esetben megállapítják a nukleoszóma elleni
antitestek megjelenését SLE-ben. Bár az ANCSA szérumbeli koncentrációja és a
betegség aktivitása között találtunk szignifikáns korrelációt, ez valószínűleg csak
következménye a nukleoszóma és a DNS elleni antitestek megjelenése közti erős
összefüggésnek. A betegség aktivitását ugyanis SLEDAI pontértékekkel jellemeztük,
amely indexnek egyik összetevője az anti-DNS antitestek jelenléte. Ellentmondó
adatokat közöltek más szerzők ebben a tárgyban is; egyesek megerősítik [152, 153],
mások cáfolják [26, 151, 154] az ANCSA és a betegség aktivitása közti korrelációt. A
negatív eredményt közlők közül többen a betegség aktivitását más pontrendszerekkel
kvantifikálták, például az ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement)
vagy a SLAM (Systemic Lupus Activity Measure) értékeket figyelembe véve [26, 151].
Érdekes, hogy ezek között a jelen dolgozatban megfogalmazott eredményekkel
ellentmondani látszó vizsgálatok között olyan is van, amely során ugyanazt a vizsgálati
módszert és reagenseket használták a szerzők [26], mint vizsgálatunk során. Ennek az
ellentmondásnak a magyarázatául ismét az eltérő betegségaktivitási-pontrendszerek
alkalmazása hozható fel.
A nukleoszómák és az ellenük termelődő antitestek, valamint a nukleoszómák
eltávolításában szerepet játszó DNáz a keringésben dinamikus egyensúlyban vannak.
Egy korábbi publikáció szerint [154] azok a szérumok, amelyekben magas nukleoszóma
antigén koncentrációt találtak, egyben alacsony antinukleoszóma antitest szinttel
rendelkeztek. A szerzők magyarázata szerint a nukleoszóma elleni antitestek az
immunkomlexek képzése révén hozzájárulnak a nukleoszómák keringésből történő
eltávolításához. Az említett tanulmány nem vizsgálja a DNáz enzim aktivitását, amely
ebben a megvilágításban az antinukleoszóma antitestekkel versengve degradálja a
keringésben megtalálható nukleoszómákat. Megfigyelésünk, amely szerint az ANCSA
titerek és a DNáz enzim aktivitása negatív korrelációt mutatnak, ennek a korábban
közölt elméletnek nem mond ellent.
64
A DNáz enzimmel kapcsolatos vizsgálatok összegzéseként elmondható, hogy bár a
DNáz enzim csökkent aktivitása az SLE-nek jellemzője, laboratóriumi paraméterként
nem alkalmas a betegség aktivitásának követésére, vagy veseérintettség előrejelzésére.
A betegségre jellemző gyulladásos folyamatok és az antifoszfolipid antitestek jelenléte a
keringésben az SLE betegeket a trombózis szempontjából magas rizikójú csoportba
helyezik. A különböző tromboembóliás események – mind az artériás, mind a vénás
epizódok – gyakrabban, és fiatalabb korban jelentkeznek az SLE betegek körében.
Mivel a cardiovascularis megbetegedések az európai népesség körében vezető
halálozási okok, nem meglepő, hogy az európai SLE-s populációban is a trombózisokat
találták – az aktív lupusz és az infekciós szövődmények mellett – a leggyakoribb
haláloknak [155].
Az általunk vizsgált SLE betegek körében az artériás és vénás tromboembóliás
események incidenciája 5,4 és 12,4 volt ezer betegévre vetítve. Egy korábbi tanulmány,
amely 625 SLE beteg adatait dolgozta fel, hasonló gyakoriságot talált a vénás
események előfordulásában, de magasabbat az artériás epizódok esetében [145]. Ennek
a különbségnek magyarázata lehet, hogy az említett tanulmányban három különböző
etnikai csoporthoz tartozó betegek szerepeltek, köztük ázsiaiak, afro-amerikaiak, és
kaukázusiak, amíg a mi populációnk kaukázusi betegekből állt. A három különböző
etnikumú SLE-s betegcsoport összehasonlításakor az artériás események
legalacsonyabb, és a vénás események legmagasabb előfordulási arányát a három közül
a 227 kaukázusi betegből álló csoportban mérték. Ezek a gyakoriságok az általunk
megállapítottakhoz hasonlóak voltak.
Az általunk vizsgált SLE-s csoportból a betegek 21 %-ának volt már valamilyen
formában trombózisa. Hasonló etnikai, nem- és korösszetételű betegcsoporttal végzett
felmérések ezt a hányadot 20 és 37 % között mérték [156, 157]. Egy 1000 európai SLE-
s beteg adatait elemző vizsgálat során a 10 éves követési idő alatt a betegek 9,2 %-a
esett át trombózison [155]. A trombózison átesett betegeink átlagos életkora az epizód
bekövetkeztekor az artériás illetve vénás trombózisok esetében is alacsonyabb volt (40,1
és 33,1 év; sorrendben), mint az általános populációban tapasztalt [158, 159], de nem
különbözött az antifoszfolipid szindrómás populációban mérttől (35,0 és 34,5 év;
sorrendben) [160].
65
Egy eset kivételével minden trombózison átesett betegnél találtunk kimutatható
kockázati tényezőt, vagy tényezőket. Így megállapíthatjuk, hogy a tromboembóliás
rizikófaktorokkal rendelkezők körében jóval magasabb volt a trombózis incidenciája
(25,5 per 1000 betegév), mint a kockázati tényezővel nem rendelkezők esetében (2 per
1000 betegév). Ez utóbbi adat hozzávetőleg egyező a normál populációra jellemző
értékkel.
Külön-külön megvizsgálva az egyes trombofíliára hajlamosító tényezőket,
megállapítottuk, hogy az SLE-s populációban ezek közül a legnagyobb mértékben az
antifoszfolipid antitestek jelenléte járul hozzá a tromboembóliás események
előidézéséhez.
Megállapítottuk, hogy az SLE-s betegek több mint egyharmadának a plazmájában
kimutatható lupus anticoaguláns aktivitás, illetve a betegek 17-26 %-ának mintájában
jelen vannak a különböző szilárd fázisú módszerrel vizsgált antifoszfolipid antitestek.
Ezek az arányok nem térnek el a mások által korábban megállapítottaktól [156, 157,
161-169]. Azok a betegek, akiknek a keringésében ezek közül az antitestek közül
valamelyik megtalálható, a tromboembóliás események bekövetkezésére 4-8-szoros
kockázattal élnek SLE-s betegtársaikhoz képest.
Az antitestek közül az anti-ß2-glikoprotein I, az anti-cardiolipin, a lupus antikoaguláns,
illetve ezek együttes előfordulása jelentette a legmagasabb kockázatot a trombózis
kialakulására. Ezzel szemben az anti-protrombin antitestek csak mérsékelt hatást
mutattak. A cardiolipin és ß2-GPI elleni antitestek és a trombózis kialakulásának
kapcsolatát többen bizonyították, és az anti-protrombin antitest pozitivitás alacsonyabb
klinikai értékéről is található már adat [168, 169].
Amennyiben az anti-foszfolipidekhez más kockázati tényezők is járulnak ez a kockázat
tovább emelkedhet. Azon betegek közül, akiknek az esetében az antifoszfolipid
antitestek egyetlen kimutatott kockázati tényezőként jelentkeztek, 30 %-nak volt
trombózisa, míg azok közül, akinek az esetében további rizikófaktorok is kimutathatóak
voltak, 50 % ez az arány. Azon betegek közül, akiknél semmilyen rizikófaktort nem
tudtunk detektálni, mindössze egy személynek volt trombózisa, szemben a csupán
antifoszfolipid antitesttel rendelkezők 30 %-ával. Ez az összehasonlítás is az
antifoszfolipid antitestek erős trombózis kialakulását elősegítő hatását mutatja.
Alátámasztandó az antifoszfolipidek jelentőségét a trombózis kialakulása során, illetve
66
az egyes kockázati tényezők együttes hatásának erejét, mérlegeljük azt, hogy az
antifoszfolipid antitestek az emelkedett homocisztein vagy VIII-as faktor szinthez,
illetve APC rezisztenciához társulva 2-5-szörösre emelik az adott rizikófaktorral együtt
élő betegek körében a trombózison átesettek arányát.
Pontosan a foszfolipidek elleni antitestek erős hatása miatt a többi vizsgált kockázati
tényező esetében az SLE-s populáción belül nem tudtuk alátámasztani azoknak a teljes
populációban jelentős tromboembóliás kockázatot jelentő hatását. Példaként
megemlíthető, hogy számításaink alapján az APA negatív SLE-sek körében a Leiden-
mutáció többszörös kockázati tényezőnek bizonyult (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34;
RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), ez jól látszik a viszonylag alacsony elemszám miatti tág
konfidencia-intervallum ellenére is; ezzel szemben az APA pozitívak körében ez a hatás
teljesen elhanyagolhatónak mutatkozott (OR=1,36 CI95%=0,17-10,84; RR=1,18
CI95%=0,41-3,39).
Az általunk vizsgált SLE-s betegcsoportban az FV Leiden és protrombin G20210A
mutációk előfordulási gyakorisága hasonló volt a magyarországi népességen végzett
egyéb tanulmányok eredményeihez [100-102]. Érdekes megjegyezni, hogy a Leiden
mutáció gyakorisága hazánkban az európai átlagnál magasabb. A két említett mutáció
elterjedését leíró vizsgálatok azt az érdekes eredményt hozták, miszerint a Leiden
mutáció Európában északról dél felé, és nyugatról kelet felé egyre nagyobb előfordulási
gyakoriságot mutat, míg a protrombin mutáció kiemelkedően magas elterjedtségét az
Ibériai-félsziget népességében írták le [98, 170].
Emelkedett (150 % feletti) FVIII szintet a trombózison átesett betegeink körében
mintegy kétszer gyakrabban találtunk, mint a trombózistól mentes SLE-s betegek közt
(32 és 17 %). Hasonló arányt, de valamivel alacsonyabb előfordulást (25 és 11 %) közöl
egy korábbi tanulmány 301-301 az átlagpopulációból kiválasztott trombózisos beteg és
egészséges kontroll személy vizsgálata után [111].
Mérsékelten emelkedett homocisztein szinteket a trombózisos és attól mentes betegeink
27 és 17 %-ánál találtunk. Egy korábbi, az átlagpopuláció hasonló csoportjainak Hcy
szintjét összehasonlító vizsgálat 29 és 12 %-ot állapított meg [171]. Bár több adat
született arról, hogy SLE-ben a betegek plazma Hcy szintje magasabb, mint az
egészséges kontrolloké, van olyan vizsgálat, amely kiemeli, hogy az SLE-s betegeknek
67
csupán a kardiovaszkuláris megbetegedésekkel küzdő csoportjának értékei emelkednek
szignifikánsan a normál populációban mért szintek fölé [172].
Mivel a különböző deficienciák, amelyek a trombózis kialakulását előidézik, a
koagulációs rendszer más-más elemét érintik, eltérő lehet a hozzájuk kötődő
tromboembóliás epizód klinikai képe is. Például, a négy heterozigóta FV-Leiden-
mutációt hordozó beteg, akiknek volt már trombózisa, minden esetben vénás
tromboembólián esett át. Ezzel szemben az az öt beteg, akiknél emelkedett
homocisztein szint és lupus anticoaguláns együttes előfordulását találtuk a trombózis
hátterében, három artériás és négy vénás epizódot is elszenvedett. Ez utóbbi betegeknél
az artériás trombózis relatív kockázata magasabb volt, mint a vénás eseményeké
(OR=9,1 CI95%= 1,74-47,5 illetve 5,11 CI95%=1,21-21,53; RR=6,4 CI95%=1,82-22,51
illetve 3,28 CI95%=1,35-7,98). Az antifoszfolipidekkel összefüggésben viszont
megállapíthatjuk, hogy nem volt eltérés az APA pozitív és APA negatív csoportok
között az artériás és vénás epizódok eloszlásában.
Két olyan beteget találtunk, akiknél szuperficiális thrombophlebitis alakult ki.
Mindkettejük esetében a lupus anticoaguláns volt az egyetlen kimutatható trombózisra
hajlamosító tényező. Bár ez a rendellenesség gyakran jelentkezik gyulladásos
állapotokkal együtt, az említett két betegnek a thrombophlebitis kialakulásának idején
inaktív volt az SLE-je.
Egy fiatal nőbetegünknél, akinek tromboembóliás rizikófaktora a magas
koncentrációban jelenlévő összes vizsgált antifoszfolipid-antitest és a lupus
anticoaguláns volt, agyi vénás sinus trombózis alakult ki. Korábbi esetek ismertek az
irodalomban, ahol fiatal betegek agyi sinusában fellépő tromboembólia hátterében a
lupus anticoaguláns áll [173, 174].
A vizsgált betegcsoportban bekövetkezett tromboembóliás események körülbelül
harmada (az artériás események 25 %-a, a vénás epizódok 35,3 %-a) az SLE
diagnózisát követő két éven belül következett be. További egyharmad (az artériás
események 37,5 %-a, a vénás epizódok 29,4 %-a) a diagnózist követő második és
tizedik év között, míg a fennmaradó harmad (az artériás események 37,5 %-a, a vénás
epizódok 35,3 %-a) következett be a betegség tizedik éve után. Ezek az adatok arra
utalnak, hogy a tromboembóliák – mind az artériás, mind a vénás események – az SLE
korai manifesztációi közé tartoznak.
68
Ismert, hogy a gyulladást- és trombocitaaktivációt gátló készítmények - mint az acetil-
szalicilsav származékai - egyben a trombóziskészséget is mérsékelik, mivel gátolják a
trombociták aggregációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Ilyen hatása volna az
aktiváló Fcγ receptorokat gátló vegyületeknek is.
Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint a
peptidkonjugátumok koncentrációfüggő módon, egymástól eltérő, és az
immunkomplexektől elmaradó mértékben képesek kötődni a receptorokhoz és kiváltani
monocita effektor funkciókat, mint például a gyulladásos citokinek termelése.
A peptidek konjugálatlan, szabad formában nem gátolták sem az immunkomplexek
FcR-okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvezítette IL-6 termelését. Egyedül a
TNFα termelést voltunk képesek gátolni az IgG Fc régiójából származó peptidekkel.
69
ÖSSZEFOGLALÁS
A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az
egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest
termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek
kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok
megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok
még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és
értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az
SLE rutin diagnosztikájában.
Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek
jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus
nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum
antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az
SLE-s populációban és ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok
bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az
ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5)
annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek
és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek,
elsősorban az SLE kezelésében.
Eredményeim szerint, az SLE-s betegek szérumában a nem autoimmun betegekéhez
képest szignifikánsan alacsonyabb a DNáz enzim aktivitása. Ez azonban nem áll
összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a betegség során kialakuló
vesekárosodással, ezért nincs klinikai jelentősége a betegek követése során.
A DNáz aktivitás negatív korrelációt mutat a betegek antinukleoszóma antitest
szintjével. Ez a megfigyelés alátámasztja azt az elképzelést, amely szerint a DNáz
enzim csökkent működése hozzájárul a DNS, nukleoszóma, illetve más
kromatinstruktúrák elleni tolerancia áttörésében, és az autoimmun folyamatok
megjelenésében.
A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer gyakoribbnak találtam a trombózis
incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva. Kimutattam, hogy SLE-ben elsősorban a
70
betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid antitestek
megjelenése vezet ehhez a kiemelkedő tromboembóliás rizikóhoz.
A klasszikus, jobbára öröklött trombofília tényezők az antifoszfolipid antitestek mellett
csak mérsékelten járultak hozzá a trombózisok kialakulásához, ezért a trombofília
vizsgálatok rutinszerű bevezetése a tromboembóliás tünetektől mentes autoimmun
betegeknél nem indokolt.
Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint
peptidkonjugátumokkal kiválthatók monocita effektor funkciók. Konjugálatlan,
monomer formában azonban a peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-
okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló
hatással voltak a TNFα termelésre. Az általunk vizsgált peptidpreparátumoknak ebben a
formában nincs farmakológiai jelentőségük.
71
IRODALOMJEGYZÉK
1. Johnson, A.E., et al., The prevalence and incidence of systemic lupus
erythematosus in Birmingham, England. Relationship to ethnicity and country of birth. Arthritis Rheum, 1995. 38(4): p. 551-8.
2. Stahl-Hallengren, C., et al., Incidence studies of systemic lupus erythematosus in Southern Sweden: increasing age, decreasing frequency of renal manifestations and good prognosis. J Rheumatol, 2000. 27(3): p. 685-91.
3. Uramoto, K.M., et al., Trends in the incidence and mortality of systemic lupus erythematosus, 1950-1992. Arthritis Rheum, 1999. 42(1): p. 46-50.
4. Hopkinson, N.D., M. Doherty, and R.J. Powell, The prevalence and incidence of systemic lupus erythematosus in Nottingham, UK, 1989-1990. Br J Rheumatol, 1993. 32(2): p. 110-5.
5. Cooper, G.S., et al., Differences by race, sex and age in the clinical and immunologic features of recently diagnosed systemic lupus erythematosus patients in the southeastern United States. Lupus, 2002. 11(3): p. 161-7.
6. Hart, H.H., R.R. Grigor, and D.E. Caughey, Ethnic difference in the prevalence of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 1983. 42(5): p. 529-32.
7. Sarzi-Puttini, P., et al., Drug-induced lupus erythematosus. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 507-18.
8. Stratton, M.A., Drug-induced systemic lupus erythematosus. Clin Pharm, 1985. 4(6): p. 657-63.
9. James, J.A., et al., An increased prevalence of Epstein-Barr virus infection in young patients suggests a possible etiology for systemic lupus erythematosus. J Clin Invest, 1997. 100(12): p. 3019-26.
10. Dror, Y., et al., Systemic lupus erythematosus associated with acute Epstein-Barr virus infection. Am J Kidney Dis, 1998. 32(5): p. 825-8.
11. Gross, A.J., et al., EBV and systemic lupus erythematosus: a new perspective. J Immunol, 2005. 174(11): p. 6599-607.
12. Gergely, P., Jr., et al., Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and cross-reactivity with immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous retroviral autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol, 2005. 116(2): p. 124-34.
13. Zandman-Goddard, G. and Y. Shoenfeld, Infections and SLE. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 473-85.
14. Cutolo, M., et al., Sex hormones influence on the immune system: basic and clinical aspects in autoimmunity. Lupus, 2004. 13(9): p. 635-8.
15. Rider, V. and N.I. Abdou, Gender differences in autoimmunity: molecular basis for estrogen effects in systemic lupus erythematosus. Int Immunopharmacol, 2001. 1(6): p. 1009-24.
16. Petri, M., Exogenous estrogen in systemic lupus erythematosus: oral contraceptives and hormone replacement therapy. Lupus, 2001. 10(3): p. 222-6.
17. Lahita, R.G., The role of sex hormones in systemic lupus erythematosus. Curr Opin Rheumatol, 1999. 11(5): p. 352-6.
18. Ostensen, M., Sex hormones and pregnancy in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci, 1999. 876: p. 131-43; discussion 144.
72
19. Tan, E.M., et al., The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982. 25(11): p. 1271-7.
20. Bombardier, C., et al., Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum, 1992. 35(6): p. 630-40.
21. Blatt, N.B. and G.D. Glick, Anti-DNA autoantibodies and systemic lupus erythematosus. Pharmacol Ther, 1999. 83(2): p. 125-39.
22. Burlingame, R.W. and R. Cervera, Anti-chromatin (anti-nucleosome) autoantibodies. Autoimmun Rev, 2002. 1(6): p. 321-8.
23. Pisetsky, D.S., Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity. Clin Diagn Lab Immunol, 1998. 5(1): p. 1-6.
24. Tozzoli, R., et al., Guidelines for the laboratory use of autoantibody tests in the diagnosis and monitoring of autoimmune rheumatic diseases. Am J Clin Pathol, 2002. 117(2): p. 316-24.
25. von Muhlen, C.A. and E.M. Tan, Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum, 1995. 24(5): p. 323-58.
26. Cairns, A.P., et al., Antinucleosome antibodies in the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 2003. 62(3): p. 272-3.
27. Amoura, Z., et al., Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue diseases: antinucleosome antibodies of the IgG3 subclass are markers of renal pathogenicity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(1): p. 76-84.
28. Amoura, Z., S. Koutouzov, and J.C. Piette, The role of nucleosomes in lupus. Curr Opin Rheumatol, 2000. 12(5): p. 369-73.
29. Tang, S., S.L. Lui, and K.N. Lai, Pathogenesis of lupus nephritis: an update. Nephrology (Carlton), 2005. 10(2): p. 174-9.
30. Kewalramani, R. and A.K. Singh, Immunopathogenesis of lupus and lupus nephritis: recent insights. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2002. 11(3): p. 273-7.
31. Houssiau, F.A., Management of lupus nephritis: an update. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(10): p. 2694-704.
32. Font, J., et al., Clusters of clinical and immunologic features in systemic lupus erythematosus: analysis of 600 patients from a single center. Semin Arthritis Rheum, 2004. 33(4): p. 217-30.
33. Brugos, B., et al., Retrospective analysis of patients with lupus nephritis: data from a large clinical immunological center in hungary. Scand J Immunol, 2006. 64(4): p. 433-7.
34. Van Bruggen, M.C., C. Kramers, and J.H. Berden, Autoimmunity against nucleosomes and lupus nephritis. Ann Med Interne (Paris), 1996. 147(7): p. 485-9.
35. Spronk, P.E., et al., Anti-dsDNA production coincides with concurrent B and T cell activation during development of active disease in systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol, 1996. 104(3): p. 446-53.
36. Herrmann, M., et al., What triggers anti-dsDNA antibodies? Mol Biol Rep, 1996. 23(3-4): p. 265-7.
37. Bruns, A., et al., Nucleosomes are major T and B cell autoantigens in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(10): p. 2307-15.
38. Berden, J.H., et al., Lupus nephritis: a nucleosome waste disposal defect? J Nephrol, 2002. 15 Suppl 6: p. S1-10.
73
39. Walport, M.J., Lupus, DNase and defective disposal of cellular debris. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 135-6.
40. Suck, D. and C. Oefner, Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA. Nature, 1986. 321(6070): p. 620-5.
41. MacLea, K.S., R.J. Krieser, and A. Eastman, Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease IIalpha. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 292(2): p. 415-21.
42. Chitrabamrung, S., R.L. Rubin, and E.M. Tan, Serum deoxyribonuclease I and clinical activity in systemic lupus erythematosus. Rheumatol Int, 1981. 1(2): p. 55-60.
43. Lachmann, P.J., Lupus and desoxyribonuclease. Lupus, 2003. 12(3): p. 202-6. 44. Napirei, M., et al., Features of systemic lupus erythematosus in Dnase1-deficient
mice. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 177-81. 45. Macanovic, M., et al., The treatment of systemic lupus erythematosus (SLE) in
NZB/W F1 hybrid mice; studies with recombinant murine DNase and with dexamethasone. Clin Exp Immunol, 1996. 106(2): p. 243-52.
46. Lachmann, P.J., Experimental aspects of systemic lupus erythematosus. Proc R Soc Med, 1967. 60(5): p. 464-5.
47. Davis, J.C., Jr., et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis. Lupus, 1999. 8(1): p. 68-76.
48. Yasutomo, K., et al., Mutation of DNASE1 in people with systemic lupus erythematosus. Nat Genet, 2001. 28(4): p. 313-4.
49. Sullivan, K.E., Genetics of systemic lupus erythematosus. Clinical implications. Rheum Dis Clin North Am, 2000. 26(2): p. 229-56, v-vi.
50. Wong, M. and B.P. Tsao, Current topics in human SLE genetics. Springer Semin Immunopathol, 2006.
51. Harley, J.B., et al., The genetics of human systemic lupus erythematosus. Curr Opin Immunol, 1998. 10(6): p. 690-6.
52. Vyse, T.J. and B.L. Kotzin, Genetic susceptibility to systemic lupus erythematosus. Annu Rev Immunol, 1998. 16: p. 261-92.
53. Schur, P.H., Genetics of systemic lupus erythematosus. Lupus, 1995. 4(6): p. 425-37.
54. Atkinson, J.P., Complement activation and complement receptors in systemic lupus erythematosus. Springer Semin Immunopathol, 1986. 9(2-3): p. 179-94.
55. Walport, M.J., K.A. Davies, and M. Botto, C1q and systemic lupus erythematosus. Immunobiology, 1998. 199(2): p. 265-85.
56. Jonsen, A., et al., Analysis of HLA DR, HLA DQ, C4A, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, MBL, and IL-1Ra allelic variants in Caucasian systemic lupus erythematosus patients suggests an effect of the combined FcgammaRIIa R/R and IL-1Ra 2/2 genotypes on disease susceptibility. Arthritis Res Ther, 2004. 6(6): p. R557-62.
57. Truedsson, L., et al., Sharing of MHC haplotypes among patients with systemic lupus erythematosus from unrelated Caucasian multicase families: disease association with the extended haplotype [HLA-B8, SC01, DR17]. J Rheumatol, 1995. 22(10): p. 1852-61.
58. Mok, C.C. and C.S. Lau, Pathogenesis of systemic lupus erythematosus. J Clin Pathol, 2003. 56(7): p. 481-90.
74
59. Tsutsumi, A., R. Takahashi, and T. Sumida, Mannose binding lectin: genetics and autoimmune disease. Autoimmun Rev, 2005. 4(6): p. 364-72.
60. Garred, P., et al., Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun, 2001. 2(8): p. 442-50.
61. Seelen, M.A., et al., A role for mannose-binding lectin dysfunction in generation of autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(1): p. 111-9.
62. Ohlenschlaeger, T., et al., Mannose-binding lectin variant alleles and the risk of arterial thrombosis in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 2004. 351(3): p. 260-7.
63. Berken, A. and B. Benacerraf, Properties of antibodies cytophilic for macrophages. J Exp Med, 1966. 123(1): p. 119-44.
64. Ravetch, J.V. and S. Bolland, IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 275-90.
65. Daeron, M., Fc receptor biology. Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 203-34. 66. Takai, T., Roles of Fc receptors in autoimmunity. Nat Rev Immunol, 2002. 2(8):
p. 580-92. 67. Hogarth, P.M., Fc receptors are major mediators of antibody based
inflammation in autoimmunity. Curr Opin Immunol, 2002. 14(6): p. 798-802. 68. Manger, K., et al., Fcgamma receptor IIa, IIIa, and IIIb polymorphisms in
German patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms. Ann Rheum Dis, 2002. 61(9): p. 786-92.
69. Hazenbos, W.L., et al., Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996. 5(2): p. 181-8.
70. Stefanescu, R.N., et al., Inhibitory Fc gamma receptors: from gene to disease. J Clin Immunol, 2004. 24(4): p. 315-26.
71. Taylor, S.M., et al., Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human Fc gamma RIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor. Blood, 2000. 96(13): p. 4254-60.
72. Egeberg, O., Inherited Antithrombin Deficiency Causing Thrombophilia. Thromb Diath Haemorrh, 1965. 13: p. 516-30.
73. Chowdhury, V., et al., Homozygous antithrombin deficiency: report of two new cases (99 Leu to Phe) associated with arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost, 1994. 72(2): p. 198-202.
74. Kuhle, S., et al., Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism. Thromb Haemost, 2001. 86(4): p. 1007-11.
75. Perry, D.J. and R.W. Carrell, Molecular genetics of human antithrombin deficiency. Hum Mutat, 1996. 7(1): p. 7-22.
76. Tait, R.C., et al., Prevalence of antithrombin deficiency in the healthy population. Br J Haematol, 1994. 87(1): p. 106-12.
77. Bucciarelli, P., et al., Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance: a multicenter collaborative family study. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999. 19(4): p. 1026-33.
75
78. Harper, P.L., et al., The incidence of dysfunctional antithrombin variants: four cases in 210 patients with thromboembolic disease. Br J Haematol, 1991. 77(3): p. 360-4.
79. Bayston, T.A. and D.A. Lane, Antithrombin: molecular basis of deficiency. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 339-43.
80. Lane, D.A., et al., Antithrombin mutation database: 2nd (1997) update. For the Plasma Coagulation Inhibitors Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost, 1997. 77(1): p. 197-211.
81. Griffin, J.H., et al., Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest, 1981. 68(5): p. 1370-3.
82. Schwarz, H.P., et al., Plasma protein S deficiency in familial thrombotic disease. Blood, 1984. 64(6): p. 1297-300.
83. Comp, P.C., et al., Familial protein S deficiency is associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest, 1984. 74(6): p. 2082-8.
84. Broekmans, A.W., J.J. Veltkamp, and R.M. Bertina, Congenital protein C deficiency and venous thromboembolism. A study of three Dutch families. N Engl J Med, 1983. 309(6): p. 340-4.
85. Reitsma, P.H., Protein C deficiency: from gene defects to disease. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 344-50.
86. Reitsma, P.H., et al., Protein C deficiency: a database of mutations, 1995 update. On behalf of the Subcommittee on Plasma Coagulation Inhibitors of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost, 1995. 73(5): p. 876-89.
87. Millar, D.S., et al., Molecular genetic analysis of severe protein C deficiency. Hum Genet, 2000. 106(6): p. 646-53.
88. Aiach, M., et al., Protein C and protein S deficiencies. Semin Hematol, 1997. 34(3): p. 205-16.
89. Gandrille, S., et al., Protein S deficiency: a database of mutations--summary of the first update. Thromb Haemost, 2000. 84(5): p. 918.
90. Miletich, J., L. Sherman, and G. Broze, Jr., Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med, 1987. 317(16): p. 991-6.
91. Dykes, A.C., et al., A study of Protein S antigen levels in 3788 healthy volunteers: influence of age, sex and hormone use, and estimate for prevalence of deficiency state. Br J Haematol, 2001. 113(3): p. 636-41.
92. Seligsohn, U., et al., Homozygous protein C deficiency manifested by massive venous thrombosis in the newborn. N Engl J Med, 1984. 310(9): p. 559-62.
93. Williamson, D., et al., Factor V Cambridge: a new mutation (Arg306-->Thr) associated with resistance to activated protein C. Blood, 1998. 91(4): p. 1140-4.
94. Bertina, R.M., et al., Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature, 1994. 369(6475): p. 64-7.
95. Dahlback, B., M. Carlsson, and P.J. Svensson, Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(3): p. 1004-8.
96. Rosendaal, F.R., et al., High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood, 1995. 85(6): p. 1504-8.
76
97. Ruggeri, M., et al., Factor V Leiden mutation carriership and venous thromboembolism in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Am J Hematol, 2002. 71(1): p. 1-6.
98. Lucotte, G. and G. Mercier, Population genetics of factor V Leiden in Europe. Blood Cells Mol Dis, 2001. 27(2): p. 362-7.
99. Herrmann, F.H., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in various populations. Genet Epidemiol, 1997. 14(4): p. 403-11.
100. Balogh, I., et al., High prevalence of factor V Leiden mutation and 20210A prothrombin variant in Hungary. Thromb Haemost, 1999. 81(4): p. 660-1.
101. Pongracz, E., et al., [Significance of Factor V gene A506G mutation (Leiden) in the pathogenesis of ischemic stroke]. Ideggyogy Sz, 2003. 56(5-6): p. 157-64.
102. Stankovics, J., et al., [Incidence of factor V G1681A (Leiden) mutation in samplings from the Hungarian population]. Orv Hetil, 1998. 139(19): p. 1161-3.
103. Jun, Z.J., et al., Prevalence of factor V Leiden and prothrombin G20210A mutations in Chinese patients with deep venous thrombosis and pulmonary embolism. Clin Lab Haematol, 2006. 28(2): p. 111-6.
104. Pepe, G., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in non-European populations. Thromb Haemost, 1997. 77(2): p. 329-31.
105. Kim, Y.W., et al., Absence of factor V Leiden mutation in Koreans. Thromb Res, 1997. 86(2): p. 181-2.
106. Franco, R.F., et al., The prevalence of factor V Arg306-->Thr (factor V Cambridge) and factor V Arg306-->Gly mutations in different human populations. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 312-3.
107. Poort, S.R., et al., A common genetic variation in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood, 1996. 88(10): p. 3698-703.
108. Bertina, R.M., Elevated clotting factor levels and venous thrombosis. Pathophysiol Haemost Thromb, 2003. 33(5-6): p. 395-400.
109. Ceelie, H., et al., Polymorphisms in the prothrombin gene and their association with plasma prothrombin levels. Thromb Haemost, 2001. 85(6): p. 1066-70.
110. Kyrle, P.A., et al., High plasma levels of factor VIII and the risk of recurrent venous thromboembolism. N Engl J Med, 2000. 343(7): p. 457-62.
111. Koster, T., et al., Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet, 1995. 345(8943): p. 152-5.
112. Cattaneo, M., Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 165-76.
113. Harpel, P.C., X. Zhang, and W. Borth, Homocysteine and hemostasis: pathogenic mechanisms predisposing to thrombosis. J Nutr, 1996. 126(4 Suppl): p. 1285S-9S.
114. Brattstrom, L., et al., Hyperhomocysteinaemia in stroke: prevalence, cause, and relationships to type of stroke and stroke risk factors. Eur J Clin Invest, 1992. 22(3): p. 214-21.
115. Haim, M., et al., Serum Homocysteine and Long-Term Risk of Myocardial Infarction and Sudden Death in Patients with Coronary Heart Disease. Cardiology, 2006. 107(1): p. 52-56.
116. Falcon, C.R., et al., High prevalence of hyperhomocyst(e)inemia in patients with juvenile venous thrombosis. Arterioscler Thromb, 1994. 14(7): p. 1080-3.
77
117. den Heijer, M., et al., Hyperhomocysteinemia as a risk factor for deep-vein thrombosis. N Engl J Med, 1996. 334(12): p. 759-62.
118. Frosst, P., et al., A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet, 1995. 10(1): p. 111-3.
119. Legnani, C., et al., Hyperhomocyst(e)inemia and a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation (Ala223Val MTHFR) in patients with inherited thrombophilic coagulation defects. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(11): p. 2924-9.
120. Schmitz, C., et al., Genetic polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and myocardial infarction. A case-control study. Circulation, 1996. 94(8): p. 1812-4.
121. Choumenkovitch, S.F., et al., In the cystathionine beta-synthase knockout mouse, elevations in total plasma homocysteine increase tissue S-adenosylhomocysteine, but responses of S-adenosylmethionine and DNA methylation are tissue specific. J Nutr, 2002. 132(8): p. 2157-60.
122. Kelly, P.J., et al., Stroke in young patients with hyperhomocysteinemia due to cystathionine beta-synthase deficiency. Neurology, 2003. 60(2): p. 275-9.
123. Mudd, S.H., et al., Homocystinuria: An Enzymatic Defect. Science, 1964. 143: p. 1443-5.
124. Di Minno, G., et al., Homocysteine, platelet function and thrombosis. Haematologica, 1999. 84 Suppl EHA-4: p. 61-3.
125. Esmon, C.T., The impact of the inflammatory response on coagulation. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 321-7.
126. Shebuski, R.J. and K.S. Kilgore, Role of inflammatory mediators in thrombogenesis. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 300(3): p. 729-35.
127. Giesen, P.L., et al., Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(5): p. 2311-5.
128. Nawroth, P.P. and D.M. Stern, Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J Exp Med, 1986. 163(3): p. 740-5.
129. Bevilacqua, M.P., et al., Interleukin 1 (IL-1) induces biosynthesis and cell surface expression of procoagulant activity in human vascular endothelial cells. J Exp Med, 1984. 160(2): p. 618-23.
130. Eilertsen, K.E. and B. Osterud, Tissue factor: (patho)physiology and cellular biology. Blood Coagul Fibrinolysis, 2004. 15(7): p. 521-38.
131. Rezende, S.M., R.E. Simmonds, and D.A. Lane, Coagulation, inflammation, and apoptosis: different roles for protein S and the protein S-C4b binding protein complex. Blood, 2004. 103(4): p. 1192-201.
132. Espinosa, G., et al., Antiphospholipid syndrome: pathogenic mechanisms. Autoimmun Rev, 2003. 2(2): p. 86-93.
133. Singh, A.K., Immunopathogenesis of the antiphospholipid antibody syndrome: an update. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2001. 10(3): p. 355-8.
134. Field, S.L., et al., Recent insights into antiphospholipid antibody-mediated thrombosis. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol, 1999. 12(3): p. 407-22.
135. Rand, J.H., The antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 2003. 54: p. 409-24.
78
136. Borrell, M., et al., Immunoglobulin fractions isolated from patients with antiphospholipid antibodies prevent the inactivation of factor Va by activated protein C on human endothelial cells. Thromb Haemost, 1992. 68(3): p. 268-72.
137. Mori, T., et al., beta 2-Glycoprotein I modulates the anticoagulant activity of activated protein C on the phospholipid surface. Thromb Haemost, 1996. 75(1): p. 49-55.
138. Rand, J.H., Antiphospholipid antibody-mediated disruption of the annexin-V antithrombotic shield: a thrombogenic mechanism for the antiphospholipid syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 107-11.
139. Wolberg, A.S. and R.A. Roubey, Mechanisms of autoantibody-induced monocyte tissue factor expression. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 391-6.
140. Kornberg, A., et al., Induction of tissue factor-like activity in monocytes by anti-cardiolipin antibodies. J Immunol, 1994. 153(3): p. 1328-32.
141. Cuadrado, M.J., et al., Thrombosis in primary antiphospholipid syndrome: a pivotal role for monocyte tissue factor expression. Arthritis Rheum, 1997. 40(5): p. 834-41.
142. Reverter, J.C., et al., Hypercoagulable state in patients with antiphospholipid syndrome is related to high induced tissue factor expression on monocytes and to low free protein s. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996. 16(11): p. 1319-26.
143. Reverter, J.C., et al., Effects of human monoclonal anticardiolipin antibodies on platelet function and on tissue factor expression on monocytes. Arthritis Rheum, 1998. 41(8): p. 1420-7.
144. Meroni, P.L., et al., Endothelial activation by aPL: a potential pathogenetic mechanism for the clinical manifestations of the syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 237-40.
145. Mok, C.C., et al., Incidence and risk factors of thromboembolism in systemic lupus erythematosus: a comparison of three ethnic groups. Arthritis Rheum, 2005. 52(9): p. 2774-82.
146. Tew, M.B., et al., A molecular analysis of the low serum deoxyribonuclease activity in lupus patients. Arthritis Rheum, 2001. 44(10): p. 2446-7.
147. Balada, E., et al., DNASE I mutation and systemic lupus erythematosus in a Spanish population: comment on the article by Tew et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(7): p. 1974-6; author reply 1976-7.
148. Chakraborty, P., et al., The A/T mutation in exon 2 of the DNASE1 gene is not present in Tunisian patients with systemic lupus erythematosus or in healthy subjects. Arthritis Rheum, 2003. 48(11): p. 3297-8.
149. Simmonds, M.J., et al., A nonsense mutation in exon 2 of the DNase I gene is not present in UK subjects with systemic lupus erythematosus and Graves' disease: Comment on the article by Rood et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(11): p. 3109-10.
150. Yeh, T.M., et al., Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus. J Biomed Sci, 2003. 10(5): p. 544-51.
151. Benucci, M., et al., Disease activity and antinucleosome antibodies in systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2003. 32(1): p. 42-5.
152. Min, D.J., et al., Anti-nucleosome antibody: significance in lupus patients lacking anti-double-stranded DNA antibody. Clin Exp Rheumatol, 2002. 20(1): p. 13-8.
79
153. Simon, J.A., et al., Anti-nucleosome antibodies in patients with systemic lupus erythematosus of recent onset. Potential utility as a diagnostic tool and disease activity marker. Rheumatology (Oxford), 2004. 43(2): p. 220-4.
154. Amoura, Z., et al., Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation with serum antinucleosome antibody titers and absence of clear association with disease activity. Arthritis Rheum, 1997. 40(12): p. 2217-25.
155. Cervera, R., et al., Morbidity and mortality in systemic lupus erythematosus during a 10-year period: a comparison of early and late manifestations in a cohort of 1,000 patients. Medicine (Baltimore), 2003. 82(5): p. 299-308.
156. Brouwer, J.L., et al., The contribution of inherited and acquired thrombophilic defects, alone or combined with antiphospholipid antibodies, to venous and arterial thromboembolism in patients with systemic lupus erythematosus. Blood, 2004. 104(1): p. 143-8.
157. Afeltra, A., et al., Thrombosis in systemic lupus erythematosus: congenital and acquired risk factors. Arthritis Rheum, 2005. 53(3): p. 452-9.
158. Nordstrom, M., et al., A prospective study of the incidence of deep-vein thrombosis within a defined urban population. J Intern Med, 1992. 232(2): p. 155-60.
159. Anderson, F.A., Jr., et al., A population-based perspective of the hospital incidence and case-fatality rates of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. The Worcester DVT Study. Arch Intern Med, 1991. 151(5): p. 933-8.
160. Erkan, D., et al., A cross-sectional study of clinical thrombotic risk factors and preventive treatments in antiphospholipid syndrome. Rheumatology (Oxford), 2002. 41(8): p. 924-9.
161. Shapiro, S.S., The lupus anticoagulant/antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 1996. 47: p. 533-53.
162. Galli, M. and T. Barbui, Prevalence of different anti-phospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus and their relationship with the antiphospholipid syndrome. Clin Chem, 2001. 47(6): p. 985-7.
163. Love, P.E. and S.A. Santoro, Antiphospholipid antibodies: anticardiolipin and the lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders. Prevalence and clinical significance. Ann Intern Med, 1990. 112(9): p. 682-98.
164. Palomo, I., et al., Antiphospholipid antibodies in Chilean patients with systemic lupus erythematosus. J Lab Clin Med, 2002. 140(5): p. 336-41.
165. Radway-Bright, E.L., C.T. Ravirajan, and D.A. Isenberg, The prevalence of antibodies to anionic phospholipids in patients with the primary antiphospholipid syndrome, systemic lupus erythematosus and their relatives and spouses. Rheumatology (Oxford), 2000. 39(4): p. 427-31.
166. Amoroso, A., et al., Safety of conventional drugs and biologic agents for Rheumatoid Arthritis. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2003. 7(5): p. 139-45.
167. Caccavo, D., et al., Raynaud's phenomenon and antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus: is there an association? Ann Rheum Dis, 2003. 62(10): p. 1003-5.
168. Sebastiani, G.D., et al., Anticardiolipin and anti-beta2GPI antibodies in a large series of European patients with systemic lupus erythematosus. Prevalence and
80
clinical associations. European Concerted Action on the Immunogenetics of SLE. Scand J Rheumatol, 1999. 28(6): p. 344-51.
169. Gould, T., et al., Prevalence and clinical correlates of anti-phospholipid antibodies in South Africans with systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2006. 35(1): p. 29-34.
170. Rees, D.C., M. Cox, and J.B. Clegg, World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995. 346(8983): p. 1133-4.
171. Simioni, P., et al., Hyperhomocysteinemia and deep-vein thrombosis. A case-control study. Thromb Haemost, 1996. 76(6): p. 883-6.
172. Svenungsson, E., et al., Risk factors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation, 2001. 104(16): p. 1887-93.
173. Levine, S.R., et al., Cerebral venous thrombosis with lupus anticoagulants. Report of two cases. Stroke, 1987. 18(4): p. 801-4.
174. Levy, D.M., et al., Thromboembolism in paediatric lupus patients. Lupus, 2003. 12(10): p. 741-6.
81
SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent közlemények Scandinavian Journal of Rheumatology: Thrombosis Risk in Systemic Lupus Erythematosus: the Role of Thrombophilia Risk Factors (accepted for publication) Sallai K, Nagy E, Bodó I, Mohl A, Gergely P Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Jan;12(1):56-9.: Antinucleosome antibodies and decreased deoxyribonuclease activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus Sallai K, Nagy E, Derfalvy B, Muzes G, Gergely P Eur J Immunol. 2004 Apr;34(4):1127-35.: Functional mapping of the Fc gamma RII binding site on human IgG1 by synthetic peptides Medgyesi D, Uray K, Sallai K, Hudecz F, Koncz G, Abramson J, Pecht I, Sarmay G, Gergely J Az értekezés témájához kapcsolódó, de abban nem szereplő közlemény Magyar Immunológia 3, 16-21 (2004): SS-A(Ro) és SS-B(La) autoantitestek előfordulása szisztémás lupus erythematosusban Sallai K, Nagy E, Gergely P.
82
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Tisztelettel köszönöm Prof. Gergely Péternek, téma- és programvezetőmnek, valamint
Prof. Mandl Józsefnek, a Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola vezetőjének a
lehetőséget a doktori munkám és dolgozatom elkészítésére.
Hálásan köszönöm dr. Nagy Eszter és dr. Bodó Imre áldozatos segítségét, számos
tanácsát és állandó támogatását közös munkánk során.
Sokszor köszönöm Berczeliné Sarus Renáta, Benák Tiborné, Homályné Herbály
Mária, Kissné Szabó Katalin, Móricz Gyöngyi, Nagy Edit, Pósa Zsolt, dr. Szabó Teréz,
Szegedi Sándorné, dr. Szilágyi Jánosné, a SE Központi Immunológiai Laboratórium
dolgozóinak - nem csupán szakmai – segítségét,
valamint dr. Mohl Adrienn Ph.D. hallgatónak segítségét és barátságát.
Nagy szeretettel köszönöm szüleim és egész családom megértő támogatását.
Köszönettel tartozom továbbá az etiópiai és brazil kávétermesztőknek, akik nélkül
dolgozatom sosem készült volna el.