67348048 relatorio 6 estudo cinetico da invertase da levedura

2010/2011

17 de Maio de 2011

1.º Ano - 2.º Semestre

Alunas:

Andreia Sousa

n.º 40261

Alexandra Salvado

n.º 40267

Bioquímica I

Estudo cinético da invertase da levedura

2 Estudo cinético da invertase da levedura

17 de Maio de 2011

Resumo

Este trabalho laboratorial teve como objectivos estudar a cinética do

enzima invertase (beta-fructofuranosidase) na reacção de hidrólise da sacarose

e a determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx. Pretendeu-se também

comparar a velocidade da reacção de hidrólise da sacarose num ensaio com

actividade enzimática e outro sem actividade enzimática.

No estudo cinético do invertase utilizou-se uma solução de enzima de

concentração 1,0 U/mL, a qual foi preparada por diluição de uma solução stock

1mg/mL, usando tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M. Após a sua preparação, a

solução de enzima foi mantida a uma temperatura próxima de 0ºC.

No ensaio com actividade enzimática, o reagente de Nelson foi

adicionado 10 minutos após a adição do invertase; como desactivador da

acção enzimática; aos tubos do segundo ensaio, o reagente de Nelson foi

adicionado antes da adição do enzima.

Os parâmetros cinéticos, Vmáx e Km, foram obtidos a partir da

construção de um gráfico das velocidades iniciais em função da concentração

de sacarose. Para a obtenção dos valores das velocidades iniciais

determinaram-se as diferentes concentrações de oses redutores produzidas

durante um intervalo de 10 minutos. Estes parâmetros foram calculados por 4

métodos diferentes e no final foi eleito o mais eficiente. Para a obtenção dos

valores e dos gráficos destes parâmetros cinéticos, foi utilizado um programa

de computador, Hyper.

Os valores obtidos de Km e Vmáx não correspondem ao esperado, sendo

que o valor de Km desta enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve

um valor de Km = – 9,482 ± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da

constante de Michaelis obtida, é maior do que o esperado, Vmáx = 3,93 ±

9,722. Este facto é devido às altas absorvâncias medidas para a hidrólise total

e a sua diferença para as absorvâncias medidas para a hidrólise não


17 de Maio de 2011

enzimática, uma vez que a diferença é grande, altas absorvâncias

correspondem a velocidades inicias altas pela equação deduzida

anteriormente:

Segundo a apresentação destes gráficos e valores de Km e Vmáx, o

método mais rigoroso foi o método directo, uma vez que por todos

apresentarem um valor negativo, o mais próximo do valor da literatura foi o

calculado por este método. O menos rigoroso será sempre o método de

Lineweaver-Burk, uma vez que os parâmetros utilizados na construção do

gráfico são o inverso dos valores obtidos, assim, os valores de erro reduzido

são apresentados com erro grande e os valores de erro maior são

apresentados com erro diminuído.

Aferiu-se que estes resultados obtidos resultaram de erros experimentais

que podiam estar relacionados com a preparação da solução de enzima, com a

preparação do reagente de Nelson, com o período de incubação, com os

valores de absorvância e com as condições do meio – pH e temperatura,

principalmente.


17 de Maio de 2011

Registo e discussão dos resultados

Cálculo da concentração exacta das várias soluções de

invertase preparadas

Preparação das soluções

Solução de invertase 1,0 U/mL

Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):

E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH 7,5) 0,01M,

obtendo então a concentração de:

Solução de invertase 2,5 U/mL

Deve retirar-se à solução anterior (à de 50 mL):

E perfazer-se a solução até aos 25 mL com tampão Tris-HCl (pH7,5) 0,01M,

obtendo então a concentração de:


17 de Maio de 2011

Medições

Cada grupo ficou com uma dada concentração de invertase para

preparar (1,0 ou 2,5 U/mL). O nosso grupo preparou a solução de 1,0U/mL.

Concentração teórica da solução de invertase 1,0 U/mL

Concentração exacta da solução de invertase preparada

Para determinar a concentração exacta da solução de enzima preparada

utilizou-se a fórmula correspondente à lei de Beer-Lambert ( ). Sendo a

absorvância, o coeficiente de absorção molar ao comprimento de onda

utilizado e o percurso óptico, ou seja, a largura da cuvette.

Para esta medição da absorvência da solução preparada utilizou-se a

cuvette de quartzo devido ao comprimento de onda utilizado, uma vez que a

280 nm é a cuvette que menos absorve, como é visível no quadro abaixo

(Quadro 1).

Quadro 1. Gama de aplicação das cuvettes de acordo com o seu tipo de material.

Gama Espectral Material Gama de Aplicação

Visível Plástico 340-800 nm

Vidro 334-2500 nm

UV Quartzo 170-2600 nm


17 de Maio de 2011

Concentração exacta:

Concentração esperada:

A concentração exacta foi bastante mais elevada do que a concentração

esperada. Isto vai resultar em absorvâncias altas, como se verá mais à frente no

relatório.

Base de actuação do reagente de Nelson

O cobre presente no reagente de Nelson é reduzido pelos glícidos

redutores (glicose e frutose) em meio alcalino e quente. A forma reduzida do

sal de cobre actua sobre o reactivo arsenomolibdato determinando o

aparecimento de cor azul, cuja intensidade é proporcional ao teor de glícidos

redutores da solução. Sob a acção do calor os glícidos redutores decompõem-

se parcialmente em fragmentos oxidáveis pelo hidróxido cuproso existente no

reagente de Nelson, resultando em ácido etanodióico, ácido propanodióico,

entre outros. Nesta reacção o hidróxido de cobre (azul) reduz-se a hidróxido

cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o hidróxido cuproso perde

uma molécula de água, transformando em óxido cuproso (vermelho). O óxido

cuproso assim formado, vai reduzir o reagente de arsenomolibdato dando o

óxido de molibdénio (MO3O8) de coloração azul, cuja intensidade é

proporcional a quantidade de glícidos redutores existentes na amostra, que

pode ser determinada espectrofotometricamente a 510 nm.

O invertase, como todos os enzimas, apresenta um pH óptimo de

actuação, onde apresenta uma actividade elevada, o seu intervalo de actuação


17 de Maio de 2011

de pH é entre 3,5-5,5, sendo o pH óptimo 4,5, a 55ºC. Se o enzima não se

encontrar em solução, a hidrólise da sacarose ocorre facilmente se o meio for

ácido.

Tendo por base estes factores, podemos deduzir que o reagente de

Nelson altera o pH da solução, basificando-o, inibindo a actuação do enzima.

Este facto deve-se à alteração do estado de ionização de um grupo funcional

do enzima, independentemente da existência do tampão de acetato de sódio,

pois este não tem capacidades de neutralizar uma base tão forte. A alteração

dos estados iónicos dos grupos dos resíduos dos aminoácidos, principalmente

do centro activo, conduz a uma alteração da sua configuração pelo que a

ligação com o substrato é impossibilitada, levando a uma perda da sua

actividade catalítica e consequente paragem da reacção catalisada pela

enzima.

Este facto em conjunto com o posterior aumento de temperatura, leva à

desnaturação do enzima, impedindo-o de voltar a reagir, sendo a reacção de

hidrólise da sacarose dada por terminada.

Resultados obtidos nos controlos efectuados

Ao longo de toda a actividade laboratorial foram utilizados tubos de

controlo para cada quadro preparado.

No quadro 1, em que foi estudado a influência da concentração de

substrato na actividade enzimática do invertase da levedura, foi utilizado para o

zero do espectrofotómetro o tubo 1, pois não havendo sacarose no meio

reaccional não foi formado nenhum produto (glucose e frutose) e

consequentemente a concentração de glícidos redutores – o que é identificado

pelo método de Nelson – é nula.

O tubo 10 foi utilizado para controlar o efeito do reagente de Nelson na

actividade enzimática. Este reagente foi adicionado neste tubo antes do

enzima, ao contrário do sucedido nos outros tubos. Assim, visto que este inibe


17 de Maio de 2011

a actuação do enzima, obteve-se uma menor concentração de glícidos

redutores – glucose e frutose - pois a hidrólise do diósido não foi catalisada por

um enzima.

O tubo 11 permitiu seguir a dissociação da sacarose sem a acção do

enzima. Ao comparar este tubo com o tubo anterior (tubo 10) é possível

concluir que a dissociação ocorrida no tubo 10 se deve a uma dissociação

química “natural” da sacarose – sem enzima, pois uma vez que as

absorvâncias medidas foram idênticas, as concentrações de glícidos redutores

foram idênticas.

No quadro 2, em que foi controlada a hidrólise não enzimática da

sacarose, foi utilizado para o zero do espectrofotómetro o tubo 1, pelos

mesmos motivos que no quadro 1.

Quanto a este quadro todos os tubos de ensaio podem ser considerados

tubos de controlo, uma vez que é em relação a estes que se vai comparar a

reacção com enzima.

Dados obtidos no estudo da hidrólise total e não enzimática –

Gráfico Absorvância VS concentração de sacarose

Concentração teórica da sacarose em cada solução (VT=10 mL)

[ ]

Tubo 1

Tubo 2


17 de Maio de 2011

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Registo dos resultados

Solução 1,0 U/mL de invertase

Quadro 2. . Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro, utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.

Tubos [Sacarose] (mM)

Abs510nm – Hidrólise total

(enzimática e não enzimática)

Abs510nm – Hidrólise não

enzimática

Abs510nm – Hidrólise

enzimática

1 0,0 0,000 0,000 0,000

2 0,5 1,984 0,287 1,697

3 1,0 1,544 0,397 1,147


17 de Maio de 2011

0,000

0,150

0,300

0,450

0,600

0,750

0,900

1,050

1,200

1,350

1,500

1,650

1,800

1,950

2,100

2,250

2,400

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

Ab

so

rvân

cia

a 5

10 n

m

Concentração de Sacarose (mM)

Absorvância VS concentração de sacarose

Hidrólise total (enzimática enão enzimática)

Hidrólise não enzimática

Hidrólise enzimática(diferença entre a hidrólisetotal e a hidrólise nãoenzimática)

4 1,5 1,755 0,343 1,412

5 2,5 1,875 0,413 1,462

6 3,5 1,917 0,489 1,428

7 5,0 2,232 0,390 1,842

8 10,0 1,892 0,548 1,344

9 15,0 1,979 1,044 0,935

Solução 2,5 U/mL de invertase

Quadro 3. Concentração de sacarose (substrato) e respectivas absorvâncias a 510 nm em cada quadro, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.


Abs510nm – Hidrólise total

(enzimática e não enzimática)

Abs510nm – Hidrólise não

enzimática

Abs510nm – Hidrólise

enzimática

1 0,0 0 0 0

2 0,5 1,560 1,333 0,000

3 1,0 1,670 1,349 0,227

4 1,5 2,120 1,421 0,321

Gráfico 1. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 1,0 U/mL.


17 de Maio de 2011

5 2,5 2,540 1,492 0,699

6 3,5 2,757 1,503 1,048

7 5,0 2,777 1,539 1,254

8 10,0 2,777 1,589 1,238

9 15,0 2,777 1,603 1,188

Gráfico 2. Representação do estudo da hidrólise enzimática total (enzimática e não enzimática), hidrólise enzimática e hidrólise não enzimática, utilizando a solução de invertase 2,5 U/mL.

Discussão dos gráficos obtidos

A reacção de hidrólise da sacarose tanto pode ocorrer “naturalmente”

como pode ocorrer na presença de enzima.

0,0000,1500,3000,4500,6000,7500,9001,0501,2001,3501,5001,6501,8001,9502,1002,2502,4002,5502,7002,8503,000

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

Ab

so

rvân

cia

a 5

10 n

m

Concentração de Sacarose (mM)

Absorvância VS concentração de sacarose

Hidrólise total (enzimática enão enzimática)

Hidrólise não enzimática

Hidrólise enzimática(diferença entre a hidrólisetotal e a hidrólise nãoenzimática)

Imagem 1. Reacção de hidrólise da sacarose.


17 de Maio de 2011

Os enzimas, sendo proteínas com funções catalíticas, aumentam a

velocidade com que se atinge o estado de equilíbrio da reacção. Assim, duas

soluções que contenham a mesma concentração de substrato (neste caso,

sacarose), se uma tiver na presença de enzima (neste caso, invertase da

levedura) e outra não, a solução que estiver na presença do enzima irá obter

uma maior concentração de produto (glícidos redutores – frutose e glucose) no

mesmo intervalo de tempo.

Tanto no Gráfico 1 como no Gráfico 2 as absorvâncias mais altas

correspondem à hidrólise total, como era esperado. Uma vez que na hidrólise

total tanto ocorre hidrólise enzimática como não enzimática, levando a uma

obtenção maior de glícidos redutores. Estes dados correspondem aos obtidos

através da aplicação do quadro 1 do procedimento.

O conjunto de pontos que se referem à absorvância medida para a

actividade não enzimática deveria corresponder aos menores valores de todos,

uma vez que não enzimaticamente a reacção de hidrólise da sacarose é mais

lenta (obtém-se uma menor quantidade de glícidos redutores). O facto descrito

anteriormente deveria ser independente da concentração do enzima no meio

reaccional. No entanto, isso só aconteceu quando a concentração da solução

de invertase era 1,0 U/mL. Estes dados correspondem aos obtidos através da

aplicação do quadro 2 do procedimento.

Quanto à hidrólise enzimática, as absorvâncias deviam estar

compreendidas entre as absorvâncias da hidrólise total e da hidrólise não

enzimática e deveriam aumentar até uma dada concentração de sacarose e

depois manter-se estável, uma vez que para concentrações de enzima muito

menores que concentrações de substrato chega a um ponto em que todos os

centros activos dos enzimas estão ocupados, não sendo possível aumentar

mais a velocidade de reacção. Como todos os enzimas estiveram nas soluções

o mesmo tempo e na mesma quantidade, a partir de uma dada concentração, a

absorvância medida deve ser igual para todos.

Uma vez que as concentrações de sacarose em cada um dos casos

anteriores foi a mesma para cada tubo de ensaio, concluiu-se que as


17 de Maio de 2011

concentrações de frutose e glucose obtidas não enzimaticamente seriam as

mesmas que na situação onde ocorreu a hidrólise total. Assim, para se obter as

absorvâncias e consequentemente as concentrações dos glícidos redutores

obtidos enzimaticamente procedeu-se ao seguinte cálculo:

No Gráfico 1 aconteceu o esperado quanto ao intervalo de valores em

que devia estar a absorvância (entre as absorvâncias da hidrólise total e a

hidrólise não enzimática) mas quanto aos valores de absorvância manterem-se

aproximadamente iguais após uma dada concentração, não aconteceu o

esperado pois obtiveram-se valores muito dispersos, não seguindo qualquer

tendência. No Gráfico 2 ocorreu exactamente o contrário do descrito para o

Gráfico 1.

Cinética de Michaelis-Menten

Cálculo da velocidade inicial da reacção de hidrólise da

sacarose na mistura reaccional (vT= 1mL) devido à acção

enzimática (µM/min) para cada concentração de substrato

utilizada

Sabendo que na hidrólise total existem dois tipos de reacção, a

enzimática e a não enzimática, pode considerar-se que a concentração da

solução não enzimática na hidrólise total é igual à concentração obtida nos

outros tubos de ensaio correspondentes à hidrólise não enzimática, sendo que

as soluções, teoricamente, continham a mesma concentração de sacarose.

Assim, subtraindo o valor da absorvância da hidrólise não enzimática à

hidrólise total da sacarose obtém-se apenas a concentração dos glícidos

redutores originados pela reacção enzimática, como explicado anteriormente. A

partir desta variação de absorvância e sabendo que o coeficiente de absorção

molar dos produtos da reacção da glucose no método de Nelson a 510 nm é

igual a Ɛ510nm = 7,1 mM-1cm-1, pode-se calcular a concentração de glícidos


17 de Maio de 2011

catalisados enzimaticamente. No entanto, apesar do método de Nelson reagir

com os dois glícidos redutores obtidos (glucose e frutose), vai-se considerar

para o cálculo da velocidade que só identifica a glucose, pois só para este

glícido é que se sabe o valor do coeficiente de absorção molar. Assim, o valor

desta concentração por unidade de tempo corresponde à velocidade inicial que

se pode determinar através da seguinte fórmula:

[ ]

Quadro 4. Registo das variações das absorvâncias - hidrólise enzimática - para as várias concentrações de sacarose nos diferentes tubos

Tubo ∆ Abs510 – Hidrólise enzimática

1 0,000

2 1,697

3 1,147

4 1,412

5 1,462

6 1,428

7 1,842

8 1,344

9 0,935

Para determinar a velocidade inicial para cada tubo de ensaio deduziu-

se uma fórmula que permitiu calcular a velocidade inicial através da

absorvância registada e da fórmula da própria velocidade.

[ ]

[ ]

Velocidade inicial


17 de Maio de 2011

Concentração da sacarose na mistura reaccional

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6


17 de Maio de 2011

Representação gráfica de vo em função da concentração de

sacarose na mistura reaccional (vT= 1 mL). Determinação dos

parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando um método gráfico

adequado. Justificação da escolha do método efectuado.

Comparação do valor obtido para Km com valores da literatura.

Quadro 5. Concentração de sacarose na mistura reaccional (1mL) e velocidade inicial correspondente.


Velocidade inicial ( ) (µM min-1)

1 0 0

2 5 23,9

3 10 16,2

4 15 19,9

5 25 20,6

6 35 20,1

7 50 25,9

8 100 18,9

9 150 13,2

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9


17 de Maio de 2011

Pela observação do gráfico obtido, podemos notar que deve ter ocorrido

algum tipo de erro experimental, pois era esperado que se observasse um

gráfico onde fosse possível identificar facilmente que a velocidade de reacção

aumenta com o aumento da concentração se substrato. Para além disso era

também esperado que fosse perceptível ver como a velocidade da reacção

tende para um valor limite onde todos os enzimas têm os seus centros activos

ocupados, encontram-se saturados - sendo esta a velocidade máxima.

Os parâmetros cinéticos que se podem retirar do gráfico obtido, Km e

Vmáx não correspondem, portanto, ao esperado, sendo que o valor de Km desta

enzima se situa entre os 25 e os 30 mM e se obteve um valor de Km = – 9,482

± 4,903. A velocidade máxima, ao contrário da constante de Michaelis obtida, é

maior do que o esperado, Vmáx = 3,93 ± 9,722. Este facto é devido às altas

absorvâncias medidas para a hidrólise total e a sua diferença para as

absorvâncias medidas para a hidrólise não enzimática, uma vez que a

diferença é grande, altas absorvâncias correspondem a velocidades inicias

altas pela equação deduzida anteriormente:

Gráfico 3. Representação da velocidade inicial (M min-1) em função da concentração de substrato, neste

caso, sacarose (mM) na mistura reaccional.


17 de Maio de 2011

Como as velocidades iniciais têm um valor elevado, a velocidade

máxima também o terá.

Para obter valores credíveis de Km e Vmáx o gráfico deveria apresentar

uma curva hiperbólica rectangular, isto é, uma curva onde à medida que a

concentração de substrato aumenta, a velocidade da reacção também

aumenta, sendo que inicialmente aumenta muito rapidamente, passando

progressivamente a tender para um determinado valor, correspondente à

velocidade máxima. Assim, seria de esperar que se observasse que o gráfico

obedecia a uma cinética de Michaelis-Menten. A constante de Michaelis, Km,

seria igual à concentração de substrato para a qual a velocidade inicial da

reacção é metade da sua velocidade máxima.

De seguida está apresentado o gráfico esperado para uma cinética de

Michaelis.

Apesar dos resultados obtidos, a equação de Michaelis-Menten

apresenta alguns problemas que dificultam os cálculos dos parâmetros

cinéticos, tais como:

Imagem 2. Equação de Michaelis-Menten e representação da curva de saturação para um enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato (eixo das abcissas) e a velocidade de reacção (eixo das ordenadas).


17 de Maio de 2011

1. Vmáx é uma assímptota da hipérbole

2. Os dois parâmetros cinéticos estão extremamente correlacionados

3. Erros experimentais

Para uma melhor determinação dos parâmetros cinéticos, a equação de

Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que são

mais úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais. São conhecidos três

métodos (transformações lineares) distintos para a determinação dos

parâmetros cinéticos (Vmáx e Km):

Método de Lineweaver-Burk;

Método de Hanes;

Método de Eadie-Hofstee.

Método de Lineweaver-Burk

O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a

forma mais comum e simples de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser

a mais fiável.

Neste método, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da

equação de Michaelis-Menten:


17 de Maio de 2011

Como se pode observar na figura, o resultado deste tipo de

representação é uma linha recta cuja equação é do tipo y = mx + b, sendo o

ponto de intersecção entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a

⁄ , e o ponto de intersecção entre a recta e o eixo de abcissas

equivalente a ⁄ .

Geralmente, os gráficos de Lineweaver-Burk distorcem as medidas

realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a

estimativas não muito exactas de Vmáx e de Km. A principal desvantagem deste

método é a de que, ao calcular-se os inversos, altera-se por completo a

distribuição dos erros experimentais – um pequeno erro experimental passa a

ser um grande erro após a inversão da equação de Michaelis-Menten. No

entanto também apresenta a sua vantagem – permite uma determinação de

Vmáx precisa.

O gráfico obtido neste trabalho experimental para o método de

Lineweaver-Burk é o que se ilustra a seguir.

Imagem 3. Representação do gráfico de Lineweaver-Burk.


17 de Maio de 2011

Para este método obteve-se os seguintes parâmetros cinéticos:

Vmáx = 17,93 M/ min

Km = -1,018 mM

Método de Hanes

Neste método multiplica-se por [S] na expressão do duplo recíproco,

vista anteriormente. Esta representação não causa alteração do desvio

experimental ao longo da escala de [S], daí ser o mais indicado para a

estimativa por transformação linear e/ou gráfica.

Imagem 5. Equação do método de Hanes e respectiva representação gráfica.

Neste método [ ]

⁄ varia linearmente com [S]. O declive da recta é igual

a ⁄ . A intersecção da recta com o eixo das ordenadas é numericamente

Imagem 4. Gráfico obtido no método de Lineweaver-Burk.


17 de Maio de 2011

igual a ⁄ e a intersecção da recta com o eixo das abcissas é

numericamente igual a –Km.

Imagem 6. Gráfico obtido no método Hanes.



Km = -8,714 mM

Método de Eadie-Hofstee

Este método consiste na multiplicação por V na expressão do duplo

recíproco e no seu rearranjo.

Imagem 7. Equação do método de Eadie-Hofstee e respectiva representação gráfica.


17 de Maio de 2011

O declive desta recta é numericamente igual a - Km. A intersecção da

recta com o eixo das ordenadas é numericamente igual à Vmáx e com o eixo das

abcissas é numericamente igual a ⁄ .

Este é um bom método para testar desvios à equação de Michaelis-

Menten.



Km = -1,032 mM

Método de Eisenthal e Cornish-Bowden

Existe ainda um método (linear) directo. É um método não paramétrico

e é denominado método de Eisenthal e Cornish-Bowden. Neste método Km e

Vmáx podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equação de

velocidade:

Imagem 8. Gráfico obtido no método de Eadie-Hofstee.


17 de Maio de 2011

[S]i, V0i

Após a sua determinação experimental, cada par de valores de [S] i e V0i

passa a ser constante;

V e Km

Para cada experiência, a incógnita é determinar qual o par de

parâmetros cinéticos que satisfaz simultaneamente todos os valores

experimentais de [S] e V0.

Para cada [S]i traça-se uma recta que une os pontos (- [S]i, 0) e (0, V0i);

Cada recta traçada inclui todos os pares de valores de Km e V que

satisfazem os valores experimentais de [S]i e V0i;

Ordenada na origem V = V0

Abcissa na origem Km = - [S]

Imagem 9. Equação usada no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.

Imagem 10. Representação gráfica pelo método de Eisenthal e Cornish-Bowden.


17 de Maio de 2011

O ponto de intersecção das duas rectas corresponde ao único par de

valores de Km e V que satisfaz simultaneamente os dois pares de

valores experimentais de [S] e V0 – Km* e V*.

A estimativa dos parâmetros cinéticos é feita através da mediana das n.(n-

1)/2 intersecções obtidas onde n é o número de pontos experimentais.

As vantagens deste método são as seguintes:

Não requer cálculos,

Com dois ou três [S] obtêm-se uma estimativa de Km e do

desenho experimental,

Insensível a outliers.

Imagem 11. Resultados ideias do cálculo dos parâmetros cinéticos pelo método de Eisenthal e Cornish-Bowden.


17 de Maio de 2011

Imagem 12 Gráfico obtido no método de Eisenthal e Cornish-Bowden.



Km = -0,9963 mM

Como é visível em todos os métodos que resultam do rearranjo da

equação de Michaelis-Menten, os dados experimentais obtidos não

correspondem, nem aproximadamente, aos valores esperados, uma vez que

seria de esperar um Km entre 25 e 30 mM e se obteve valores negativos de Km.

Sendo Km o valor de uma concentração é impossível ter um valor negativo.

Quanto à Vmáx seria de esperar uma menor velocidade. Segundo a

apresentação destes gráficos e valores de Km e Vmáx, o método mais rigoroso

foi o método directo, uma vez que por todos apresentarem um valor negativo, o

mais próximo do valor da literatura foi o calculado por este método. O menos

rigoroso será sempre o método de Lineweaver-Burk, uma vez que os

parâmetros utilizados na construção do gráfico são o inverso dos valores

obtidos, assim, os valores de erro reduzido são apresentados com erro grande

e os valores de erro maior são apresentados com erro diminuído.


17 de Maio de 2011

O facto de se obter valores tão distantes dos esperados leva a

considerar que ocorreram uma série de erros na realização do procedimento

que afectaram os resultados. Esses erros podem começar, por exemplo, na

preparação da solução de invertase e continuar na preparação do reagente de

Nelson. Uma má preparação deste reagente pode ter como consequência a

não paragem da actividade enzimática, levando a uma maior produção de

glícidos redutores e consequentemente a uma absorvância maior. Uma adição

tardia deste reagente a cada tubo conduziria a um aumento do tempo de

incubação e como tal a uma maior concentração de produto formado.

Além da preparação de soluções podem também ter ocorrido erros na

medição das absorvâncias nos diferentes tubos, uma vez que a linearidade

entre a absorvância e concentração é limitada por diversos factores químicos e

instrumentais, tais como: dispersão da radiação devido à presença de

partículas na solução ou desvios nos coeficientes de absorção molar devido a

interacções intermoleculares entre moléculas “muito próximas”, a utilização

radiação não totalmente monocromática e possibilidade de fluorescência da

amostra, assim como alterações do índice de refracção das cuvvetes e

alterações no equilíbrio das soluções analisadas. Ao obter absorvâncias muito

altas, irá obter-se concentrações de produto formado muito altas, o que vai

influenciar a velocidade inicial obtida em cada tubo de ensaio e

consequentemente os parâmetros cinéticos.

A obtenção de valores de Km muito baixos pode dever-se à alta afinidade

entre enzima e substrato. Cada enzima apresenta um valor característico de Km

e de Vmáx. Para a maioria das enzimas, o valor de Km está entre 10-1 e 10-7 M.

Esse valor depende do substrato em particular e também das condições no

sistema de reacção, tais como pH, temperatura e força iónica. Km corresponde

à concentração de substrato em que metade dos centros activos da enzima

está preenchida e mostra a afinidade pela enzima ao substrato; um Km baixo

implica uma grande concentração do complexo enzima substrato em solução,

portanto, muito substrato em solução, isto é, pequeno Km implica velocidade

maior.

Existem outros factores que podem influenciar a actividade enzimática,

como o pH e a temperatura do meio:


17 de Maio de 2011

pH

As proteínas como já foi visto, são construídas a partir de

aminoácidos. Estas unidades bioquímicas possuem grupos básicos,

neutros e ácidos.

Consequentemente, a enzima intacta

pode conter ambos os grupos

carregados positiva ou

negativamente a um dado pH. Deste

modo, grupos ionizáveis são,

aparentemente, muitas vezes parte

do centro activo visto que a acção

catalítica de ácidos e bases está ligada a vários mecanismos

enzimáticos. Além disso, variações do pH podem alterar a estrutura

tridimensional das enzimas. Por essas razões, as enzimas são activas

somente dentro de uma certa faixa de pH. O pH do meio pode afectar a

velocidade máxima da reacção, Km, e a estabilidade da enzima. Em

alguns casos, o substrato pode conter grupos iónicos, e o pH do meio

influi na afinidade do substrato com a enzima.

Temperatura

A velocidade das reacções catalisadas por enzimas cresce até

um certo limite. Acima de uma determinada temperatura, a actividade da

enzima diminui devido à sua desnaturação.

A velocidade de uma reacção química é afectada pela

temperatura – isso pode ser explicado pela teoria de Arrhenius que se

baseia na hipótese de que duas partículas devem se colidir na

orientação correcta e com energia cinética suficiente para que os

reagentes sejam transformados em produtos. Pode-se dizer que o

mesmo acontece com as reacções catalisadas por enzimas, lembrando

que a variação de temperatura afecta as constantes cinéticas (Km e

Vmáx).

Imagem 13. Efeito do pH na actividade enzimática.


17 de Maio de 2011

Em baixas temperaturas, as reacções são mais lentas devido à

queda da energia cinética do sistema. Porém, como as enzimas são

proteínas, o aumento da temperatura não causa apenas o aumento da

velocidade de reação, mas, sim, dois efeitos opostos:

Até determinada temperatura, ocorre um aumento da

velocidade de reação;

A partir de determinada temperatura, há uma diminuição na

velocidade de reação.

A actividade enzimática da invertase atinge um máximo aos 55ºC,

a temperatura ambiente do

laboratório era 29ºC.

À medida que a temperatura

aumenta, a actividade catalítica

aumenta também, até atingir um

determinado valor - Temperatura

Óptima. A partir desta temperatura,

que corresponde ao valor máximo de

actividade enzimática, a actividade

catalítica começa a diminuir, pois, a temperaturas elevadas inicia-se a

desnaturação térmica das proteínas.

Imagem 14. Efeito da temperatura na actividade enzimática.


17 de Maio de 2011

Bibliografia

Alexander, R.R., Griffiths, J.M., e Wilkinson, M.L. (1984) Basic

Biochemical Methods, John Wiley & Sons: New York, pp. 56-67.

Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley:

Reading, MA, pp.299-321.

Cornish-Bowden, A. (1995) Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland

Press: London.

Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison

Wesley Longman: New York.

Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for

Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp.

199-206.

Questionário

1. Porque é que a solução de invertase foi preparada em tampão

Tris-HCl (pH 7,5) 0,01 M e os ensaios foram realizados usando-se tampão

acetato de sódio (pH 4,5) 0,2 M?

O enzima invertase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica α(1→2) do

dióxido não redutor, sacarose, originando glucose e frutose na proporção de

1:2 - por cada molécula de sacarose hidrolisada, formam-se duas moléculas de

oses redutoras.

A invertase apresenta uma actividade elevada num intervalo alargado de

valores de pH (3,5 – 5,5), apresentando um valor de pH óptimo igual a 4,5.

O pH tem uma grande influência na actividade enzimática. Os enzimas

sofrem os mesmos efeitos estruturais observados nas proteínas globulares


17 de Maio de 2011

pela variação de pH - mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da

enzima devido a uma repulsão de cargas.

Assim, a solução de enzima foi preparada a valor de pH igual a 7,5 pois

para este valor de pH, o enzima é bastante estável. Nesta fase o importante foi

preparar uma solução diluída assegurando que o enzima estaria presente na

sua forma estável para que mais tarde fosse possível estudar a sua actividade.

Os ensaios foram realizados usando-se tampão acetato de sódio (pH

4,5) 0,2 M pois este é o valor de pH óptimo do enzima, ou seja, é o valor de pH

para o qual o enzima tem máxima potência e eficiência.

Caso a preparação da solução fosse realizada para outros valores de

pH, o enzima poderia não ser estável e, mais tarde, ao realizar os ensaios,

poderia ocorrer o caso extremo de não se encontrar enzima em solução para

catalisar a reacção, sendo impossível de atingir o objectivo do trabalho.

2. Como comprovaria que a ocorrência de uma reacção num

homogenato ou extracto celular era devida à acção catalítica de um

enzima, presente nesse homogenato, sobre o substrato utilizado?

Para comprovar que a ocorrência de uma reacção num homogenato ou

extracto celular era devida à acção catalítica de um enzima realizar-se-ia um

estudo cinético, traçando-se o gráfico da velocidade inicial em função da

concentração de substrato. Se nesse gráfico se obtivesse uma hipérbole

rectangular, concluir-se-ia que a reacção era devida à acção catalítica de um

enzima que obedece a uma cinética de Michaelis-Menten.

No entanto, existem vários enzimas que não possuem um

comportamento Michaeliano e, por isso, seria necessário recorrer a outra forma

de confirmar a existência de actividade catalítica. Poder-se-ia, então, efectuar

um ensaio com um agente interferente, causando, por exemplo, uma variação

significativa de pH e/ou temperatura. Caso se obtivesse um gráfico de

velocidades iniciais em função da concentração de substrato em que a

velocidade inicial da reacção tivesse diminuído ou mesmo desaparecido em


17 de Maio de 2011

relação ao ensaio cinético sem agentes interferentes, saber-se-ia que o enzima

era responsável pela actividade catalítica. Os agentes interferentes actuariam

como agentes desnaturantes dos enzimas catalíticos da reacção, de natureza

proteica, perdendo assim a sua actividade devido a alteração das condições

experimentais do meio.

3. Um enzima que apresenta um pH óptimo a 6,8, tem uma

actividade muito reduzida a pH 4,2. Como poderia determinar se esta

redução na actividade resulta de uma ionização reversível do substrato

e/ou enzima ou é causada por uma desnaturação irreversível do enzima?

O pH determina o estado de ionização dos diferentes grupos

constituintes dos diversos componentes do vaso reaccional, nomeadamente

dos enzimas e do substrato. Variações acentuadas deste, poderão levar à

impossibilidade de estabelecer ligações enzima-substrato, devido à

modificação do centro activo do enzima. Estas modificações poderão ser de tal

modo significativas que alteram a estrutura da proteína, pois as alterações das

forças electroestáticas de diferentes grupos ionizáveis levam a um aumento da

instabilidade do enzima, levando à sua desnaturação e consequente perda da

actividade catalítica.

Para verificar experimentalmente se ocorreu desnaturação irreversível

do enzima ou ionização reversível do substrato e/ou enzima, realizar-se-ia um

ensaio cinético para um pH óptimo de 6,8. De seguida realizar-se-ia um outro

ensaio adicionando um ácido, de modo a diminuir o pH até ao valor de 4,2.

Analisando a velocidade da reacção, verificar-se-ia que no último ensaio

ocorreria uma diminuição da mesma. Se, ao voltarmos ao pH 6,8, adicionando

base, se verificasse um aumento da velocidade da reacção, significaria que

tinha ocorrido uma ionização reversível do substrato e/ou enzima. Caso

contrário, se a velocidade se mantivesse inalterável, significaria que tinha

ocorrido uma desnaturação irreversível.


17 de Maio de 2011

4. Qual é a forma geral da curva que representa a dependência

da velocidade de uma reacção enzimática com a temperatura do meio?

Justifique sucintamente.

A temperatura apresenta uma grande influência na catálise enzimática.

Existe uma temperatura para a qual a actividade do enzima é máxima –

temperatura óptima – diferente de enzima para enzima (Imagem 14. Efeito da

temperatura na actividade enzimática.)

Esta influência sobre a cinética da reacção enzimática deve ser

entendida em duas fases distintas: no princípio, aumentos de temperatura

levam a aumentos da velocidade de reacção, por aumentar a energia cinética

das moléculas componentes do sistema – este efeito é observado num

intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial

do enzima.

No entanto, temperaturas muito mais elevadas levam à desnaturação do

enzima por alterarem as ligações químicas que mantêm a sua estrutura

tridimensional. A temperatura que provoca a desnaturação está, geralmente,

pouco acima da sua temperatura óptima. Deste modo, verifica-se uma

diminuição da actividade enzimática à medida que a temperatura aumenta a

partir da temperatura óptima.

Por outro lado, a temperaturas inferiores à temperatura óptima, a

velocidade da reacção é pequena devido à existência de menor energia

envolvida nas colisões entre o enzima e o substrato, originando uma menor

actividade enzimática.

67348048 relatorio 6 estudo cinetico da invertase da levedura

Documents