laboratório bbm invertase

Engenharia Biomdica

Bioqumica e Biologia Molecular

Relatrio

Cintica da Enzima Invertase

Relatrio realizado por:

Ana Calhau n54605 Drcio Silva n54214 Jos Frazo n54198

1 Semestre, Ano Lectivo 2005/2006

Sumrio

Usam-se diversas abordagens no estudo do mecanismo de aco de enzimas purificadas, mas a abordagem principal determinar a taxa da reaco enzimtica e como muda em resposta mudana dos parmetros experimentais, esta conhecida como cintica enzimtica.

Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cintica da enzima invertase, ou seja, determinar o valor da velocidade mxima (mxima velocidade a que a enzima degrada o substrato) e determinar o valor do Km que uma medida da afinidade enzimtica para o substrato (essa afinidade igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade baixa. A invertase uma enzima que catalisa a degradao da sacarose em glucose e frutose.

Inicialmente, obteve-se a absorvncia e a concentrao dos acares redutores (tendo-se feito dois ensaios). Depois, calculou-se a velocidade de reaco para cada concentrao inicial de sacarose. Para se obter os valores usou-se a equao da recta Y=0,0004x-0,0186, em que Y a absorvncia. Em seguida colocaram-se estes resultados num grfico (concentrao de sacarose x velocidade de reaco), obtendo-se uma curva de Michaelis-Menten (fig.1).

Fig.1 Variao da velocidade de reaco em funo da

concentrao de substracto curva de Michaelis-Menten. Esta curva descrita pela equao que leva o mesmo nome:

Apesar de ser possvel calcular o valor de Km e da velocidade mxima atravs desta curva frequente utilizar-se a representao grfica de 1/v em funo de 1/[S] representao de Lineweaver-Burk- pois torna mais simples o estudo da cintica bioqumica, j que o

traado de uma recta exige menos leituras experimentais (menos pontos) do que o da curva e permite uma determinao de Km mais expedita.

Fig.2 Representao de Lineweaver-Burk para a determinao

de Km Esta representao descrita pela equao

Assim, o objectivo de estudar a cinemtica da enzima invertase

foi alcanado, obtendo-se valores de Km iguais a 12,52 g/L (36,6mM) pela interpretao linear de Lineweaver-Burk e de 11,5 g/L (33,6mM) pela interpretao de Michaelis Menten. Os valores da velocidade mxima foram de 1,84g/(L.min) e 1,6 g/(L.min) respectivamente.

Resultados

Nos primeiros resultados, aps se ler a densidade ptica, obtiveram-se logo valores mximos para a velocidade. Assim, reduziu-se a quantidade de invertase utilizada.

Aps a reduo a 1/5 de invertase quantos aos resultados, obteve-se, relativamente cor, que esta passava de transparente para amarelo, aps adio da invertase, qualquer que fosse a concentrao de sacarose. Aps passagem pelo banho de gua a 100C passava a castanho.

Contudo, para os tubos aos quais no foi adicionado invertase e que correspondem ao tempo zero para cada uma das concentraes de sacarose verificou-se a passagem do transparente para o amarelo e a permanncia desta cor.

Quanto aos valores obtidos para a absorvncia e para a concentrao os resultados so os seguintes:

9 Valores obtidos para as concentraes de 15, 30 e 45 g/l Ensaio 1

Concentrao de sacarose 15g/L

Absorvncia [] (mg/L) Tempo (s)

0 0,1 296,5 0

1 0,24 646,5 60

2 0,59 1521,5 120

3 0,85 2171,5 180

4 1 2546,5 240

5 1,1 2796,5 300

6 1,2 3046,5 360

7 1,35 3421,5 420



0 0,011 74 0

1 0,525 1359 60

2 1,112 2826,5 120

3 1,561 3949 180

4 1,867 4714 240

5 2,936 7386,5 300

6 2,37 5971,5 360

7 2,59 6521,5 420



0 0,018 91,5 0

1 0,622 1601,5 60

2 1,171 2974 120

3 1,693 4279 180

4 1,967 4964 240

5 2,35 5921,5 300

6 2,597 6539 360

7 2,697 6789 420

Ensaio 2



0 0,032 126,5 01 0,574 1481,5 602 1,021 2599 1203 1,392 3526,5 1804 1,76 4446,5 2405 2,048 5166,5 3006 2,338 5891,5 3607 2,516 6336,5 420



0 0,023 104 01 0,565 1459 602 0,921 2349 1203 1,21 3071,5 1804 1,52 3846,5 2405 1,845 4659 3006 2,121 5349 3607 2,235 5634 420



0 0,009 69 01 0,779 1994 60

2 1,304 3306,5 1203 1,834 4631,5 1804 2,48 6246,5 2405 2,467 6214 3006 2,81 7071,5 3607 2,744 6906,5 420

9 Valores obtidos para as concentraes de 45, 60 e 75 g/l Ensaio 1

Concentrao de sacarose 60 g/L


0 0,008 66,5 01 0,64 1646,5 602 1,311 3324 1203 1,828 4616,5 1804 2,221 5599 2405 2,535 6384 3006 2,672 6726,5 3607 2,809 7069 420



0 0,009 69 01 0,638 1641,5 602 1,145 2909 1203 1,604 4056,5 1804 2,076 5236,5 2405 2,326 5861,5 3006 2,59 6521,5 3607 2,684 6756,5 420



0 0,024 106,5 01 0,941 2399 602 1,428 3616,5 120

3 1,997 5039 1804 2,406 6061,5 2405 2,598 6541,5 3006 2,759 6944 3607 2,836 7136,5 420

Ensaio 2

Concentrao de sacarose 60 g/L Absorvncia

[] (mg/L) Tempo (s)

0 0,185 509,000 01 0,850 2171,500 902 1,400 3546,500 1503 2,203 5554,000 2104 2,479 6244,000 2705 2,626 6611,500 3306 2,814 7081,500 3907 2,848 7166,500 450

Concentrao de sacarose 75g/L Absorvncia

[] (mg/L) Tempo (s)

0 0,58 1496,5 01 602 1,456 3686,5 1203 2,04 5146,5 1804 2,405 6059 2405 2,72 6846,5 3006 - - 3607 . - 420

Concentrao de sacarose 100g/L Absorvncia

[] (mg/L) Tempo (s)

0 0,038 141,5 01 0,787 2014 602 1,4 3546,5 1203 1,864 4706,5 1804 2,191 5524 2405 2,546 6411,5 3006 2,741 6899 360

7 2,666 6711,5 420

Assim, a mdia para cada grupo de valores obtidos :



0 0,066 211,5 0

1 0,407 1064 60

2 0,8055 2060,25 120

3 1,121 2849 180

4 1,38 3496,5 240

5 1,574 3981,5 300

6 1,769 4469 360

7 1,933 4879 420



0 0,017 89 0

1 0,545 1409 60

2 1,0165 2587,75 120

3 1,3855 3510,25 180

4 1,6935 4280,25 240

5 1,845 4659 300

6 2,2455 5660,25 360

7 2,4125 6077,75 420



0 0,0135 80,25 0

1 0,7005 1797,75 60

2 1,2375 3140,25 120

3 1,7635 4455,25 180

4 2,2235 5605,25 240

5 2,4085 6067,75 300

6 2,7035 6805,25 360

7 2,7205 6847,75 420



0 0,008 66,5 01 0,64 1646,5 602 1,311 3324 1203 1,828 4616,5 1804 2,221 5599 2405 2,535 6384 3006 2,672 6726,5 3607 2,809 7069 420



0 0,009 69 01 0,638 1641,5 602 1,145 2909 1203 1,604 4056,5 1804 2,076 5236,5 2405 2,326 5861,5 3006 2,59 6521,5 3607 2,684 6756,5 420

Concentrao de sacarose 100 g/L


0 0,024 106,5 01 0,941 2399 602 1,428 3616,5 1203 1,997 5039 1804 2,406 6061,5 2405 2,598 6541,5 3006 2,759 6944 3607 2,836 7136,5 420

Desta forma, graficamente obtemos:

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tempo (min)

Con

c de

Au

care

s R

eduz

idos

(g/L

)

Conc.S acarose 15g/LConc.S acarose 30g/LConc.S acarose 45g/LConc.S acarose 60g/LConc.S acarose 75g/LConc.S acarose 100g/L

Pelo clculo do declive das rectas anteriores obtm-se a curva de Michaelis-Menten:

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 15 30 45 60 75 100

Conc. Sacaros e (g/L)

Velc

idad

es (g

/L.m

in)

Srie2

Desta forma (pela aplicao das frmulas apresentadas no sumrio), obtm-se: Km=11,5 g/L (33,6mM) Vmx=1,6 g/(L.min)

Pela inverso dos valores dos eixos acima obtm-se o grfico de Lineweaver-Burk:

y = 6,806x + 0,5435

-0,5

-0,3

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

-0,1 -0,05 0 0,05 0,1

1/[ ]

Srie1Linear (Srie1)

Mais uma vez, pela aplicao das frmulas apresentadas no sumrio, obtm-se: Km=12,52 g/L (36,6mM) Vmx=1,84 g/(L.min)

Discusso

Os primeiros resultados obtidos evidenciaram, muito inicialmente, valores de velocidade mxima, uma vez que, a reaco deu-se muito depressa devido ao excesso de produto, ou seja, utilizou-se enzima em excesso, tendo-se, posteriormente, devido a tal acontecimento, diminudo a sua quantidade em 1/5.

Quanto colorao obtida, verifica-se que, apenas para o tubo correspondente ao tempo zero esta no muda pois no foi adicionada invertase, que ao reagir provoca o escurecimento da soluo.

Para a construo dos grficos e clculo das mdias foram desprezados valores, os correspondentes a tempos diferentes e valores em que a velocidade mxima era rapidamente atingida.

Para o grfico da concentrao de aucares reduzidos (g/L) por unidade de tempo (s) foi desprezado um valor correspondente ao tubo 5 de concentrao 30g/L por apresentar um valor anmalo derivado a um erro de leitura.

O valor terico de Km para a enzima invertase (segundo o Brenda) de 14,09 g/L (41,02mM). O valor obtido neste trabalho experimental foi diferente do valor terico possivelmente porque as condies requeridas para estipular um valor tabelado so muito mais exigentes e precisas do que as que conseguidas numa aula laboratorial.

Por outro lado, foi tambm diferente o valor de Km obtido, dependendo este da representao utilizada a de Michaelis-Menten (Km=11,5 g/L (33,6mM)) ou a de Lineweaver-Burk (Km=12,52 g/L (36,6mM)) - devido diferente preciso dos mtodos. Contudo, verifica-se, nitidamente, que o valor obtido pela recta de Lineweaver-Burk bem mais aproximado ao terico, devido, precisamente, sua maior preciso.

Vrias podem ter sido as razes que explicam a diferena entre os valores obtidos e os tericos, assim como a diferenas nos ensaios para iguais concentraes de sacarose. Destacam-se:

- A impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45C a

soluo de sacarose esta estivesse exactamente a 45, visto que o sistema partilhado por 4 grupos o que pode originar pequenas oscilaes de temperatura, assim como a impossibilidade de garantir que o banho de gua estivesse a 100C pelas mesmas razes.

- O prprio facto de se agitar o tubo de forma diferente e durante tempos diferentes aps de adicionar a invertase pode influenciar o resultado, uma vez que, se formam agregados mais ou menos maiores;

- Mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros ao pipetar e ao transferir para o recipiente;

- O facto de ser impossvel cumprir escrupulosamente com os tempos estipulados no protocolo;

- Aproximaes no tratamento dos resultados; - Erros de leitura no espectrofotmetro, nomeadamente, erros de

paralaxe, uma vez que os valores foram lidos por ns; - O facto de terem sido desprezados vrios pontos no traado das

rectas cujo declive d a velocidade. A escolha dos pontos pode no ter sido a mais correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinao das constantes cinticas, pode ter ocorrido propagao de erros.

Contudo, apesar de todas as diferenas verificadas, pode concluir-se que se obteve valores aceitveis de Km e de velocidade mxima (constantes cinticas) pela leitura da recta de Lineweaver-Burk.

Bibliografia

Campos, Lus S., Entender a Bioqumica, 4 edio. Escolar Editora. Lisboa, 2005;

Engenharia Biomdica Ana Calhau n54605

laboratório bbm invertase

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