2001.

Organizmi su više od prostog

zbira njihovih gena

1972.

1-2% genoma kodira proteine

>2/3 genoma “višak DNK”

Venter: “Biology is complicated, that's one of the key messages that came out of the genome. ….

We have a hundred trillion cells, the complexity of our biology depends on so many things after the

genetic code. You know, our complexity is immense, we need new tools if we're going to ever go

forward to really understand why we're alive and how we came to be”.

Genom

Transkriptom

Proteom

>93% genoma čoveka se transkribuje(ENCODE 2007)

> 70% se transkribuje sa oba lanca

Pervazivna transkripcija

“Višak DNK” → “Višak RNK” vs. funkcionalni molekuli RNK

Transkriptom čoveka (ENCODE 2012):

195 000 transkripata

100 000 nema konzervisani okvir čitanja i dužine je 50-100 000 nt

Genom čoveka – 13500 gena za lncRNK koji daju 22500 transkripata (ENCODE 2012)

Transkripti duži od 200 nukleotida koji nemaju potencijal za kodiranje proteina

duge nekodirajuće RNK – lncRNK – regulatorni molekuli

Duge nekodirajuće RNK

Duge nekodirajuće RNK – dekoracija genoma

Geni za lncRNK

Između gena

Unutar gena za proteine

U blizini ili u samim regulatornim elementima (promotorima, pojačivaćima, 3 UTR)

lncRNK

DNK

Mogu se preklapati sa informacijom za proteine (sense orijantacija)

Mogu se eksprimirati sa suprotnog lanca DNK (antisense orijantacija)

Duge nekodirajuće RNK – ekspresija

Transkripcija – Pol II

Odlike Pol II transkripata – 5-kapa, poli-A rep

Regulacija specifična za tip ćelije i fazu razvića

Duge nekodirajuće RNK – demonstracija moći

Regulatorni molekuli –

regulišu ekspresiju genoma na svim nivoima

StrukturnI molekuli –

oblikovanje trodimenzionalne strukture nukleusa

Signalni molekuli između ćelija

lncRNK

80% genoma čoveka služi nekoj biohemijskoj funkciji (ENCODE 2012)

Ključni igrači – regulatorne RNK

Najveći deo genoma bi mogao biti sastavljen od funkcionalne DNK

Odnos nekodirajuće i ukupne DNK

raste tokom evolucije

2001.

Organizmi su više od prostog

zbira njihovih gena

2012.

80% genoma čoveka služi nekoj biohemijskoj funkciji

(regulatorni elementi, regulatorne RNK)

1972.

1-2% genoma kodira proteine

>2/3 genoma “višak DNK”

Ključ evolucije, razvića i funkcionisanja živih sistema je regulacija

Kako izgleda molekul RNK u ćeliji?

5 ACGUGGCUAAGCCAUUUGCA 3

primarna struktura

RNK je jednolančani molekul

Intramolekulsko sparivanje –

sekundarna struktura

“Savijanje” u prostoru –

trodimenzionalna struktura

“Moć” RNK u živom sistemu

Princip ključ-brava

Dve vrste

informacija za

interakcijeDigitalna informacija -

primarna struktura RNK je

vezivno mesto za nukleinsku

kiselinu

Analogna informacija -

sekundarna i tercijalna struktura

RNK je vezivno mesto za protein

• lncRNK vs. proteini

Fleksibilije u pogledu vezivanja partner-proteina

poseduju raznovrsnije i fleksibilnije sekundarne i tercijarnom

Specifičnije u pogledu prepoznavanja određenih sekvenci u genomu

lncRNK nemaju ograničenje u dužini i kompoziciji digitalne informacije i mogu nepogrešivo prepoznati jedinstveno mesto u genomu - idealne za lokus- i alel- specifičnu regulaciju

Transkripcioni faktori prepoznaju kratke motive DNK koji se nalaze na hiljade mesta u genomu i utiču na ekspresiju stotina gena istovremeno – deluju u okviru velikih regulatornih mreža - koordinacija ekspresije gena

Interakcija lncRNK sa partner-molekulima

“Moć” RNK u živom sistemu

Princip ključ-brava

• In cis

Funkciju obavljaju na mestu svoje sinteze i direktno deluju na jedan ili nekoliko vezanih, kontinuiranih gena na jednom hromozomu

Prisustvo u malom broju kopija i kratak poluživot

Idelane za lokus- i alel- specifičnu regulaciju

Molekuli vodiči koji usmeravaju proteinske komplekse na mesto svoje sinteze u genomu

Duge ncRNK deluju in cis i in trans

• In trans

Difunduju sa svog mesta sinteze i direktno deluju na udaljene gene, uključujući i gene na drugim hromozomima

In trans targetiranje – molekuli vodiči koji usmeravaju proteinske komplekse na specifično udaljeno mesto u genomu

Tipični trans faktori – postaju deo velikih regulatornih mreža i globalno regulišu ekspresiju gena

Modeli delovanja lncRNK

Molekul vodič i molekul adapter, in cis i in transMolekul pojačivač (represor ili izolator)

-in cis sa efektom širenja

Regulacija proteina i miRNK (endogeni sunđer)

Molekul sponaMolekul mamac, trans faktor

Organizovanje hromatinskih domena Epigenetička i transkripciona regulacija

Strukturna uloga

• Transkripcija zavisna regulacija sa lncRNK - posredstvom sopstvene transkripcije – bitan je proces transkripcije lncRNK, a ne sama lncRNK

Transkripcija lncRNK otvara hromatin

Transkripcija lncRNK onemogućava transkripciju susednog gena (transkripciona interferencija –ometanje jedne transkripcione jedinice drugom)

Modeli delovanja lncRNK

Pregled mehanizama regulacije ekspresije gena sa lncRNK

Pregled mehanizama regulacije ekspresije gena sa lncRNK

“... pravi "Divlji Zapad" u pogledu funkcija i mehanizama delovanja ... ovih veoma intrigantnih molekula." J. Lee, Science, 2012

Regulacija ekspresije gena sa lncRNK

Epigenetička

Transkripciona

Post-transkripciona

Duge nekodirajuće RNK – epigenetičke efemere

Karika koja je nedostajala ...

Regrutovanje kompleksa za epigenetičku regulaciju na jedinstveno mesto u genomu –lncRNK

Inaktivirani

X hromozom

Mara

• Ključna uloga u epigenetičkoj regulaciji:

inaktivacija X hromozoma

genetičko utiskivanje

epigenetička regulacija drugih gena

• Osobine lncRNK koje im daju prednost u odnosu na transkripcione regulatore u epigenetičkoj regulaciji

Digitalna informacija – obezbeđuje usmeravanje kompleksa za promenu strukture hromatina na jedinstveno mesto u genomu

Analogna informacija – felksibilnost u interakciji sa proteinima

• Princip

Asembliraju komplekse za promenu strukture hromatina na jedinstvenu/specifičnu lokaciju u genomu (molekuli vodiči, molekuli pojačivači)

Transkripciona interferencija

Epigenetička regulacija i lncRNK

alel- i lokus-specifična, in cis

lokus-specifična, in cis i in trans

• Inaktivacija X hromzoma

Nasumično utišavanje jednog od dva X hromozma kod ženki sisara – regulisano sa X inaktivacionim centrom

• Genetičko utiskivanje

Neki geni se eksprimiraju sa jednog od dva alela u zavisnosti od roditeljskog porekla

Imprintovani geni su obično grupisani u utisnutim domenima i koordinisano su regulisani in cis sa kontrolnim regionom za utiskivanje

• Zajedničko za utiskivanje gena i inaktivaciju X hromozoma:

kontrolni regioni deluju in cis i ostvaruju dugotrajni epigenetički efekat na hromatin

alelska priroda regulatornih procesa (inaktivacija samo jednog od dva alela, odnosno jednog od dva X hromozoma)

• Ključni igrači u ovim regulatornim procesima su regulatorne RNK

služe kao platforma za regrutovanje proteina in cis koji dovode do epigenetičkih promena

transkripciona interferencija

kodiranju ih kontrolni regioni

Dozne kompenzacije i regulatorne RNK

• X-inaktivacioni centar - kontrolni region za inaktivaciju X hromzoma

Region X hromozoma veličine 10 do 500 kb koji in cis kontroliše inaktivaciju

U njemu počinje inaktivacija i širi se na celi hromozom

Sadrži najmanje sedam gena za lncRNK

• Glavni "glasnik" X-inaktivacionog centra je Xist RNK - informaciju o inaktivaciji širi in cis i direktno je odgovorna za utišavanje ekspresije gena

X-inaktivacioni centar i lncRNK

• Xist RNK regrutuje kompleks PRC2 i druge faktore koji modifikuju i kondenzuju hromatin

• Jednom kada je došlo do naktivacije hromozoma, Xist RNK više nije potrebna

• Modifikacije hromatina dovode do inaktivacije hromozoma i obezbeđuju da se inaktivacija istog X hromozoma nasleđuje u svim potomcima date ćelije nasleđivanjem nastalih modifikacija hromatina

Xist RNK inicira i uspostavlja inaktivaciju koja se održava nasleđivanjem

strukture hromtina

• Igf2r utisnuti domen – utišane očeve kopije

Airn utisnuti gen kodira lncRNK i eksprimira se sa očeve kopije

Airn (antisense to Igf2r RNA non-coding) – antisense orijantacija u odnosu na Igfr2 i preklapa se sa promotorom Igf2r gena

Airn promotor je jači od Igfr2 promotora

Transkripciona interferencija + metilacija promotra gena Igf2r

Jednom kada je došlo do inaktivacije Igf2r, Airn RNK više nije potrebna

• KCNQ1 utisnuti domen – utišane očeve kopije

Kcnqot1 utisnuti gen kodira lncRNK i eksprimira se sa očeve kopije

Kao molekul vodič in cis regrutuje kompleks PRC2 i druge faktore koji modifikuju i kondenzuju hromatin

Jednom kada je došlo do inaktivacije hromozoma, Kcnqot1 RNK više nije potrebna

Utiskivanje gena i lncRNK

• Analize transkriptoma – veliki broj lncRNK vrši epigenetičko utišavanje, slično lncRNK koje učestvuju u doznoj kompenzaciji

• Čak 38% lncRNK stupa u interkaciju sa kompleksima za uvođenje represivnog hromatina

• lncRNK mogu regrutovati i komplekse koji uvode aktivan hromatin.

Epigenetička regulacija ekpsresije genoma i lnc RNK

• Mehanizam delovanja

molekuli vodiči (in cis i in trans)

molekuli pojačivači (in cis)

• Vezuju epigenetičke komplekse direktno ili preko RNK-vezivnih proteina

Epigenetička regulacija ekpsresije genoma i lnc RNK

začetnici u asembliranju proteinskih kompleksa

(analogna informacija) na određenom mestu u genomu (digitalna infromacija)

• Interakcija sa RNK-vezivnim proteinima dodatno povećava fleksibilnost mreže lncRNK-proteini

• RNK-vezivni protein može prepoznati veći broj ciljnih molekula RNK

RNK-vezivni proteini sadrže nekoliko RNK-vezivnih domena koji prepoznaju određene strukture/sekvence u molekulima RNK

kombinatorno koriste svoje RNK-vezivne domene

• Strukturna fleksibilnost molekula RNK omogućava da veći broj RNK ima ista vezivna mesta za neki RNK-vezivni protein ali različito raspoređena

Epigenetička regulacija ekpsresije genoma i lnc RNK

• Ulogom lncRNK u epigenetičkoj regulaciji objašnjava paradoks vezan za epigenetičke komplekse

mali brojakompleksa za promenu strukture proteina

pokazuju malu specifičnost za sekvencu DNK

određuju složene promene strukture hromatina na određenom mestu u genomu tokom razvića, kao i u odgovoru na signale koje ćelija

•

• Kompleksi ncRNK-proteini – fleksibilna platforma koja deluje kao senzor različitih fizioloških signala i signala tokom razvića i integriše aktivnosti velikog broja regulatornih kompleksa na jedinstvenom mestu u genomu

Epigenetička regulacija ekpsresije genoma i lnc RNK

• Mreža lncRNK-regulatorni proteini

deluju na određeno mesto u genomu

• Mreža elementi DNK-regulatorni proteini

koordiniše ekspresiju na stotine gena

• Zajedno regulišu transkripcioni program genoma

• rDNK = Tandemski ponovljne grupe gena

• Motiv koji se ponavlja = transkripciona jedinica + intergenski graničnik

• Ekspresija usklađena sa trenutnim potrebama ćelija za sintezom proteina – neke kopije su aktivne, a neke transkripciono utišane

• Transkripciono utišavanje vodi pRNK - transkribuje se sa promotra za transkripcionu jedinicu pre-rRNK koji je lociran u intergenskom graničniku

pRNK in cis epigenetički utišava rDNK

• pRNK – molekul vodič koji in cis utišava ponovljene transkripcione jedinice u skladu sa potrebom ćelije za sintezu proteina:

Formira specifičnu strukturu drška-petlja koja regrutuje i vezuje NoRC (nukleolusni kompleks za remodelovanje)

NoRC menja pozicije nukleozoma u promotoru i kao spona koordiniše aktivnosti drugih enzima koji pišu represivni histonski kod i metiliju DNK

• Tripleks strukturu DNK-RNK koju formira pRNK sa ciljnom DNK specifično prepoznaje DNK metiltransferaza koja uspostavlja de novo metilaciju u promotrskom regionu

pRNK in cis epigenetički utišava rDNK

• CCND1 lncRNK se prepisuje sa regiona koji je uzvodno u odnosu na promotor gena za ciklin D1 (CCND1)

• Eksprimira se u uslovima genotoksičnog stresa

• In cis regrutuje RNK-vezivni protein i posreduje u represivnoj modifikaciju histona i reprimira CCDN1

Regrutuje TLS

TLS inhibira CBP/p300 - uspostavlja se hipoacetilovani hromatin (menja otvorenu strukturu hromatina u zatvorenu) i reprimira se transkripcija CCND1

Regrutuju PRC2

CCND1 lncRNK in cis regrutuje RNK-vezivni protein

• Geni HOX kontrolišu anteriorno-posteriornu osu i segmentalnu duplikaciju tokom razvića.

• U genomu čoveka su organizovani u četri klastera – A, B, C i D, smeštena na različitim hromozomima.

• 230 lncRNK u okviru četri klastera gena HOX

Precizno i sekvencijalno regulisana ekspresija tokom razvića

Regulišući ekspresiju gena HOX tokom razvića –definišu hromatinske domene sa različitom strukturom i dostupnošću RNK polimerazi,

HOX klasteri gena i lncRNK

• HOTAIR RNK (Hox transcript antisense RNA)

• Transkribuje se sa regiona HOXC klastera koji je utišivač

• Utišava ekspresiju gena klastera HOXD

In trans kao molekul vodič targetuje klaster HOXDi regrutuje represivni kompleks za metilaciju histona PRC2

HOTAIR RNK in trans utišava gene HOXD

• HOTTIP RNK (HOXA transcript at the distal tip)

• Transkribuje se sa 5'-kraja klastera HOXA

• Koordiniše aktivaciju nekoliko gena na 5'-kraju klastera HOXA delujući kao pojačivač:

Indukuje formiranje hromatinske petlje što je dovodi u neposrednu blizinu ciljnih gena

Stupa u interkaciju sa WDR5 iz komplesa WDR5/MLL.

MLL uvodi i održava aktivno stanje hromatina

HOTTIP RNK kao pojačivač epigenetički aktivira gene HOXA

Molekul pojačivač

• Antisense transkripti

indukuju metilaciju DNK i represivnu metilaciju histona u promotorima sense gena

Prekomerna ekspresija može indukovati i demetilaciju DNK i povećati ekspresiju sense transkripta

Duge ncRNK in cis regulišu metilaciju DNK