Control de la expresión génica a nivel postranscripcional. Traducción y estabilidad del ARN

Ribosoma

El ARNt también se procesa

•Longitud promedio de 75 a 80 nt.•Se sintetizan por la ARNpolimerasa III•Precursor más largo (pre ARNt)•Modificaciones de bases. (10%)•Eliminación del extremo 5´•´Eliminación de intrón catalizado por proteínas, no por ARN•Región específica (anticodón) que se une a l ARNm (codón)

•Longitud promedio de 75 a 80 nt.•Se sintetizan por la ARNpolimerasa III•Precursor más largo (pre ARNt)•Modificaciones de bases. (10%)•Eliminación del extremo 5´•´Eliminación de intrón catalizado por proteínas, no por ARN•Región específica (anticodón) que se une a l ARNm (codón)

La aminoacil ARNt sintetasa reconoce a su aminoacil-ARNt específico a través de extensas interacciones entre la enzima y varias partes del ARNt:Tallo aceptorTallo Dbucle anticodón

La enzima también reconoce al aminoácido correcto y excluye a los aminoaácidos incorrectos

Aminoacil-tRNA sintetasas

• Une los aa al correcto tRNA• 20 enzimas diferentes• Requiere ATP

Reconocimiento del tARNt:puntos de contacto entre tRNA y sitio activo de proteína (1–5 sitios, muchas veces incluye anticodon)

40S subunit

Ribosomas

4 sitios de bindingmRNA-binding siteA site (aminoacyl)P site (peptidyl)E site (exit)

Procariotas :

subunidades 30s y 50s

Traducción (panorama general)

3 fases

•Iniciación

•Elongación

•Terminación

y Reciclado

INICIACION

Procariotas Eucariotas

Tanscripción- traducción acopladas

Iniciación en mRNAs que se están transcribiendo

Reconocimiento de sitio de iniciación

Reconocimiento de sitio de inicio

(Secuencia Shine-Dalgarno)

3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3)

Iniciación citoplasmática

Estrategias diferentes para interacción

mRNA-RNAr

Traducción Cap-dependiente (Scanning)

Traducción Cap-independiente (IREs)

13 factores diferentes

En la Iniciación

• Hay factores proteicos que según la etapa en que participen se llaman IF, EF y RF (con “e” delante si son eucariotas).

• Participan tres factores:• - IF1 e IF3: estabilizan la subunidad pequeña separada de

la grande.

• Los mensajeros de procariotas tienen el codon de iniciación AUG (con menor frecuencia GUG y más raramente UUG) y “corriente abajo” tienen una secuencia (Shine-Dalgarno) muy conservada rica en purina complementaria de la secuencia del RNA de la subunidad pequeña (16S).

5'--UAAGGAGG(5-10 bases)AUG mRNA

3'--AUUCCUCC........ 16S rRNA

Secuencia Shine- Dalgarno (Procariotas)

5'--ACCAUGG- mRNASecuencia Kozak (Eucariotas)

En procariotas el codón de inicio de la traducción está inmediatamente después de la secuencia Shine-Dalgarno

• secuencia del ARNr 16S complementaria a la Secuencia Shine-Dalgarno

Inicio de la traducción en procariotas

1. Unión de factores de iniciación a la subunidad

30S.

2. Unión del primer tRNA y el ARNm a la subunidad

pequeña.

3. Unión de la subunidad 50S. Hidrólisis de GTP unido a IF2 y liberación de IF2-GDP

del complejo.

• IF2: Permite que el primer aminoacil-tRNA se una al sitio P, asociado a IF2 que ha de estar en forma activa (uniendo un nucleótido GTP) y es esencial.

Es el único aminoacil-tRNA que se une cuando sólo está la subunidad pequeña. La metionina está formilada en el a -amino (formilmetionina).

Cuando se une la subunidad grande se disocian todos los factores proteicos. IF1 e IF3 salen pero IF2 ha de hidrolizar el GTP para salir.

El inicio de la traducción en eucariotas es un proceso más complejo

- Hay muchos más factores de iniciación.

• - No hay secuencias de Shine-Dalgarno.

• - Metionina no formilada.

En la mayoría de casos, en eucariotas, la traducción depende de Cap y ocurre por un mecanismo de “Scanning”

• El modelo de “escaneo” fue propuesto por Marilyn Kozak (1978)

- Reconocimiento m7G-cap en extremo 5´

- Unión de subunidad 40s

- scanning hasta AUG iniciador (ACCAUGG)

• El capuchón del extremo 5’ es reconocido por eIF-4E, que forma un complejo con eIF-4A y eIF4G.

• eIF-4G se une a la proteína de unión a poli A

•Estos factores de iniciación de la traducción, asociados a los extremos 5´y 3´del ARNm dirigen a éste hacia la subunidad ribosómica 40S.

El ARNm es reconocido y dirigido hacia el ribosoma por los factores eIF-4

Inicio de la traducción en eucariotas (Cap dependiente)

1. Formación del complejo de preiniciación 43 S (eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5, subunidad 40S) .

2. Unión del iniciador tRNAiMet a la subunidad menor (participa eIF2-GTP).

3. Unión del ARNm al complejo (participan los factores eIF4, que interactúan con Cap y cola poli A).

4. Localización codón de iniciación (scanning).

5. Unión de la subunidad mayor del ribosoma. eIF5 desencadena la hidrólisis del GPT unido a eIF2 y éste se libera como eIF2-GDP; los otros factores también.

Inicio de la traducción en eucariotas (Cap dependiente)

La hidrólisis del GTP unido a eIF-2 producida por eIF-, provoca la liberación de los factores de iniciación, incluso eIF-2 unido a GDP.

La subunidad 60S se une a la subunidad 40S para formar el complejo de iniciación 80S, iniciándose la traducción.

La subunidad 40S, unida al metionil tRNA y a los eIF chequea al ARNm hasta encontrar un codón AUG

Inicio de la traducción en eucariotas (Cap dependiente)

Inicio de la traducción en eucariotas (Cap dependiente)

Inicio de la traducción en eucariotas (Cap dependiente)

La elongación es similar en procariotas y eucariotasHay tres factores de elongación:•EF-Tu eEF-1a •EF-Ts eEF-1bg •EF-G eEF-2

EF-Tu: Media la entrada del amino acil tRNA

EF-G: Translocación del ribosoma

EF-Ts: Media liberación de EF-Tu-GDP y regeneración de EF-TU-GTP

Participan factores de enlongación unidos a GTP, que guían al aminoacil tRNA hacia el ribosoma (eEF1a y GTP están unidos al segundo aminoacil tRNA).El ribosoma “selecciona” el segundo aminoacil tRNA mediante el centro decodificador ubicado en la subunidad pequeña del ribosoma.

Enlongación

Enlongación

Una vez que se libera eEF1 , a el ribosoma (la subunidad mayor) cataliza la formación del enlace peptídico.

La translocación está mediada por eEF2 y la hidrólisis de GTP. El ribosoma se desplaza tres nucleótidos sobre el ARNm.

La enlongación requiere de eEF1 a unido a GTP.eEF-1bg participa en el proceso de regeneración de eEF1 a unido a GTP.

Terminación

•Uno de los tres codones (UAA, UAG, UGA) se colocan en el sitio A.

• Un factor de liberación reconoce a estos codones en el sitio A.

• El factor de liberación se une al codón de terminación.

• La cadena polipeptídica se libera, seguida de la disociación del ARNt y el ARNm del ribosoma

eRF1 humanoARNt

CCA acceptor stem

anti-codon loopanticodon-like site -TASNIKS-

• termina la traducción

• reconoce a los tres codones STOP

• Facilita la hidrólisis de la unión péptido-tRNA

eRF1

- GGQ -

• El inicio de la traducción dependiente del extremo 5’ es estimulado por la proteína de unión a poli A (Pabp1p), que interacciona con eIF4G.

• Esta interacción circulariza al ARNm y facilita la formación del complejo de iniciación.

• Este mecanismo asegura que solo el ARNm intacto sea traducido.

POLISOMA

POLISOMA

m7Gppp

AUG

Estructura de tallo y bucle

Estructuras del ARNm en el extremo 5´ no codificante

Estructuras del ARNm en el extremo 3´ no codificante

AAAAAAAAAAAAAorf

stop

Elementos ricos en A/U (AREs)

- sitios de unión para proteínas estabilizadors o desestabilizadoras

Elementos de localización del ARNm

- sitios de unión para proteínas que interaccionan con el citoesqueleto - sitios de unión para proteínas (localizadas en lugares específicos

del citoplasma) y que anclan al ARNm en esa región.

Regulación de la traducción

Unión de proteínas represoras que bloquean la traducción. Ejemplo: regulación de la síntesis de ferritina (proteína que almacena hierro como reserva y protege a la célula contra la toxicidad del Fe libre.

Regulación de la traducciónLa misma proteína que regula la traducción del ARNm de la ferritina, controla la degradación del ARNm de la transferrina.

La misma proteína que regula la traducción del ARNm de la ferritina, controla la degradación del ARNm de la transferrina.

Regulación de la traducciónUnión de proteínas represoras que bloquean la traducción mediante la unión a secuencias reguladoras del extremo 3´. Estas proteínas son responsables de la localización del ARNm en regiones específicas de la célula.

Regulación de la traducciónModelo del control de la poliadenilación citoplasmática e inicio de la traducción.

En ovocitos inmaduros, la proteína de unión al elemento de poliadenilación citoplasmático rico en U., reprime la traducción de los ARNm

Cuando se produce la maduración, se activa una proteina quinasa que fosforila a CPEB, liberando al represor. El alargamiento de la cola poli A permite la unión a ésta de la proteína de unión a poli A citoplasmática.

Control de la estabilidad del ARNLa estabilidad de los ARNm es un factor determinante en la eficiencia de la expresión génica.

Vías de degradación del ARNm en eucariotas

Eliminación del casquete(independiente de desadenilación)

Dependiente de desadenilación Endonucleolítica

ARN reguladoresLa interferencia por ARN fue descubierta por primera vez en C. elegans en 1998, cuando Andrew Fire, Craig Mello y col. Encontraron que la infección de ARN de doble cadena inhibía la expresión de un gen con una secuencia

de ARNm complementaria

ARN reguladoresRegulación de la traducción por micro ARN

Los miRNA desempeñan un importante papel en la regulación génica , tanto durante el desarrollo embrionario temprano, desarrollo del sistema nervioso, musculatura,

corazón. Se ha demostrado que muchos miRNA regulan la proliferación y supervivencia de la célula

ARN reguladoresUn miRNA se genera a partir de un precursor (pre-ARNmi) que fue transcripto por la RNA pol II. El precursor puede codificar para más

de un miARN.Drosha se une al RNA de doble cadena y lo corta en la base del tallo, liberando un pre-

miARN de 60 a 70 nucléotidos.Éste es transportado hacia el citoplasma.

En el citoplasma, Dicer se une al pre-miRNA y lo recorta, dando lugar al miRNA.

Por último, los miARN dirigen al complejo RISC hacia un ARN homólogo para inducir su degradación (complementariedad perfecta)

o la inhibición de la traducción, desadenilación y degradación del ARNm

(complementariedad imperfecta)

ARN reguladores

Los ARNi pueden también inhibir la

transcripción.

Inducen modificaciones de histonas que provocan

condensación de cromatina y formación de

heterocromatina

Otro mecanismo de regulación de la traducción en células eucariotas es mediente la modulación, por fosforilaciones, de la actividad de factores de iniciación como eIF2 y eIF4e.

Algunos ARNm eucariotas poseen sitios internos para el ingreso de los ribosomas “internal ribosome entry site” (IRES); éstos están alejados del extremo 5´que

contiene el cap. En estos casos es posible que la traducción ocurra sin el mecanismo de “scanning”.

Esta estrategia es aprovechada por algunos virus, ya que tienen ARNm policistrónicos

Traducción cap-independiente (1988-Picornavirus)

Unión directa de subunidad ribosomal 40s en sitio IRES del ARNm.

• Proteínas que participan en el inicio de la traducción

• Picornavirus clivan el extremo N-terminal de eIF4G, impidiendo la interacción con eIF4E. eIF4G sigue siendo funcional para la iniciación ya que interacciona con eIF3 y probablemente mediante la interacción de una proteína de unión a IRES.

• La unión de Pab1p produce la circularización del ARNm

- proteje al ARN de la degradación - Selecciona ARNm intactos. - Los ribosomas pueden realizar

múltiples ciclos de traducción sin disociarse.

Modificaciones postraduccionales

Plegamiento de proteínas Procesamiento de proteínas

Escisión de proteínasGlicosilación

Anclaje delípidosN-miristoilación

PrenilacónPalmitoilación

FosforilaciónUbiquitinación