Presentacin de PowerPoint

REGULACIN A NIVEL DE PROCESAMIENTO POST-TRANSCRIPCIONALPresentan:

Cataln Maya EmmanuelGarca Ruvalcaba Dulce ElizabethPrez Vergara Ana DeliaTello Garca Luis Abdas

Procesamiento postranscripcional:

Proceso de maduracin del RNA a travs del cual se eliminan los intrones de un transcrito primario para evitar que sea degradado por enzimas una vez que salga del ncleo.A nivel postranscripcional, la regulacin de la expresin de los genes eucariotas se subdivide en:

Splicing diferencialDiferentes sitios de poliadenilacin Estabilidad de los mRNAAlmacenamiento de los mRNASplicing diferencialOcurre cuando un solo gen da lugar a ms de una secuencia de mRNAAl cambiar sitios de splicing se puede introducir un codn de terminacin o cambiar un marco de lecturaEn algunos casos, un solo transcrito primario se empalma en ms de una forma, y los exones internos pueden sustituirse, aadirse o eliminarse. Eleccin del sitio de poliadenilacinOtra posibilidad de obtener varios tipos de mRNAs a partir de un mismo transcrito primario reside en la variabilidad de eleccin del sitio de poliadenilacin.Pueden modificar el extremo carboxi-terminal de la protenaLos diferentes productos de maduracin terminan en polipptidos que poseen actividades totalmente diferentesEstabilidad de los mRNAsLa modificacin de la duracin de la vida de los mensajeros es un factor importante en la regulacin de la expresin de algunos genes. / de protenasEjemplo : La sntesis de histonas est estrechamente acoplada a la replicacin del DNA, teniendo por efecto una perfecta adecuacin entre la cantidad de histonas fabricadas y la del DNA sintetizado.El almacenamiento de los mRNADespus de un estmulo, la variacin en la concentracin de protenas y de mensajeros citoplasmticos puede ser muy rpido mientras que la velocidad de la transcripcin cambia poco, sobreentendindose un nivel de regulacin postranscripcional que estriba en la liberacin de un mRNA que estaba almacenado.Efecto de la temperatura en el procesamiento postranscripcionaldel intrn VP1 del SV40 insertado en vectores de expresintransfectados en clulas de peces

Instituto Superior de Ciencias Mdicas Carlos J FinlayCentro de Inmunologa y Productos Biolgicos (CENIPBI)Camagey, CubaOscar Hernndez BetancourtHiptesisLa baja efectividad de las secuencias no homologas utilizadas como activadores, se deben a las fallas en la maquinaria transcripcional o postranscripcional debido a las bajas temperaturas propias de los cultivos celulares de los peces. Objetivo

Evaluar el efecto de este factor sobre el mecanismo molecular, mediante el empleo del intron VP1 del virus 40 del simio (SV40) insertado en varios vectores de expresin haciendo uso de dos lneas celulares de peces.Las construcciones genticas derivaron del plsmido pSVLEn qu punto o puntos acta exactamente el mecanismo?A los cuales se les insertaron lospromotores:CMV (citomegalovirus humano) RSV (virus del sarcoma de Rous) TK (timidina quinasa)

Cada vector con un promotor dio lugar a tres construcciones genticas:

Una sin intrnOtra con el intrn VP1 del virus 40 del simio (SV40) Y una tercera con el primer intrn INTT de la hormona de crecimiento de trucha.

Para evaluar el efecto de cada intrn ensayado, se conformaron tres series integradas por tres vectores de expresin para cada gen usado: La enzima cloramfenicol acetil transferasa (CAT) La hormona de crecimiento de tilapia (HCti).Serie control

Vectores con el INTT fusionado al ADNc del cat INTT-catVectores carentes de intronesCMV-catRSV-catTK-cat CMV-INTT-cat RSV-INTT-cat TK-INTT-cat catVectoresportadores del intrn VP1VP1-catCMV-VP1-cat RSV-VP1-cat TK-VP1-cat

Cul es la seal o cmo recibe la seal para actuar?Se utilizaron las lneas celulares de peces:EPC (clulas epiteliales de carpa)TO2 (clulas de ovario de tilapia)

La temperatura para el cultivo vari segn la lnea celular: EPC a 30 C, TO2 a 30 C, y posterior a la transfeccin, se cultivaron a 37 C.

Los ensayos se realizaron de forma transitoria por un periodo de 72 h

Incrementa o disminuye la expresin?Se muestra que la inhibicin de la expresin de los genes cat y HCti por parte de los vectores que incluyeron el intrn de SV40, a temperaturas inferiores de 37 C se debi a fallas ocurridas a nivel postranscripcional en el procesamiento del mismo (corte y empalme)Est claro que la temperatura es un factor fsico relacionado con los procesos celulares, e influye en el correcto funcionamiento y control de estos.

< 37 C

Esta comparacin permite evaluar el efecto que tuvo la insercin de los intrones VP1 e INTT sobre la expresin del gen asociado a la temperatura, eso se muestra como la media de las trans-fecciones realizadas en duplicado para vector de la serie.

Estos resultados, corroboran la expresin del gen HCti en el medio de cultivo a 37C que confirma el efecto positivo de este factor sobre la expresin.

El vector que porta el intron VP1 genero la acumulacin de un transcripto primario de talla superior a la esperada , el mecanismo de corte y empalme no fue suficiente cuando se utilizo esta secuencia viral en la lnea celular, inhibiendo los niveles de protena CAT

A 37C la secuencia heterologa empleada (VP1) es correctamente procesada, se muestra la seal del ARNm correspondiente a la construccin del gen, comparable con la de los vectores utilizados.

Confirma el efecto positivo que presenta el incremento de la temperatura sobre el correcto procesamiento de esta secuencia heterologa, posterior a la transcripcin. El intrn VP1 del SV40 se encuentra entre las secuencias empleadas como activador transcripcional para incrementar la produccin de algunas protenas.

Sin embargo se observ que no era muy efectivo para tal propsito en clulas de peces, lo que llev a investigar r el motivo de dicha ineficiencia.

Varios trabajos hacan referencia a que factores fsicos tales como la temperatura tenan un papel importante a nivel molecular.

En este trabajo se observ que efectivamente la temperatura afecta a la maquinaria postranscripcional evitando as que se lleve a cabo el correcto procesamiento (durante el corte y empalme splicing ) del transcrito primario de la secuencia de dicho gen por lo que se genera una acumulacin de este precursor inhibiendo los niveles de la protena CAT.Se mostro por primera vez el efecto positivo que ejerce la temperatura sobre el mecanismo postranscripcional de splicing en un intron aislado de un virus que afecta a clulas de mamfero y que es insertado en vectores de expresin que fueron transfectados en clulas de peces.

Se sugiere un cambio de conformacin en la molcula precursora que favorece el mecanismo a 37C y brinda las bases para el diseo de nuevos experimentos que confirmen esta hiptesis.