20.05.2015

1

LEUKEMIER

Klassifiseringog

Diagnostisk immunfenotyping

1

Leukemi

• Klonal sykdom av hematologiske stamceller.

• Deling av den leukemiske stamcellen fører tilopphopning av umodne blodceller og hemming av de friske stamcellene.

• Kan fører til benmargsvikt med bl.a:

lave trombocytter-blødning

lav Hb

Infeksjonstendens

• Generell sykdomsfølelse, fatigue

2

20.05.2015

2

Hvor begynner vi?WHO- klassifikasjon

3

EiKKr

KreftregisteretNye tilfeller

2007 2012 2013

515 886 997

4

20.05.2015

3

Klassifisering av leukemier

• FAB - Fransk-Amerikansk-Britisk gruppe(1976) basert på morforlogi og immunhistokjemi.

• EGIL - European Group for Immunolgisk klassifisering av leukemier, 1995?- basert på immunfenotype.

• WHO 2008 – Stor internasjonal arbeidsgruppe. Basert på morfologi, cytogenetikk, molekylærgenetikk og flowcytometri.

(REAL -klassifisering av lymfoid neoplasi 2004)

5

Leukemi inndeling• Akutte leukemier

-AML Akutt Myelogen Leukemi (barn og voksne)

-ALL Akutt Lymfoblastisk Leukemi (barn og voksne) Lymfoblastlymfom (voksne)

• Kroniske Leukemier-MNP Myeloproliferative Neoplasier

KML Kronisk Myelogen Leukemi (voksne)

-Lymfoproliferative sykdommerKLL Kronisk Lymfatisk Leukemi (eldre voksne)

• MDS Myelodysplastisk syndrom

6

20.05.2015

4

FAB-klassifisering

AML• Mo- udifferensiert

• M1- uten modningstegn

• M2- med modningstegn

• M3- hypergranulærpromyelocytt

• M4- myelomonocytt

• M5- monoblast

• M6- erytroleukemi

• M7- megakaryoblast

• Andre sjeldne (eosinofili, NK-celle)

ALL

• L1- cytoplasmafattige, små blaster

• L2- mer heterogent med henblikk på cytoplasmarikdom og størrelse

• L3- blaster med basofiltvakuolisert cytoplasma

7

EGIL/FAB klassifikasjon av AML8

Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561

20.05.2015

5

EGIL-klassifikasjon av B-ALL9

Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561

EGIL-klassifikasjon av T-ALL 10

Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561

20.05.2015

6

WHO klassifisering av AML

• AML med genetiske abnormaliteter9 undergrupper

• AML med myelodysplasi relasjon

• AML behandlingsrelatert

• AML NOS (not otherwise specified)11 undergrupper

• Myeloid sarcoma• Myeloid proliferasjon relatert til Downs syndrom

2 undergrupper

11

WHO klassifisering av ALLPrecursor lymfoid neoplasi

• B lymfoblastisk leukemi/lymfom NOS

• B lymfoblastisk leukemi/lymfom med genetiske abnormaliteter.7 undergrupper

• T lymfoblastisk leukemi/lymfom

12

20.05.2015

7

Acute leukemias of ambiguous lineage

• AUL, akutt udifferensiert leukemi

• MPAL, Mixed Phenotype Akutt leukemi (bifenotypisk)5 undergrupper

13

MorfologiAuerstaver

Monocytt - esteraseMyeloperoxidase

MGG

14

20.05.2015

8

Eksempel på ulike teknikker

A: MGG farging B/M utstryk

B: Flowcytometri

C: Cytokjemi

D: Cytogenetikk

E: Molekylærgenetikk: FISH

15

Blood, 2008 111;3941-3967

Hva er flowcytometri?

• Måling av celler i væskestrømCellestørrelse

Celleform

Kompleksitet

Fluorescens

Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten,i cytoplasma eller i kjernen på celler.

16

20.05.2015

9

Hva kan måles med flowcyometri?17

ALL

Perifert blodBeinmarg

18

20.05.2015

10

Hvordan

• Antistoff / antigenbinding

• Lysspredning

• Fluorescens

19

Antistoff / antigenbinding

Membran receptor

Nucleære antigen

Cytoplasmatiske antigen

Cellulære antigen

AntistofferMonoklonale antistoff konjugert med fluorokrom (f.eks FITC, PE osv.)

CD-markører

20

20.05.2015

11

Lysspredning FCS/SSC

Malign populasjon?

21

22

Fluorescens

Hvert fluorokrom har sitt spesifikke exitasjon- og emmisjonsspekter

20.05.2015

12

23

Fluorescens intensitet

Fluorokromer24

Laser

BD Horizon™ V450 (Em-Max 448 nm)

Pacific Blue™ (Em-Max 452 nm)AmCyan (Em-Max 491 nm) BD Horizon™ V500 (Em-Max 500 nm) Alexa Fluor® 488 (Em-Max 519 nm).FITC (Em-Max 520 nm)

R-PE (Em-Max 578 nm),.PE-Texas Red® (Em-Max 615 nm) Texas Red® (Em-Max 620 nm) APC (Em-Max 660 nm), PE-Cy™5 (Em-Max 667 nm) Alexa Fluor® 647 (Em-Max 668 nm).PerCP (Em-Max 678 nm) PerCP-Cy™5.5 (Em-Max 695 nm) Alexa Fluor® 700 (Em-Max 723 nm).APC-Cy™7 (Em-Max 785 nm) APC-H7 (Em-Max 785 nm) PE-Cy™7 (Em-Max 785 nm)

Flere lasere: Opplysning om inntil 10 parametere på hver celle

20.05.2015

13

25

Flowcytometrisk Immunfenotyping

Granulocytter

Monocytter

Lymfocytter

Granulocytter

Monocytter

LymfocytterErytroide forstadier

Erytroide forstadier

”Blastregionen”

Benmarg

SSC/CD45-gatingSSC/FSC-gatingEosinofile

Liv T.N. Osnes

Normal AML ALL ALL

Normal benmarg vs AML vs ALL

Grønn populasjon :Blaster

26

M H Fenstad

20.05.2015

14

Immunfenotype

• Avvik fra normalmønster

• Linjetilhørighet av patolologisk populasjonLymfoid –B eller T, Myeloid

• Akutt eller kroniskSubklassifisering - betydning for behandling/prognose

• Markørkombinasjonerviktig for oppfølging av MRD

27

Immunfenotyping av leukemi

• Konsensuspaneler

• NOPHO/NFCG (nordisk samarbeid)• Felles 6-farge-panel for B-ALL og T-ALL til diagnostikk og MRD

deteksjon

• Fra 2008 har FCM-MRD-funn behandlingsmessig konsekvens

• EMN02 Myelomatose MRD European Myeloma Network (2012)

• EuroFlowJuni-09: Forslag til 8-farge-FCM-paneler for de aller fleste diagnoser (www. EuroFlow.org)

28

20.05.2015

15

Etikett: Dato:

Materiale:Sign lege(r): Prøve tatt: kl:

Prøve analysert: kl:

WBC: x109/L

WBC/analyserør: x106/rør

Kommentar:

Filene exportert til X:\

Sign bioing:

Ekstra Rør FITC µl PE µl

PerCP-CY5.5 µl PE-Cy7 µl APC µl

APC-H7 APC-Cy7 µl

P B / HRZ V450 µl

HRZ V500 µl

Antall events

1CD8 og Lambda

2,5 5

CD56 og kappa

2,5 5

CD19 og TCRgd 2,5 CD3 2,5 CD38 2,5

CD20 og CD4 2,5 CD45 2,5 50000 (LST)

2 CD36 5 CD64 10 CD34 5 CD117 5 CD33 5 CD14 5 HLADR 2,5 CD45 2,5 50000(rør 2 AML

3 cy MPO 5 cy CD79a 5 CD34 5 CD19 2,5 CD7 5 CD3 2,5 cy CD3 2,5 CD45 2,5 50000 (ALOT)

ALOT rør: Før merking må prøven lyseres vha Ammoniumklorid ( NH4Cl). Vask to ganger før vanlig prosedyre for intracellulær merking følges.Benytt intracellulær metode til antistoffer med rød skrift

LST: Benytt 25 µl av mix, tilsett PerCP-Cy5:5, PE-Cy7 og APC-Cy7/H7 i tillegg Tilhører EQS-prosedy re 8482 "Immunfenoty ping v ed flow cy tometri"

Antistoff kombinasjon

8-farge Screening

Panel for screening29

Immunologiske linjemarkører

• Acute leukemia orientation tube (ALOT) (EuroFlow)

ALL, AML, akutt udifferensiert leukemi

B-cellerCD19/CD79a

T-cellerCD7/CD3/cyCD3

Myeloide celler:cyMPO/ (CD13/CD33)

30

Liv T.N. Osnes

20.05.2015

16

Mistanke om leukemi31

Erasmus MC,

32

Litt til nå….!

20.05.2015

17

33

• Leukemi-assosiert fenotype (LAPs)– Umodne celler

(eks CD34, CD117, TdT)

– Asynkron/abberant markør ekspresjon(eks: dobbelpositive CD13-CD7, CD13-CD19)

– Antigen overekspresjon

– Fravær av linjespesifikke markører(spes T-ALL CD7+/CD3-)

– Unormal lysspredning(FSC/SSC)

Minimal residual disease(MRD)

• Molekylært/cytogenetisk/immunfenotypiskbevis for rest-sykdom

• Rest-sykdom kan ikke påvises ved vanlig mikroskopering (morfologisk remisjon:<5% leukemiceller)

• Flow cytometri– Sensitivitet <0,01% (hvis nok celler)– Abberant fenotype (viktig redskap i MRD oppfølging)

34

20.05.2015

18

35

Flowcytometrisk immunfenotyping

• Identifisering av celletype– B- vs T-celle, myeloid– Moden vs umoden– Myeloid vs lymfoid

forstadium

• Kvantitering– Mengde/dominans av

maligne celler

• Karakterisering– Abberante fenotyper– Prognose– Monitorering

• Konklusjon

Normal? �+ leg �+arm �+ mouth�+ eyes

FC Analysis: Abnormal!

�The legs don’t go witharms, eye or mouth

�Decrease in eyes

36

20.05.2015

19

37

Takk for oppmerksomheten ! 38