06-proizvodnja i preČiŠĆavanje biotehnoloŠkih molekula
DESCRIPTION
06-PROIZVODNJA I PREČIŠĆAVANJE BIOTEHNOLOŠKIH MOLEKULATRANSCRIPT
PROIZVODNJA I
PREČIŠĆAVANJE
BIOTEHNOLOŠKIH MOLEKULA
Docdr Lejla Pojskić
BIOTEHNOLOŠKA PRODUKCIJA
Neophodnost ekonomičnosti procesa
Potreba za stalnim unapređenjem za kontrolu
kvaliteta procesa Proizvodnja do konačnog produkta
Purifikacija ciljanog produkta
Karakterizacija ciljanog produkta
BIOLOŠKI SISTEMI ZA EKSPRESIJU
Ćelije domaćina koji sadrže stabilno
inkorporiranu rDNA (gen od interesa)
Eukariotske (kvasci gljive biljne animalne i
sisarske) i prokariotske stanice (bakterije)
Izbor sistema prvenstveno zavisi od prirode i
izvora ciljanog proteina namjene i ekonomskih
troškova procesa Ne može bilo koja ćelija producirati bilo koji protein ndash
npr kada je protein stran ćeliji domaćinu translacija se
može postići no u procesu posttranslacijske modifikacije
mogu se desiti neke neželjene promjene u kvalitetu
proteina
Bakterije npr ne mogu producirati glikoproteine jer
nemaju kapacitet za ovu vrdtu PT modifikacije
KRITERIJI ZA IZBOR SISTTEMA ZA
EKSPRESIJU
Karakteristika
produkta
Prokariotski
domaćin
Eukariotski
kvasac
Eukariotski
sisar
Koncentracija Visoka Visoka Niska
Molekulska
masa
Niska Visoka Visoka
Disulfidni
mostovi
Ograničeno Neograničeno Neograničeno
Sekrecija Ne DaNe Da
Agregatno
stanje
Inkluzijska
tijela
Pojedinačno
nativna forma
Pojedinačno
nativna forma
Folding Pogrešan Precizan Precizan
Glikozilacija Ne Moguća Moguća
Retrovirus Ne Ne Moguće
Pirogen Moguće Ne Ne
BILJKE KAO SISTEMI ZA EKSPRESIJU
BIOTEHNOLOŠKIH LIJEKOVA
Iako je stabilna ekspresija humanog albumina
postignuta u ćelijskim kulturama krompira i
duhana ipak se još uvijek proučava
Nestabilnost biljnog genoma
Drugi biljni produkti (fenolna jedinjenja) mogu
uticati na strukturu ciljnog proteina
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOTEHNOLOŠKA PRODUKCIJA
Neophodnost ekonomičnosti procesa
Potreba za stalnim unapređenjem za kontrolu
kvaliteta procesa Proizvodnja do konačnog produkta
Purifikacija ciljanog produkta
Karakterizacija ciljanog produkta
BIOLOŠKI SISTEMI ZA EKSPRESIJU
Ćelije domaćina koji sadrže stabilno
inkorporiranu rDNA (gen od interesa)
Eukariotske (kvasci gljive biljne animalne i
sisarske) i prokariotske stanice (bakterije)
Izbor sistema prvenstveno zavisi od prirode i
izvora ciljanog proteina namjene i ekonomskih
troškova procesa Ne može bilo koja ćelija producirati bilo koji protein ndash
npr kada je protein stran ćeliji domaćinu translacija se
može postići no u procesu posttranslacijske modifikacije
mogu se desiti neke neželjene promjene u kvalitetu
proteina
Bakterije npr ne mogu producirati glikoproteine jer
nemaju kapacitet za ovu vrdtu PT modifikacije
KRITERIJI ZA IZBOR SISTTEMA ZA
EKSPRESIJU
Karakteristika
produkta
Prokariotski
domaćin
Eukariotski
kvasac
Eukariotski
sisar
Koncentracija Visoka Visoka Niska
Molekulska
masa
Niska Visoka Visoka
Disulfidni
mostovi
Ograničeno Neograničeno Neograničeno
Sekrecija Ne DaNe Da
Agregatno
stanje
Inkluzijska
tijela
Pojedinačno
nativna forma
Pojedinačno
nativna forma
Folding Pogrešan Precizan Precizan
Glikozilacija Ne Moguća Moguća
Retrovirus Ne Ne Moguće
Pirogen Moguće Ne Ne
BILJKE KAO SISTEMI ZA EKSPRESIJU
BIOTEHNOLOŠKIH LIJEKOVA
Iako je stabilna ekspresija humanog albumina
postignuta u ćelijskim kulturama krompira i
duhana ipak se još uvijek proučava
Nestabilnost biljnog genoma
Drugi biljni produkti (fenolna jedinjenja) mogu
uticati na strukturu ciljnog proteina
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOLOŠKI SISTEMI ZA EKSPRESIJU
Ćelije domaćina koji sadrže stabilno
inkorporiranu rDNA (gen od interesa)
Eukariotske (kvasci gljive biljne animalne i
sisarske) i prokariotske stanice (bakterije)
Izbor sistema prvenstveno zavisi od prirode i
izvora ciljanog proteina namjene i ekonomskih
troškova procesa Ne može bilo koja ćelija producirati bilo koji protein ndash
npr kada je protein stran ćeliji domaćinu translacija se
može postići no u procesu posttranslacijske modifikacije
mogu se desiti neke neželjene promjene u kvalitetu
proteina
Bakterije npr ne mogu producirati glikoproteine jer
nemaju kapacitet za ovu vrdtu PT modifikacije
KRITERIJI ZA IZBOR SISTTEMA ZA
EKSPRESIJU
Karakteristika
produkta
Prokariotski
domaćin
Eukariotski
kvasac
Eukariotski
sisar
Koncentracija Visoka Visoka Niska
Molekulska
masa
Niska Visoka Visoka
Disulfidni
mostovi
Ograničeno Neograničeno Neograničeno
Sekrecija Ne DaNe Da
Agregatno
stanje
Inkluzijska
tijela
Pojedinačno
nativna forma
Pojedinačno
nativna forma
Folding Pogrešan Precizan Precizan
Glikozilacija Ne Moguća Moguća
Retrovirus Ne Ne Moguće
Pirogen Moguće Ne Ne
BILJKE KAO SISTEMI ZA EKSPRESIJU
BIOTEHNOLOŠKIH LIJEKOVA
Iako je stabilna ekspresija humanog albumina
postignuta u ćelijskim kulturama krompira i
duhana ipak se još uvijek proučava
Nestabilnost biljnog genoma
Drugi biljni produkti (fenolna jedinjenja) mogu
uticati na strukturu ciljnog proteina
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
KRITERIJI ZA IZBOR SISTTEMA ZA
EKSPRESIJU
Karakteristika
produkta
Prokariotski
domaćin
Eukariotski
kvasac
Eukariotski
sisar
Koncentracija Visoka Visoka Niska
Molekulska
masa
Niska Visoka Visoka
Disulfidni
mostovi
Ograničeno Neograničeno Neograničeno
Sekrecija Ne DaNe Da
Agregatno
stanje
Inkluzijska
tijela
Pojedinačno
nativna forma
Pojedinačno
nativna forma
Folding Pogrešan Precizan Precizan
Glikozilacija Ne Moguća Moguća
Retrovirus Ne Ne Moguće
Pirogen Moguće Ne Ne
BILJKE KAO SISTEMI ZA EKSPRESIJU
BIOTEHNOLOŠKIH LIJEKOVA
Iako je stabilna ekspresija humanog albumina
postignuta u ćelijskim kulturama krompira i
duhana ipak se još uvijek proučava
Nestabilnost biljnog genoma
Drugi biljni produkti (fenolna jedinjenja) mogu
uticati na strukturu ciljnog proteina
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BILJKE KAO SISTEMI ZA EKSPRESIJU
BIOTEHNOLOŠKIH LIJEKOVA
Iako je stabilna ekspresija humanog albumina
postignuta u ćelijskim kulturama krompira i
duhana ipak se još uvijek proučava
Nestabilnost biljnog genoma
Drugi biljni produkti (fenolna jedinjenja) mogu
uticati na strukturu ciljnog proteina
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
ŽIVOTINJE KAO SISTEMI EKSPRESIJE
CILJNIH PROTEINA
Još se istražuje
Prednost je relativno veća sigurnost upotrebe u
liječenju ljudi
Ipak neželjeni efekti na organizam domaćina su
privremeno zaustavili korištenje enimalnih
sistema u svrhu produkcije humanih terapeutika
(npr eritropoetin u kravljem mlijeku)
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOREAKTORI ILI FERMENTERI (SISTEMI ZA
KULTIVACIJU)
Posude sa tečnom hranjivom podlogom (medijem) u kojima su ćelije suspendirane pričvršćene na mikrosferama imobilizirane u monosloju ili matricama u čvrstom stanju
Od izbora i tipa kulture zavisi izbor separacijskih i purifikacijskih procedura
Masovna produkcija biotehnološkog produkta odvija se u bioreaktorima u kojim se vrši neprestana homogenizacija kultura
Ovisno o tipu mješanja razlikuju se vrste bioreaktora sa mehaničkim miješanjem
sa zračnim miješanjem
sa mikronosačima i
membranski bioreaktori
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOTEHNOLOŠKI PROTOKOLI
Fermentacijski protokoli Lotovski (diskontinuirani)
Kontinuirani
Sterilni uslovi bez mikroorganizama
Mjere bezbjednosti su određene internacionalnim
standardima (WHO i sl)
Najčešće model-kulture za proizvodnju proteina
za ljudsku upotrebu su Ćelije ovarija kineskog hrčka ndash CHO
Ćelije bubrega infanta kineskog hrčka ndash BHK
Limfoblastoidne tumorske ćelije (za proizv interferona)
Ćelije melanoma ndash plazminogen aktivator
Ćellinije hibridoma ndash monoklonalna antitijela
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOREAKTOR SA
MEHANIČKIM
MIJEŠANJEM
Tip nutrijenta Sadržaj
Šećeri Glukoza laktoza
saharozamaltoza
dekstrini
Masti Masne kiseline
trigliceridi
Voda (sterilna) injekciona
Aminokiseline glutamin
Elektroliti K Ca Na fosfati
Vitamini C-vitamin B
kompleks folati
Serum (teleći
fetalni sintetski)
Albumin
transferin
Minerali u tragu FeMn Cu Co Zn
Hormoni Faktori rasta
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
PROBLEM KONTAMINACIJE U
BIOREAKTORIMA
Maksimalna čistoća produkta (gt=99) za humanu parenteralnu upotrebu (EMEA1999)
Postprodukcijska purifikacija ndash rezultira sa bioaktivnim proteinima sa definisanim osobinama za ljudsku upotrebu
Uklanjanje ldquosvihrdquo mogućih kontaminanata
Izvor Kontaminant
Iz domaćina Virusi proteini
varijante glikozilacije
N- i C- terminalne
varijante endotoksini
(iz Gram negativnih
bakterija)
Porijeklom od
produkta
Mutacije denturisani
protein konformacijski
izomeri dimeri i
agregati varijante
bisulfidnog uparivanja
deamidne varijante
fragmenti proteina
Porijeklom iz
procesa
Faktori rasta
purifikacijski reagensi
metali dijelovi kolona
za prečišćavanje
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
PURIFIKACIJA BIOTEHNOLOŠKOG
PRODUKTA
Razdvajanje
produkta od
biološkog sistema sa
svim pripadajućim
komponentama
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
POSTPRODUKCIJSKO PROCESIRANJE
BIOTEHNOLOŠKOG PRODUKTA (GLIKOZILIZIRANI
REKOMBINANTNI INTERFERON )
TEČNA ĆELIJSKA KULTURA
Tangencijalna filtracijacentrifugiranje
bull (uklanjanje ćelija ćelostataka virusa)
Ultrafiltracija
dijafiltracija
bull Koncentriranje tečne kulture bez ćelija
Hromatrografija anjonskom izmjenom
Uklanjanje proteina lipida DNK i virusa
Filtracija
Filtracija sa 40nm filterima
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija katjonskom izmjenom
Uklanjanjanje serumskih proteina i transferina
Adsorpcija
Virusna inaktivacija
Ultrafiltracija
Uklanjanje precipitata i virusnih ostataka
Hromatografija hidrofobnih interakcija
Uklanjanje proteinskih kontaminanata
Ultrafiltracija
Dijafiltracija
Koncentriranje i prilagođavanje fizičkih
svojstava
Hromatografija na permeabilnom gelu
Formulacija separacija od agregata
Filtracija
Sterilna filtracija produkta
Punjenje i označavanje etiketiranje
FINALNA FORMA PRODUKTA
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOTEHNOLOGIJE
1 Bioprocesno inženjerstvo
2 Monoklonalna antitijela
3 Staničnaćelijska kultura
4 Tkivno inženjerstvo
5 Genetičko inženjerstvo
6 Bioinformatika
7 Mikročipovi
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
STANIČNE KULTURE
Predstavljaju nezamjenjivo sredstvo u
savremenim molekularno-biološkim
biotehničkim i biomedicinskim istraživanjima
kao biološki model tj
Biotehnologija najšire primijenjivana u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
Predstavljaju uzgoj stanica različitih tipova i
porijekla u strogo kontroliranim uslovima
Sterilnosti
Temperature
Svjetlosti
Izvora hrane
Stimulatora i supresora rasta i
Drugih faktora
STANIČNE KULTURE
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
VRSTE KULTURA
Mikrobne kulture
Bakterije gljivice jednoćelijske i nitaste alge
Escherichia coli Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Pichia
pastoris
Chlorella vulgaris Chlamydomonas dysosmos
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
VRSTE KULTURA
1 Uzgoj u tekućem mediju
hranjivi sastojci potrebni za bakterijski rast
minimalni medijmdash mineralne soli izvor ugljika i energije (glukoza)
potpuni (ldquobogatirdquo) medij mdash soli aminokiseline vitamini nukleotidni prekursori itd
mdash LB-medij (Luria-Bertani tripton kvaščev ekstrakt NaCl)
2 Uzgoj na tvrdoj podlozi
Tekući medij uz dodatak agara
Kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij)
Posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterizabilno
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
TIPOVI MEDIJA
Bogati (LB 2XTY TB
puferiran sa fosfatnim
puferom)
Ekstrakt kvasca
Tripton
NaCl
pufer
1048708 Fosfatni pufer
1048708 Izvor dušika (amonijev
klorid amonijev sulfat)
1048708 Izvor ugljika (glukoza ili
glicerol)
1048708 Metali u tragovima (Ca
Co Cu Fe Mn Mo Se and
Zn)
1048708 vitamini (biotin tiamin
folat riboflavinniacinamid
PABA
pantotenat i piridoksin)
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
KRIVULJA RASTA BAKTERIJSKE
POPULACIJE U KULTURI
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
ANALIZA RASTA
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
MODEL EUKARIOTSKE KULTURE
Saccharomyces cerevisiae
bulljednostavan za uzgoj u laboratoriju
ndash
bullGeneracijsko vrijeme-vrijeme diobe
15-2 h na 30degC
bull haploidni i diploidni životni ciklus
bull diploidnost omogućava mutacije
esencijalnih gena koji bi bili letalni
u haploidnom soju
bull geni iz različitih sojeva mogu se
kombinovati ukrštanjem
bull može se uzgajati fermentacijom na
glukozi ili respiracijom na izvoru
ugljika kao što je glicerol ili etanol
što nije moguće kod viših eukariota
ndashidealan za studij mitohondrijskih
proteina potrebnih za stanično
disanje
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
ANIMALNE KULTURE
direktno od embrionalnih odraslih ili tumorskih stanica
monoslojevi (kontaktna inhibicija)
sa i bez sposobnosti dijeljenja
humani fibroblasti ndash zadržavaju sposobnost dijeljenja
originalni diploidni kariotip stupanj diferenciranosti
visoka replikabilnost in vivo stanja
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Izolacijom ili obogaćivanjem ćelija iz tkiva za potrebe istraživanja
Metode
-mehaničkim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-enzimskim ldquorazbijanjemrdquo tkiva
-separacijomcentrifugiranjem na osnovu gustoće (+ ili -)
-selektivnim prijanjanjem (plastika najlon i sl)
-separacija na osnovu karakteristika plazmamembrane (+ ili -)
(FACS MACS)
-selektivni rast ili selektivni toksicitet
Cilj ćelijske izolacije je omogućiti maksimalan broj vijabilnih čistih i
funkcionalnih ćelija za potrebe dalje kultivacije i manipulacije
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
KAKO SE DOBIJAJU PRIMARNE
KULTURE
Faktori uspješnosti izolacije primarnih kultura
1 Tip tkiva
2 Vrsta
3 Starost donora (i dužina post-mortem perioda)
4 Medij za disocijaciju
5 Enzimi za disocijaciju
6 Nečistoće enzima koji se koriste za disocijaciju
7 Koncentracije enzima koji se koriste za disocijaciju
8 Temperatura
9 Vrijeme inkubacije
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
STANIČNE LINIJE
Nastaju pasažiranjem ili transformacijom primarnih staničnih kultura
To podrazumijeva fiziološku adaptaciju induciranu nekom od hemikalija (34-benzpiren nitrozometil urea) ili virusima (Rous sarkoma virus)
Fiziološke promjene neograničena sposobnost dijeljenja (nema kontaktne inhibicije) brži rast fiziološka svojstva slična tumorskim stanicama ujednačenost fenotipa
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
TIPOVI STANIČNIH LINIJA
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
VRSTE STANIČNIH KULTURA
1 adherirajuće kulture bull stanice rastu adherirane na podlogu bull primarne kulture normalne diploidne stanične linije tumorske stanične linije 2 stanične suspenzije bull hibridoma stanice HeLa tumorske stanične
linije bull male gustoća st ndash st na dnu posude bull visoka gustoća st ndash uz miješanje (areacija) ndash kontrolirani uvjeti rasta (temperatura medij
pCO2) ndash posuđe netoksično po mogućnosti prozirno i sterilizabilno ndash održavanje stalnog broja pasažiranjem
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Adherirajuće ćelije su
bullOvisne o podlozi i
obično rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu je
preduvjet za proliferaciju
bullKontaktna inhibicija-
prestaju se dijeliti u
konfluenciji
bullU konfluenciji neke
ćelije počinju odumirati
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
VRSTE STANIČNIH KULTURA
Suspenzije su
bullNisu ovisne o podlozi i
ne rastu u monosloju
bullVezanost za podlogu
nije preduvjet za
proliferaciju
bullHematopoetske ćelije
neke transformirane i
neke maligne tumorske
linije
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
STANDARDNI OSNOVNI MEDIJI
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
OSTALI MATERIJAL ZA UZGOJ
ANIMALNIH STANICA
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
RAZLIKE U RASTU KULTURE
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
SUBKULTIVACIJA PRESAĐIVANJE
PASAŽIRANJE
Adherirajuće kulture ndash stanice prije unošenja u novi medij treba odvojiti od podloge
1048708 Tripsinizacija (serum inhibira tripsin)
1048708 Struganje (može oštetiti staničnu membranu)
1048708 Razdvajanje stanica koje se drže zajedno (raspuhivanje)
1048708 Kulture u suspenziji ndash prebacivanje manje količine stanica u svježi medij
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BROJANJE STANICA
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
STERILIZACIJA
Suha sterilizacija 1048708 160degC 2 h ili 180degC 30 min 1048708 Stakleno posuđe Autoklaviranje 1048708 tlak 13-14 bar 120degC 15-20 min 1048708 Mediji za rast bakterija i kvasaca 1048708 stakleno posuđe laboratorijska plastika (nastavci za pipete Eppendorf epruvete) Zračenje 1048708 Neionizirajuće ndash UV- sterilizacija prostora 1048708 Ionizirajuće γ sterilizacija ndash plastičnih boca i Petrijevki za uzgoj staničnih kultura Filtracija 1048708 022 μm filteri 1048708 Mediji i otopine koje nisu stabilne pod visokim tlakom i
temperaturom
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Stem ćelije su pluripotentne ili multipotentne ćelije koje u toku embrionalnog razvića daju diferencirane ćelije organizma a u toku postnatalnog života učestvuju u održavanju adultnih tkiva u toku perioda odrastanja i starenja i u procesu regeneracije tkiva nakon oštećenja Stem ćelije mogu biti totipotentne pluripotentne i multipotentne Totipotentna stem ćelija (oplođena jajna ćelija) može da
se razvije u sve poznate ćelije osim ćelija trofoblasta
Pluripotentne stem ćelije su ćelije unutrašnje ćelijske mase blastociste ranog embriona
Multipotentne stemprogenitorne ćelije naseljavaju skoro sve organe adultnog organizma
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
MATIČNE (STEM) ĆELIJE Razlikuju se od diferenciranih somatskih ćelija
po
1 sposobnosti samoobnavljanja i neograničene diobe u toku embrionalnog i postnatalnog razvoja
2 sposobnosti diferencijacije u sve tipove ćelija u toku embrionalnog razvića (pluripotentnost) ili u više tipova ćelija (multipotentnost)
3 izrazita migtarornost
4 u slučaju transplantacije stem ćelija kod životinja kojima se vrši transplantacija duž alogenih i ksenogenih barijera dolazi do stvaranja otpornosti na reakciju odbacivanja kalupa tj indukuje se tkivna tolerancija
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
MATIČNE (STEM) ĆELIJE
Zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro s jedne strane i pluripotentnosti s druge matične ćelije predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva za praktičnu kliničku primjenu u tzv ldquoregenerativnoj medicinirdquo ili ldquotkivnom inženjerstvurdquo U ovom momentu svedoci smo velikog napretka u proučavanju stem ćelija a u neposrednoj budućnosti može se očekivati snažan napredak u njihovoj terapijskoj upotrebi naročito u upotrebi humanih embrionalnih stem ćelija
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOREAKTORI
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOREAKTORI
Osnovna pravila za konstrukciju bioreaktora ne smije postojati povezanost sterilnog i nesterilnog dijela u
sustavu na najmanju mogucu mjeru treba smanjiti spojeve s
prirubnicama (opasnost od kontaminacije) što je više moguce koristiti zavarene spojeve maksimalno moguce smanjiti ldquomrtve ugloveldquo i ldquodžepoveldquo dijelovi procesnih sustava moraju se moci odvojeno sterilizirati svaki spoj s reaktorom mora imati toplinsku barijeru (sterilna
zaštita) npr sustav dvostrukih ventila koristiti ventile i ostalu armaturu koja se lagano sterilizira
(npr membranski i kuglasti ventili) za vrijeme rada bioreaktora osigurati stalni pretlak sterlinog
zraka ili sterilnog inertnog plina ili osigurati hermeticko zatvaranje osigurati zaštitu radne okoline od izlaska radnog
mikroorganizma
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
BIOREAKTORI
koristiti pogodne meterijale (manji reaktori mogu biti od stakla) veci i
industrijski bioreaktori izraduju se od nerdajuceg celika osugurati dovoljnu pogonsku snagu za miješanje sadržaja u
reaktoru velicinu reaktora potrebno je procijeniti prema
a) ukupno projektiranom kapacitetu postrojenja b) riziku-gubitku zbog kontaminacije c) mogucnostima isporucitelja reaktora d) zakonskih opterecenja u prometu
godišnji kapacitet proizvodnje P= koncentracija proizvoda V = volumen tekuce faze u raktoru Tb =
vrijeme trajanja procesa i vrijeme potrebno za postavljanje procesa ( u danima) n= broj
reaktora E= efikasnost procesa gubici u vreemenu (dani) zbog mogucih poremecaja u
prostoru oo tlocrtni raspored bioreaktora provesti na nacin da se što više skrati
duljina cjevovoda
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
OSNOVNI TIPOVI BIOREAKTORA
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK