Teknik Teknik Dasar Dasar dalam dalam MikrobiologiMikrobiologi

Pengantar tentang teknik dalam mikrobiologi

• Satu jenis mikroorganisme di alam berinteraksi dengan mikroorganisme lain (mixed culture)

• Untuk mempelajari morfologi, fungsi, dan karakter lain satu jenis mikroorganisme maka mikroorganisme tersebut perlu dipisahkan dari mikroorganisme lainnya dan diperbanyak sehingga diperoleh kultur murni (pure culture)

• Media tumbuh, pengenceran, teknik mengisolasi, dan teknik perhitungan jumlah sel diperlukan untuk memisahkan dan menumbuhkan mikroorganisme secara terpisah dari mikroorganisme lain, dan menduga jumlah awalnya.

• Media tumbuh harus steril agar tidak ada mikroorganisme kontaminan

Lima Teknik Dasar dalam Mikrobiologi

1. PENGAMBILAN & PENGIRIMAN SPESIMEN

Collection & transportation of Good quality specimen for microbiological examination is

crucial

Ose atau loop inokulasi untuk gores langsung pada proses inokulasi dan isolasi

2. INOKULASI: menanam mikroorganisme ke dalam media

Streaking/gores langsung dengan 3 kwadran

4. ISOLASI: memisahkan sel satu dari yang lain atau memisahkan mikroorganisme dari campurannya

Teknik Streaking/goresan

3. INKUBASI: menanam atau memasukkan sampel mikroorganisme ke dalam media dan menumbuhkannya pada suhu tertentu selama waktu tertentu

Hasil gores langsung setelah inkubasi 18-48 jam.

Bagaimana mengevaluasi?

Pengenceran dan Pour Plating/Spreadplating

untuk Inokulasi dan Isolasi

Batang drügalsky untuk Spread Plating

Media tumbuh dan sterilisasi• Media tumbuh dapat berupa media padat

atau media cair• Setelah media dibuat, maka media

disterilisasi dengan autoklaf. • Tempat untuk media juga harus disterilisasi• Ruang dan alat untuk bekerja juga harus

steril • Saat bekerja harus selalu aseptik• Pembuatan media dan sterilisasi akan

dijelaskan lebih rinci saat praktikum

– sterilisasi media dan alat dengan uap panas (Steam) dan tekanan tinggi. (menggunakan autoklaf)

uap menghasilkan tekanan yang tinggi didalam sistem ruangan tertutup sehingga temperatur lebih cepat naik (Contoh alat : Autoklaf Gmbr 7.6 )

• Alat alat dapat juga disterilisasi dengan pembakaran pembakaran Oose /loop di atas bunsen (Gambar 7.8).

Isolasi adalah suatu teknik memisahkan satu sel dari sel lain, kemudian menumbuhkan dan memperbanyaknya sehingga diperoleh kultur murni

• Perlu media padat steril yang sesuai• Perlu pengenceran untuk mengurangi konsentrasi sel supaya sel

terpisah satu dari yang lain.• Kadang diperlukan pengkayaan terlebih dahulu jika

mikroorganisme yang akan diisolasi jumlahnya sedikit.• Teknik isolasi yang sering dilakukan adalah dengan cawan

tuang, cawan sebar dan cawan gores.• Sel yang telah terpisah akan tumbuh di media membentuk koloni

yang dapat dilihat dengan mata tanpa bantuan mikroskop.• Masing masing koloni dianggap berasal dari satu sel, kemudian

ditumbuhkan pada media padat steril di dalam tabung dan disimpan untuk dipelajari lebih lanjut.

• Pembuatan media padat steril, pengenceran dan teknik isolasi akan dijelaskan lebih rinci saat praktikum

Yang diperlukan dalam isolasi dan Kultivasi Kultur murni mikroba :Medium pertumbuhanMetode inokulasi :- Streak (gores/gesek)- Spread (Sebar)- Pour(tuang)InokulumKoloni

Contoh mikroorganisme hasil cawan tuang dari tanah

Jika suspensi tanah di encerkan kemudian 1 ml dari hasil pengenceran masukkan ke petridish steril dan diberi media dan diratakan. Setelah diinkubasi 2x24 jam akan terlihat hasil seperti gambar disamping. Berbagai jenis mikroorganisme tumbuh di media.

Isolasi dan Kultivasi Kultur Murni• Metode inokulasi :

- Streak (Gmbr A)Inokulum digoreskan di permukaan medium agar nutrien dengan menggunakan Oose

- Spread (Gmbr B)1-2 tetes inokulum disebarkan merata dipermukaan agar nutrien dengan menggunakan batang L (drügalsky)

- Pour (Gmbr C)Inokulum di masukkan ke agar nutrien yang masih cair namun bertemperatur hangat, kemudian dituangkan merata ke dalam cawan petri

A

B C

• Teknik enrichment culture (Gmbr 28.4)

Preservasi Kultur Murni• Kultur murni yang telah diperoleh

harus tetap hidup dan terjaga kemurniannya dalam jangka waktu panjang untuk digunakan saat diperlukan

• Penyimpanan dalam jangka waktu pendek (hari-bulan, tergantung kekuatan mikroorganisme)disimpan dalam kulkas (suhu 4-100C)

• Penyimpanan dalam jangka waktu panjang kultur disimpan: - tangki Nitrogen cair (-1960C)- dalam keadaan beku (-70 – 1200C)- dalam keadaan beku,didehidrasi,dan dikemas dalam keadaan vakum (disebut Liofiliasi / freeze-drying) Gmbr

TEKNIK DASAR 4. EXAMINATION (PENGENALAN/ PEMERIKSAAN MIKROORGANISME /INSPEKSI)

•PEWARNAAN SEL

>Sel perlu diwarnai sebelum diamati dengan mikroskop agar

lebih mudah dan lebih jelas terlihat.

>Ada berbagai teknik pewarnaan sel. Jika hanya

menggunakan satu pewarna, maka disebut pewarnaan

sederhana. Jika menggunakan dua atau lebih dari dua

pewarna disebut pewarnaan komplek/pembeda (Differential

Staining).

>Pewarnaan pembeda bertujuan untuk membedakan satu

kelompok sel dengan kelompok sel lain, atau untuk

membedakan bagian bagian sel

•>Pewarnaan Gram, pewarnaan kapsul, dan Pewarnaan

spora adalah tiga dari beberapa pewarnaan pembeda.

> Pewarnaan gram digunakan untuk mengetahui apakah sel

bakteri yang diamati masuk dalam kelompok bakteri gram

positif atau kelompok bakteri gram negatif.

> Pewarnaan spora digunakan untuk mengetahui apakah sel

yang diamati memiliki endospora atau tidak memiliki

endospora

•>Pewarnaan kapsul digunakan untuk mengetahui apakah

suatu sel mikroba menghasilkan lapisan kapsul

> Teknik pewarnaan akan dibahas lebih rinci saat Praktikum

Tahapan Pewarnaan Gram

• Ditemukan oleh Christian Gram (th.1884)

• Metode pewarnaan Gram dibagi menjadi dua: Gram Positif (sel bakteri tetap menyimpan pewarna kristal violet) dan Gram Negatif (pewarna kristal violet pada sel bakteri hilang tercuci alkohol)

• Perbedaan tersebut terjadi karena perbedaan struktur dinding sel bakteri

Pengamatan Morfologi Sel Mikroorganisme

• Teknik yang digunakan dalam pengamatan sel mikroorganisme pewarnaan :– Pewarnaan Sederhana – Pewarnaan Gram– Pewarnaan Diferensial :

• Pewarnaan kapsula• Pewarnaan Flagela• Pewarnaan Spora• dll

Ringkasan Persiapan Pengujian dengan menggunakan Mikroskop

Penghitungan Jumlah Sel Mikroorganisme

• Teknik menduga jumlah sel mikroorganisme di alam atau disuatu bahan yang sering dilakukan adalah plate counting, Most Probable Number, dan menggunakan haemasitometer.

• Ketiga teknik ini akan diterangkan secara rinci saat praktikum.

• Masih banyak teknik lain yang digunakan dalam mikrobiologi. Misalkan 1) untuk mengetahui produk yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme, 2) Apakah suatu mikroorganisme berperan dalam terjadinya penyakit atau berperan dalam pengendalian penyakit, 3) Apakah suatu mikroorganisme berperan dalam meningkatkan ketersediaan hara untuk pertumbuhan tanaman dll.

Identifikasi cepat dengan API 20E Bio-Mireux

Dasar identifikasi adalah reaksi enzimatis/ biokimiawi

TEKNIK DASAR 5. IDENTIFICATION

Identifikasi cepat dengan API 50-CH Bio-Mireux

Dasar identifikasi adalah reaksi enzimatis/biokimiawi