Patologia generale

Lezione del 28\10\2013

Prof. Teti

APOPTOSI E NECROSI

La metaplasia è un processo del tutto reversibile, contrariamente a quello che succede nei tumori, dove il processo è irreversibile quando è dovuto a una modificazione strutturale dei geni, non a un'alterazione epigenetica. Mentre, abbiamo detto, la metaplasia è un processo reversibile perché, se si allontana lo stimolo nocivo o la stimolazione è di breve intensità e durata, l'alterazione è soltanto fenotipica (quindi alterazione morfologica della differenziazione) e di tipo reversibile, proprio perché il genoma cellulare è integro e quindi l'espressione dei geni prima repressi, o diversamente espressi, può ritornare nella norma. Nonostante ciò, la metaplasia, come vi accennavo la volta scorsa, è un processo che, nonostante sia reversibile e nonostante sia un processo di adattamento delle cellule in determinate condizioni ambientali, può costituire il punto di partenza per l'instaurarsi di altri processi patologici. Vi ricordavo la volta scorsa che, quando si ritrova un carcinoma polmonare [...], è logico dedurre che questo sia un' evoluzione di una metaplasia squamosa, infatti ci sono diversi passaggi tra un processo metaplastico e uno neoplastico, in seguito all'instaurarsi di stimoli nocivi che possono indurre un'iperplasia. Già vi ho detto la volta scorsa che, nelle condizioni in cui c'è un processo metaplastico con un aumento della proliferazione, noi possiamo definire delle reazioni precancerose e quindi è molto più facile l'instaurarsi di un processo iperplastico in un tessuto metaplastico, piuttosto che in un tessuto normale. Le cellule andate incontro a metaplasia, sotto stimolo ormonale, funzionale, chimico, fisico, traumatico, che può indurre un aumento della proliferazione, possono andare incontro a quelle lesioni che abbiamo definito precancerose, come per esempio i polipi intestinali. Successivamente, sempre a livello di queste lesioni, che sono reversibili e non neoplastiche, se ci sono altri fattori, come per esempio esposizione a sostanze chimiche o diciamo condizioni che possono determinare più facilmente un danno a livello della struttura dei geni(quindi delezione, mutazione ecc), si passa a una condizione neoplastica vera e propria. Per esempio non è difficile la transizione tra polipo intestinale a cancro del colon. Quindi sono tutti passaggi in cui queste condizioni di adattamento, come la metaplasia, in risposta a stimoli, danni o agenti lesivi, similmente all'iperplasia, sono maggiormente esposti e sensibili, a lungo andare, all'azione di agenti cancerogeni. Questi agenti, che danno lesioni a livello genico, sono agenti cancerogeni veri e propri e queste cellule sono maggiormente esposte agli agenti oncogeni rispetto alle cellule normali e, di conseguenza, può essere il punto di partenza per una condizione neoplastica.

Abbiamo detto che l'iperplasia è l'altra risposta adattativa delle cellule che hanno mantenuto la loro attività proliferativa e l'aumento della proliferazione. L'iperplasia è dovuta all'attivazione dei geni che codificano per i fattori di trascrizione coinvolti nell'attivazione genica che sono: C- Fos , C-Jun , C-Myc , coinvolti nella cosiddetta risposta precoce, quindi sono espressi nella prima metà della fase G1. Per quanto riguarda le cellule cosiddette stabili, diciamo che queste possono andare incontro a proliferazione, se sottoposte a determinati stimoli. Un esempio è l'epatectomia parziale

che dà luogo a un aumento della proliferazione per l'azione di agenti ossidanti, di citochine, di carico metabolico e può dare luogo a un aumento della proliferazione perché sono preponderanti i fattori di crescita, nel topo sopratutto EGF (epidermal Growth factor), ma anche FGF (fibroblast growth factor), e sono poi in equilibrio con sostanze che possono intervenire successivamente e che inibiscono la proliferazione,per cui abbiamo un aumento di questi fattori che inibiscono la crescita, in particolare per l'epitelio il TGF-Beta (trasforming growth factor), e la riduzione dei fattori di crescita,i cosiddetti fattori adiuvanti,di cui abbiamo parlato l'altra volta (sono i fattori di promozione e progressione del ciclo mitotico)

L'ipertrofia è l'aumento del volume di un tessuto per aumento dei componenti strutturali perché è espressione di un aumento della richiesta funzionale, di una richiesta lavorativa aumentata, di stimoli ormonali, che comportano un maggior impegno metabolico e funzionale, per cui aumentano gli organuli preposti alla sintesi proteica, alla respirazione ecc e quindi le cellule aumentano di volume. Dobbiamo tenere presente che, sebbene ipertrofia e iperplasia siano processi del tutto diversi tra di loro (uno comporta l'aumento del numero di cellule, l'altro del volume), non si escludono a vicenda, possono anche verificarsi frequentemente e, come abbiamo visto nelle lezioni che abbiamo fatto, sono innescate dagli stessi meccanismi, cioè richiesta funzionale o stimolo ormonale. Per esempio un aumento del volume dell'utero può essere dovuto a entrambi i processi(iperplasia e ipertrofia). In altri casi anche se le cellule possono dividersi, magari possono non rispondere a un processo di stimolo funzionale, non vanno incontro a iperplasia, ma vanno incontro a ipertrofia, se sono presenti dei fattori che inibiscono la proliferazione. Dobbiamo sempre tener conto che ogni processo biologico, fisiologico e sopratutto patologico è sottoposto al controllo di fattori che lo attivano e lo inibiscono e il risultato dipende dal prevalere degli uni o degli altri, quindi anche cellule capaci di proliferare, se sottoposte a determinati stimoli possono non proliferare e andare incontro a ipertrofia se sono presenti fattori che inibiscono la proliferazione,in particolar modo il TGF-beta.

Questa [slide] è la risposta del miocardio a un aumentato stretching meccanico, all'azione di alfa agonisti e fattori di crescita. Vediamo che le cellule miocardiche rispondono con un'ipertrofia, però c'è sempre un'attivazione dei geni target dei fattori di trascrizione, C-Fos, C-jun e C- Myc, che non portano all'iperplasia, ma che portano a un aumento dell'attività contrattile,aumenta la risposta allo stress, quindi aumentano le cosiddette proteine chaperon, ad esempio heat shock protein, c'è uno switch delle isoforme dell'actina e della miosina (l'actina diventa Alfa-actina simile a quella della muscolatura scheletrica) , c'è il cambiamento di isoforma dell'ATPasi Na\K dipendente e riduzione dei beta recttori. Importante da un punto di vista funzionale è l'aumento del fattore natriuretico atriale (ANP), che agisce eliminando liquidi e sodio, quindi è utile per l'attività funzionale cardiaca e, di conseguenza, anche questo è un meccanismo di adattamento e di risposta a una maggiore richiesta funzionale.

L'atrofia è il contrario dell'ipertrofia, in cui si ha una riduzione del volume per riduzione delle attività metaboliche, cioè le cellule riducono le loro funzioni a quelle minime necessarie per la loro sopravvivenza. Come fanno a ridurre le loro funzioni? Riducendo i loro organuli cellulari e questo comporta proprio una distruzione di questi organuli e quindi una riduzione del volume della

cellula, che diventa più piccola perché contiene un minor numero di organuli. Queste condizioni di atrofia sono diverse e ci sono varie cause. Le principali sono:

Diminuito carico di lavoro a livello muscolare, Perdita di innervazione, ad esempio nella poliomielite l'atrofia muscolare è proprio dovuta

a una perdita di innervazione, quindi perdita di attività e trofismo da parte dei nervi, Diminuito apporto di sangue, che determina una riduzione dell'attività funzionale delle

cellule, Inadeguata nutrizione, Riduzione stimolazione endocrina, Invecchiamento.

Con questo sistema le cellule cercano di stabilire un equilibrio dinamico diverso dal precedente e ne stabiliscono uno meno valido,però utile per la condizione in cui si trovano. Questo nuovo equilibrio comporta solo la sopravvivenza e non altre funzioni che la cellula non può più assolvere. Le cellule che vanno incontro ad atrofia, se lo stimolo permane, vanno in apoptosi, cioè non è una condizione che può perdurare a lungo per cui o finisce lo stimolo che ha indotto l'atrofia, e in tal caso si ritorna alla condizione precedente, oppure, se lo stimolo perdura, le cellule vanno incontro a morte programmata,l'apoptosi. Come arriva la cellula a questo risultato? - Mediante il blocco della sintesi di nuovi organuli, infatti sapete che gli organuli sono sottoposti a un continuo turnover. - Mediante la degradazione degli organuli già presenti. Questo turnover è sotto il controllo di alcuni ormoni, per esempio l'insulina, gli ormoni tiroidei, i glicocorticoidi, le prostaglandine, che sono dunque coinvolti nel controllo degli organuli all'interno delle cellule. Se c'è un'atrofia prolungata, quindi una condizione di degradazione proteica che può anche essere lieve, ma che è continua nel tempo, si incorre in una condizione di morte cellulare, come accade per esempio nelle distrofie muscolari. La distrofia muscolare è l'esito di questo lungo periodo di atrofia, causato da varie condizioni, che portano poi alla morte delle cellule muscolari. Ovviamente, in questo turnover di degradazione degli organuli sono molto importanti le Heat Shock Protein, che ricoprono le proteine alterate e le avviano alla distruzione a livello del proteasoma. L'atrofia, però, non sempre si realizza per attivazione del proteasoma, ma, a un certo punto, può coinvolgere anche le idrolasi lisosomiali e questo porta a un processo che si chiama autofagia, cioè la cellula mangia se stessa e questo si manifesta con la formazione di vacuoli, si perde citoplasma, si perdono gli organuli e si realizzano questi vacuoli autofagici, che sono espressione di questa attività idrolitica lisosomiale dell'atrofia. C'è un particolare tipo di atrofia, chiamata atrofia bruna, che è evidente nella cute delle persone anziane ed è causata dall'invecchiamento e porta proprio alla formazione di questi vacuoli e alla presenza, all'interno di questi vacuoli, di alcuni granuli di lipofuscina, che danno una colorazione bruna e che sono l'espressione dei prodotti di digestione della cellula parzialmente digeriti.

Tutti i comportamenti della cellula analizzati finora sono tesi al mantenimento dell'equilibrio omeostatico delle dimensioni di un tessuto. L'altra condizione che entra in gioco nel mantenimento dell'equilibrio omeostatico è la morte cellulare, prevalentemente per apoptosi.

L'apoptosi è in equilibrio con i fattori che favoriscono la proliferazione per mantenere costante le dimensioni di un tessuto. Ci sono due possibilità di morte cellulare:

Apoptosi Necrosi

Vedremo che anche in questo caso una non esclude l'altra, cioè una cellula che va incontro ad apoptosi potrebbe andare incontro anche a necrosi. Vediamo quali sono le differenze più importanti tra i due processi.

Partiamo dalle differenze morfologiche.

Dobbiamo considerare differenze che riguardano la plasmamembrana, cioè il punto chiave che regola tutte le funzioni della cellula, non a caso nei tumori la prima ripercussione dell'alterazione dei geni è a livello della plasmamembrana. Nella necrosi la plasmamembrana è alterata, perché la necrosi è dovuta essenzialmente all'azione di tossine o a condizioni di ipossia, quindi ridotta disponibilità di ossigeno, che riduce la capacità di produrre molecole come l'ATP e questo altera la possibilità da parte della plasmamembrana di mantenere in attività la pompa Na\K e quindi si ha un accumulo di sodio all'interno della cellula e un richiamo di liquidi e questo comporta un rigonfiamento, non solo della cellula, ma anche degli organuli cellulari, compresi i lisosomi, il che porta alla liberazione di enzimi idrolitici.

Sia nella necrosi sia nell'apoptosi si hanno delle alterazioni a livello della membrana plasmatica, si formano infatti queste estroflessioni che si chiamano BLEBS. Inizialmente si formano piccole estroflessioni, successivamente iniziano a esserci alterazioni a livello nucleare.

Le BLEBS della necrosi si fondono una con l'altra, diventando più grandi. Un'altra cosa da notare è che all'interno di queste estroflessioni in una cellula in necrosi NON ci sono gli organuli cellulari, che rimangono al centro della cellula. Il contrario avviene nell'apoptosi, in quanto le estroflessioni NON si fondono tra di loro e in queste estroflessioni ci sono organuli cellulari ancora vitali e funzionanti

Altre differenze sono a livello nucleare .

Per quanto riguarda l'apoptosi a livello del nucleo si può notare la frammentazione del DNA in piccoli pezzi di lunghezza uguale tra di loro e molto regolari, non a caso un test per vedere se la cellula è in apoptosi è proprio lo studio della frammentazione del DNA, mentre a livello della cellula in necrosi il nucleo va incontro a lisi, picnosi o caveolisi, in quanto il DNA viene frammentato in maniera disorganica e caotica dagli enzimi lisosomiali, mentre la frammentazione del DNA nell'apoptosi è dovuta ad altri enzimi che si chiamano CASPASI, che agiscono in punti precisi del DNA, cioè hanno un'azione specifica su alcuni punti della struttura del DNA, in quanto vanno a distruggere il DNA a livello dei residui di acido aspartico, presenti a livello internucleosomale. Quindi la rottura del DNA avviene a livello internucleosomale, per azione di enzimi specifici che sono le CASPASI. Nel caso della necrosi, invece, il DNA viene distrutto da enzimi lisosomiali che non hanno alcuna attività specifica. La cellula, che va incontro a necrosi, presenta poi delle soluzioni di continuità a livello della plasmamembrana, si ha, infatti, la rottura della plasmamembrana e la fuoriuscita di tutto il contenuto cellulare al di fuori della cellula. Gli organuli hanno perso la loro vitalità e non sono più funzionanti. La conseguenza della fuoriuscita del contenuto intracellulare è l'INFIAMMAZIONE. Quindi, possiamo dire che una necrosi è causa di INFIAMMAZIONE. La morte per necrosi distrugge le cellule circostanti determinando il processo infiammatorio, mentre l'apoptosi non crea nessuna risposta infiammatoria perché non c'è rottura della membrana e le BLEBS si approfondiscono sempre di più fino a formare i cosiddetti corpi apoptotici, che contengono ognuno di essi un numero di organuli cellulari ancora vitali e funzionanti. Questi corpi apoptotici a loro volta vengono fagocitati, però, dato che sono vitali, hanno dei recettori sulla superficie e questo è importante perché vengono impegnati dei recettori specifici dei macrofagi, che riconoscono delle strutture presenti sui corpi apoptotici, non determinando di conseguenza la risposta da parte di geni proinfiammatori. I macrofagi hanno molti recettori sulla loro membrana, alcuni di questi attivano la via di trasduzione del segnale che porta all'attivazione di geni proinfiammatori e abbiamo l'infiammazione, altri, invece, non sono collegati e non attivano la via di trasduzione del segnale che attiva i geni poinfiammatori, ma attivano altre vie di trasduzione del segnale che determinano poi la distruzione e la formazione di corpi apoptotici, senza implicare geni proinfiammatori. I corpi apoptotici, avendo dei ligandi ben precisi, interagiscono con i macrofagi dotati dei recettori che non attivano i geni proinfiammatori, infatti la morte per apoptosi non determina infiammazione per questo motivo. Bisogna, inoltre, sottolineare che le cellule apoptotiche possono essere fagocitate non solo dai macrofagi, ma anche dalle cellule parenchimali vicine. Le cellule parenchimali, infatti, presentano funzioni fagocitiche solo ed esclusivamente nei confronti di questi corpi apoptotici. Quindi, il risultato della morte per necrosi o apoptosi è completamente diverso. L'apoptosi proprio per le sue caratteristiche e per la non produzione di infiammazione è stata paragonata alla caduta delle

foglie. Si distingue, dunque, dalla necrosi, perché SOLO con l'apoptosi le cellule contribuiscono all'equilibrio omeostatico di un tessuto ed è inoltre fondamentale per bloccare lo sviluppo delle cellule cancerose e per distruggerle. Ci sono molti tumori in cui l'apoptosi gioca un ruolo fondamentale, in quanto l'alterazione dell'apoptosi stessa è un meccanismo fondamentale attraverso il quale il tumore si sviluppa. Le leucemie sono un esempio eclatante di come la riduzione dell'apoptosi possa essere un presupposto fondamentale per lo sviluppo della malattia e per la presenza di un numero elevato di cellule cancerose. Il malfunzionamento dell'apoptosi è implicato anche in altre condizioni patologiche che non sono solo quelle neoplastiche, per esempio nelle malattie neurodegenerative, in cui l'apoptosi sia in eccesso. La morte eccessiva di cellule del sistema nervoso può per esempio determinare il Prakinson. L'AIDS è un'altra condizione in cui si ha attivazione dell'apoptosi, determinata dall'interazione della glicoproteina del virus con il recettore CD4 dei linfociti T. Quindi l'eccesso dell'apoptosi è un danno per l'organismo, per esempio nel Parkinson, nell' AIDS, nello stroke ischemico. Allo stesso modo un difetto dell'apoptosi può essere causa di danno come per esempio nei tumori. Quindi non è l'evento causa di malattia, ma l'equilibrio nel quale questo evento si inserisce, alterandolo. L'apoptosi si confronta con altri fattori, come la proliferazione.

Qui ho riassunto le differenze in relazione agli stimoli, in quanto le cause sono diverse. La necrosi è dovuta essenzialmente all'azione di sostanze tossiche o a condizioni di ipossia, che alterano la capacità della cellula di produrre ATP. Diciamo quindi che una condizione fondamentale della necrosi è la riduzione della produzione di ATP, cosa che non avviene nell'apoptosi, anzi la produzione di quantità sufficienti di ATP è condizione affinché si verifichi l'apoptosi: infatti, in parole povere, l'apoptosi è un processo ATTIVO (In biologia si definisce un processo attivo o passivo a seconda che si utilizzi ATP). In questo caso l'apoptosi è un processo attivo perché ha bisogno dell'ATP perché si realizzi, mentre la necrosi si realizza perché manca l'ATP.

Per l'apoptosi ci sono stimoli patologici e fisiologici, quindi è innescata sicuramente da eventi patologici, ma anche da eventi fisiologici.

Da un punto di vista morfologico come si presenta la cellula in necrosi e come si presenta in apoptosi? La cellula in necrosi si presenta rigonfia perché al suo interno ha liquidi, quindi sodio e acqua. La cellula che va incontro ad apoptosi è invece una cellula raggrinzita. E' come se la cellula si raggrinzisse (Si dice shrinked = raggrinzito). La cellula può entrare in apoptosi anche senza andare incontro ad atrofia. Nell'apoptosi si attivano questi enzimi che vanno a frammentare il DNA, ma vanno a frammentare anche altri substrati, per cui la cellula si raggrinzisce. Certo è che la cellula non si rigonfia perché l'ATP è bello e funzionante, però c'è proprio il raggrinzimento perché questi enzimi, che si chiamano CASPASI, idrolizzano molti substrati, per cui la cellula si raggrinzisce. Dunque qui non c'entra il discorso dell'osmosi, qui c'entra l'attivazione di enzimi che distruggono strutture cellulari, per cui la cellula va incontro a raggrinzimento.

Un altro concetto importante, proprio per le cause che riguardano la necrosi e l'apoptosi, è il coinvolgimento delle cellule, cioè nella necrosi sono coinvolte molte cellule, si può dire che sia

coinvolto tutto il tessuto, perché è inverosimile che una o due cellule siano sottoposte all'azione di tossine o a ipossia, in quanto, in una possibile condizione di ipossia, è coinvolto tutto il tessuto o se ci sono delle tossine, queste riguardano un grande numero di cellule. Invece, l'apoptosi riguarda la singola cellula o al massimo due cellule, in quanto è un processo attivato dalla stessa cellula esposta a un determinato stimolo fisiologico o patologico. L'apoptosi dunque si realizza o per un’interazione tra ligandi e recettori presenti sulla cellula o perché la cellula ha subito un grave danno al DNA e decide di attivare il programma di morte per evitare di trasmettere il danno alle cellule figlie, quindi è una decisione presa da una cellula di fronte a un determinato stimolo. Quindi, è l'attivazione di un programma (non a caso si parla di morte programmata) che si trova all'interno della cellula, dunque è un meccanismo volontario della cellula, che decide di attivarlo. Nella necrosi è coinvolta una massa cellulare, perché è la massa esposta all'ipossia o all'azione di tossine, quindi è un evento passivo, cioè le cellule sono danneggiate o dalla carenza di ossigeno o dalla presenza di tossine.

Nell'apoptosi la cromatina viene condensata, quindi la frammentazione del DNA determina la condensazione della cromatina, cosa che non avviene invece nella necrosi. Nella necrosi abbiamo la distruzione degli organelli in seguito all'ingresso di sodio e di acqua, proprio per questo gradiente di osmolarità che si realizza nella necrosi; organelli che si mantengono vitali all'interno dei corpi apoptotici, anche se ridotti in seguito ad atrofia.

Il meccanismo che porta alla necrosi è quello mediato dalla deplezione di ATP, in quanto le cause che inducono la necrosi sono tutte cause che determinano una diminuzione della produzione di ATP, cosa che non si verifica nell'apoptosi. Quindi, qual è il meccanismo dell'apoptosi? L'attivazione genica, cioè il "programma" è scritto sui cosiddetti geni della morte (è brutto dirlo, ma è così), che vengono attivati. Quindi si ha un processo di attivazione genica, quindi un processo attivo, che richiede ATP e che determina l'attivazione di geni prima poco espressi o non espressi o espressi a livello [uno starnuto non mi permette di capire bene la parola]. Questa attivazione genica comporta a sua volta l'attivazione di alcuni enzimi, tra cui le ENDONUCLEASI, ma anche di altri enzimi che intervengono nell'apoptosi. Nell'apoptosi non c'è danno di membrana che invece è presente nella necrosi e che è dovuto a un'alterazione della pompa Na\K per deplezione dell'ATP e, inoltre,a causa di un aumento di acqua c'è anche un'attivazione dei radicali liberi: infatti c'è un danno da radicali liberi, che non c'è nell'apoptosi.

La reazione tissutale è diversa perché nella necrosi si ha l'infiammazione, nell'apoptosi non si ha infiammazione perché i corpi apoptotici vengono fagocitati. Voi sicuramente sapete che la fagocitosi è alla base dell'infiammazione, non c'è infiammazione senza fagocitosi, per cui quando vi dico che i corpi apoptotici vengono fagocitati potete non ritrovarvi. Però vi ho spiegato che i corpi apoptotici all'interno contengono organuli perfettamente vitali e sulla loro membrana, perfettamente integra, presentano dei ligandi che interagiscono con dei recettori sui macrofagi che non attivano i geni proinfiammatori, ecco perché non c'è infiammazione nonostante ci sia la fagocitosi.

Se non ci fosse l'apoptosi, non si avrebbe uno sviluppo armonico e ordinato durante lo sviluppo embrionale, in quanto durante lo sviluppo embrionale c'è una tumultuosa proliferazione e

replicazione cellulare, che porta a un eccesso di cellule che poi devono essere eliminate proprio attraverso l'apoptosi.

Caratteri fondamentali dell'apoptosi sono dunque lo shrinkage, quindi questo raggrinzimento, che rende la cellula più piccola, per cui il citoplasma risulta più denso e gli organelli sono ammassati. La cromatina si addensa alla periferia, subito sotto la membrana nucleare e queste masse sono ben definite, proprio perché intervengono questi enzimi che agisco a livello internucleosomale, quindi sono ben definiti, anche se hanno varie forme di grandezza. Anche il nucleo si può frammentare. A livello della membrana si formano queste BLEBS, che poi vanno incontro a un approfondimento maggiore fino a quando si frammenta la cellula e si formano i corpi apoptotici, rivestiti da membrana integra e formati da citoplasma e da organelli impacchettati, ma ancora vitali. La fagocitosi si realizza anche da parte delle cellule parenchimali adiacenti, oltre che da parte dei macrofagi. La cosa sorprendente è che quando una cellula andata incontro ad apoptosi viene fagocitata, nell'uno o nell'altro modo, immediatamente viene sostituita da una cellula nuova, che va a ricoprire il vuoto lasciato dalla cellula apoptotica, senza che vi sia danno a livello tissutale e questo è alla base del mantenimento dell'equilibrio omeostatico. L'importanza dell'apoptosi nello sviluppo embrionale è data dal comportamento di questa molecola di segnale morfogenetico, che si chiama SHH ( Sonic Hedgehog Homolog), molecola connessa con l'apoptosi e fondamentale nello sviluppo degli organi dell'embrione di drosophila perché agisce secondo il proprio gradiente di concentrazione, cioè viene prodotta dalla notocorda e poi si diffonde in base a un gradiente di concentrazione e in base al gradiente di concentrazione stesso si ha lo sviluppo di vari organi e apparati. Questa molecola interagisce con un suo recettore che si chiama PTC1 (Patched One) e questo legame induce le cellule a proliferare e a sopravvivere. Se però questo recettore rimane privo del suo ligando, perché l'SHH viene prodotta in minore quantità o perché c'è un gradiente in cui la concentrazione di questo fattore morfogenetico è bassa, il recettore stesso perde la sua porzione intracitoplasmatica, che viene idrolizzata, e espone un dominio che attiva l'apoptosi. Quindi lo stesso processo può indurre o proliferazione e sopravvivenza o morte cellulare a seconda della concentrazione di questo fattore SHH, per cui se questo manca o è ridotta la sua concentrazione, si ha l'attivazione dell'apoptosi perché viene degradata la porzione intracitoplasmatica del recettore Patched 1 e quindi vengono attivate le CASPASI. Il gene si chiama HH e controlla la segmentazione dell'embrione di Drosophila e si è visto che nei moscerini in cui era alterato, mutato o deleto questo gene e quindi il fattore morfogenetico non veniva prodotto, il moscerino in questione assumeva un aspetto genetico molto strano caratterizzato da estroflessioni che somigliavano alle spine del riccio o dell'istrice, da questo deriva il nome Hedgehog (= istrice,riccio). Vi sto parlando di questa molecola non solo per farvi capire che nei processi proliferativi si possono innescare, in determinate condizioni, processi apoptotici, ma anche perché questa molecola è importante per la sopravvivenza e per la proliferazione cellulare in età adulta, non solo nel periodo embrionale, perché è coinvolta nella divisione della cellula staminale e può essere coinvolta anche nella patogenesi di alcuni tipi di cancro.

L'apoptosi è fondamentale anche nella risposta immunitaria, in quanto durante il processo di sviluppo dei linfociti T si possono formare anche dei cloni di cellule autoreattive che devono essere eliminate mediante l'apoptosi: infatti, se non ci fosse un adeguato processo apoptotico, noi

andremmo incontro a malattie autoimmuni. Anche l'attività citotossica dei CD8+ è mediata da un processo apoptotico un po' particolare perché, interagendo con la cellula target, liberano perforina che determina la formazioni di pori a livello della membrana e così inoculano Granzyme che è una serin-proteasi. Le CASPASI si chiamano così perchè C= cisteina ASP = acido aspartico, cioè il sito attivo è dato dalla cisteina e idrolizzano le proteine a livello dell'acido aspartico. Ora il Granzyme va sempre ad agire sull'acido aspartico, ma non è una cistein-proteasi, bensì una serin-proteasi, quindi il suo sito attivo è dato dalla serina, non dalla cisteina per cui è una CASPASI-simile. Dell'apoptosi si dice che è una morte pulita, perché non determina infiammazione, e programmata , perché determina l'attivazione dei geni della morte e altruista. Noi non abbiamo le mani palmate perché, per fortuna, abbiamo avuto l'apoptosi che ci ha distrutto le membrane interdigitali.

Vediamo di capire meglio i meccanismi dell'APOPTOSI. L'apoptosi è un processo abbastanza complesso ed è controllata da diversi segnali, che possono agire sia dall'esterno della cellula sia dall'interno della stessa cellula, distinguiamo dunque:

VIA ESTRINSECA: attivata da segnali esterni, VIA INTRINSECA: attivata da segnali interni, derivanti sopratutto da un danno a livello del

DNA.

I segnali esterni possono essere sia attivanti l'apoptosi sia inibenti. Quindi, se consideriamo questi fattori che incidono sull'apoptosi, possiamo trovare anche le tossine che sono quelle che agiscono determinando la necrosi, poi

- Ormoni, - Fattori di crescita, - NO (ossido nitrico), - Citochine, che attraversano la membrana e inducono questa risposta. Come vi ho detto questi segnali possono essere sia positivi, che negativi. Se sono segnali positivi, inducono l'apoptosi, ma la cellula, prima di avviare il proprio programma di morte, ci pensa due volte. La cellula attiva coscientemente l'apoptosi, però si vuole assicurare che sia proprio necessario, per cui, anche se riceve segnali positivi, per capire se l'apoptosi è necessaria, ritarda un po' il processo, cioè lo fa passare attraverso delle "Forche Caudine", in modo poi da attivarla. La cellula riesce a fare questo grazie all'inserimento, lungo la via di trasduzione del segnale di morte, di proteine regolatrici. Queste proteine sono diverse a seconda che il segnale di morte provenga dall'interno o dall'esterno.

Se il segnale di morte proviene dall'interno queste proteine regolatrici sono coinvolte nella funzionalità mitocondriale, quindi si tratta di proteine della famiglia BCL, coinvolte nella regolazione della permeabilità mitocondriale. Sono proteine regolatrici perché una volta che viene alterata la permeabilità mitocondriale, viene attivata la via apoptotica intrinseca.

Se il segnale di morte proviene dall'esterno le proteine regolatrici sono caratterizzate da proteine adattatrici,cioè proteine che si inseriscono nella porzione intracitoplasmatica del recettore della morte. Infatti, i segnali esterni vanno a interagire con dei recettori della morte presenti sulle cellule. Una volta che è avvenuta l'interazione, non si ha subito l'attivazione dell'apoptosi, ma a livello del recettore, impegnato con il ligando della morte, vanno ad inserirsi delle proteine cosiddette adattatrici,che a loro volta legano le CASPASI,che così si attivano. Ci sono, dunque, degli intermediari tra il recettore, che interagisce con il ligando della morte, e le CASPASI, che poi sono quelle responsabili dell'apoptosi. Quindi l'apoptosi si attiva, se per esempio il segnale perdura,ma se la cellula si rende conto che è possibile evitare l'apoptosi, allora in questo modo può non attivare il programma di morte cellulare.

I fattori che inducono i segnali apoptotici esterni possono essere rappresentati dal ligando del TNFR, sono recettori della famiglia del TNF (Tumor Necrosis Factor) e ve ne sono di due tipi:

- TNFR 1 - TNFR 2

Un altro recettore è il FAS (anche chiamato CD95), che interagisce con un ligando che si chiama Fas-ligand. Ricapitolando abbiamo due tipi recettori:

TNFR (1 e 2), recettore per il TNF, FAS (CD95), recettore per il FAS-ligando.

In realtà c'è un terzo tipo di recettore che si chiama DR4- DR5

Questi sono i principali recettori che legano i ligandi che attivano l'apoptosi, ma ci sono anche altre condizioni che attivano l'apoptosi, come il calore, le radiazioni, la carenza di sostanze nutritive che portano prima all'atrofia, poi all'apoptosi. Ancora possiamo menzionare i glicocorticoidi: infatti, un eccesso di terapia cortisonica può portare a una deplezione di linfociti. Prima si ha una spremitura del midollo e quindi una maggiore presenza di linfociti T in circolo,ma una prolungata terapia cortisonica può proprio portare a una deplezione centrale dei linfociti, per questo non bisogna mai esagerare con la terapia cortisonica, se non strettamente necessario.

Una delle risposte più rapide quando viene attivata l'apoptosi è la degradazione di alcuni enzimi chiave della riparazione del DNA. Cioè alcuni enzimi implicati nella riparazione del DNA vengono subito eliminati nel momento in cui viene attivata l'apoptosi, per evitare, in caso di danno eccessivo che richieda troppo tempo per la riparazione, che lo stesso danno venga trasmesso alle cellule figlie. Viene quindi disattivato, per prima cosa, un enzima importante nella riparazione del DNA che è l'enzima PARP ( Poli ADP-ribosio polimerasi), che fa parte del complesso del riparosoma e che recupera molecole di poliribosio da parte del NAD e li porta in substrati fondamentali per la riparazione del DNA. Quindi è un enzima che depaupera il NAD di molecole di ribosio e li porta a livello del DNA danneggiato: infatti PARP riconosce proprio siti del DNA danneggiato e ha la capacità di polimerizzare e quindi di riparare il DNA. PARP presenta tre domini:

-DNA-binding, che lega il DNA,

- Dominio catalitico, che ha questa attività polimerasica,

- Dominio di auto modificazione, in quanto tutti questi enzimi polifunzionali hanno la capacità di modificare la loro conformazione.

Durante l'apoptosi PARP viene idrolizzata dalle CASPASI, che ne determinano la frammentazione in due porzioni:

- Uno molto piccolo di 24 kD che interagisce con il DNA danneggiato,

- Un'altra parte che contiene la porzione catalitica e che rimane con il riparosoma.

La presenza di questo frammento legato al sito del DNA impedisce il legame delle endonucleasi al DNA stesso, quindi non solo viene impedito il processo di riparazione mediato da PARP, ma viene impedito anche qualsiasi altro processo di riparazione, perché il sito è coperto dal dominio DNA-binding del PARP, quindi si impedisce l'accesso alle endonucleasi e quindi il processo di riparazione (le endonucleasi scindono per poi polimerizzare e riprodurre il nuovo frammento). Ricapitolando: la grossa porzione del PARP rimane legato al riparosoma ed è costituito dal dominio catalitico e dal dominio di auto modificazione, mentre il dominio DNA-binding rimane invece legato al sito danneggiato del DNA, impedendo l'azione di qualsiasi enzima coinvolto nella riparazione, lo lascia danneggiato. Questa scissione di PARP agisce in due modi:

1. Mediante un impedimento sterico dovuto al legame del dominio DNA-Binding con il DNA danneggiato,

2. Mediante l'altra porzione rimasta legata al riparosoma, che ovviamente non è più efficiente e funzionante, per la mancanza appunto del DNA-binding.

Ci possono essere delle conseguenze diverse se questo processo non è sotto controllo, perché l'attivazione del PARP, in condizione di normalità, può essere utile alla riparazione del DNA, in quanto questo è uno stimolo dato da agonisti di un recettore NMDA di glutammato, che agisce attraverso questo recettore e porta alla produzione di ossido nitrico. Se l'ossido nitrico è a basse concentrazioni (L'ossido nitrico, sapete, è un potentissimo radicale libero, coinvolto anche nell'infiammazione, infatti è un mediatore gassoso dell'infiammazione), determina un danno del DNA e se il danno è breve si ha l'attivazione della PARP e la riparazione, se invece il danno al DNA è eccessivo, si ha un over-attivazione di PARP con deplezione del NAD, perché va a rifornirsi di ribosio a livello del NAD, per cui si ha una ribosilazione del NAD eccessiva, dunque deplezione del NAD, riduzione di ATP e quindi anche morte cellulare. Questo è il meccanismo del duplice effetto dell'attivazione di PARP.

Consideriamo l'apoptosi attivata dal meccanismo intrinseco, quindi danno del DNA. Abbiamo detto che ci sono delle proteine regolatrici, che regolano la risposta apoptotica, abbiamo infatti visto poco fa che c'è questo meccanismo intermedio, che cerca di vedere se effettivamente è necessario arrivare all'apoptosi e che regolano la permeabilità della membrana mitocondriale. Per esempio l'ossido nitrico, essendo radicale libero, agisce a livello del potenziale della membrana mitocondriale, aumentando la permeabilità e questo porta a due eventi fondamentali. 1. Liberazione del citocromo C, 2. Liberazione di alcuni prodotti che attivano l'apoptosi, presenti sempre a livello del mitocondrio e questi prodotti si chiamano SMAC\ DIABLO. SMAC = Second Mitochondria-derived Activator of Caspases [La prof ha detto "apoptosis",ma credo si sia sbagliata perchè su Wikipedia e sul libro c'è scritto "Caspases"] e sono secondari all'aumento della permeabilità mitocondriale.

Il citocromo C attiva, con le molecole adattatrici che si chiamano APAF, le varie CASPASI e quindi meccanismo intrinseco dell'apoptosi. Le altre molecole che si chiamano SMAC attivano anch'esse l'apoptosi, ma con un altro meccanismo.

Le SMAC\ DIABLO sono a loro volta controbilanciate da alcune proteine che si chiamano IAP ( Inhibitors of Apoptosis protein) e sono proteine inibitrici dell'apoptosi. Quindi ogni evento, in questo caso l'apoptosi, è regolato da fattori che lo inibiscono e fattori che lo attivano. Vediamo le SMAC, che sono bersaglio delle IAP, ma le IAP non agiscono solo a livello delle SMAC, ma anche a livello delle CASPASI, cioè gli enzimi proprio effettori dell'apoptosi. Queste CASPASI sono enzimi specifici che agiscono sull'acido aspartico, hanno come sito attivo la cisteina ed effettuano la loro azione su diversi substrati. A parte la PARP, di cui già abbiamo parlato, agiscono su varie proteine chiave del metabolismo e dell'attività funzionale della cellula, per esempio le LAMINE, che si trovano a ridosso della membrana nucleare e che legano il DNA, oppure le protein-chinasi DNA dipendenti, quindi tutti quei fattori che attivano i processi di riparazione e attivano un fattore di degradazione del DNA che determina frammentazione del DNA stesso. Dunque le CASPASI attivano proprio questo fattore di frammentazione, che si chiama DFF (DNA fragmentation factor)

e questo determina appunto una delle caratteristiche principali dell'apoptosi che è il DNA in frammenti ben ordinati. Le CASPASI possono essere distinte in:

- CASPASI iniziatrici,

- CASPASI effettrici.

Quindi, possiamo dire che anche questo è un processo che procede secondo delle tappe, cioè le CASPASI non vengono subito attivate. Se parliamo della via estrinseca parliamo di ligando---- ---->recettore----> proteina adattatrice ------> attivazione di CASPASI iniziatrici ----> attivazione di CASPASI effettrici. Quindi vedete che c'è un pathway abbastanza complesso formato da più step, che porta sicuramente alla morte cellulare, ma è anche vero che a livello di ciascuno stadio il processo si può interrompere, quindi non necessariamente la cellula va incontro ad apoptosi.

L'apoptosi è un processo così importante per l'economia del nostro organismo, che si è mantenuto costante nel tempo il meccanismo con cui si realizza, non a caso ci sono proteine omologhe alle proteine apoptotiche dei mammiferi, che sono state riscontrate addirittura in un nematode,nel Caenorhabditis Elegans. In quest'ultimo è stata individuata una proteina, che si chiama CED 3, che ha molte omologie con la CASPASI 1 dei mammiferi, che è anche un enzima che converte l'interleuchina 1 (Interleukin-1 converting enzyme). Questo è un altro collegamento con l'infiammazione, in quanto l'interleuchina 1 è una citochina coinvolta in vari processi biologici, prodotta dai fagociti, nel riconoscimento e presentazione dell'antigene ed è coinvolta anche nell'apoptosi, perché appunto la CASPASI idrolizza l'interleuchina 1-beta. Quindi, abbiamo detto, CED 3 di C. Elegans è un omologo di CASPASI 1 dei mammiferi e si chiama ICE (Interleukin-1 converting enzyme). Altre molecole omologhe sono il CED 4 e il CED 9. IL CED 4 è omologo di una proteina coinvolta nella via intrinseca,cioè APAF di cui ho parlato poco fa, mentre CED 9 è una molecola che inibisce l'apoptosi, che attiva la proliferazione e che è omologa a BCL2. Cioè nel C. Elegans vi sono tre proteine coinvolte nell'apoptosi: 1. CED3 omologo a CASPASI 1, coinvolta nella via estrinseca 2. CED4 omologo della molecola adattatrice APAF, coinvolta nella via intrinseca 3. CED9 omologo a BCL2, anti-apoptotica, attiva la proliferazione.

Vediamo appunto come nel C. Elegans CED 9 blocca CED 3 e CED 4, che invece attivano la morte cellulare. Nei mammiferi una cosa simile viene effettuata da BCL 2 che agisce su una CASPASI omologa che attiva la morte cellulare.

Nella Drosophila Melanogaster abbiamo un gene simile che ha un meccanismo sovrapponibile a quello dei mammiferi.

La via intrinseca è attivata da problemi interni alla cellula, come alterazione del DNA, stress ossidativi, come per esempio il danno causato dall'ossido nitrico o dai radicali liberi dell'ossigeno, da un danno mitocondriale. La via estrinseca è mediata da ligandi che agiscono con recettori specifici presenti sulla cellula.

Nella via intrinseca abbiamo la lesione a livello della membrana mitocondriale, che comporta, oltre alla liberazione di SMAC, anche la librazione di citocromo C, fondamentale nell'attivazione dell'apoptosi per via intrinseca. Il citocromo C, infatti, si lega a una proteina adattatrice che è APAF-1 (apoptotic protein activating factor, cioè fattore di attivazione delle proteine coinvolte nell'apoptosi). L'APAF-1 si ritrova in forma inattiva, ma viene attivata dal legame con il citocromo C, liberato in seguito a danno della membrana mitocondriale. Questo evento porta all'aggregazione di 7 molecole di APAF-1 tra di loro. Queste molecole adattatrici ovviamente sono polifunzionali, cioè hanno vari domini, in quanto devono legare il citocromo C, devono interagire tra di loro e devono reclutare le CASPASI per attivarle, quindi, con un dominio che si chiama CARD ( Caspase Recruitment Domain), reclutano la procaspasi 9, che è la forma inattiva e la inserisce in un complesso che si chiama APOPTOSOMA e, a questo livello, la procaspasi 9 viene attivata, mediante un clivaggio, in CASPASI 9. Questa è la CASPASI iniziatrice della via intrinseca, in quanto a sua volta attiva le CASPASI a valle, cioè le CASPASI effettrici, che sono essenzialmente la CASPASI 3 e la CASPASI 7, quindi avviene l'attivazione della cosi detta "Cascata delle CASPASI".

A livello dell'apoptosoma abbiamo dunque: 1. Dominio CARD, che serve a reclutare la procaspasi 9, 2. Dominio simile a CED 4, quindi abbiamo questo dominio che è simile alla proteina CED4 importante nell'apoptosi del nematode (per questo vi ho parlato del C.Elegans), 3. Dominio C-terminale, che si chiama WD40. Questo è un dominio che presenta 12 o 13 unità di ripetizione, ogni unità, di queste 12 o 13, è costituita da 40 residui di acido aspartico e di triptofano. Questo è un elemento regolatore negativo, che interagisce con CARD, ma che probabilmente può interagire anche con altre molecole regolatrici, quindi con altre molecole adattatrici dell'apoptosi. Notate come l'apoptosi si autoregoli. E' importante sottolineare come l'espressione di APAF-1 sia sotto il controllo di p53. Quando il citocromo C fuoriesce dal mitocondrio, si lega ad APAF 1 modificandone la conformazione. Infatti, da una conformazione chiusa, grazie al legame con il citocromo C e successivamente con le molecole di ATP che fuoriescono dal mitocondrio (ecco perché è fondamentale l'ATP), si passa a una conformazione aperta. Quindi sette molecole di APAF-1 si aggregano tra di loro e, attraverso il dominio CARD, reclutano le molecole di procaspasi-9, formano l'apoptosoma e attivano le procaspasi-9, che diventano CASPASI 9. Vedete quindi l'attivazione di procaspasi 3 e procaspasi 7 e l'attivazione dell'apoptosi. Il dominio CED 4 - like è importante per questo cambiamento conformazionale e i domini WD40 interagiscono con il citocromo C.

Francesca Galletta

*[ Ragazzi ho notato che nelle sbob comprate in copisteria la stessa Prof. Teti afferma che la proteina CED 3 è omologa alla CASPASI 3,compresa tra le CASPASI effettrici. Nonostante ciò nella registrazione si sente chiaramente che la prof parla di CASPASI 1 o non di CASPASI 3.]