1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Karsinoma payudara merupakan keganasan yang paling sering terjadi pada

perempuan. Diperkirakan jutaan perempuan di seluruh dunia terkena karsinoma

payudara tiap tahunnya. Karsinoma ini merupakan salah satu masalah kesehatan

yang penting dan menjadi penyebab kematian terbanyak pada perempuan. Angka

kematian dapat diturunkan apabila deteksi dini, diagnosis, dan penatalaksanaan

karsinoma ini dilakukan secara tepat dan cepat.

Karsinoma payudara merupakan karsinoma terbanyak kedua di dunia, dengan

perkiraan 1,67 juta kasus karsinoma baru yang didiagnosis pada tahun (Globocan,

2012). Angka kejadian pada negara berkembang mencapai 6%, di mana angka

kejadiannya mencapai dua kali lipat pada daerah lain (Muhammad et al., 2012).

Sekitar 100.000 kasus baru terdiagnosis dan sekitar 30.000 pasien meninggal

akibat karsinoma ini di Amerika Serikat setiap tahunnya. Sedangkan di Inggris

sekitar 26.000 kasus baru dan 15.000 kematian terjadi setiap tahunnya (Tanwani

and Majeed, 2009).

Di Indonesia berdasarkan data dari Badan Registrasi Kanker Ikatan Dokter

Ahli Patologi Indonesia (IAPI) pada tahun 2011, karsinoma payudara di Indonesia

mengalami peningkatan menjadi 28,99%. Sementara itu di Bali pada tahun 2011

merupakan kejadian karsinoma peringkat pertama sebesar 23,33% dari

2

keseluruhan karsinoma primer pada wanita, di mana terjadi peningkatan

dibandingkan tahun 2006 sebesar 21,45% (DitYanMed, 2006, 2011).

Karsinoma payudara di dunia lebih sering terjadi pada wanita dengan usia

yang lebih tua dengan puncak insiden pada usia 75-80 tahun. Karsinoma payudara

sangat jarang terjadi sebelum usia 25 tahun (Lester, 2015). Di Indonesia dan Bali,

sebagian besar kasus karsinoma payudara terdiagnosis pada rentang usia 35-44

tahun (DitYanMed, 2006, 2011).

Perjalanan akhir dari karsinoma payudara ini tergantung dari gambaran

biologis karsinoma yaitu tipe histologis atau molekular serta perluasan dan

penyebaran karsinoma tersebut. Faktor prognosis dari karsinoma ini dibagi

menjadi dua kelompok yaitu faktor prognosis yang berhubungan dengan perluasan

karsinoma (stadium) dan yang berhubungan dengan biologis karsinoma. Faktor

prognosis yang berhubungan dengan perluasan karsinoma adalah adanya ukuran

tumor, invasi limfovaskular, metastasis kelenjar getah bening, dan metastasis jauh.

Tipe histologis khusus, derajat histologis, tingkat proliferasi, reseptor estrogen,

reseptor progesteron, reseptor HER-2, dan subtipe molekular merupakan faktor

prognosis yang berhubungan dengan biologis karsinoma (Lester, 2015).

Derajat histologis pada karsinoma invasif tipe tidak spesifik dinilai

berdasarkan penggabungan skor penilaian tiga karakteristik yaitu formasi tubular

(kelenjar), pleomorfia inti sel, dan hitung mitosis per 10 lapang pandang besar.

Penilaian derajat histologis ini mengacu pada Nottingham Grading System atau

disebut juga Nottingham Combined Histologic Grade/Patey & Scarff and Bloom

& Richardson modified by Elston & Ellis (Colditz dan Chia, 2012).

3

Pada dekade terakhir, penelitian tentang tumor microenvironment (TME)

berkembang dengan pesat dan mulai turut dipertimbangkan sebagai salah satu

faktor prognosis (Scully et al., 2012). Tumor microenvironment terdiri dari sel

stromal, sel sistem imun dan inflamasi, faktor pertumbuhan, pembuluh darah dan

limfe, serta matriks ekstraseluler (ECM). Pada keadaan normal jaringan stroma

memiliki kemampuan sebagai pertahanan terhadap keganasan melalui mekanisme

supresi respon imun dan menekan proses karsinogenesis. Akan tetapi sel

karsinoma dapat merubah dan memodulasi lingkungan mikro di sekitar tumor

untuk mendukung pertumbuhan dan sifat progresivitas tumor (Li et al., 2007;

Rohan et al., 2014). Sel-sel epitelial dapat juga berkonversi menjadi sel-sel

mesenkimal melalui proses yang dikenal sebagai epithelial-mesenchymal

transition (EMT). Hal ini akan meningkatkan kapasitas migrasinya (Lee and

Nelson, 2012).

Perubahan karakteristik morfologi sel pada EMT berhubungan dengan

beberapa perubahan ekspresi molekul. Molekul ini sering digunakan sebagai

penanda untuk mendeteksi EMT. Salah satunya adalah peningkatan ekspresi

protein matrix metalloproteinases yaitu MMP-2, MMP-3, dan MMP-9 (Lee dan

Nelson, 2012).

Matriks metalloproteinase merupakan suatu kelompok endopeptidase yang

tergantung pada zinc dan terlibat dalam degradasi matriks ekstraselular baik pada

proses fisiologis maupun patologis. Pada keadaan fisiologis MMP ini membantu

proses morfogenesis, angiogenesis, dan perbaikan jaringan. Sementara pada

4

proses patologis, MMP terlibat pada terjadinya sirosis, artritis, dan kanker (Farina

and Mackay, 2014).

MMP-9 atau gelatinase B lebih banyak mendapat perhatian oleh karena

aktivitas dan regulasinya lebih kompleks dibandingkan semua kelompok MMP

yang lain (Loffek et al., 2011).

Pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik MMP-9 mengalami

regulasi melalui interaksi antara sel tumor dengan lingkungan mikro di sekitarnya,

yaitu sel stroma, sel endotel, dan sel radang. Sudah sangat diakui peranan sel

radang seperti makrofag, neutrofil, sel mast sel dendritik, dan sel T pada inisiasi

dan progresi tumor. Sel tumor ini mampu menghasilkan faktor-faktor pro-

inflamasi dan MMP berperan pada progresivitas tumor (Deryugina dan Quigley,

2006).

Matriks metalloproteinase-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik terlibat pada semua tahap progresivitas sel kanker mulai dari proliferasi,

angiogenesis, apoptosis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), dan

metastasis. Proses metastasis dimudahkan oleh kemampuan sel tumor untuk

berubah dari bentuk sel epitel yang tidak mampu bergerak menjadi sel

mesenkimal yang mampu bergerak (Farina dan Mackay, 2014). MMP-9 ini

dikatakan berpartisipasi dalam invasi tumor dan metastasis dengan menurunkan

matriks ekstraselular pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik

(Mahmood et al., 2015) (Benson et al., 2013).

Beberapa penelitian yang menghubungkan ekspresi MMP-9 dengan derajat

histologis pada karsinoma payudara sudah pernah dilakukan. Pada penelitian yang

5

dilakukan oleh Irianiwati et al. terhadap 50 kasus karsinoma payudara, dilakukan

pulasan MMP-9 untuk menilai perburukan derajat histologisnya. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekspresi MMP-9 berbeda bermakna pada derajat tinggi

dibandingkan derajat rendah (Irianiwati et al, 2012).

Penelitian oleh Yousef et al. ekspresi tinggi MMP-9 ditemukan pada

karsinoma payudara dengan derajat keganasan yang tinggi. Sedangkan pada

jaringan payudara normal tidak ditemukan adanya ekspresi dari MMP-9 (Yousef

et al., 2014).

Penelitian oleh Mahmood dan kawan-kawan di Irak menghubungkan antara

ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dengan berbagai variabel klinikopatologis pada

karsinoma payudara stadium II dan III. Didapatkan korelasi yang signifikan antara

ekspresi MMP-9 dengan beberapa variabel klinikopatologis, yaitu: stadium tumor,

derajat histologis, tipe histologis, dan status metastasis limfonodi (Mahmood et

al., 2015).

Vasaturo et al. di Italia melakukan penelitian ekspresi MMP-2 dan MMP-9

pada pasien karsinoma payudara. Dengan hasil penelitian menunjukkan tampak

perbedaan yang bermakna pada pasien-pasien karsinoma payudara bila ditinjau

dari sudut pandang variabel derajat histologis (Vasaturo et al., 2012).

Penelitian yang dilakukan oleh Benson et al. di India terhadap 39 sampel

kanker payudara dan 16 jaringan payudara yang normal, menunjukkan adanya

peningkatan MMP-9 secara berbeda pada jaringan kanker payudara (Benson et

al., 2013).

6

Di Finlandia ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dianalisis oleh Pellikainen et al.

secara imunohistokimia dalam prospektif seri besar dari 421 pasien kanker

payudara. MMP-9 terekspresi dalam sitoplasma sel-sel ganas dan stroma. Ekspresi

tinggi MMP-9 dalam sel karsinoma terkait stadium tumor, sedangkan ekspresi

positif pada stroma dikaitkan dengan faktor-faktor agresif. Evaluasi ekspresi

MMP-9 juga memberikan informasi tentang prognosis kanker payudara

(Pellikainen et al., 2014).

Hasil kontradiktif didapatkan oleh Wu dan kawan-kawan melalui

penelitiannya di Cina berusaha mencari signifikansi antara ekspresi MMP-9

dengan berbagai variabel klinikopatologis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

tidak ada korelasi yang signifikan antara ekspresi MMP-9 dengan semua variabel

penelitian yang dievaluasi termasuk derajat histologis (Wu et al., 2014).

Meskipun penelitian yang menghubungkan ekspresi MMP-9 dengan derajat

histologis pada karsinoma payudara sudah pernah dilakukan akan tetapi masih

terdapat hasil yang kontradiktif. Di samping itu, penelitian yang menunjukkan

adanya pengaruh antara ekspresi MMP-9 dengan karakteristik derajat histologis

pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik sampai saat ini belum pernah

dilakukan di Bali, sehingga sangat menarik untuk dilakukan penelitian tersebut

agar dapat memahami keterlibatan MMP-9 pada progresivitas karsinoma

tersebut.

Pada penelitian ini dilakukan pulasan imunohistokimia MMP-9 untuk melihat

apakah ada hubungan antara ekspresi MMP-9 dengan derajat histologis pada

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik.

7

1.2.Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut di atas yaitu masih ditemukannya

ketidaksesuaian pendapat di antara para peneliti mengenai hubungan antara

ekspresi MMP-9 dengan derajat histologis pada karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik, maka rumusan masalah pada penelitian ini adalah :

1. Apakah terdapat hubungan antara ekspresi MMP-9 dengan derajat histologis

pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik?

2. Apakah ekspresi MMP-9 mempengaruhi faktor karakteristik derajat histologis

yang paling dominan pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik?

1.3.Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang dan rumusan masalah di atas maka tujuan penelitian

adalah sebagai berikut:

1. Membuktikan adanya hubungan antara ekspresi MMP-9 dengan derajat

histologis pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik.

2. Membuktikan bahwa ekspresi MMP-9 mempengaruhi faktor karakteristik

derajat histologis yang paling dominan.

1.4.Manfaat Penelitian

1.4.1.Manfaat Akademik

1. Memberikan informasi data molekular tentang ekspresi MMP-9 yang

dihubungkan dengan derajat histologis karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik.

8

2. Memberikan tambahan pengetahuan mengenai ekspresi MMP-9 yang dapat

mempengaruhi faktor karakteristik derajat histologis yang paling dominan,

serta pengetahuan yang mendukung MMP-9 dan derajat histologis sebagai

faktor prognostik dalam diagnosis karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik.

1.4.2.Manfaat Praktis

Memberikan informasi tambahan kepada klinisi bahwa ekspresi MMP-9 yang

tinggi berkaitan dengan derajat histologis yang lebih tinggi pula dan memiliki

prognosis yang lebih buruk, sehingga penanganan karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik dapat dilakukan lebih baik.

9

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Karsinoma Payudara

2.1.1 Klasifikasi Karsinoma Payudara

Karsinoma payudara merupakan kelompok lesi yang heterogen. Pada tahap

pertumbuhannya dibagi menjadi karsinoma in situ dan karsinoma invasif.

Karsinoma duktal dan lobular merupakan tumor yang paling sering didapat

meliputi 70-80% dari keseluruhan karsinoma invasif pada payudara (Ellis et al.,

2012). Karsinoma insitu merupakan proliferasi sel-sel neoplastik yang belum

menembus membran basal duktus maupun lobulus, sedangkan apabila sel-sel

neoplastik tersebut telah menembus membran basal dan menginfiltrasi stroma

disebut sebagai karsinoma invasif. Sel-sel tersebut kemudian mampu menginvasi

pembuluh limfe maupun pembuluh darah sehingga dapat menyebabkan metastasis

pada kelenjar getah bening maupun dapat bermetastasis jauh (Lester, 2010).

Berikut ini adalah klasifikasi karsinoma payudara invasif menurut klasifikasi

World Health Organization (WHO) (Ellis et al., 2012):

1. Invasive carcinoma of no special type (NST)

2. Invasive lobular carcinoma

3. Tubular carcinoma

4. Cribriform carcinoma

5. Mucinous carcinoma

6. Carcinoma with medullary features

10

7. Metaplastic carcinoma

8. Carcinoma with apocrine differentiation

9. Salivary gland / skin adnexal type tumours

10. Adenoid cystic carcinoma

11. Mucoepidermoid carcinoma

12. Polymorphous carcinoma

13. Carcinoma with signet-ring cell differentiation

14. Carcinoma with neuroendocrine features

15. Invasive papillary carcinoma

16. Invasive micropapillary carcinoma

17. Inflammatory carcinoma

Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik yang sebelumnya disebut juga

karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik adalah keganasan yang terjadi pada

sel-sel epitel duktuli payudara, terutama sel-sel dari terminal duct lobular unit

(TDLU) yang ditandai adanya invasi ke stroma jaringan dan tumor ini tidak

membentuk suatu pola tipe histologis tertentu (Ellis et al., 2012).

Diklasifikasikan sebagai karsinoma invasif tipe tidak spesifik apabila

komponen gambaran tidak spesifiknya lebih dari 50% massa tumor dengan

pemeriksaan dari potongan yang representatif. Jika gambaran tidak spesifik

kurang dari 50% atau sekitar 10% - 49% dari massa tumor dan sisanya adalah tipe

spesifik maka disebut kelompok campuran yaitu campuran karsinoma invasif tipe

tidak spesifik dan tipe spesifik (Ellis et al., 2012).

11

2.1.2 Epidemiologi Karsinoma Payudara

Karsinoma payudara merupakan karsinoma terbanyak kedua di dunia, dengan

perkiraan 1,67 juta kasus karsinoma baru yang didiagnosis pada tahun 2012 (25%

dari semua jenis karsinoma) (Globocan, 2012). Di mana merupakan keganasan

yang paling sering dan penyebab kematian terbanyak pada wanita baik di negara

maju maupun negara berkembang. Angka kejadian pada negara berkembang

mencapai 6%, di mana angka kejadiannya mencapai dua kali lipat pada daerah

lain (Muhammad et al., 2012). Setiap tahun di Amerika Serikat sekitar 100.000

kasus baru terdiagnosis dan sekitar 30.000 pasien meninggal akibat karsinoma ini.

Sedangkan di Inggris sekitar 26.000 kasus baru dan 15.000 kematian terjadi setiap

tahunnya (Tanwani and Majeed, 2009).

Di Indonesia berdasarkan data dari Badan Registrasi Kanker Ikatan Dokter

Ahli Patologi Indonesia (IAPI) pada tahun 2006 karsinoma payudara menempati

peringkat kedua dari seluruh kasus karsinoma sebesar 22,8%. Karsinoma

payudara merupakan karsinoma ke-2 tersering pada wanita setelah karsinoma

leher rahim. Pada tahun 2011, karsinoma payudara di Indonesia mengalami

peningkatan menjadi 28,99%. Sementara itu di Bali pada tahun 2006, karsinoma

payudara merupakan karsinoma kedua yaitu sebesar 21,45%. Pada tahun 2011

kejadian karsinoma payudara di Bali menempati peringkat pertama sebesar

23,33% dari keseluruhan karsinoma primer pada wanita (DitYanMed, 2006,

2011).

Karsinoma payudara lebih sering terjadi pada wanita dengan usia yang lebih

tua dengan puncak insiden pada usia 75-80 tahun. Usia rata-rata saat diagnosis

12

adalah 61 tahun pada wanita kulit putih, 56 tahun pada Hispanik, dan 46 tahun

pada wanita Afrika-Amerika. Karsinoma payudara sangat jarang terjadi sebelum

usia 25 tahun (Lester et al., 2015). Di Indonesia dan Bali, sebagian besar kasus

karsinoma payudara terdiagnosis pada rentang usia 35-44 tahun (DitYanMed,

2006; DitYanMed, 2011).

2.1.3 Derajat Histologis Karsinoma Payudara

Diagnosis pada karsinoma payudara berdasarkan tipe histologis saja tidak cukup

untuk menentukan terapi akhir. Oleh karena itu, dibuatlah sistem derajat

histologis, oleh karena baik dalam menentukan diagnostik dan terapeutik.

Karsinoma payudara dengan derajat histologis baik umumnya memiliki prognosis

yang baik, sedangkan tumor-tumor derajat histologis buruk akan berkembang

cepat dan memiliki prognosis yang kurang baik.

Derajat histologis karsinoma payudara ini dinilai berdasarkan sistem

Nottingham Combined Histologic Grade (Elston-Ellis Modification of Scarff-

Bloom-Richardson Grading System) atau biasa disebut dengan Nottingham

Grading System. Sistem ini menilai karsinoma payudara berdasarkan tiga

karakteristik tumor yaitu formasi tubular (kelenjar), pleomorfisme inti sel, dan

hitung mitosis. Sistem ini menggunakan skor 1 sampai skor 3 yang dinilai secara

individual pada tiap faktor (Tabel 2.1) (Ellis et al., 2012).

Formasi tubular dinilai dari jumlah persentase struktur gambaran glanduler

atau kelenjar yang jelas menunjukkan adanya lumen di tengahnya. (Ellis et al.,

2012). Seluruh bagian tumor ditinjau dengan lapangan pandang kecil. Ambang

13

batas yang dipakai adalah 10% dan 75%. Skor 1 apabila mayoritas tumor

memiliki struktur tubular dan kelenjar sebanyak > 75%, skor 2 bila tumor

mengandung struktur tubular dan kelenjar sebanyak 10-75%, sedangkan skor 3

bila tumor mengandung struktur tubular sebanyak < 10% disajikan dalam gambar

2.1 (Anonim, 2005; Hoda et al., 2014).

Gambar 2.1 Gambaran derajat histologis dari karsinoma payudara invasif. A. Derajat histologis rendah dengan bentukan kelenjar yang terbentuk dengan baik. B. Derajat histologis sedang dengan pola pertumbuhan kelenjar yang kompleks.

C.Derajat histologis buruk dengan pola pertumbuhan solid, arsitektur nonglanduler. (Hoda et al., 2014).

Pleomorfisme inti sel dinilai dari regularitas ukuran inti dan bentuk sel epitel,

dimana peningkatan iregularitas membran inti dan rasio inti/sitoplasma menjadi

tanda bertambahnya skor pleomorfisme inti sel (Ellis et al., 2012). Dimulai dari

nilai skor 1 sampai 3. Skor 1 bila inti hampir serupa ukurannya (<1,5 kali dari sel-

14

sel epitelial payudara normal), batasnya regular, kromatin inti uniform, beberapa

kasar, sedikit variasi bentuk dan ukurannya (pleomorfia inti yang minimal), dan

anak inti tidak tampak jelas. Dikatakan skor 2 apabila sel lebih besar daripada sel

normal, inti membesar (1,5-2 kali ukuran inti sel-sel epitelial normal) terdapat

variasi yang sedang dalam ukuran dan bentuknya (pleomorfia inti ringan sampai

sedang), inti open vesikular, dan anak inti terlihat namun kecil dan tidak nyata.

Dan skor 3 bila inti semakin membesar (>2 kali ukuran inti sel epitel normal),

ukuran dan bentuknya sangat bervariasi (pleomorfia inti berat), biasanya dengan

bentuk bizarre dan sangat besar, kromatin inti vesikular, sering dengan anak inti

yang sangat jelas terlihat disajikan dalam gambar 2.2 (Anonim, 2005; Hoda et al.,

2014).

Gambar 2.2 Gambaran inti dari karsinoma payudara invasif. A. Derajat rendah dengan inti kecil. B. Derajat sedang. C. Derajat tinggi dengan pleomorfik inti

yang memiliki nukleolus yang prominen. (Hoda et al., 2014).

15

Hitung mitosis dilakukan dimulai dari bagian tepi tumor dan bila terdapat

heterogenesitas maka daerah yang dihitung adalah yang paling banyak

mengandung mitosis (Ellis et al., 2012). Penghitungan mitosis dinilai dengan

menghitung jumlah mitosis per 10 lapang pandang besar mikroskop atau High

Power Field (HPF) dengan pembesaran 400x. Cut-off point untuk skor mitosis

tergantung dari besarnya area lapang pandang objektif masing-masing mikroskop,

sehingga perlu mengkalibrasi mikroskop dengan ukuran diameter dari lapang

pandang besar (objektif 40x) disajikan dalam gambar 2.3 (Colditz and Chia,

2012).

Gambar 2.3 Hitung skor mitosis berdasarkan luas lapang pandang besar mikroskop (Colditz and Chia, 2012).

16

Skor dari ketiga penilaian tersebut dijumlahkan menghasilkan total skor

dengan rentang 3-9, kemudian dikatakan derajat histologis 1 atau baik bila skor

yang didapat adalah 3-5, derajat histologis 2 atau sedang bila total skor yang

didapat adalah 6-7 sedangkan derajat histologis 3 atau buruk bila total skor yang

didapat 8-9 (disajikan dalam tabel 2.1 dan gambar 2.4) (Lester et al., 2015;

Colditz and Chia, 2012; Hoda et al., 2014).

Tabel 2.1 Metode semi-kuantitatif penilaian derajat histologis karsinoma payudarainvasif (Ellis et al., 2012).

Gambaran Skor

Bentukan tubular dan kelenjar

Pada mayoritas tumor (> 75%)

Derajat sedang (10-75%)

Sedikit atau tidak ada (<10%)

1

2

3

Pleomorfia inti

Sel-sel uniform, kecil, pleomorfia inti ringan

Peningkatan sedang dalam bentuk dan ukuran (pleomorfia

sedang)

Bentuk sangat bervariasi (pleomorfia berat)

1

2

3

Hitung mitosis

Tergantung dari luas lapang pandang besar mikroskop Lihat nilai pada

gambar 2.3

Derajat akhir

Dijumlah semua skor dari bentukan kelenjar, pleomorfia inti

sel, dan hitung mitosis per 10 lapang pandang besar

Derajat histologis I : total skor 3 – 5

Derajat histologis II : total skor 6 – 7

Derajat histologis III : total skor 8 – 9

17

Gambar 2.4 Derajat histologis karsinoma payudara invasif Modified Bloom-Richardson Histologic Grading (Hoda et al., 2014).

Gambar 2.5 Gambaran karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III (Lester, 2010)

18

2.1.4 Stadium Karsinoma Payudara

Sistem stadium karsinoma payudara yang dipergunakan adalah sistem TNM dari

American Joint Committee on Cancer (AJCC) berdasarkan evaluasi terhadap

tumor (T), keterlibatan kelenjar getah bening (N), dan metastasis jauh (M) (Ellis

et al.,2012). Kategori T, N, dan M dikombinasikan untuk membuat 5 stadium

yaitu stadium 0, I, II, III, dan IV yang memberikan informasi tentang keadaan

penyakit ( ukuran tumor, invasi kulit atau dinding dada, dan keterlibatan kelenjar

getah bening) serta metastasis jauh. Gambaran ini digunakan untuk

mengklasifikasikan penderita karsinoma payudara kedalam kelompok prognosis

demi kepentingan pengobatan, konseling, dan uji klinis (Ellis et al.,2012; Moelans

and Diest, 2012).

Stadium karsinoma payudara berdasarkan AJCC yaitu :

Stadium 0 : Ductal carcinoma in situ (DCIS) atau Lobular carcinoma in situ

(LCIS); harapan hidup 5 tahun adalah 93%.

Stadium I : Karsinoma invasif dengan ukuran 2 cm atau kurang tanpa

terkenanya kelenjar getah bening dan tanpa metastasis jauh;

harapan hidup 5 tahun adalah 88%.

Stadium II : Karsinoma invasif dengan ukuran 5 cm atau kurang disertai

metastasis ke kelenjar getah bening aksila yang tidak terfiksasi

dan tanpa metastasis jauh atau karsinoma invasif dengan ukuran

lebih dari 5 cm tanpa metastasis ke kelenjar getah bening atau

tanpa metastasis jauh; harapan hidup 5 tahun adalah 74-81%.

19

Stadium III : Karsinoma invasif dengan ukuran lebih dari 5 cm dengan

metastasis ke kelenjar getah bening atau karsinoma invasif ukuran

berapapun dengan metastasis ke kelenjar getah bening yang

terfiksir; atau karsinoma yang menginvasi dinding dada, kulit,

edema, serta beradang, jika tidak ditemukan metastasis jauh;

harapan hidup 5 tahun adalah 41-67%.

Stadium IV : Karsinoma invasif ukuran berapapun dengan metastasis ke tempat

jauh (termasuk kelenjar getah bening supraklavikula ipsilateral);

harapan hidup 5 tahun adalah 15% (Moelans and Diest, 2013).

2.1.5 Karsinogenesis

Penyebab karsinoma payudara berhubungan erat dengan faktor genetik dan

pengaruh hormonal (Lester et al., 2015). Pada literatur lain dikatakan faktor diet,

faktor hormonal dan reproduksi, serta faktor terpapar radiasi juga ikut

berpengaruh (Colditz and Chia, 2012). Sebagian besar perubahan genetik

berperan dalam pertumbuhan karsinoma payudara di mana riwayat keluarga

dengan karsinoma payudara akan lebih berisiko. Faktor hormonal dan reproduksi

yang mempengaruhi antara lain meliputi usia pertama kali menstruasi,

nulliparitas, usia saat kelahiran anak pertama, tidak menyusui, usia menopause,

dan penggunaan kontrasepsi oral. Sedangkan faktor diet berupa peningkatan berat

badan pada wanita postmenopause, westernized diet, kurangnya olahraga,

kurangnya asupan buah dan sayuran, merokok serta alkohol (Colditz and Chia,

2012).

20

Adanya mutasi gen BRCA 1 pada kromosom 17q21.3 dan mutasi gen BRCA

2 pada kromosom 13q12-13 pada beberapa kasus menunjukkan bahwa mutasi ini

sangat berpengaruh. Kedua gen ini berperan dalam repair DNA sebagai gen

supresor karena inaktif atau defek keduanya germ line mutation dan somatic

mutation. Mutasi yang mempengaruhi proto-onkogen dan gen penekan tumor di

epitel payudara ikut serta dalam proses transformasi onkogenik. Di antara

berbagai mutasi tersebut ekspresi berlebihan proto-onkogen ERBB2 atau HER-

2/neu mengalami amplifikasi pada 30% kanker payudara. Ketidakseimbangan

hormon sangat berperan terhadap pertumbuhan karsinoma payudara. Banyak

faktor risiko yang telah disebutkan nuliparitas, usia subur yang lama, usia lanjut

saat memiliki anak pertama menunjukkan peranan kadar estrogen terhadap risiko

karsinoma payudara. Reseptor estrogen dan progesteron secara normal terdapat di

epitel payudara berinteraksi dengan promotor pertumbuhan yang dikeluarkan oleh

sel kanker payudara untuk menciptakan mekanisme autokrin perkembangan tumor

(Lester et al., 2015).

Beberapa gen yang terlibat dalam karsinogenesis payudara adalah gen

penekan tumor yaitu BRCA1, BRCA2, dan gen P53 serta onkogen yang terdiri

dari gen HER2, gen apoptosis, gen reseptor steroid (Estrogen Receptor dan

Progesteron Receptor), gen adhesi sel dan invasif, serta gen angiogenesis.

Apoptosis diperlukan untuk menghancurkan sel-sel dengan kerusakan DNA atau

sel-sel yang telah menjadi sel kanker. Beberapa onkogen seperti Bax dan Bcl2, c-

myc dan P53 terlibat dalam pengaturan sinyal proapoptosis dan anti apoptosis

yang dikontrol oleh beberapa gen. Bcl2 mengatur pelepasan protein mitokondria

21

seperti sitokrom. Sitokrom c berikatan dengan faktor lainnya untuk membentuk

kompleks aktivasi disebut apoptosom. Apoptosom yang aktif akan mengaktifkan

caspase yang akhirnya akan menyebabkan apoptosis. Hormon-hormon steroid

juga dikenal dapat menyebabkan up-regulation atau down-regulation apoptosis

dengan jalan mengontrol kematian sel yang dimediasi P53 (Boder, 2013).

Perubahan genetik dan epigenetik yang diperlukan untuk karsinogenesis

menimbulkan perubahan morfologi yang dikenali sebagai lesi payudara, yang

berhubungan dengan meningkatnya risiko perkembangan kanker. Perubahan awal

tersebut adalah perubahan proliferatif, yang berasal dari hilangnya sinyal

menghambat pertumbuhan, menyimpangan kenaikan sinyal pro-pertumbuhan,

atau penurunan apoptosis. Selama perkembangan tumor, klonal ganas menjadi

abadi dan memperoleh kemampuan pembentukan neo-angiogenesis. Gambaran

morfologi dan biologis karsinoma biasanya terbentuk pada tahap insitu, karena di

sebagian besar kasus lesi insitu mirip karsinoma invasif yang menyertai. Langkah

akhir dari karsinogenesis adalah perubahan lesi insitu menjadi karsinoma invasif

(Lester et al., 2015).

Berdasarkan jalur molekular terdapat tiga jalur utama dalam perkembangan

kanker payudara (Gambar 2.6). Jalur yang terbanyak adalah terjadinya karsinoma

ER positif, HER2 negatif. Terjadi pada penderita dengan mutasi germline

BRCA2. Jalur ini berhubungan dengan delesi kromosom 16q dan penambahan

kromosom 1q serta aktivasi mutasi PIK3CA. Lesi prekursor yang sering

ditemukan adalah flat epithelial atypia dan atypical hyperplasia. Jalur kedua yaitu

karsinoma HER2 positif. Ditemukan pada penderita dengan mutasi germline TP53

22

dan terjadi amplifikasi gen HER2. Lesi prekursor yang ditemukan adalah atypical

apocrine adenosis. Jalur yang paling jarang adalah karsinoma ER dan HER2

negatif. Pada karsinoma ini lesi prekursor tidak jelas, kemungkinan karena

perkembangan lesi yang sangat cepat menjadi karsinoma. Sering ditemukan pada

penderita dengan mutasi germline BRCA1, sedangkan pada tumor sporadic

terjadi mutasi pada TP53 (Tamaki et al., 2013; Lester et al., 2015).

Gambar 2.6 Jalur utama perkembangan kanker payudara (Lester, 2015).

2.2 Tumor microenvironment

Solid tumor merupakan “organ like structure” terdiri atas sel tumor dan stromal.

Pada dekade terakhir, penelitian tentang tumor microenvironment (TME)

berkembang dengan pesat (Scully et al., 2012). Tumor microenvironment terdiri

dari sel stromal, sel sistem imun dan inflamasi, faktor pertumbuhan, jaringan

pembuluh darah dan limfe, serta matriks ekstraseluler (ECM). Pada keadaan

normal jaringan stroma memiliki kemampuan sebagai pertahanan terhadap

23

keganasan melalui mekanisme supresi respon imun dan menekan proses

karsinogenesis. Akan tetapi sel karsinoma dapat merubah dan memodulasi

lingkungan mikro di sekitar tumor untuk mendukung pertumbuhan dan sifat

progresivitas tumor melalui sekresi berbagai sitokin, kemokin, dan faktor

pertumbuhan serta enzim-enzim proteinase. Stroma akan menjadi reaktif terhadap

stimulus dari sel-sel karsinoma (Li et al., 2007; Rohan et al., 2014).

Sel-sel epitelial dapat juga berkonversi menjadi sel-sel mesenkimal melalui

proses yang dikenal sebagai epithelial-mesenchymal transition (EMT). EMT dan

proses sebaliknya, mesenchymal-epithelial transition (MET), meregulasi stadium

awal pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Reaktivasi EMT pada masa

lanjut dianggap sebagai upaya fisiologis untuk mengontrol inflamasi dan

memulihkan jaringan yang rusak. EMT juga terlibat dalam proses patologis

seperti fibrosis dan karsinoma. Perkembangan dan patologikal EMT

dilambangkan oleh berbagai spektrum perubahan morfologi, ekspresi gen, dan

jalur-jalur sinyal (Lee and Nelson, 2012).

2.2.1 Sel Epitelial dan Mesenkimal

Sel-sel epitelial dan mesenkimal dikarakteristikkan oleh keunikan fenotip dan

morfologi masing-masing. Gambaran perbedaan antara keduanya disajikan dalam

gambar 2.7. Sel epitelium yang tipikal adalah lembaran sel yang dihubungkan

dengan kompleks junctional yang spesifik antar selnya, meliputi tight junctions,

adherens junctions, desmosomes, dan gap junctions. Lembaran epitelial

menunjukkan karakteristik terpolarisasi dengan pola apical-basal dan normalnya

24

berhubungan erat dengan sel tetangganya, sehingga menghambat potensi

pergerakan dan disosiasinya dari lembaran sel (Lee and Nelson, 2012).

Sebaliknya, sel-sel mesenkimal tidak membentuk lembaran sel yang reguler

dan tidak memiliki kompleks adesi interseluler spesifik. Sel ini memiliki bentuk

yang relatif elongated dibandingkan sel epitelial dan menunjukkan polaritas end-

to-end dan adesi fokal. Hal ini meningkatkan kapasitas migrasinya. Sel-sel

mesenkimal bermigrasi dengan mudah di dalam jaringan secara individual

ataupun bersama-sama membentuk untaian (Lee and Nelson, 2012).

Gambar 2.7Gambaran umum sel-sel epitelial dan mesenkimal (Lee and Nelson, 2012).

2.2.2 Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)

Epithelial-mesenchymal transition dideskripsikan sebagai perubahan cepat serial

pada fenotip seluler. Selama EMT, sel-sel epitelial mengubah struktur perlekatan

25

sel dan polaritasnya sehingga menjadi terisolir, motil, dan resisten terhadap

kematian sel. Istilah EMT sering diaplikasikan pada peristiwa-peristiwa biologis

bagaikan sebuah proses yang terlindung, akan tetapi kenyataannya, proses yang

berhubungan dengan EMT dapat bervariasi dalam intensitas mulai dari kehilangan

polaritas sel yang tersamar sampai pemrograman ulang sel secara total

(Klymkowsky and Savagner, 2009).

Epithelial-mesenchymal transition dapat diklasifikasikan dalam tiga subtipe

(Gambar 2.8). Tipe 1 EMT melibatkan transisi dari sel epitel primordial ke sel

motil mesenkimal dan berhubungan dengan generasi bermacam-macam jenis sel

selama perkembangan embrio dan organogenesis. Jenis ini tidak menyebabkan

fibrosis atau menginduksi invasi, dan dalam banyak kasus, sel-sel mesenkimal

yang dihasilkan kemudian menjalani MET yang selanjutnya menimbulkan epitel

sekunder. Tipe 2 EMT melibatkan transisi dari sel epitel sekunder untuk jaringan

fibroblas dan berhubungan dengan penyembuhan luka, regenerasi jaringan, dan

fibrosis organ (Lee and Nelson, 2012).

Berbeda dengan tipe 1, tipe 2 EMT diinduksi dalam menanggapi peradangan,

tetapi berhenti setelah peradangan dilemahkan, terutama selama penyembuhan

luka dan regenerasi jaringan. Selama jaringan fibrosis, tipe 2 EMT terus merespon

peradangan secara persisten, yang mengakibatkan kerusakan jaringan (Lee and

Nelson, 2012).

Tipe 3 EMT terjadi pada sel-sel karsinoma yang telah terbentuk sebagai

tumor padat dan berhubungan dengan transisi ke sel-sel tumor metastatik yang

memiliki potensi untuk bermigrasi melalui aliran darah, dan dalam beberapa kasus

26

membentuk tumor sekunder di tempat lain melalui MET. Selama tipe 3 EMT,

beberapa sel tetap mempertahankan sifat epitel sementara memperoleh

karakteristik mesenkimal dan sel-sel lainnya melepaskan karakteristik epitelnya

dan menjadi sepenuhnya mesenkimal (Lee and Nelson, 2012).

Gambar 2.8Berbagai jenis tipe EMT (Lee and Nelson, 2012).

Konversi epitelial menjadi mesenkimal memerlukan perubahan dalam hal

morfologi seluler, adesi, dan kapasitas migrasi. Berbagai marka biologis telah

dikemukakan untuk mengenali ketiga subtipe EMT (Tabel 2.2). Spektrum

perubahan yang terjadi selama EMT tidak selalu identik dan mungkin ditentukan

oleh integasi sinyal-sinyal ekstraseluler (Lee and Nelson, 2012).

27

Tabel 2.2 Kriteria mayor untuk mendeteksi EMT, termasuk marka-marka yang sudah ditegakkan, fenotip ((Lee and Nelson, 2012).

Marka Fenotip EMT

- Berbentuk spindel, fenotip fibroblast-like- Peningkatan motilitas dan kapasitas migrasi- Peningkatan resistensi terhadap kematian sel dan apoptosis- Mempertahankan fenotip ini setelah stimuls dihentikan

EMT Proteome

Protein yang menurun selama EMT- E-cadherin, ZO-1, mucin1, cytokeratin, occludin, desmoplakin,

collagen IV, laminin 1, MiR-200 familyProtein yang meningkat selama EMT

- Faktor transkripsi: Snail (Snai1/Snail1), Slug (Snai2/Snail2), ZEB1(TCF8/δEF1), ZEB2 (SIP1), E47 (TCF3), E2-2 (TCF4, Twist1,FOXC2

- Matrix metalloproteinases: MMP2, MMP3, MMP9- Protein permukaan sel: N-cadherin, OB-cadherin, α5β1 integrin, αVβ6

integrin, DDR2- Marka cytoskeletal: vimentin, fibronectin, αSMA, FSP1- Faktor transkripsi yang bertranslokasi dalam inti: β-catenin, NF-ƙB,

Smad 2/3- miRNA: miR 10b, miR-21x- HSP-47

Perubahan Minor

- Filamen intermediate dan mikrofilamen yang banyak- Hilangnya kondensasi kromatin berhubungan dengan adanya multipel

nukleoli- Granul lisosom yang berlimpah

Sinyal-sinyal yang Memicu EMT

- Faktor pertumbuhan dan sitokin: TGFβ, EGF, HGF, FGF- Komponen ECM melalui integrin- Protein Wnt, Notch- Hipoksia- ROS- Stres mekanik

28

2.3 Matriks Metalloproteinase (MMP)

2.3.1 Struktur, Jenis, dan Fungsi Umum MMP

Matriks metalloproteinase adalah kelompok endopeptidase yang tergantung pada

zinc. Protein ini terlibat dalam degradasi matriks ekstraselular, serta berperan

penting pada proses fisiologis maupun patologis. Pada keadaan fisiologis MMP

membantu proses morfogenesis, angiogenesis, dan perbaikan jaringan. Sementara

pada proses patologis, MMP terlibat pada terjadinya sirosis, arthritis dan

karsinoma (Yabluchanskiy et al., 2013; Gong et al., 2014). Jerome Gross dan

Charles Lapiere adalah orang yang pertama kali menemukan MMP pada

metamorfosis ekor kecebong di tahun 1962. Triple helix kolagen didegradasi jika

ekor kecebong ditempatkan pada matriks kolagen kecebong yang

bermetamorfosis (Loffek et al., 2011; Ansari et al., 2013).

Matriks metalloproteinase mengandung beberapa komponen dengan fungsi

yang berbeda-beda berupa :

1) Pro-peptida yang berperan menjaga enzim dalam bentuk tidak aktif.

Domain ini mengandung “Cystein switch” yakni residu cystein unik dan

selalu terjaga, yang berinteraksi dengan zinc pada bagian aktif. Saat

aktivasi enzim, bagian ini akan dipecah secara proteolitik oleh furin secara

intraseluler atau MMP lainnya dan protease serin secara ekstraseluler.

2) Domain katalitik yang menjadi penanda struktural corak pengikat zinc. Ion

Zn2+, diikat oleh tiga residu histidin membentuk area aktif. Area aktif ini

berjalan secara horizontal melewati molekul sebagai celah dangkal dan

berikatan dengan substrat.

29

3) Bagian penghubung (hinge region) merupakan sebuah jembatan lentur

atau bagian penghubung yang terbuat dari 75 rantai asam amino berfungsi

untuk menghubungkan domain katalitik dengan domain terminal-C.

Bagian ini sangat penting untuk menjaga stabilitas enzim.

4) Domain terminal-C yang menyerupai hemopexin

(hemopexin like - domain) merupakan domain yang rangkaiannya

menyerupai protein serum hemopexin. Rantai polipeptida domain ini

tersusun dalam empat lembaran β yang simetris. Permukaan datar yang

disediakan oleh struktur ini dipercaya terlibat dalam interaksi antar protein

dan merupakan penentu spesifisitas substrat, contohnya: TIMP berinteraksi

pada area ini (Nagase et al., 2005; Ansari et al., 2013).

Berdasarkan struktur tersebut, MMP diklasifikasikan menjadi empat

kelompok yaitu archetypal MMPs, matrilysins, gelatinases dan furin-activatable

MMPs. Archetypal MMPs terbagi lagi menjadi tiga kelompok kecil sesuai dengan

kandungan subsrat spesifiknya yaitu kolagenase, stromelysin, dan kelompok

lainnya. Matrilysins merupakan kelompok MMP yang tidak memiliki hemopexin

domain. Sementara gelatinases mengandung struktur fibronectin berulang di

dalam catalytic domain-nya dimana MMP-2 (Gelatinase A) dan MMP-9

(Gelatinase B) termasuk didalamnya. Kelompok furin-activatable mengandung

furin recognition motif termasuk diantaranya secreted, membrane type dan type II

transmembrane (Nagase et al., 2005; Gong et al., 2014).

Aktivitas MMP megalami regulasi ketat pada berbagai tingkat sebelum

menjadi bentuk aktif. Regulasi ini terjadi baik pada tingkat mRNA maupun

30

aktivasi protein melalui aktivator dan inhibitornya serta berbagai sel di lingkunagn

sekitar tumor. Seperti misalnya MMP-9 pada karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik mengalami regulasi melalui interaksi antara sel tumor dengan

lingkungan mikro di sekitarnya seperti sel stroma, sel endotel, makrofag, maupun

sel radang neutrofil. Sudah sangat diakui peranan sel radang seperti makrofag,

neutrofil, sel mast sel dendritik, dan sel T pada inisiasi dan progresi tumor. Sel

tumor ini mampu menghasilkan faktor-faktor pro-inflamasi dan MMP berperan

pada progresivitas tumor (Deryugina dan Quigley, 2006). Co-culture sel tumor

dengan sel stroma secara in vitro mampu meningkatkan ekspresi pro-MMP-9 di

sel tumor dan menekan regulasi inhibitornya (TIMPs) di sel stroma. Co-culture sel

tumor dengan sel endotel juga mampu meningkatkan ekspresi MMP-9 serta

meningkatkan kemampuan invasi sel tumor melalui peningkatan sekresi IL-6 oleh

sel endotel. Sitokin dan faktor pertumbuhan yang dikeluarkan oleh sel tumor,

endotel dan sel radang di lingkungan mikro tumor bersama-sama meregulasi

ekspresi MMP-9, baik melalui jalur autokrin maupun parakrin (Gong et al., 2014).

Fungsi fisiologis MMP tampak signifikan selama perkembangan embriogenik

di mana MMP memegang peranan penting pada proses remodeling ECM yang

merupakan bagian penting dalam pertumbuhan dan morfogenesis jaringan. Secara

sistematis, beberapa fungsi seluler MMP selama perkembangan dan fisiologis

normal (Gambar 2.9), yaitu:

1) Membantu migrasi sel melalui degradasi molekul ECM

2) Mengubah perangai seluler dengan mengubah lingkungan mikro ECM

31

3) Membantu aktivitas molekul aktif secara biologis dengan pemecahan

langsung, pelepasan dari simpanan, atau memodulasi aktivitas

penghambatnya.

Gambar 2.9 Fungsi seluler MMP selama perkembangan dan fisiologis normal

(Ansari et al., 2013).

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, ketidakseimbangan antara aktivasi

dan inhibisi mengarahkan MMP pada kondisi patologis seperti misalnya

keganasan. Pada kondisi ini MMP dihasilkan langsung oleh sel tumor maupun sel

fibroblast pada stroma dan sel makrofag melalui rangsangan sel tumor (Gialeli et

al., 2010; Kumar et al., 2015). Selanjutnya MMP akan menyebabkan degradasi

komponen ECM pada membran basalis dan jaringan ikat interstisial yang tersusun

atas kolagen, glikoprotein, dan proteoglikan. Proses metastasis suatu karsinoma

32

diawali oleh interaksi antara sel tumor dengan ECM. Pertama-tama sel tumor

harus menembus membran basalis dibawahnya, kemudian melintasi jaringan ikat,

dan secara cepat mencapai sirkulasi dengan cara menembus membran basalis

pembuluh darah. Proses ini berulang lagi jika emboli sel tumor mengalami

ekstravasasi ke tempat jauh. Invasi melalui ECM mengawali kaskade metastasis

dan merupakan proses aktif yang melibatkan beberapa tahap, diantaranya

perubahan interaksi sel tumor , degradasi ECM, perlekatan ke komponen ECM,

dan migrasi sel tumor (Kumar et al., 2015).

Tahap pertama proses invasi yaitu disosiasi sel terjadi karena kelainan

molekul adhesi interseluler seperti E-cadherins yang menyebabkan perlekatan

antar sel berkurang sehingga sel mudah terlepas dari tumor primer dan meluas ke

jaringan sekitarnya. Tahap kedua berupa proses degradasi lokal membran basalis

dan jaringan ikat interstisial. Proses ini melibatkan enzim proteolitik seperti MMP

yang dapat disekresikan langsung dari sel tumor atau dari induksi terhadap sel

stroma seperti fibroblast dan sel inflamasi. Protease lain yang juga disekresikan

yaitu cathepsin D dan urokinase plasminogen activator. Untuk mengatur invasi

tumor, MMP bukan hanya mengubah komponen yang tidak larut pada membran

basalis dan matriks interstisial, tetapi juga melepaskan growth factor yang

disimpan ECM seperti misalnya VEGF (Deryugina and Quigley, 2006; Bouchet

et al., 2014; Kumar et al., 2015).

2.3.2 Matriks Metalloproteinase-9 (MMP-9)

Matriks metalloproteinase-9 dikenal sebagai enzim metallo-multidomain yang

mampu mendegradasi matriks ekstraselular selama proses invasi dan metastasis.

33

Secara struktural MMP-9 termasuk dalam kelompok gelatinase B dengan catalytic

site tersusun atas domain pengikat logam yang dipisahkan dari active site oleh

ulangan tiga fibronektin yang memfasilitasi degradasi substrat besar seperti elastin

dan penghancuran kolagen (Gambar 2.10) (Patil and Kundu, 2006). Dalam regio

ini, asam amino Asp309, Asn319, Asp232, Tyr320 dan Arg3076 penting untuk

pengikat gelatin. Catalytic site tetap dipertahankan dalam bentuk tidak aktif oleh

amino-terminal pro-peptide PRCGXPD, dengan koordinasi cysteine bersama

katalitik Zn2+. Ujung terminal COOH dari MMP-9 mengandung domain

hemopexin yang mengatur ikatan dengan substrat, berinteraksi dengan inhibitor

dan membantu ikatan ke permukaan sel. Domain O-glycosylated sentral

memberikan fleksibilitas molekuler, mengatur spesifisitas substrat MMP-9 invasi

yang bergantung MMP-9, interaksi dengan TIMP dan lokalisasi permukaan sel.

Domain ini membantu pergerakan MMP-9 sepanjang substrat makromolekuler

dan melepaskan ikatan kolagen sebelum dipecahkan oleh enzim lainnya (Loffek et

al., 2011; Farina and Mackay, 2014).

Gambar 2.10 Struktur MMP-9 (Gelatinase B) (Loffek et al., 2011)

Matriks metalloproteinase-9 dihasilkan baik oleh sel tumor maupun sel di

sekitar lingkungan tumor seperti sel fibroblast di stroma, sel endotelial, sel

34

polimorfonuklear (PMN), keratinosit, makrofag dan beberapa sel epitel (Verma

and Hansch, 2006; Loffek et al., 2011). Akibatnya aktivasi dan produksi MMP-9

atau gelatinase B sangat dipengaruhi oleh interaksi komponen tersebut di atas.

Selain fungsinya dalam proses metastasis, MMP 9 juga memainkan peran penting

pada proses fisiologis seperti penyembuhan luka. Inhibisi terhadap aktivitas

enzimatik MMP-9 dilakukan oleh inhibitor protease sistemik α2-makroglobulin,

anggota famili TIMP dan antagonis terhadap domain hemopexinnya sendiri

(Vempati et al., 2007; Farina and Mackay, 2014; Gong et al, 2014). Mekanisme

yang menyebabkan ketidakseimbangan antara MMP-9 dan TIMP terutama TIMP-

1 mengarahkan MMP-9 untuk terlibat dalam proses patologis tumor (Gialeli et al.,

2010; Farina and Mackay, 2014).

Saat ini diketahui MMP-9 bukan hanya memiliki kemampuan dalam

mendegradasi kolagen tipe IV, komponen utama dari membran basalis epitel dan

vaskuler; fibronektin dan gelatin yang memegang peranan penting dalam proses

invasi dan metastasis, namun juga memiliki potensi pro-onkogenik antara lain

transformasi neoplastik, inisiasi tumor dan instabilitas genetik. MMP-9 dapat

menempati inti sel, meskipun memiliki sinyal lokalisasi inti klasik yang rendah

dan aktivitas gelatinase inti menyatu dengan peningkatan fragmentasi DNA.

Gelatinase inti ini mendegradasi matriks protein inti yaitu PARP (poly-ADP-

ribose-polymerase) dan menghindarkannya dari proses perbaikan DNA (Gialeli et

al., 2010; Farina and Mackay, 2014).

Matriks metalloproteinase-9 dan TIMP-1 terekspresi dalam jumlah besar di

dalam berbagai tipe sel dan disekresikan dalam bentuk komplek pro-MMP-

35

9/TIMP-1. Lingkungan tumor yang mengandung sel tumor, stroma, dan elemen

radang memberikan kontribusi dalam menjaga stabilitas kompleks tersebut.

Infiltrasi neutrofil pada tumor menyebabkan keluarnya MMP-9 yang tidak terikat

TIMP dan memfasilitasi perubahan sifat sel tumor (Gambar 2.11) (Gialeli et al.,

2010; Farina and Mackay, 2014; Vandooren et al., 2013).

Gambar 2.11 Peranan MMP-9 yang tidak terikat TIMP yang berasal dari sel radang PMN sel tumor dalam inisiasi tumor dan promosi instabilitas genetik. melalui degradasi ECM, pelepasan dan aktivasi kemokin, sitokin, dan growth factor (Farina and

Mackay, 2014)

Peranan MMP-9 yang berasal dari sel radang neutrofil juga tampak pada

inisiasi adenoma intestinal. Ini dibuktikan oleh penurunan lesi adenoma sebanyak

40% pada heterozygous APC (APC-min) knockout mice yang mengalami

defisiensi MMP-9. Pada tumor hepar MMP-9 dilaporkan menginisiasi sel tumor

melalui pelepasan proteolitik dan aktivasi TGFβ dan VEGF. Sementara pada

epitel payudara manusia, MMP-9 meningkatkan ekspresi onkoprotein HER2/Neu,

36

menghambat apoptosis, dan menyebabkan transformasi fenotip sel normal di

mana ekspansi klonal sel ini merupakan langkah penting proses progresivitas

tumor (Farina and Mackay, 2014).

Stem cell niche merupakan lokasi spesifik dan unik yang mengatur jumlah,

self-renewal dan pembelahan stem cell baik pada sel normal maupun sel tumor.

Pada sel tumor stem cell niche ini mempengaruhi heterogenitas tumor, metastasis

dan resistensi terapi yang diregulasi oleh kondisi-kondisi di dalam tumor dan

didukung oleh stress yang berhubungan dengan tumor seperti misalnya hipoksia.

MMP-9 dikatakan berimplikasi terhadap perubahan perilaku stem cell niche dan

sumsum tulang. MMP-9 mendegradasi matriks ekstraselular stem cell niche

sehingga menyebabkan aktivasi dan mobilisasi stem cell hemopoetik. Hal ini

difasilitasi oleh perubahan bentuk stem cell terikat membran menjadi stem cell

bebas yang mampu meningkatkan promosi c-KIT terkait proliferasi sel. MMP-9

juga melepaskan stem cell prekursor sel endothelial dari sumsum tulang yang

berkontribusi dalam angiogenesis. Interaksi antara stroma-derived factor (SDF)-1

dan reseptor kemokin CXCR4 penting dalam fungsi sel progenitor dan induksi

ekspresi MMP-9 (Gong et al., 2014 ).

Matriks metalloproteinase-9 juga dikenal sebagai gen penting yang

berhubungan dengan proses transisi EMT dan sekaligus menjadi penyebab EMT

(Gambar 2.12) (Gialeli et al., 2010). Ini merupakan proses perubahan sel epitel

yang tidak dapat bergerak menjadi sel mesenkimal yang mampu bergerak. Proses

ini penting pada pertumbuhan (tipe 1), penyembuhan luka normal atau fibrosis

patologis (tipe 2) dan proses metastasis sel karsinoma (tipe 3). Sel EMT tipe 3

37

fundamental untuk progresi tumor menjadi metastasis, dan baik reaktivasinya

dalam dehistologis sel karsinoma maupun aktivasi dalam stem cell, mampu

menginduksi fenotip dan motilitas sel karsinoma menjadi invasif (Farina and

Mackay, 2014).

Gambar 2.12 Transisi epitelial menjadi mesenkimal (EMT) yang dipicu MMP-9

(Farina and Mackay, 2014)

2.3.3 Matriks Metalloproteinase-9 (MMP-9 / Gelatinase) dan Peranannya

pada Karsinoma Payudara

Matriks metalloproteinase-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik

terlibat pada semua tahap progresivitas sel kanker mulai dari proliferasi,

angiogenesis, apoptosis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), dan metastasis

(Gong et al., 2014). Matriks metalloproteinase-9 ini juga mampu mendegradasi

matriks ekstraselular dari stem cell niche yang mengakibatkan terjadinya

38

perubahan bentuk stem cell niche menjadi bentuk bebas, dan selanjutnya

meningkatkan promosi c-KIT yang terkait dengan proliferasi sel. Proses

angiogenesis pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik dipicu melalui

mobilisasi dan aktivasi mitogen angiogenik dari matriks penyimpanannya. Proses

ini difasilitasi oleh MMP-9 yang tidak terikat TIMP-1 yang sekaligus mampu

melepaskan faktor pertumbuhan FGF dan VEGF dari matriks. Proses metastasis

dimudahkan oleh kemampuan sel tumor untuk berubah dari bentuk sel epitel yang

tidak mampu bergerak menjadi sel mesenkimal yang mampu bergerak (EMT).

Matriks metalloproteinase-9 dikatakan juga terlibat pada proses ini (Farina dan

Mackay, 2014).

Terdapat beberapa penelitian yang telah dilakukan untuk meneliti hubungan

dan peranan MMP-9 pada karsinoma payudara. Pada penelitian yang dilakukan

oleh Irianiwati et al. (2012) terhadap 50 kasus karsinoma payudara, dilakukan

pulasan MMP-9 untuk menilai perburukan derajat histologisnya. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekspresi MMP-9 berbeda bermakna pada derajat tinggi

dibandingkan derajat rendah, di mana ekspresi tinggi MMP-9 ditemukan pada

karsinoma payudara derajat tinggi (Irianiwati et al., 2012).

Penelitian serupa dilakukan oleh Yousef et al. terhadap 200 kasus karsinoma

payudara yang dibagi menjadi tiga derajat histologis. Penghitungan ekspresi

MMP-9 dilakukan secara semi kuantitatif berdasarkan presentase jumlah sel yang

terpulas positif dengan intensitas pewarnaan. Sel yang mengekspresikan MMP-9

akan tampak berwarna coklat pada sitoplasma sel epitel ganas maupun stroma

(Gambar 2.12). Pada penelitian ini, sampel dibagi menjadi dua yaitu ekspresi

39

MMP-9 dengan tingkat rendah dan tingkat tinggi. Hasil dari penelitian ini

didapatkan ekspresi MMP-9 tingkat tinggi pada karsinoma payudara derajat tinggi

(Gambar 2.13) (Yousef et al., 2014).

Gambar 2.13Ekspresi MMP-9 pada jaringan payudara normal

A. Pulasan positif lemah MMP-9 pada kelenjar payudara normal yang terpulas pada sel epitel luminal dan myoepitel. Sel stromal di

sekitarnya tidak terpulas (pada 75% pasien) B. Pulasan positif lemah MMP-9 pada sitoplasma sel epitel luminal, myoepitel, dan sel stroma di antara asinus

jaringan payudara normal (Yousef et al.,2014).

Penelitian karsinoma payudara di negara Irak tahun 2015 yang dilakukan oleh

Mahmood dan kawan-kawan, menghubungkan antara ekspresi MMP-2 dan MMP-

9 dengan berbagai variabel klinikopatologis pada karsinoma payudara stadium II

dan III. Penelitian dilakukan dengan jumlah pasien sebanyak 64 orang. Hal ini

serupa dengan metode penelitian-penelitian sebelumnya. Didapatkan korelasi

yang signifikan antara ekspresi MMP-9 dengan beberapa variabel

klinikopatologis, yaitu: stadium tumor, derajat histologis, tipe histologis, dan

status metastasis limfonodi (Mahmood et al., 2015).

Di Italia, penelitian ekspresi MMP-2 dan MMP-9 pada pasien-pasien dengan

karsinoma payudara, dilakukan dengan mengambil level plasmadari MMP

40

tersebut. Jadi, penilaian tidak didasarkan pada pewarnaan IHK. Penelitian

dilakukan terhadap 50 pasien karsinoma payudara dan 30 pasien fibroadenoma.

Hasil penelitian menunjukkan tidak ada perbedaan yang bermakna ekspresi MMP-

9 plasma antara pasien-pasien dengan karsinoma dan fibroadenoma. Perbedaan

yang bermakna ekspresi MMP-9 plasma didapatkan pada pasien-pasien karsinoma

payudara bila ditinjau dari sudut pandang variabel derajat histologis (Vasaturo et

al., 2012).

Penelitian di India dengan 39 sampel kanker payudara dan 16 jaringan

payudara yang normal menunjukkan adanya peningkatan MMP-9 secara berbeda

pada jaringan kanker payudara dengan jaringan payudara yang normal. Dimana

tampak peningkatan ekspresi MMP-9 pada karsinoma payudara (Benson et al.,

2013).

Di Finlandia ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dianalisis secara imunohistokimia

dalam prospektif seri besar dari 421 pasien kanker payudara. MMP-9 terekspresi

dalam sitoplasma sel-sel ganas dan stroma. Ekspresi tinggi MMP dalam sel

karsinoma terkait stadium tumor, sedangkan ekspresi positif pada stroma

dikaitkan dengan faktor-faktor agresif. Evaluasi ekspresi MMP-9 menambahkan

informasi tentang prognosis kanker payudara (Pellikainen et al., 2014).

Hasil kontradiktif didapatkan oleh Wu dan kawan-kawan melalui

penelitiannya di Cina pada tahun 2014, mereka berusaha mencari signifikansi

antara ekspresi MMP-9 dengan berbagai variabel klinikopatologis pada 41

spesimen operasi mastektomi tanpa riwayat terapi sebelumnya (radioterapi dan

kemoterapi). Kasus-kasus dievaluasi dengan variabel tipe histologis, derajat

41

histologis, metastasis limfonodi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada

korelasi yang signifikan antara ekspresi MMP-9 dengan semua variabel penelitian

yang dievaluasi (Wu et al., 2014).

Sebagai kesimpulan, data-data yang dikumpulkan mendukung hipotesis

bahwa ekspresi MMP-9 berhubungan dengan derajat histologis. Namun tidak

dijelaskan apakah ada perbedaan bermakna antara tiap variabel

klinikopatologisnya.

42

BAB III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir

Progresivitas sel karsinoma erat kaitannya dengan kemampuan proliferasi, invasi,

serta metastasis. Pada karsinoma payudara tipe tidak spesifik, progresivitas sel

kanker secara histopatologis ditentukan berdasarkan sistem Nottingham Combined

Histologic Grade (Elston-Ellis Modification of Scarff-Bloom-Richardson Grading

System). Sistem ini menilai karsinoma payudara berdasarkan tiga karakteristik

tumor yaitu formasi tubular (kelenjar), pleomorfisme inti sel, dan jumlah mitosis.

Diagnosis pada karsinoma payudara berdasarkan tipe histologis saja tidak

cukup untuk menentukan terapi akhir dan memprediksi prognosis pasien. Oleh

karena itu, dibuatlah dengan sistem derajat histologis. Karsinoma payudara

dengan histologis baik umumnya memiliki prognosis yang baik, sedangkan

tumor-tumor derajat histologis buruk akan berkembang cepat dan memiliki

prognosis yang kurang baik.

Proses invasi serta metastasis melibatkan beberapa tahap salah satunya adalah

degradasi komponen matriks ekstraselular (ECM). Proses ini melibatkan suatu

protease utama yaitu matriks metalloproteinase (MMP), salah satunya adalah

MMP-9. Secara struktural MMP-9 termasuk dalam kelompok gelatinase B dengan

catalytic site tersusun atas domain pengikat logam yang dipisahkan dari active site

oleh ulangan tiga fibronektin yang memfasilitasi degradasi kolagen tipe IV.

43

Matriks metalloproteinase-9 dihasilkan baik oleh sel tumor maupun sel di

sekitar lingkungan tumor seperti sel fibroblas di stroma, sel endotel pembuluh

darah, sel polimorfonuklear, keratinosit, makrofag, dan beberapa sel epitel

sehingga aktivasi dan produksinya sangat dipengaruhi oleh interaksi komponen

tersebut. Faktor pertumbuhan dan sitokin yang disekresikan oleh sel tumor,

stroma, dan sel radang di lingkungan mikro tumor bersama-sama dapat

meningkatkan ekspresi MMP-9 melalui jalur autokrin dan parakrin.

Selanjutnya MMP-9 yang berasal dari neutrofil meregulasi penarikan perisit,

apoptosis, pengambilan dan mobilisasi sumsum tulang yang mengandung

prekursor angiogenik ke stroma tumor sehingga meningkatkan proses angiogenik

dan vaskulargenik. Pada saat proses angiogenik oleh sel tumor terjadi, MMP-9

juga memicu tombol angiogenik melalui mobilisasi dan aktivasi mitogen

angiogenik dari matriks penyimpanannya. Selain itu MMP-9 mampu melepaskan

faktor pertumbuhan FGF dan VEGF, urokinase plasminogen activator (uPA),

serpin protease nexin-1 (PN-1) yang penting pada proses invasi dan angiogenesis.

Progresi tumor primer hingga menjadi tumor metastasis merupakan suatu

proses yang kompleks. MMP-9 memegang peranan penting pada hampir setiap

tahap proses progresivitas tersebut sehingga dapat dijadikan sebagai penanda

penting progresivitas karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik. Ekspresi

MMP-9 diduga berkaitan dengan derajat karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik berdasarkan sistem Nottingham Grading System yang ditelusuri pada

penelitian ini.

44

3.2. Konsep Penelitian

Bertolak dari kerangka berpikir di atas, maka dibuat konsep penelitian :

Gambar 3.1

Bagan Konsep Penelitian

Keterangan: : Variabel yang diteliti

3.3 Hipotesis Penelitian

1. Terdapat hubungan antara ekspresi MMP-9 dengan derajat histologis pada

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik.

2. Terdapat pengaruh ekspresi MMP-9 dalam menentukan faktor

karakteristik derajat histologis yang paling dominan.

MMP-9

Karsinoma Payudara Invasif

Tipe Tidak Spesifik

Derajat Histologis I

Derajat Histologis II

Derajat Histologis III

Skor Formasi Tubular

Skor Pleomorfia Inti

Skor Hitung Mitosis per 10 lapang pandang

45

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan menggunakan

rancangan potong lintang (cross-sectional analytic study). Bagan rancangan

penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.1.

Gambar 4.1Bagan Rancangan Penelitian

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah

Denpasar dari 31 Agustus 2016 – 30 November 2016.

4.3 Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup penelitian ini adalah gambaran mikroskopis dari bahan biopsi dan

operasi mastektomi penderita karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik

derajat histologis I, II, dan III yang diperiksa secara histopatologi di Bagian/SMF

46

Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar dan mikroskopis dari

bahan biopsi dan operasi mastektomi penderita karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III yang diperiksa imunohistokimia

MMP-9 di Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada/RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta.

4.4 Penentuan Sumber Data

4.4.1 Populasi

4.4.1.1. Populasi target

Populasi penelitian ini adalah semua sediaan blok parafin dari penderita

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III yang

diperiksa secara histopatologi dari hasil biopsi dan operasi mastektomi di Bali.

4.4.1.2. Populasi terjangkau

Populasi penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari penderita karsinoma

payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III yang diperiksa

secara histopatologi dari hasil biopsi dan operasi di Bagian/SMF Patologi

Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar.

4.4.2 Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini adalah sediaan blok parafin penderita karsinoma payudara

invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III yang diperiksa secara

histopatologi dari hasil biopsi dan operasi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK

47

UNUD/RSUP Denpasar dari tanggal 1 Januari 2013 sampai dengan 31 Juli 2016

yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.

4.4.3 Kriteria Inklusi

1. Sediaan blok parafin yang berasal dari bahan biopsi atau operasi payudara

yang mengandung cukup jaringan tumor karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik dan memenuhi

kriteria karakteristik bentukan tubular, pleomorfia inti, dan hitung mitosis per

10 lapang pandang besar mikroskop.

2. Sediaan blok parafin yang berasal dari bahan biopsi atau operasi karsinoma

payudara invasif tipe tidak spesifik yang belum mendapat radioterapi,

kemoterapi, dan terapi hormonal.

4.4.4 Kriteria Eksklusi

1. Sediaan dari sisa frozen section karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik.

2. Sediaan yang mengandung infiltrasi padat sel radang PMN neutrofil dan

makrofag.

3. Sediaan dari bahan biopsi dengan ukuran yang tidak mencukupi untuk

menentukan derajat histologisnya.

4. Blok parafin yang berjamur.

48

4.4.5 Besar Sampel

Pada penelitian ini besar sampel dihitung dengan rumus (Araoye, 2003):

n = Z α2PQ

d2

Keterangan:

n = besar sampel

P = prevalensi karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik pada penelitian

terdahulu

Q = 1-P

d = deviasi di populasi (15%)

α = tingkat kemaknaan 95% (Zα = 1,96)

Jumlah sampel (n) dihitung dengan rumus di atas. Di mana Zα2 yaitu 1,96 x 1,96

dikalikan dengan P sebesar 0,545, kemudian dikalikan oleh Q yaitu 1-P = 0,455.

Lalu dibagi dengan d2 yaitu 0,0225. Dan didapatkan hasil yang paling besar yaitu

42,34. Oleh karena adanya kemungkinan drop out/data blank, maka ditambahkan

10% sehingga sampel menjadi 42,34 + 4,234 = 46,57 dan dibulatkan menjadi 47

sampel. Jadi besar sampel keseluruhan dalam penelitian ini adalah 47 sampel.

4.4.6 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik penentuan sampel dilakukan dengan cara berikut :

a. Dari populasi sediaan blok parafin diadakan pemilihan sampel berdasarkan

kriteria inklusi dan eksklusi.

49

b. Populasi terjangkau yang telah memenuhi syarat diambil secara random untuk

mendapatkan jumlah sampel yang dibutuhkan, yaitu sebanyak 47 sediaan.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Klasifikasi Variabel

1. Variabel tergantung : - Ekspresi MMP-9.

- Karakteristik derajat histologis.

2. Variabel bebas : Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik

derajat histologis I, II, dan III.

4.5.2 Definisi Operasional Variabel

1. Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik adalah keganasan yang terjadi

pada sel-sel epitel duktuli payudara, terutama sel-sel dari terminal duct

lobular unit (TDLU) yang ditandai adanya invasi ke stroma jaringan dan

tumor ini tidak membentuk suatu pola tipe histologis tertentu.

Diklasifikasikan sebagai karsinoma invasif tipe tidak spesifik apabila

komponen gambaran tidak spesifiknya lebih dari 50% massa tumor dengan

pemeriksaan dari potongan yang representatif. Jika gambaran tidak spesifik

kurang dari 50% atau sekitar 10-49% dari massa tumor dan sisanya adalah

tipe spesifik maka disebut kelompok campuran yaitu campuran karsinoma

invasif tipe tidak spesifik dan tipe spesifik.

2. Karakteristik derajat histologis : karakteristik derajat histologis terdiri dari

formasi tubular, pleomorfia inti, dan hitung mitosis. Masing-masing

50

karakteristik memiliki skor 1 sampai 3. Formasi tubular diamati dengan

mikroskop cahaya binokuler merk Olympus CX21 dengan pembesaran lemah

40 kali, dilihat seluruh lapang pandang. Skor 1 bila bentukan tubular lebih

dari 75%, skor 2 bentukan tubular 10%-75%, skor 3 bila bentukan tubular

kurang dari 10%. Penghitungan pleomorfia inti diamati dengan mikroskop

cahaya binokuler merk Olympus CX21 dengan pembesaran lemah 40 kali

sampai pembesaran kuat 400x dilihat seluruh lapang pandang. Skor 1 bila sel-

sel uniform, kecil, pleomorfia inti ringan, skor 2 bila peningkatan inti sedang

dalam bentuk dan ukuran dikatakan pleomorfia inti sedang, skor 3 bila bentuk

sangat bervariasi dikatakan sebagai pleomorfia inti berat. Penghitungan

mitosis diamati dengan mikroskop cahaya binokuler merk Olympus CX21

dinilai dengan menghitung jumlah mitosis per 10 lapang pandang besar

mikroskop atau High Power Field (HPF) dengan pembesaran 400x.

Penghitungan dengan cara mencari massa tumor yang padat dan dinilai secara

random meaner. Skor 1 bila hitung mitosis ≤ 12 per 10 lapang pandang besar

mikroskop, skor 2 bila hitung mitosis 13-24 per 10 lapang pandang besar

mikroskop dan skor 3 bila hitung mitosis ≥ 25 per 10 lapang pandang besar

mikroskop (Colditz dan Chia, 2012).

3. Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I : kelompok

keganasan payudara yang terjadi pada sel-sel epitel duktuli payudara yang

ditandai adanya invasi ke stroma jaringan dan tumor tidak membentuk suatu

pola tipe histologik tertentu sesuai kriteria WHO tahun 2012 dengan skor

total derajat histologis bernilai 3, 4, atau 5 poin berdasarkan Nottingham

51

Combined Histologic Grade (Elston-Ellis Modification of Scarff-Bloom-

Richardson Grading System) atau biasa disebut dengan Nottingham Grading

System (Colditz dan Chia, 2012).

4. Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis II :

kelompok keganasan payudara yang terjadi pada sel-sel epitel duktuli

payudara yang ditandai adanya invasi ke stroma jaringan dan tumor tidak

membentuk suatu pola tipe histologik tertentu sesuai kriteria WHO tahun

2012 dengan skor total derajat histologis bernilai 6 atau 7 poin berdasarkan

Nottingham Combined Histologic Grade (Elston-Ellis Modification of Scarff-

Bloom-Richardson Grading System) atau biasa disebut dengan Nottingham

Grading System (Colditz dan Chia, 2012).

5. Karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis III :

kelompok keganasan payudara yang terjadi pada sel-sel epitel duktuli

payudara yang ditandai adanya invasi ke stroma jaringan dan tumor tidak

membentuk suatu pola tipe histologik tertentu sesuai kriteria WHO tahun

2012 dengan skor total derajat histologis bernilai 8 atau 9 poin berdasarkan

Nottingham Combined Histologic Grade (Elston-Ellis Modification of Scarff-

Bloom-Richardson Grading System) atau biasa disebut dengan Nottingham

Grading System (Colditz dan Chia, 2012).

6. Ekspresi MMP-9 adalah penilaian protein MMP-9 secara imunohistokimia

menggunakan Monoclonal Rabbit Anti-Human MMP-9 Antigen, Abcam

kemudian secara semikuantitatif diamati dengan mikroskop cahaya binokuler

merk Olympus CX21 dimulai dari pembesaran lemah 40 kali untuk melihat

52

persentase sel tumor yang terpulas positif sampai pembesaran kuat 400 kali

untuk menilai intesitas pewarnaan pada sel yang terpulas positif. Sel yang

mengekspresikan MMP-9 akan tampak berwarna coklat pada sitoplasma sel

epitel ganas maupun stroma. Penilaian ekspresi MMP-9 dibuat berdasarkan

perkalian skor persentase sel yang terpulas positif dan intensitas

pewarnaannya. Berdasarkan persentase sel yang terpulas positif oleh MMP-9

maka dibagi menjadi skor 0-4 yaitu : 0 (tidak terwarnai), 1+ (1-10% sel

terpulas), 2+ (10-50% sel terpulas), 3+ (50-70% sel terpulas), dan 4+ (70-

100%). Berdasarkan intensitas warna coklat pada sel ganas yang

menunjukkan pulasan positif MMP-9 maka dibagi menjadi skor 0-3 yaitu : 0

(negatif), 1 (lemah), 2 (sedang) dan 3 (kuat). Skor persentase dari sel yang

terpulas positif kemudian dikalikan dengan skor intensitasnya, sehingga

didapatkan hasil perkalian 0-12 dan dibagi menjadi skor 0-4 yaitu tingkat

rendah dan skor 5-12 yaitu tingkat tinggi (Yousef et al.,2014). Pemeriksaan

imunohistokimia MMP-9 dikerjakan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK

Universitas Udayana. Interpretasi ekspresi MMP-9 dilakukan oleh peneliti

dan 2 orang dosen pembimbing tanpa mengetahui data kliniko-patologi

pasien.

7. Ekspresi MMP-9 adalah imunoskor dari skor presentase sel yang dikalikan

dengan intensitas warna dan kemudian akan diuji analisis dengan Chi-square

test dan One-way Annova test.

8. Dari ketiga faktor derajat histologis yaitu formasi tubular, pleomorfia inti, dan

hitung mitosis akan diuji analisis dengan uji regresi logistik untuk

53

menentukan faktor mana yang paling dominan yang dipengaruhi oleh

ekspresi MMP-9.

4.6 Bahan Penelitian

1. Bahan pemeriksaan histopatologi berupa blok parafin dari bahan biopsi

dan operasi mastektomi pasien yang menderita karsinoma payudara

invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, dan III yang diperiksa

secara histopatologi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP

Sanglah Denpasar, dan slide dengan pengecatan H&E.

2. Reagen pewarnaan Harris’s hematoksilin dan eosin.

3. Phosphate buffer saline (PBS).

4. Monoclonal Rabbit Anti-Human MMP-9 Antigen, Abcam.

5. DAB (3,3’-diaminobenzidine).

6. Streptavidin Peroxidase.

7. Reagen pewarnaan Harris’s hematoksilin.

8. Alkohol 50% hingga alkohol absolut.

9. Xylol.

4.7 Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

1. Buku Registrasi Pemeriksaan Histopatologi Bagian/SMF Patologi

Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar tahun 2013 hingga 2016

untuk mencari data pasien yang menderita karsinoma payudara invasif tipe

54

tidak spesifik derajat histologis I, II, III dari 1 Januari 2013 sampai dengan

31 Juli 2016.

2. Mikroskop cahaya binokuler merk Olympus CX21, untuk mengevaluasi

sediaan karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I,

II, III pulasan H&E, serta menilai ekspresi MMP-9.

3. Ocular micrometer lense model XY11.

4. Metode pulasan imunohistokimia MMP-9 menggunakan Monoclonal

Rabbit Anti-Human MMP-9 Antigen, Abcam.

5. Mikrotom Leica RM 2125 dan Leica RM 2235.

6. Waterbath dan hot plate.

7. Gelas obyek merk Sail dan Sigma dengan ukuran lebar satu inchi, panjang

tiga inchi, dan tebal 1,2 mm.

8. Pipet mikro.

9. Staining jar.

10. Inkubator dan aluminium chamber.

11. Rotator.

12. Oven microwave.

4.8 Prosedur Penelitian

4.8.1 Cara Pengumpulan Data

1. Peneliti mencari sediaan penderita yang didiagnosis sebagai karsinoma

payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II, III dari bahan biopsi

dan operasi mastektomi yang diperiksa secara histopatologis dari tanggal 1

55

Januari 2013 sampai dengan 31 Juli 2016 di Bagian /SMF Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah Denpasar.

2. Preparat hasil pulasan Hematoksilin dan Eosin sesuai nomor-nomor di atas,

dikumpulkan, dievaluasi, dan dilakukan diagnosis ulang oleh peneliti dan dua

orang ahli Patologi Anatomi.

3. Apabila dalam proses penilaian ditemukan preparat yang sulit dievaluasi oleh

karena warna yang mulai pudar, maka akan dilakukan proses pewarnaan

kembali. Apabila preparat berjamur atau rusak, dilakukan pemotongan ulang

blok parafin dan dipulas dengan pulasan rutin menggunakan Harris’s

Hematoksilin dan Eosin. Prosedur pulasan H&E sesuai dengan prosedur

pulasan yang rutin dikerjakan di Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah, Denpasar.

4. Memilih preparat yang digunakan sebagai dasar untuk mencari blok parafin.

Preparat yang dipilih untuk pemeriksaan imunohistokimia MMP-9 adalah

preparat yang mengandung massa tumor terbanyak.

5. Peneliti mencari blok parafin yang sesuai dengan preparat yang dipilih dan

memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.

6. Blok parafin dipotong setebal tiga µm dengan mikrotom untuk pulasan

imunohistokimia di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Universitas Gadjah

Mada/RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta.

7. Melakukan pulasan imunohistokimia MMP-9 dengan menggunakan metode

streptavidin biotin kompleks Monoclonal Rabbit Anti-Human MMP-9 Antigen,

Abcam.

56

8. Pemeriksaan pulasan imunohistokimia MMP-9 dilakukan oleh peneliti dan

dua orang ahli Patologi Anatomi.

9. Blok parafin yang sudah selesai diproses, dikembalikan ke Bagian /SMF

Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah,

Denpasar.

10. Slide preparat H&E yang sudah selesai dinilai rediagnosis, dikembalikan ke

Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Udayana/RSUP Sanglah, Denpasar.

11. Pencatatan dan pengumpulan data.

12. Analisis data.

4.8.2 Prosedur Pemeriksaan Bahan

1. Prosedur pemeriksaan makroskopis dan pemilihan sampel menggunakan

prosedur yang rutin dikerjakan di Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah, Denpasar, yaitu:

a. Identifikasi spesimen dan formulir.

b. Lakukan pemeriksaan bahan sesuai kaidah keilmuan.

c. Catat dan buat ilustrasi hasil pemeriksaan makroskopis tersebut pada form.

d. Jika sampel besar, lakukan pemilihan sampel sesuai kaidah keilmuan. Jika

sampel kecil, semua jaringan diproses.

57

2. Prosedur prosesing jaringan menggunakan prosedur yang rutin dikerjakan di

Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Udayana/RSUP Sanglah, Denpasar, yaitu:

a. Masukkan sampel ke dalam kaset-kaset jaringan, selanjutnya fiksasi

dengan formalin buffer 10% semalaman.

b. Pindahkan kaset-kaset jaringan ke dalam mesin tissue processor otomatis

(24 jam).

c. Keluar dari tissue processor, jaringan-jaringan tersebut selanjutnya.

diembedding dengan parafin cair dan dibiarkan memadat (menjadi blok

parafin).

d. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica RM 2125 dan Leica

RM 2235 dengan ketebalan empat μm.

e. Masukkan hasil potongan mikrotom ke dalam waterbath.

f. Tempelkan hasil potongan mikrotom di atas gelas obyek merk Sail Brand

dengan ukuran lebar satu inchi, panjang tiga inchi dan tebal 1,2 mm; yang

sudah diberi nomor lab dengan pensil kaca (menjadi preparat).

3. Prosedur pulasan H&E menggunakan prosedur pulasan yang rutin dikerjakan

di Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana

/RSUP Sanglah Denpasar, yaitu:

58

a. Deparafinisasi dengan dicelupkan pada xilol sebanyak empat kali masing-

masing celupan selama tiga sampai lima menit.

b. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan kosentrasi menurun

menggunakan alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, dan alkohol 50%,

masing-masing celupan selama tiga sampai lima menit.

c. Masukkan ke air selama 10 menit.

d. Rendam preparat dalam cat utama yaitu Harris’s hematoksilin selama 10 –

15 menit.

e. Cuci dengan air selama 10 menit.

f. Celupkan dalam HCl 0,4% sebanyak satu sampai dua celup.

g. Cuci dengan air selama lima sampai 10 menit.

h. Celupkan dalam Lithium karbonat 5% sebanyak tiga celup.

i. Cuci lagi dengan air selama lima sampai 10 menit.

j. Rendam dalam larutan Eosin selama 15 detik sampai dua menit.

k. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat

mengunakan alkohol 50%, alkohol 70%, alkohol 80%, dan alkohol 95%

masing-masing celupan selama tiga sampai lima menit.

l. Penjernihan dengan xilol sebanyak empat kali celupan, lama masing-

masing celupan selama tiga sampai lima menit.

m. Mounting menggunakan entelan dan preparat ditutup dengan kaca

penutup.

n. Beri label.

59

5. Prosedur pulasan imunohistokimia MMP-9 menggunakan prosedur pulasan

imunohistokimia yang rutin dikerjakan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK

Universitas Gadjah Mada/RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta, yaitu:

a. Dipotong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan

ketebalan tiga μm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah

dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi,

panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.

b. Diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37o C selama 1 malam.

c. Dideparafinisasi dengan xylol, preparat dicelupkan ke dalam xylol

sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 3 menit.

d. Direhidrasi dengan alkohol bertingkat yaitu alkohol absolut 2 kali,

alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70%, masing-masing 3 menit.

e. Dicuci dengan aquadest selama 10 menit.

f. Diteteskan H2O2 dalam metanol 3% sampai menutupi seluruh permukaan

jaringan selama 15 menit.

g. Dicuci dengan aquadest selama 10 menit.

h. Dicuci dengan PBS (phosphate buffer saline) sebanyak 2 kali, masing-

masing selama 10 menit.

i. Direndam dengan buffer sitrat 0,01 M, pH 6,0. Kemudian panaskan di

dalam oven microwave selama 15 menit, mula-mula dengan pemanasan

tinggi (80oC) sampai tepat mendidih kemudian dengan pemanasan

sedang (50oC) selama 5 menit.

j. Dinginkan pada suhu kamar.

60

k. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.

l. Teteskan 40 μl antibodi primer menggunakan antibody monoclonal

MMP-9 dari Abcam yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama

30 menit pada suhu kamar atau semalam pada suhu 40C.

m. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.

n. Diteteskan Biotinylated Anti Polyvalent selama 10 menit.

o. Dicuci dengan BS sebanyak 2 kali, masing-masing 10 menit.

p. Diteteskan Streptavidin Peroxidase selama 10 menit.

q. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.

r. Diteteskan dengan reagen DAB selama 10 menit.

s. Dicuci dengan air mengalir.

t. Dipulas dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit.

u. Dicuci dengan air mengalir.

v. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat yaitu alkohol 70%, alkohol 80%,

alkohol 95%, dan alkohol absolut 2 kali, masing-masing selama 3 menit.

w. Dicelupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit.

x. Ditutup dengan cover glass.

6. Dibuatkan pula pengecatan IHK untuk kontrol positif dan negatif.

7. Pemeriksaan IHK MMP-9 dikerjakan di laboratorium IHK bagian Patologi

Anatomi FK Universitas Gadjah Mada/RSUP dr. Sardjito Yogyakarta.

8. Pencatatan dan pengumpulan data.

9. Analisis data

61

4.8.3 Alur Penelitian

Skema alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.2.

Gambar 4.2Alur Penelitian

62

4.9 Analisis Data

Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan SPSS 16.0 for windows

dengan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Analisis deskriptif.

2. Uji korelasi dengan uji chi square berdasarkan uji silang 3x2.

3. Uji korelasi dengan uji one way Annova bila berdistribusi normal atau uji

Kruskal-Wallis bila berdistribusi tidak normal.

4. Untuk mengetahui faktor karakteristik derajat histologis yang paling dominan

dalam menentukan ekspresi MMP-9 dilakukan uji regresi logistik.

5. Uji kemaknaan ditentukan pada p<0,05. Presisi data ditentukan dengan nilai

Confident Interval (CI) 95%.

63

BAB V

HASIL PENELITIAN

5.1 Karakteristik Sampel Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan menggunakan

rancangan potong lintang (cross-sectional study). Jumlah besar sampel sebanyak

47 sampel karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik derajat histologis I, II,

dan III. Sampel tersebut terdiri dari 7 sampel derajat histologis I, 18 sampel

derajat histologis II, dan 22 sampel derajat histologis III. Subyek penelitian

berasal dari blok parafin bahan biopsi dan operasi mastektomi dari penderita

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik yang diperiksa secara histopatologi

di bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar, yang

memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi dari tanggal 1 Januari 2013 sampai 31 Juli

2016 yang kemudian dilakukan pulasan imunohistokimia dengan MMP-9. Pada

penelitian ini, data usia dilakukan analisis deskriptif terlebih dahulu dan hasil

analisis deskriptif karakteristik sampel penelitian dan derajat histologis disajikan

pada Tabel 5.1, Tabel 5.2 dan Tabel 5.3.

Rentang usia pasien pada penelitian ini bervariasi yaitu mulai dari usia 30

tahun sampai 70 tahun dengan jumlah terbanyak pada rentang usia 40-49 tahun

baik pada derajat histologis I, II, maupun III (Tabel 5.1 dan Gambar 5.1).

64

Tabel 5.1 Distribusi Kasus Berdasarkan Kelompok Usia dan Derajat Histologis

Usia Derajat histologis I

Derajat histologis II

Derajat histologis III

Total

30-39 Tahun 1 1 2 4

40-49 Tahun 4 3 11 18

50-59 Tahun 0 9 7 16

60-69 Tahun 2 4 2 8

70-79 Tahun 0 1 0 1

Jumlah 7 18 22 47

Gambar 5.1.Karakteristik Usia Subyek Penelitian

Rerata usia untuk keseluruhan kasus penderita karsinoma payudara invasif

tipe tidak spesifik dalam penelitian ini adalah 51,45±8,87 tahun, sedangkan rerata

usia untuk masing-masing derajat histologis yaitu derajat histologis I adalah

48,14±9,39 tahun dengan rentang usia 38 sampai 62 tahun, derajat histologis II

65

adalah 54,89±8,66 tahun dengan rentang usia 39 sampai 70 tahun, derajat

histologis III adalah 49,68±8,32 dengan rentang usia 30 sampai 69 tahun.

Tabel 5.2 Rerata Usia Sampel Penelitian

Variabel

Derajat Histologis

Seluruh derajat

I II III

Usia (tahun) 48,14±9,39 54,89±8,66 49,68±8,32 51,45±8,87

Tabel 5.3 Distribusi Kasus Berdasarkan Derajat Histologis

Derajat Histologis Jumlah %

I 7 14,9

II 18 38,3

III 22 46,8

Berdasarkan diagnosis didapatkan sampel karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik derajat histologis I sebanyak 7 kasus (14,9%), derajat histologis II

sebanyak 18 kasus (38,3%), dan derajat histologis III sebanyak 22 kasus (46,8%)

seperti yang disajikan pada Gambar 5.2.

Gambar 5.2. Karakteristik Derajat Histologis

66

5.2 Ekspresi MMP-9

5.2.1 Ekspresi MMP-9 dengan Derajat Histologis

Pada penelitian ini didapatkan hasil seperti yang disajikan pada Tabel 5.4.

Tabel 5.4 Distribusi Kasus berdasarkan Ekspresi MMP-9

Karakteristik Jumlah %

Skor Presentase Sel Ekspresi MMP-9

(0) 0%

(1) 1-10%

(2) 10-50%

(3) 50-70%

(4) 70-100%

0

2

8

10

27

0

4,3

17

21,3

57,4

Skor Intensitas Warna Ekspresi MMP-9

Skor 0 (negatif)

Skor 1 (lemah)

Skor 2 (sedang)

Skor 3 (kuat)

0

14

26

7

0

29,8

55,3

14,9

Penilaian Hasil Ekspresi MMP-9

Tingkat rendah

Tingkat tinggi

20

27

42,5

57,5

Hasil presentase sel pulasan ekspresi MMP-9 dari 47 sampel didapatkan hasil

sebagai berikut: tidak tampak ekspresi MMP-9 (skor 0) sebanyak 0 kasus (0%),

ekspresi MMP-9 1-10% (skor 1) sebanyak 2 kasus (4,3%), ekspresi MMP-9 10-

50% (skor 2) sebanyak 8 kasus (17%), ekspresi MMP-9 50-70% (skor 3)

sebanyak 10 kasus (21,3%), dan ekspresi MMP-9 70-100% (skor 4) sebanyak 27

67

kasus (57,4%). Hasil intensitas warna pulasan ekspresi MMP-9 dari 47 sampel

didapatkan hasil sebagai berikut: tidak terpulas MMP-9 (skor 0), intensitas lemah

(skor 1) sebanyak 14 kasus (29,8%), intensitas sedang (skor 2) sebanyak 26 kasus

(55,3%), dan intensitas kuat (skor 3) sebanyak 7 kasus (14,9%). Berdasarkan hasil

tersebut maka disimpulkan bahwa ekspresi MMP-9 tingkat rendah (yang bernilai

0–4) sebanyak 20 kasus (42,5%) dan ekspresi MMP-9 tingkat tinggi (yang

bernilai 5-12) sebanyak 27 kasus (57,5%).

Tabel 5.5 Penilaian Skor Presentase Sel Ekspresi MMP-9Berdasarkan Derajat Histologis

Skor Presentase Sel MMP-9 Derajat Histologis

I II III

Skor 0 (tidak terwarnai) 0 0 0

Skor 1 (1-10%) 0 2 0

Skor 2 (10-50%) 5 2 1

Skor 3 (50-70%) 2 3 5

Skor 4 (70-100%) 0 11 16

Jumlah 7 18 22

68

Tabel 5.6 Penilaian Skor Intensitas Warna Ekspresi MMP-9 Berdasarkan Derajat Histologis

Skor Intensitas Warna MMP-9 Derajat Histologis

I II III

Skor 0 (negatif) 0 0 0

Skor 1 (lemah) 3 6 5

Skor 2 (sedang) 4 9 13

Skor 3 (kuat) 0 3 4

Jumlah 7 18 22

Berdasarkan data yang disajikan pada Tabel 5.5 dapat dilihat skor presentase

sel ekspresi MMP-9 pada derajat histologis I didapatkan skor 0 sebanyak 0 kasus,

skor 1 sebanyak 0 kasus, skor 2 sebanyak 5 kasus, skor 3 sebanyak 2 kasus, dan

skor 4 sebanyak 0 kasus. Derajat histologis II didapatkan skor 0 sebanyak 0 kasus,

skor 1 sebanyak 2 kasus, skor 2 sebanyak 2 kasus, skor 3 sebanyak 3 kasus, dan

skor 4 sebanyak 11 kasus. Derajat histologis III didapatkan skor 0 sebanyak 0

kasus, skor 1 sebanyak 0 kasus, skor 2 sebanyak 1 kasus, skor 3 sebanyak 5 kasus,

dan skor 4 sebanyak 16 kasus. Sedangkan intensitas warna ekspresi MMP-9 pada

derajat histologis I didapatkan skor 0 (negatif) sebanyak 0 kasus, skor 1 (lemah)

sebanyak 3 kasus, skor 2 (sedang) sebanyak 4 kasus, dan skor 3 (kuat) sebanyak 0

kasus. Pada derajat histologis II didapatkan skor 0 (negatif) sebanyak 0 kasus,

skor 1 (lemah) sebanyak 6 kasus, skor 2 (sedang) sebanyak 9 kasus, dan skor 3

69

(kuat) sebanyak 3 kasus. Pada derajat histologis I didapatkan skor 0 (negatif)

sebanyak 0 kasus, skor 1 (lemah) sebanyak 5 kasus, skor 2 (sedang) sebanyak 13

kasus, dan skor 3 (kuat) sebanyak 4 kasus. Kemudian skor presentase sel

dikalikan dengan skor intensitas warna kemudian didapatkan ekspresi MMP-9

tingkat rendah dengan nilai 0-4 dan nilai 5-12 ekspresi MMP-9 tingkat tinggi.

Pada derajat histologis I terdapat 6 kasus ekspresi MMP-9 tingkat rendah dan 1

kasus ekspresi MMP-9 tingkat tinggi. Pada derajat histologis II terdapat 9 kasus

ekspresi MMP-9 tingkat rendah dan 9 kasus ekspresi MMP-9 tingkat tinggi. Pada

derajat histologis III terdapat 5 kasus ekspresi MMP-9 tingkat rendah dan 17

kasus ekspresi MMP-9 tingkat tinggi.

Mengetahui hubungan antara derajat histologis dengan ekspresi MMP-9,

maka dilakukan uji korelasi uji chi square berdasarkan uji silang 3x2 seperti

disajikan pada Tabel 5.7.

Tabel 5.7 Uji Chi square antara Derajat Histologis dengan Ekspresi MMP-9

Derajat

histologis

Jumlah Kasus Ekspresi

MMP-9 p

Tingkat

Rendah

Tingkat

Tinggi

I 6 1

0,010II 9 9

III 5 17

70

Berdasarkan uji chi square maka terdapat hubungan yang bermakna antara

derajat histologis dengan ekspresi MMP-9 pada karsinoma payudara invasif tipe

tidak spesifik (p=0,010; p<0,05).

Pada penelitian ini data ekspresi MMP-9 terlebih dahulu diuji normalitas data.

Berdasarkan hasil analisis dengan uji Shapiro-Wilk didapatkan data MMP-9 tidak

berdistribusi normal (p<0,05), sehingga digunakan uji nonparametrik yaitu uji

Kruskal-Wallis yang kemudian dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney. Hasil

disajikan dalam Tabel 5.8.

Tabel 5.8Hasil Uji Normalitas Data Ekspresi MMP-9

Kelompok Subjek n p Keterangan

Derajat Histologis I 7 0,183 Tidak Normal

Derajat Histologis II 18 0,001 Tidak Normal

Derajat Histologis III 22 0,004 Tidak Normal

Data yang tidak berdistribusi normal dapat dilakukan analisis komparabilitas

dengan uji Kruskal-Wallis. Hasil analisis kemaknaan dengan uji Kruskal-Wallis

didapatkan hasil yang bermakna (p=0,001). Disajikan pada Tabel 5.9.

Tabel 5.9Perbandingan Ekspresi MMP-9 antar Kelompok Derajat Histologis

Kelompok Subyek n p

Derajat histologis I 7

71

Derajat histologis II 18 0,001

Derajat histologis III 22

Analisis komparabilitas diuji dengan uji Mann-Whitney disajikan pada Tabel

5.10, 5.11, dan 5.12.

Tabel 5.10Perbandingan Ekspresi MMP-9 antara Derajat Histologis I dan II

Kelompok Subjek NMean

MMP-9U p

Derajat Histologis I

Derajat Histologis II

7

18

42,86

68,1123 0,014

Tabel 5.11Perbandingan Ekspresi MMP-9 antara Derajat Histologis I dan III

Kelompok Subjek NMean

MMP-9U p

Derajat Histologis I

Derajat Histologis III

7

22

42,86

81,368 0,000

Tabel 5.12Perbandingan Ekspresi MMP-9 antara Derajat Histologis II dan III

Kelompok Subjek NMean

MMP-9U p

Derajat Histologis II

Derajat Histologis III

18

22

68,11

81,36115 0,024

Pada Tabel 5.10-5.12 tampak hasil analisis kemaknaan dengan uji Mann-

72

Whitney. Hasil tes perbandingan ekspresi MMP-9 antara derajat histologis I dan II

menunjukkan bahwa nilai mean derajat histologis II (68,11%) lebih tinggi

dibandingkan nilai mean derajat histologis I (42,86%) dengan perbedaan selisih

25,25%, nilai U=23 dan nilai p=0,014. Hasil tes perbandingan ekspresi MMP-9

antara derajat histologis I dan III menunjukkan bahwa nilai mean derajat

histologis III (81,36%) lebih tinggi dibandingkan nilai mean derajat histologis I

(42,86%) dengan perbedaan selisih 38,5%, nilai U=8 dan nilai p=0,000. Hasil tes

perbandingan ekspresi MMP-9 antara derajat histologis II dan III menunjukkan

bahwa mean derajat histologis III (81,36%) lebih tinggi dibandingkan nilai mean

derajat histologis II (68,11%) dengan perbedaan selisih 13,25%, nilai U=115 dan

nilai p=0,024. Hal ini berarti bahwa ekspresi MMP-9 paling tinggi ditemukan

pada kelompok derajat histologis III, lalu derajat histologis II, dan ekspresi MMP-

9 paling rendah pada derajat histologis I karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik (p<0,05).

Gambaran ekspresi MMP-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik derajat histologis I, II, dan III dapat dilihat pada Gambar 5.3, 5.4 dan 5.5.

73

Gambar 5.3Ekspresi MMP-9 pada derajat histologis I dengan intensitas lemah (insert)

Gambar 5.4Ekspresi MMP-9 pada derajat histologis II dengan intensitas sedang (insert)

74

Gambar 5.5Ekspresi MMP-9 pada derajat histologis III dengan intensitas kuat (insert)

5.2.2 Pengaruh Faktor Karakteristik Derajat Histologis

Terdapat tiga faktor karakteristik derajat histologis yaitu formasi tubular,

pleomorfia inti, dan hitung mitosis per 10 lapang pandang besar. Mengetahui

faktor karakteristik derajat histologis yang paling dominan yang dipengaruhi oleh

ekspresi MMP-9 maka dilakukan uji regresi logistik.

Uji regresi logistik dilakukan dan didapatkan hasil bahwa hitung mitosis

merupakan faktor yang paling dominan. Pada hitung mitosis didapatkan hasil

yang bermakna dengan hasil p=0,012 (p<0,05), sedangkan untuk faktor formasi

tubular dan pleomorfik inti didapatkan hasil yang tidak bermakna dengan masing-

masing nilai p=0,922 dan p=0,594 dimana p>0,05 seperti yang disajikan pada

Tabel 5.13.

75

Tabel 5.13 Uji Regresi Logistik

b Sig (p) Exp(b)

Tubular 0,057 0,922 1,059

Pleomorfik 0,312 0,594 1,367

Mitosis 1,204 0,012 3,334

Constant -2,944 0,078 0,053

76

BAB VI

PEMBAHASAN

6.1 Ekspresi MMP-9

6.1.1 Hubungan Ekspresi MMP-9 dengan Derajat Histologis

Matriks metalloproteinase-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik

terlibat pada semua tahap progresivitas sel kanker mulai dari proliferasi,

angiogenesis, apoptosis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), dan metastasis

(Gong et al., 2014). Matriks metalloproteinase-9 ini juga mampu mendegradasi

matriks ekstraselular dari stem cell niche yang mengakibatkan terjadinya

perubahan bentuk stem cell niche menjadi bentuk bebas, dan selanjutnya

meningkatkan promosi c-KIT yang terkait dengan proliferasi sel. Proses

angiogenesis pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik dipicu melalui

mobilisasi dan aktivasi mitogen angiogenik dari matriks penyimpanannya. Proses

ini difasilitasi oleh MMP-9 yang tidak terikat TIMP-1 yang sekaligus mampu

melepaskan faktor pertumbuhan FGF dan VEGF dari matriks. Proses metastasis

dimudahkan oleh kemampuan sel tumor untuk berubah dari bentuk sel epitel yang

tidak mampu bergerak menjadi sel mesenkimal yang mampu bergerak (EMT).

Matriks metalloproteinase-9 dikatakan juga terlibat pada proses ini (Farina dan

Mackay, 2014).

Derajat histologis karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dinilai

berdasarkan Nottingham Combined Histologic Grade (Elston-Ellis Modification

of Scarff-Bloom-Richardson Grading System) atau biasa disebut dengan

77

Nottingham Grading System. Sistem ini menilai karsinoma payudara berdasarkan

tiga karakteristik tumor yaitu formasi tubular, pleomorfia inti sel, dan hitung

mitosis per 10 lapang pandang besar. Berdasarkan penilaian tersebut derajat

histologis dibagi menjadi 3 yaitu derajat histologis I, derajat histologis II, dan

derajat histologis III (Lester et al., 2015; Colditz and Chia, 2012; Hoda et al.,

2014).

Matriks metalloproteinase-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak

spesifik mengalami regulasi melalui interaksi antara sel tumor dengan lingkungan

mikro di sekitarnya seperti sel stroma, sel endotel, makrofag, maupun sel radang

neutrofil. Sudah sangat diakui peranan sel radang seperti makrofag, neutrofil, sel

mast sel dendritik, dan sel T pada inisiasi dan progresi tumor. Sel tumor ini

mampu menghasilkan faktor-faktor pro-inflamasi dan MMP berperan pada

progresivitas tumor (Deryugina dan Quigley, 2006). Co-culture sel tumor dengan

sel stroma secara in vitro mampu meningkatkan ekspresi pro-MMP-9 di sel tumor

dan menekan regulasi inhibitornya (TIMP) di sel stroma. Co-culture sel tumor

dengan sel endotel juga mampu meningkatkan ekspresi MMP-9 serta

meningkatkan kemampuan invasi sel tumor melalui peningkatan sekresi IL-6 oleh

sel endotel. Sitokin dan faktor pertumbuhan yang dikeluarkan oleh sel tumor,

endotel dan sel radang di lingkungan mikro tumor bersama-sama meregulasi

ekspresi MMP-9, baik melalui jalur autokrin maupun parakrin (Gong et al., 2014).

Matriks metalloproteinase-9 tampak terpulas pada sebagian besar sel tumor,

sel stroma, endotel, maupun sel radang neutrofil baik pada karsinoma payudara

invasif tipe tidak spesifik dengan histologis tinggi maupun rendah. Hal ini

78

membuktikan bahwa MMP-9 dihasilkan baik oleh sel tumor itu sendiri maupun

melalui interaksi dengan lingkungan mikronya (Farina and Mackay, 2014).

Penelitian yang dilakukan oleh Irianiwati et al. terhadap 50 kasus karsinoma

payudara, dilakukan pulasan MMP-9 untuk menilai perburukan derajat

histologisnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi MMP-9 berbeda

bermakna pada derajat tinggi dibandingkan derajat rendah, dimana ekspresi tinggi

MMP-9 ditemukan pada karsinoma payudara derajat tinggi. Tampak korelasi

bermakna dengan nilai r=0,518 dan p=0,0000. Dan dari penelitian ini disimpulkan

bahwa MMP-9 berperan penting pada perkembangan, derajat histologis, dan

stadium karsinoma payudara (Irianiwati et al., 2012).

Penelitian serupa dilakukan oleh Yousef et al. terhadap 200 kasus karsinoma

payudara yang dibagi menjadi tiga derajat histologis. Penghitungan ekspresi

MMP-9 dilakukan secara semi kuantitatif berdasarkan presentase jumlah sel yang

terpulas positif dengan intensitas pewarnaan. Hasil dari penelitian ini didapatkan

ekspresi MMP-9 tingkat tinggi pada karsinoma payudara derajat tinggi. Ekspresi

MMP-9 dapat membantu memisahkan karsinoma payudara yang agresif seacara

klinis. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa MMP-9 adalah calon gen atau

protein yang harus dipertimbangkan dalam pengembangan panel multi-gen untuk

memprediksi hasil klinis (Yousef et al., 2014).

Penelitian karsinoma payudara oleh Mahmood et al. di negara Irak

menghubungkan antara ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dengan berbagai variabel

klinikopatologis pada karsinoma payudara stadium II dan III. Penelitian dilakukan

dengan jumlah pasien sebanyak 64 orang. Hal ini serupa dengan metode

79

penelitian-penelitian sebelumnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa MMP-9

dapat digunakan sebagai biomarker untuk diagnosis karsinoma payudara dalam

menentukan stadium tumor, derajat histologis, tipe histologis, dan status

metastasis limfonodi (Mahmood et al., 2015).

Vasaturo di Italia melakukan penelitian ekspresi MMP-2 dan MMP-9 pada

pasien-pasien dengan karsinoma payudara, dilakukan dengan mengambil level

plasma dari MMP tersebut. Penelitian dilakukan terhadap 50 pasien karsinoma

payudara dan 30 pasien fibroadenoma. Hasil penelitian menunjukkan tidak ada

perbedaan yang bermakna ekspresi MMP-9 plasma antara pasien-pasien dengan

karsinoma dan fibroadenoma. Perbedaan yang bermakna ekspresi MMP-9 plasma

didapatkan pada pasien-pasien karsinoma payudara bila ditinjau dari sudut

pandang variabel derajat histologis (Vasaturo et al., 2012).

Di India, Benson melakukan penelitian dengan 39 sampel kanker payudara

dan 16 jaringan payudara yang normal menunjukkan adanya peningkatan MMP-9

secara berbeda pada jaringan kanker payudara dengan jaringan payudara yang

normal. Tampak peningkatan ekspresi MMP-9 pada karsinoma payudara.

Ekspresi MMP-9 diregulasi di jaringan kanker dibandingkan dengan kontrol

dengan nilai p <0,050. Hasil penelitian menunjukkan bahwa MMP-9 secara

berbeda diatur dalam jaringan kanker payudara dan berperan pada derajat

histologis, metastasis, dan angiogenesis. Dengan demikian, MMP-9 adalah nilai

besar untuk dipelajari sebagai penanda diagnostik dan target terapi (Benson et al.,

2013).

80

Pellikainen et al. di Finlandia melakukan penelitian terhadap ekspresi MMP-2

dan MMP-9 yang dianalisis secara imunohistokimia dalam prospektif seri besar

dari 421 pasien kanker payudara. MMP-9 terekspresi dalam sitoplasma sel-sel

ganas dan stroma. Ekspresi tinggi MMP dalam stadium tumor, sedangkan ekspresi

positif pada stroma dikaitkan dengan faktor-faktor agresif. Evaluasi ekspresi

MMP-9 menambahkan informasi tentang prognosis kanker payudara (Pellikainen

et al., 2014).

Hasil kontradiktif didapatkan oleh Wu dan kawan-kawan melalui

penelitiannya di Cina, mereka berusaha mencari signifikansi antara ekspresi

MMP-9 dengan berbagai variabel klinikopatologis pada 41 spesimen operasi

mastektomi tanpa riwayat terapi sebelumnya (radioterapi dan kemoterapi). Kasus-

kasus dievaluasi dengan variabel tipe histologis, derajat histologis, metastasis

limfonodi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada korelasi yang signifikan

antara ekspresi MMP-9 dengan semua variabel penelitian yang dievaluasi (Wu et

al., 2014).

Pada penelitian yang kami lakukan pada 47 kasus karsinoma payudara invasif

tipe tidak spesifik. Dengan jumlah sampel masing-masing yaitu derajat histologis

I sebanyak 7 kasus (14,9%), derajat histologis II sebanyak 18 kasus (38,3%), dan

derajat histologis III sebanyak 18 kasus (46,8%). Hasil presentase sel pulasan

ekspresi MMP-9 dari 47 sampel didapatkan hasil sebagai berikut: tidak tampak

ekspresi MMP-9 (skor 0) sebanyak 0 kasus (0%), ekspresi MMP-9 1-10% (skor 1)

sebanyak 2 kasus (4,3%), ekspresi MMP-9 10-50% (skor 2) sebanyak 8 kasus

(17%), ekspresi MMP-9 50-70% (skor 3) sebanyak 10 kasus (21,3%), dan

81

ekspresi MMP-9 70-100% (skor 4) sebanyak 27 kasus (57,4%). Hasil intensitas

warna pulasan ekspresi MMP-9 dari 47 sampel didapatkan hasil sebagai berikut:

tidak terpulas MMP-9 (skor 0), intensitas lemah (skor 1) sebanyak 14 kasus

(29,8%), intensitas sedang (skor 2) sebanyak 26 kasus (55,3%), dan intensitas

kuat (skor 3) sebanyak 7 kasus (14,9%). Berdasarkan hasil tersebut maka

disimpulkan bahwa ekspresi MMP-9 yang bernilai rendah ada 20 kasus (42,5%)

dan yang bernilai tinggi ada 27 kasus (57,5%).

Interaksi tumor dan lingkungan sekitar juga ikut mempengaruhi ekspresi

MMP-9, dimana semakin banyak sel tumor berinteraksi dengan lingkungan

sekitarnya maka akan semakin kuat ekspresi MMP-9.

Matriks metalloproteinase-9 pada proses keganasan tidak hanya memiliki

kemampuan dalam mendegradasi kolagen tipe IV yang merupakan komponen

utama dari membran basalis epitel dan vaskuler, namun juga memiliki

kemampuan pro-oncogenic yaitu transformasi keganasan, penempelan tumor, dan

instabilitas genetik. Matriks metalloproteinase-9 juga dikenal sebagai gen yang

penting dalam proses transisi epitel menjadi mesenkimal atau yang dikenal

sebagai epithelial mesenchymal transition (EMT) dan sekaligus menjadi penyebab

EMT. Epithelial mesenchymal transition ada 3 tipe yaitu tipe 1, tipe 2, dan tipe 3.

Tipe 3 dari EMT ini berfungsi dalam progresi tumor maupun aktivasi dalam stem

cell serta pergerakan sel kanker menjadi invasif (Gialeli et al., 2010; Farina dan

Mackay, 2014).

Selanjutnya MMP-9 yang berasal dari sel radang neutrofil meregulasi

penarikan perisit serta apoptosis yang mengandung prekursor angiogenik ke

82

stroma tumor, sehingga dapat meningkatkan proses angiogenik dan vaskulogenik.

Proses angiogenik oleh sel tumor terjadi kemudian MMP-9 juga merangsang

angiogenik melalui mobilisasi dan aktivasi mitogen angiogenik dari matriks

penyimpanannya. Selain itu MMP-9 juga mampu melepaskan faktor pertumbuhan

yaitu FGF dan VEGF, serpin protease nexin-1 (PN-1, urokinase plasminogen

activator (uPA) yang penting pada proses invasi dan angiogenesis pada keganasan

(Patil dan Kundu, 2006; Gialeli et al., 2010; Farina dan Mackay, 2014).

Tingginya ekspresi MMP-9 yang sejalan dengan peningkatan derajat

histologis pada penelitian ini menunjukkan peranan penting MMP-9 pada setiap

tahap progresivitas tumor sehingga dapat dijadikan sebagai marka penting

agresivitas karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik. Namun hingga saat ini

belum terdapat kesepakatan tentang nilai cut off point ekspresi MMP-9 pada

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik sehingga menyulitkan dalam

aplikasi klinis.

6.1.2 Faktor Karakteristik Derajat Histologis yang Paling Dominan

Berpengaruh Terhadap Ekspresi MMP-9

Penilaian derajat histologis dengan Nottingham Combined Histologic Grade

(Elston-Ellis Modification of Scarff-Bloom-Richardson Grading System) atau

biasa disebut dengan Nottingham Grading System. Sistem ini menilai karsinoma

payudara berdasarkan tiga karakteristik yaitu formasi tubular, pleomorfia inti sel,

dan hitung mitosis per 10 lapang pandang besar. Selain didapatkannya hubungan

bermakna antara derajat histologis dengan ekspresi MMP-9, pada penelitian ini

dilakukan pula uji regresi logistik untuk menilai faktor karakteristik derajat

83

histologis (formasi tubular, pleomorfia inti sel, atau hitung mitosis) yang paling

dominan dipengaruhi oleh ekspresi MMP-9.

Pada penelitian ini didapatkan hasil yang bermakna dimana menunjukkan

bahwa hitung mitosis merupakan faktor yang paling dominan dengan nilai

p=0,012 (p<0,05). Sedangkan untuk faktor formasi tubular dan pleomorfia inti

didapatkan hasil yang tidak bermakna dengan masing-masing nilai p=0,922 dan

p=0,594 dimana p>0,05. Hal ini sejalan dengan Boder pada tahun 2013 yang

menunjukkan bahwa pada analisis multivariate, hitung mitosis merupakan

penunjuk faktor prognosis yang lebih baik daripada formasi tubular dan

pleomorfia inti.

Ekspresi MMP-9 lebih tinggi pada derajat histologis yang tinggi termasuk

pada hitung mitosis yang tinggi. Hitung mitosis dapat dipengaruhi oleh laju

proliferasi sel, dimana semakin tinggi laju proliferasi maka akan semakin tinggi

pula hitung mitosisnya dan hal ini menunjukkan suatu agresivitas karsinoma

tersebut. Formasi tubular dan pleomorfia inti tidak berpengaruh dominan oleh

karena penilaian dari kedua hal ini sangatlah subyektif, selain itu pada kedua

faktor tersebut tidak selalu berjalan seiring dengan laju proliferasi.

Hasil yang berbeda dapat disebabkan oleh karena perlakuan jaringan

makroskopis sejak awal yang dapat mempengaruhi hasil skor masing-masing

kriteria, yaitu seperti lama atau cepatnya suatu jaringan tersebut mendapatkan

fiksasi, tipe dari cairan fiksasi yang dipakai, tingkat pH buffer formalin, dan dilusi

dari formalin tersebut.

84

Meskipun pada penelitian ini hitung mitosis memiliki pengaruh yang

dominan, namun semua faktor-faktor karakteristik derajat histologis yaitu formasi

tubular, pleomorfia inti, dan hitung mitosis tetap memiliki peranan yang penting

dalam penentuan derajat histologis.

85

BAB VII

SIMPULAN DAN SARAN

7.1 Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini maka dapat disimpulkan sebagai berikut :

1. Tampak hubungan bermakna antara ekspresi MMP-9 dengan derajat

histologis pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik.

2. Ekspresi MMP-9 mempengaruhi hitung mitosis sebagai faktor

karakteristik derajat histologis yang paling dominan.

7.2 Saran

Ekspresi tinggi MMP-9 dapat digunakan sebagai penanda tingkat agresivitas

tumor yang didiagnosis berdasarkan derajat histologis, dimana berkaitan dengan

faktor prognosis yang lebih buruk, sehingga dapat dipakai untuk petunjuk klinis

yang berhubungan dengan diagnosis dan prognosis pasien agar penanganan

karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik dapat dilakukan lebih baik lagi.

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk menentukan cut off point ekspresi

MMP-9 pada karsinoma payudara invasif tipe tidak spesifik sehingga didapatkan

keseragaman pelaporan untuk kepentingan aplikasi klinis. Penelitian ini dapat

digunakan sebagai referensi tambahan penelitian-penelitian selanjutnya oleh

karena masih kurangnya penelitian mengenai faktor karakteristik derajat

diferensiasi yang paling dominan yang dipengaruhi oleh ekspresi MMP-9.

86

DAFTAR PUSTAKA

Allison, K.H. 2012. Molecular Pathology of Breast Cancer: What a PathologistNeeds to Know. America : American Journal Clinical Pathology. p. 700-780.

Anonim. 2005. Pathology Reporting of Breast Disease. London : NHS CancerScreening Programmes jointly with the Royal College of Pathologist. p.61-89.

Anonim. 2008. The Pathology Reporting of Breast Cancer, A Guide forPathologists, surgeons, Radiologists and Oncologists third edition.Australia : National Breast and Ovarian Cancer Centre and AustralianCancer Network. p. 22-33.

Ansari, M.A., Shaikh, S., Muteeb, G., Rizvi, D., Shakil, S., Alam, A.,Tripathi, R.,Ghazal, F., Rehman, A., Ali, S.Z., Pandey, A.K., Ashraf, G.M. 2013. Roleof Matrix Metalloproteinases in Cancer. In : Ashraf, G.M., Sheikh, I.A.,editors. Advanced in Protein Chemistry. USA : OMICS group ebook. p.4-10.

Benson, C.S., Babua, S.D., Radhakrishnab, S., Selvamuruganc, N., Sankara, B.R. 2013. Expression of matrix metalloproteinases in human breast cancertissues. Department of Biotechnology, School of Bioengineering, SRMUniversity, Kattankulathur, Chennai, India. Available from :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23568046. Accessed August 2,2016.

Boder, J.M.E. 2013. Nuclear Morphometry, Apoptotic and Mitotic Indices, andTubular Differentiation in Lybian Breast Cancer (tesis). Turky :University of Turky.

Bouchet, S., Bauvois, B. 2014. Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin(NGAL), Pro-Matrix Metalloproteinase-9 (pro-MMP-9) and TheirComplex Pro-MMP-9/NGAL in Leukaemias. Cancers. Sixth edition. p.796-812.

Chakrabarti, S., Zee, J.M., Patel, K.D. 2006. Regulation of matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) in TNF-stimulated neutrophils: novelpathways for tertiary granule release. J. Leukoc. Biol; 79: p. 214-222.

Colditz, G., Chia, K.S. 2012. Invasive Breast Carcinoma: Introduction andGeneral Feature. In: Lakhani, S.R., Ellis, I.O., Schnitt, S.J., Tan, P.H.,Vijver, M.J., editors. WHO Classification of Tumours of the Breast

87

Fourth Edition. Lyon: International Agency for Research on Cancer. p.14-17.

Deryugina, E.I dan Quigley, P.J. 2006. Matrix metalloproteinases and tumormetastasis. Cancer Metastasis Rev; 25: p. 9-34.

Direktorat Jendral Pelayanan Medik. 2006. Kanker di Indonesia Tahun 2006. DataHistopatologik. Jakarta: Departemen Kesehatan R.I.

Direktorat Jendral Pelayanan Medik. 2011. Kanker di Indonesia Tahun 2011. DataHistopatologik. Jakarta: Departemen Kesehatan R.I.

Ellis, I.O., Collins, L., Ichihara, S., MacGrogan, S. 2012. Invasive Carcinoma ofNo Special Type. In: Lakhani, S.R., Ellis, I.O., Schnitt, S.J., Tan, P.H.,Vijver, M.J., editors. WHO Classification of Tumours of the BreastFourth Edition. Lyon: International Agency for Research on Cancer. p.34-38.

Falck, A.K., Ferno, M., Bendahl, P.O., Ryden, L. 2013. St Gallen MolecularSubtypes in Primary Breast Cancer and Matched Lymp Node Metastases-Aspect on Distribution and Prognosis for Patients with Luminal ATumours: Result from a Proapective Randomised Trial. BMC Cancer, 13:558. Available from: http://www.biomedcentral.com. Accessed January10, 2016.

Farina, A.R., Mackay, A.R. 2014. Gelatinase B/MMP-9 in Tumour Pathogenesisand Progression. Cancers, 6: p. 240-296.

Gialeli, C., Theocharisand, A.D., Karamanos, N.K. 2010. Roles of matrixmetalloproteinases in cancer progression and their pharmacologicaltargeting. FEBS Journal; 278: p. 16-27.

Globocan. 2012. Global cancer statistics, 2012. Available from:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21262/full. AccessedJanuary 15, 2016.

Gong, Y., Chippada-venkata. U.D., William, K. 2014. Review : Roles of MatrixMetalloproteinases and their natural Inhibitors in Prostate CancerProgression. Cancers, 6: p. 1298-1327.

Hoda, S.A., Brogi, E., Koerner, F.C., Rosen, P.P. 2014. Invasive DuctalCarcinoma: Assessment of Prognosis with Morphologic and Biologic

88

Markers. In: Hoda, S.A., editors. Rosen’s Breast Pathology FourthEdition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. p. 413-467.

Irianawati, Harijadi, Prabawa S., Hermanto Y., Septiana A., Arditya, B. 2012. Thecorrelation between TAM, MVD, VEGF, and MMP-9 expressions amongvarious histological progression, histological grading and staging ofbreastcancer.Availablefrom:http://jurnal.ugm.ac.id/bik/article/view/3271.com. Accessed January 7, 2016.

Kumar, V., Abbas, A.K., Fausto, N., Aster, J.C. 2015. Cellular Responses to Stressand Toxic Insult: Adaptation, Injury, and Death. Robbin and Cotran’sPathology Basic of Diseases. Philadelphia: Saunders Elsevier. p. 1-26.

Lee, K., Nelson, C.M. 2012. New Insights into the Regulation ofEpithelial–Mesenchymal Transition and Tissue Fibrosis. InternationalReview of Cell and Molecular Biology, Volume 294. Elsevier Inc. p. 173-193.

Lester, S.C. 2015. The Breast. In: Kumar, V., Abbas, A.K., Fausto, N., Aster, J.C.,editors. Robbin and Cotran’s Pathology Basic of Diseases EighthEdition.Philadelphia: Saunders Elsevier. p. 1043-1071.

Li, H., Fan, X., Houghton, J. 2007. Tumor microenvironment: The role of thetumor stroma in cancer. Available from:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jcb.21159/full. AccessedFebruary 27, 2016.

Loffek, S., Schilling, O., Franzke, C-W. 2011. Biological role of matrixmetalloproteinases: a critical balance. Eur Respir J, 38: p. 191–208.

Mahmood, N.A., Fakhoury, R.M., Yaseen, N.Y., Moustafa, M.E. 2015. MatrixMetaalloproteinases MMP2 and MMP9 Expression in Stages II-IIIBreast Cancer in Iraqi Women. AL-Mustansiriya Univ, Baghdad Iran.Availablefrom:http://pearlresearchjournals.org/journals/jmbsr/index.html.Accessed February 27, 2016.

Moelans, C.B., Diest, P.J. 2013. Breast: Ductal Carcinoma. Atlas Genet CytogenetOncol Haematol, 17(3).

Muhammad, E.M.S., Ahmad, A.N., Guirguis, M.N., Ali, A.M. 2012.Immunohistochemical MMP9 Expression in Breast Carcinoma with

89

Correlation to Clinico-Pathological Parameters. Med J Cairo Univ.80(2): p. 179-189.

Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. 2005. Structure and function of matrixmetalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69: 562-573.

Patil, D.P., Kundu, G.C. 2006. MMP-9 (matriks metallopeptidase 9 (gelatinase B,92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)). Atlas Genet CytogenetOnco Haematol. 10(3): p. 168-170.

Pellikainen, J.M., Ropponen, K.M., Kataja,V.V., Kellokoski, J.K., Eskelinen, M.J.,Kosma, V. 2014. Expression of Matrix Metalloproteinase (MMP)-2 andMMP-9 in Breast Cancer with a Special Reference to Activator Protein-2, HER2, and Prognosis. Available from :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15569994. Accessed August 4,2016.

Rohan, T.E., Xue, X., Lin, H.M., Alfonso, T.M., Ginter, P.S. Tumormicroenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breastcancer.Availablefrom: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24895374.Accessed January 17, 2016.

Scully.O.J., Bay, B., Yip, G., Yu, Y. 2012. Breast Cancer Metastasis. Availablefrom: http://cgp.iiarjournals.org/content/9/5/311.short. Accessed January17, 2016.

Tamaki, M., Kamio, T., Kameoka, S., Kojimahara, N., Nishikawa, T. 2013. TheRelevance of the Intrinsic Subtype to the Clinicopathological Featuresand biomarkers in Japanese Breast Cancer Patients. World Journal ofSurgical Oncology, 11: 293. Available from:http://www.wjso.com/content/11/1/293. Accessed January 27, 2016.

Tanwani, A.K., Majeed, M. 2009. Pattern of Invasive Ductal Carcinoma of Breastaccording to Nottingham Prognostic Index. Ann. Pak. Inst. Med. Sci.5(4): p. 251-254.

Vandooren, J., Van Den Steen, P.E., Opdenakker, G. 2013. Biochemistry andmolecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade. Crit Rev Biochem Mol Biol; 48(3): p. 222-72.

Vasaturo, F., Solai, F., Malacrino, C., Nardo T., Vincenzi, B., Modesti, M., ScarpaS. 2012. Plasma levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 correlatewith histological grade in breast cancer patients. University SapienzaItaly. Available from:

90

http://www.pubpdf.com/search/author/Fortunata+Vasaturo. AccessedFebruary 27, 2016.

Vempati, P., Emmanouil, D., Karagianis., Popel, A.S. 2007. A Biochemical Modelof Matrix Metallopreoteinase 9 Activation and Inhibition. J.Biomol.Chem , 282: p. 37585-37596.

Verma, R.P., Hanch, C. 2007. Matrix metalloproteinases (MMPs): Chemical-biological functions and (Q)SARs. 2006. Bioorganic and MedicinalChemistry; 15: p. 2223-2268.

Wu, Q., Yang, Q., Huang, Y., She, H., Liang, J., Yang, Q., Zhang, Z. 2014.Expression and Clinical Significance of Matrix Metalloproteinase-9 inLymphatic Invasiveness and Metastasis of Breast Cancer. XiamenUniversity China. Available from:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4028268/. AccessedFebruary 27, 2016.

Yabluchanskiy, A., Ma, Y., Padmanabhan, R.I., Hall, M.E., Lindsey, M.L. 2013.Matrix Metalloproteinase-9: Many Shades of Function of CardivascularDisease. Physiology; 28: p. 391-403.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., Pierre, Y.S., Gaboury, L.A.. 2014. MMP-9 expressionvaries according to molecular subtypes of breast cancer. Available from:http://www.biomedcentral.com/1471-2407/14/609. Accessed January 17,2016.

91

Lampiran 1. Ethical Clearance

92

Lampiran 2. Surat Ijin Penelitian

93

Lampiran 3. Data Subyek Penelitian

No.

No. PA USIAGRAD

ETUBULA

RPLEO

MITOSIS

TOTAL JUMLAH SKOR

PRESENTASE SEL

INTENSITAS

HASIL PERKALIA

N

MMP-9

1848PP2013 62 1 2 2 1

52 1 2

R

22730PP201

448 1

2 1 14

3 1 3R

3566PP2015 38 1 1 1 1

33 2 6

T

4802PP2015 44 1 1 2 2

52 2 4

R

52371PP201

540 1

1 1 13

2 2 4R

6931PP2016 60 1 1 2 1

42 1 2

R

71922PP201

645 1

2 1 14

2 2 4R

8445PP2014 70 2 2 2 3

73 2 6

T

92348PP201

460 2

3 2 27

3 2 6T

102404PP201

464 2

3 2 27

4 2 8T

112931PP201

439 2

3 2 16

2 2 4R

123015PP201

440 2

3 2 27

4 1 4R

135848PP201

463 2

2 3 17

1 3 3R

14430PP2015 67 2 3 2 1

64 2 8

T

151533PP201

558 2

3 3 17

4 1 4R

161818PP201

555 2

3 2 16

4 3 12T

172344PP201

555 2

3 3 1

7

4 1 4

R

182848PP201

555 2

2 3 27

4 2 8T

193060PP201

554 2

2 3 16

4 1 4R

203271PP201

545 2

3 2 27

3 1 3R

21795PP2016 57 2 3 2 1

64 1 4

R

22982PP2016 54 2 3 2 2

71 2 2

R

231449PP201

644 2

2 3 16

4 2 8T

242599PP201

657 2

2 3 27

4 2 8T

252752PP201

651 2

3 2 16

2 3 6T

26339PP2014 53 3 3 3 3

93 2 6

T

27739PP2014 49 3 2 3 3

84 2 8

T

28752PP2014 69 3 3 3 2 8 2 1 2 R

29798PP2014 30 3 3 2 3 9 3 2 6 T

30860PP2014 43 3 3 3 3 9 4 1 4 R

311421PP201

458 3

3 3 3 9 4 2 8 T

94

321664PP201

449 3

3 2 3 8 4 1 4 R

333659PP201

451 3

3 3 3 9 3 2 6 T

343790PP201

464 3

3 3 2 8 4 3 12 T

355497PP201

445 3

3 3 3 9 3 2 6 T

36149PP2015 48 3 3 3 2 8 4 2 8 T

37417PP2015 44 3 3 3 2 8 4 2 8 T

38592PP2015 45 3 3 2 3 8 4 2 8 T

39940PP2015 57 3 3 3 3 9 4 3 12 T

402053PP201

548 3

3 3 3 9 4 2 8 T

412341PP201

545 3

3 3 3 9 4 2 8 T

422391PP201

545 3

3 3 3 9 4 2 8 T

432402PP201

554 3

3 3 2 8 4 3 12 T

442973PP201

555 3

3 3 2 8 3 1 3 R

4527PP2016 54 3 3 3 2 8 4 1 4 R

46382PP2016 48 3 3 3 3 9 4 2 8 T

47603PP2016 39 3 3 2 3 8 4 3 12 T

Catatan :

a. Skor persentase sel yang terpulas (distribusi) : 0 (tidak terwarnai), 1 (1-10% sel

terpulas), 2 (10-50% sel terpulas), 3 (50-70% sel terpulas), dan 4 (70-100%).

b. Skor intensitas warna coklat pada sel ganas, sel stroma, sel radang, dan

pembuluh darah : 0 (negatif), 1 (lemah), 2 (sedang), dan 3 (kuat).

c. Hasil perkalian skor presentase sel dan skor intensitas warna dibagi menjadi dua

kategori yaitu : 0-4 tingkat rendah dan 5-12 tingkat tinggi.

95

Lampiran 4. Analisis Statistik

4.a. Hasil Analisis Usia Keseluruhan Derajat Histologis

Frequencies

Statistics

Usia Grade Tubular Pleomorfik Mitosis Kelompok_usia

N Valid 47 47 47 47 47 47

Missing 0 0 0 0 0 0

Mean 51.45 2.32 2.62 2.45 2.00 5.66

Median 51.00 2.00 3.00 3.00 2.00 6.00

Mode 45 3 3 3 1a 5

Std. Deviation 8.868 .726 .644 .653 .834 .939

Minimum 30 1 1 1 1 4

Maximum 70 3 3 3 3 8

a. Multiple modes exist. The smallest value is shown

Frequency Table

Usia

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 30 1 2.1 2.1 2.1

38 1 2.1 2.1 4.3

39 2 4.3 4.3 8.5

40 2 4.3 4.3 12.8

96

43 1 2.1 2.1 14.9

44 3 6.4 6.4 21.3

45 6 12.8 12.8 34.0

48 4 8.5 8.5 42.6

49 2 4.3 4.3 46.8

51 2 4.3 4.3 51.1

53 1 2.1 2.1 53.2

54 4 8.5 8.5 61.7

55 4 8.5 8.5 70.2

57 3 6.4 6.4 76.6

58 2 4.3 4.3 80.9

60 2 4.3 4.3 85.1

62 1 2.1 2.1 87.2

63 1 2.1 2.1 89.4

64 2 4.3 4.3 93.6

67 1 2.1 2.1 95.7

69 1 2.1 2.1 97.9

70 1 2.1 2.1 100.0

Total 47 100.0 100.0

Grade

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 7 14.9 14.9 14.9

2 18 38.3 38.3 53.2

3 22 46.8 46.8 100.0

Total 47 100.0 100.0

97

Tubular

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 4 8.5 8.5 8.5

2 10 21.3 21.3 29.8

3 33 70.2 70.2 100.0

Total 47 100.0 100.0

Pleomorfik

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 4 8.5 8.5 8.5

2 18 38.3 38.3 46.8

3 25 53.2 53.2 100.0

Total 47 100.0 100.0

Mitosis

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 16 34.0 34.0 34.0

2 15 31.9 31.9 66.0

3 16 34.0 34.0 100.0

Total 47 100.0 100.0

98

Kelompok_usia

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 4 4 8.5 8.5 8.5

5 18 38.3 38.3 46.8

6 16 34.0 34.0 80.9

7 8 17.0 17.0 97.9

8 1 2.1 2.1 100.0

Total 47 100.0 100.0

Statistics

Usia_grade1 Usia_grade2 Usia_grade3

N Valid 7 18 22

Missing 40 29 25

Mean 48.14 54.89 49.68

Median 45.00 55.00 48.50

Mode 38a 55 45

Std. Deviation 9.388 8.663 8.323

Minimum 38 39 30

Maximum 62 70 69

a. Multiple modes exist. The smallest value is shown

99

Frequencies

Statistics

Persentase_sel Intensitas Hasil_kali MMP9 MMP_9

N Valid 47 47 47 47 47

Missing 0 0 0 0 0

Mean 3.32 1.85 6.13 1.57

Median 4.00 2.00 6.00 2.00

Mode 4 2 8 2

Std. Deviation .911 .659 2.886 .500

Minimum 1 1 2 1

Maximum 4 3 12 2

Frequency Table

Persentase_sel

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 2 4.3 4.3 4.3

2 8 17.0 17.0 21.3

3 10 21.3 21.3 42.6

4 27 57.4 57.4 100.0

Total 47 100.0 100.0

Intensitas

100

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 14 29.8 29.8 29.8

2 26 55.3 55.3 85.1

3 7 14.9 14.9 100.0

Total 47 100.0 100.0

Hasil_kali

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 2 4 8.5 8.5 8.5

3 4 8.5 8.5 17.0

4 12 25.5 25.5 42.6

6 8 17.0 17.0 59.6

8 14 29.8 29.8 89.4

12 5 10.6 10.6 100.0

Total 47 100.0 100.0

MMP9

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid R 20 42.6 42.6 42.6

T 27 57.4 57.4 100.0

Total 47 100.0 100.0

MMP_9

101

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid 1 20 42.6 42.6 42.6

2 27 57.4 57.4 100.0

Total 47 100.0 100.0

4.b. Hasil Analisis Uji Chi-square

Chi square usia terhadap grade

Crosstabs

Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

Kelompok_usia * Grade 47 100.0% 0 .0% 47 100.0%

Kelompok_usia * Grade Crosstabulation

Count

Grade

Total1 2 3

Kelompok_usia 4 1 1 2 4

5 4 3 11 18

6 0 9 7 16

7 2 4 2 8

8 0 1 0 1

Total 7 18 22 47

102

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 11.123a 8 .195

Likelihood Ratio 14.111 8 .079

Linear-by-Linear Association .710 1 .399

N of Valid Cases 47

a. 11 cells (73.3%) have expected count less than 5. The minimum expected

count is .15.

Chi square grade terhadap MMP-9

Crosstabs

Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

Grade * MMP9 47 100.0% 0 .0% 47 100.0%

Grade * MMP9 Crosstabulation

Count

MMP9

TotalR T

Grade 1 6 1 7

2 9 9 18

3 5 17 22

Total 20 27 47

Chi-Square Tests

103

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 9.280a 2 .010

Likelihood Ratio 9.832 2 .007

N of Valid Cases 47

a. 2 cells (33.3%) have expected count less than 5. The minimum

expected count is 2.98.

Penilaian Skor Presentase Sel Ekspresi MMP-9 Berdasarkan Derajat

Histologis

104

Penilaian Skor Intensitas Warna Ekspresi MMP-9 Berdasarkan Derajat

Histologis

4.c. Hasil Uji Normalitas pada berbagai grade

105

4.d. Hasil Analisis Uji Kruskal-Wallis pada berbagai grade

106

4.e. Hasil Analisis Uji Mann-Whitney pada derajat histologis I dan II

Hasil Analisis Uji Mann-Whitney pada derajat histologis I dan III

107

Hasil Analisis Uji Mann-Whitney pada derajat histologis II dan III

4.f. Hasil Analisis Uji Regresi Logistik

Logistic Regression

108

Block 1: Method = Enter

Iteration Historya,b,c,d

Iteration -2 Log likelihood

Coefficients

Constant Tubular Pleomorfik Mitosis

Step 1 1 52.964 -2.526 .053 .257 1.028

2 52.721 -2.919 .057 .309 1.193

3 52.720 -2.943 .057 .312 1.204

4 52.720 -2.944 .057 .312 1.204

a. Method: Enter

b. Constant is included in the model.

c. Initial -2 Log Likelihood: 64.109

d. Estimation terminated at iteration number 4 because parameter estimates changed by less than

.001.

Omnibus Tests of Model Coefficients

Chi-square df Sig.

Step 1 Step 11.389 3 .010

Block 11.389 3 .010

Model 11.389 3 .010

Model Summary

Step -2 Log likelihood

Cox & Snell R

Square

Nagelkerke R

Square

1 52.720a .215 .289

109

Model Summary

Step -2 Log likelihood

Cox & Snell R

Square

Nagelkerke R

Square

1 52.720a .215 .289

a. Estimation terminated at iteration number 4 because parameter

estimates changed by less than .001.

Hosmer and Lemeshow Test

Step Chi-square df Sig.

1 4.842 7 .679

Contingency Table for Hosmer and Lemeshow Test

MMP9 = R MMP9 = T

TotalObserved Expected Observed Expected

Step 1 1 4 3.913 1 1.087 5

2 3 4.330 3 1.670 6

3 4 3.302 1 1.698 5

4 4 2.639 2 3.361 6

5 0 .747 2 1.253 2

6 3 2.523 4 4.477 7

7 1 .947 4 4.053 5

8 0 .152 1 .848 1

9 1 1.446 9 8.554 10

Classification Tablea

Observed

Predicted

MMP9Percentage

CorrectR T

Step 1 MMP9 R 11 9 55.0

T 5 22 81.5

110

Overall Percentage 70.2

a. The cut value is .500

Variables in the Equation

B S.E. Wald df Sig. Exp(B)

95.0% C.I.for EXP(B)

Lower Upper

Step 1a Tubular .057 .581 .010 1 .922 1.059 .339 3.308

Pleomorfik .312 .585 .285 1 .594 1.367 .434 4.305

Mitosis 1.204 .481 6.257 1 .012 3.334 1.298 8.567

Constant -2.944 1.670 3.107 1 .078 .053

a. Variable(s) entered on step 1: Tubular, Pleomorfik, Mitosis.

Correlation Matrix

Constant Tubular Pleomorfik Mitosis

Step 1 Constant 1.000 -.531 -.491 -.105

Tubular -.531 1.000 -.268 -.271

Pleomorfik -.491 -.268 1.000 -.224

Mitosis -.105 -.271 -.224 1.000

111

112