wykorzystanie metod wspó³czesnej analizy materia³u … · 1. wstêp somatyczna embriogeneza jest...

Wykorzystanie metod wspó³czesnejanalizy materia³u roœlinnegow badaniach somatycznejembriogenezy Gentiana kurroo(Royle)

Agnieszka Fiuk, Jan J. Rybczyñski

Ogród Botaniczny – Centrum Zachowania Ró¿norodnoœci Biologicznej,Polska Akademia Nauk, Warszawa

Application of modern methods for plant material studies ofGentiana kurroo (Royle) somatic embryogenesis

S u m m a r y

Nowadays somatic embryogenesis is being investigated with special atten-tion paid to the identification of genes directly involved in triggering of cellcompetence and development of ontogenic stages. In order to trace successivecell divisions that lead to the formation of the globular structures, modern scan-ning and electron microscopy methods are applied. Plantlets, which come fromsomatic embryogenesis process, should be exactly the same as mother plantsbut in vitro culture conditions may induce many disturbances, which could belasting (hereditary) or only transitory. These changes are usually called soma-clonal variation and could be observed on different levels of the plant organiza-tion. To investigate this kind of variations both of the genetic and epigenetictypes, specially designed molecular systems are needed. Here, we describe in-duction of somatic embryos from several explants of G. kurroo. In order to evalu-ate the particular ontogenic stages of somatic embryos and variability of regen-erated plants, following methods were applied: light microscopy, scanning andtransmission electron microscopy, 2D protein electrophoresis, flow cytometryof DNA content in the cell nucleus, cytogenetic analysis of chromosome numberand molecular analysis with the use of AFLP.

Key words:

Gentiana kurroo, somatic embryogenesis, methods of plant material analy-sis.

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Agnieszka Fiuk,Ogród Botaniczny –Centrum ZachowaniaRó¿norodnoœci Biologicznej,Polska Akademia Nauk,02-973 Warszawa.

4 (75) 95–106 2006

1. Wstêp

Somatyczna embriogeneza jest zjawiskiem unikatowym w œwiecie organizmów¿ywych. Dotychczas uda³o siê j¹ zaindukowaæ na ró¿nego rodzaju eksplanatach, za-równo roœlin jedno- jak i dwuliœciennych. Jednak¿e mimo blisko piêædziesi¹t lat ododkrycia somatycznej embriogenezy wci¹¿ zadajemy sobie liczne pytania dotycz¹cemechanizmów jej sterowania. Przybli¿enie wiedzy na ten temat mo¿liwe jest dziêkibadaniom, w których wykorzystuje siê ró¿norodne, nowoczesne metody analizy ma-teria³u roœlinnego. Badania takie u³atwia opracowanie wydajnego i powtarzalnegosystemu uzyskiwania zarodków somatycznych dla poszczególnych gatunków roœlin.

2. Somatyczna embriogeneza goryczek

U roœlin nie tylko zygota mo¿e daæ pocz¹tek ca³emu organizmowi. Wed³ug teoriikomórkowej mówi¹cej o totipotencjalnych w³aœciwoœciach komórek roœlinnych,w odpowiednich warunkach, informacja genetyczna w nich zakodowana, mo¿e zo-staæ uruchomiona i doprowadziæ do odtworzenia ca³ego organizmu (1). Ujawnieniesiê pe³nej totipotencji nastêpuje na drodze organogenezy lub somatycznej embrio-genezy. Oba te procesy mog¹ zachodziæ bezpoœrednio z komórek eksplantatu lubpoœrednio przez stadium tkanki kalusowej, a tak¿e komórkowej kultury zawiesino-wej. Ich efektywnoœæ zale¿y od wielu czynników biologicznych, chemicznych i fizycz-nych. Mo¿na tu wymieniæ m.in. genotyp i stadium rozwojowe materia³u roœlinnego,z którego pobierany jest eksplantat, sk³ad mineralny po¿ywki, dodawane do po¿ywkiregulatory wzrostu i kompleksowe sk³adniki organiczne oraz zbalansowanie ich stê-¿eñ, stê¿enie osmotyczne po¿ywki, natê¿enie œwiat³a i d³ugoœæ jego fali (2).

Dotychczas na drodze organogenezy opracowano metodê rozmna¿ania trzynas-tu gatunków i mieszañców goryczek, do których nale¿¹: G. acaulis, G. lutea, G. purpurea,G. cruciata (3), G. cerina, G. corymbifera (4), G. kurroo (5), G. punctata (6), G. tibetica (7)G. scabra var. buergeri (8), G. pneumonanthe (9), G. triflora (10) i G. trifora x G. scabra(11). Wydajnoœæ tego procesu nie by³a jednak wysoka. Otrzymywano œrednio od2 do 20 pêdów w kulturze agarowej.

U niewielu gatunków goryczek zaindukowano rozmna¿anie drog¹ somatycznejembriogenezy. Pierwsze doniesienie pochodzi z 1994 r. (12). Autor obserwowa³ po-wstawanie zarodków somatycznych w kulturach zawiesinowych G. triflora zainduko-wanych z kalusa otrzymanego na elementach kwiatów. Zawiesina komórkowa by³anamna¿ana na po¿ywce zawieraj¹cej 1,0 mg/l 2,4-D i 0,1 mg/l BAP. Po przeniesieniutkanki na po¿ywkê pozbawion¹ hormonów wzrostu lub z niskim stê¿eniem cytokini-ny nastêpowa³ rozwój zarodków. Konwersja przebiega³a w obecnoœci 1,0 mg/l GA3.

Szczegó³owego opisu somatycznej embriogenezy goryczek w kulturach p³ynnychdokona³a Miku³a i wsp. (13). Autorzy obserwowali powstawanie zarodków somatycz-nych z pojedynczych komórek masy proembriogenicznej (PEM). Komórki te charakte-


96 PRACE PRZEGL¥DOWE

ryzowa³y siê obecnoœci¹ du¿ego, centralnie po³o¿onego j¹dra, ma³ych wakuoli, licz-nych mitochondriów, diktiosomów i szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. Do-datkowo w amyloplastach nastêpowa³o gromadzenie siê du¿ych iloœci skrobi. Wszyst-kie wymienione cechy œwiadczy³y o embriogenicznym charakterze komórek. Ich po-dzia³y prowadzi³y do powstania dwu- i trzykomórkowych, wyraŸnie odseparowanychstruktur, z których kolejno nastêpowa³o formowanie siê zarodków globularnych.

Proces somatycznej embriogenezy zosta³ równie¿ dok³adnie przeœledzony w kul-turze eksplantatów pierwotnych hipokotyli G. cruciata (14) i liœci G. pneumonanthe (15).W przeprowadzonych eksperymentach wykazano, ¿e embriogeniczna tkanka kalu-sowa powstaje w wyniku odró¿nicowywania komórek perycyklu hipokotyli siewek.Zarodki somatyczne tworzy³y siê masowo z zewnêtrznych, merystematycznych ko-mórek tej tkanki. Wykazano tak¿e liczne zaburzenia podczas podzia³ów komórekepidermy i kory pierwotnej, które w rezultacie prowadzi³y do ich degradacji. For-mowanie siê zarodków somatycznych równie¿ na eksplantatach liœci poprzedzoneby³o powstawaniem tkanki kalusowej. Embriogeniczny kalus tworzy³ siê tutaj z ko-mórek otaczaj¹cych wi¹zki przewodz¹ce (16).

Wydajnoœæ somatycznej embriogenezy eksplantatów pierwotnych zale¿a³a odich rodzaju, zastosowanych regulatorów wzrostu i badanego gatunku. W kulturachG. pneumonanthe otrzymywano odpowiednio 28 i 37 zarodków somatycznych na jed-nym eksplantacie liœcia i merystemu wierzcho³kowego (16). Proces ten zachodzi³w obecnoœci picloramu lub 2,4-D i BAP. Procent eksplantatów formuj¹cych embrio-geniczny kalus zale¿a³ od czasu inkubacji w ciemnoœci, natomiast nie zale¿a³ od ro-dzaju eksplantatu. Miku³a i Rybczyñski (17) indukowali somatyczn¹ embriogenezêna liœcieniach, hipokotylach i korzeniach siewek trzech gatunków goryczek. Najlep-szym eksplantatem okaza³ siê hipokotyl, na którym otrzymano odpowiednio 46,111 i 71 zarodków dla G. cruciata, G. tibetica i G. pannonica.

Zawiesiny komórkowe stanowi³y znacznie wydajniejsze Ÿród³o zarodków soma-tycznych. Eksperymenty przeprowadzono dla trzech gatunków goryczek: G. pannonica(18), G. cruciata i G. tibetica (19). Embriogenicznoœæ tkanki podtrzymywano na po-¿ywce zawieraj¹cej 1,0 mg/l dicamby; 0,1 mg/l NAA; 2,0 mg/l BAP i 80,0 mg/l siarcza-nu adeniny. Po przeniesieniu 100 mg tkanki zawiesinowej na po¿ywki zawieraj¹ce80,0 mg/l siarczanu adeniny; 1,0 mg/l kinetyny i 0,5 mg/l GA3 otrzymywano œrednio570 zarodków somatycznych dla G. pannonica, 634 zarodki dla G. tibetica i 257 za-rodków dla G. cruciata. Liczba zarodków somatycznych zale¿a³a od wielkoœci agre-gatów komórkowych i by³a najwy¿sza dla frakcji > 450 �m i 240-400 �m (20).

3. Somatyczna embriogeneza u G. kurroo

Spoœród przebadanych do tej pory gatunków goryczek (16,17,20), G. kurroo wyka-zywa³a najwy¿sze zdolnoœci embriogeniczne. W badaniach wykorzystano ró¿negotypu eksplantaty wielokomórkowe takie jak: liœcie, elementy siewek (korzeñ, hipoko-

Wykorzystanie metod wspó³czesnej analizy materia³u roœlinnego w badaniach somatycznej embriogenezy

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 95-106 2006 97

tyl, liœcienie) i zawiesiny komórkowe oraz jednokomórkowe, które stanowi³y proto-plasty (21).

W kulturach eksplantatów liœci zastosowano 3 ró¿ne auksyny: 2,4-D, NAA i dicambêoraz 5 cytokinin: zeatynê, TDZ, CPPU, BAP i kinetynê. Razem przebadano 189 kombina-cji hormonów. Spoœród zastosowanych auksyn, NAA i dicamba najintensywniej induko-wa³y somatyczn¹ embriogenezê zw³aszcza w obecnoœci BAP. Dodatkowo NAA i 2,4-D sil-nie stymulowa³y ryzogenezê, podczas gdy na po¿ywkach zawieraj¹cych dicambê nie ob-serwowano powstawania korzeni. Wydajnoœæ somatycznej embriogenezy, wyra¿onaliczb¹ eksplantatów tworz¹cych jeden lub wiêcej zarodków somatycznych by³a najwy¿-sza w obecnoœci po¿ywki zawieraj¹cej 0,5 mg/l dicamby oraz 1,0 mg/l zeatyny i wyno-si³a 54,7%. Zadowalaj¹ce wyniki uzyskano równie¿, gdy zamiast zeatyny zastosowanoBAP, wydajnoœæ somatycznej embriogenezy wynosi³a wówczas 45,9-48,0%. Najwy¿sz¹liczbê zarodków somatycznych na jednym eksplantacie liœcia, w liczbie oko³o 19 sztuk,odnotowano w obecnoœci dicamby i zeatyny. Na tle innych gatunków goryczek i eks-plantatów jest to przeciêtny wynik, jednak¿e w przypadku G. kurroo, równie¿ na wyra-staj¹cych z eksplantatu korzeniach przybyszowych obserwowano tworzenie siê zarod-ków somatycznych. Jest to zjawisko niezwykle interesuj¹ce z punktu widzenia dal-szych badañ, tym bardziej, ¿e – jak siê wydaje – zarodki somatyczne tworzone by³yw tym przypadku z pojedynczych komórek ryzodermy.

Innego rodzaju eksplantaty stanowi³y liœcienie, hipokotyle i korzenie siewek. In-dukcjê procesu somatycznej embriogenezy obserwowano tutaj bezpoœrednio napo¿ywce zawieraj¹cej 0,5 mg/l 2,4-D i 1,0 mg/l kinetyny. Na eksplantatach najpierwpojawia³ siê kalus, a powstawanie zarodków by³o reakcj¹ wtórn¹. Pojedyncze eks-plantaty z zarodkami somatycznymi w ró¿nych stadiach rozwojowych od globularne-go po liœcieniowe przenoszono na po¿ywkê do konwersji. Liczba zarodków po trzy-dziestu dniach kultury by³a du¿o wy¿sza ni¿ na eksplantatach liœciowych i wynosi³a od78 na jednym korzeniu do oko³o 160. w przeliczeniu na jeden liœcieñ.

Z zaindukowanej na eksplantatach siewek tkanki kalusowej wyprowadzano za-wiesiny komórkowe: liœcieniow¹ (K/L), hipokotylow¹ (K/H) i korzeniow¹ (K/K). Podwóch miesi¹cach od za³o¿enia zawiesin oceniane by³y ich zdolnoœci morfogene-tyczne. Na iloœæ otrzymanych ze 100 mg tkanki zarodków somatycznych mia³y wp³yw:pochodzenie zawiesiny, wielkoœæ frakcji oraz stê¿enie stosowanych hormonów.Z zawiesiny pochodzenia liœcieniowego, frakcji agregatów komórkowych wielkoœci>500 �m otrzymano ponad 800 zarodków. Wykazano statystycznie istotny wp³ywstê¿eñ badanych regulatorów wzrostu, jak równie¿ istotne ich wspó³dzia³anie. Wrazze wzrostem stê¿enia kinetyny przy braku lub niewielkim stê¿eniu GA3 obserwowa-no wzrost liczby tworzonych zarodków somatycznych, natomiast podwy¿szanie stê-¿enia GA3 stopniowo zmniejsza³o ich liczbê. Dodatkowo obserwowano obni¿enieintensyfikacji procesu somatycznej embriogenezy wraz ze zmniejszaniem siê wiel-koœci agregatów komórkowych.

Zarodki somatyczne G. kurroo otrzymywano równie¿ w kulturach protoplastówizolowanych z embriogenicznych zawiesin komórkowych. Wydajnoœæ somatycznej



embriogenezy w tego typu kulturach nie przewy¿sza³a zdolnoœci morfogenetycznychsamych zawiesin, ale okaza³o siê, ¿e mo¿liwe jest tutaj uzyskanie regeneracji drog¹bezpoœredni¹ z pojedynczego protoplastu, jeœli tylko Ÿród³o protoplastów stanowi¹m³ode 3-6-miesiêczne zawiesiny. Na podstawie przeprowadzonej analizy trójczynni-kowej wykonanej na podstawie oceny podzia³ów komórkowych liczonych w siód-mym dniu kultury, wykazano wysokie istotne ró¿nice w interakcji pomiêdzy badany-mi typami kultury, wielkoœci¹ agregatów komórkowych i rodzajem po¿ywki. Przynajlepszych kombinacjach wymienionych czynników uzyskano œrednio 63,3 zarodkisomatyczne w kulturze protoplastów K/L i 48,9 w kulturze protoplastów K/H z jed-nej 100 �l kropli po¿ywki zestalonej agaroz¹.

Somatyczna embriogeneza w kulturach G. kurroo jest g³ówn¹ drog¹ na którejujawniaj¹ siê zdolnoœci morfogenetyczne tego gatunku. Jej wydajnoœæ, podobnie jaku innych goryczek, jest zale¿na od szeregu czynników. Najwydajniejsze Ÿród³o za-rodków somatycznych G. kurroo stanowi kultura zawiesinowa. Daje ona równie¿mo¿liwoœæ dok³adnego przeœledzenia omawianego procesu w tym samym czasie, zewzglêdu na obecnoœæ zarówno pojedynczych komórek, jak i kilkunasto- czy kilku-dziesiêciokomórkowych agregatów, w lub z których nastêpuje ró¿nicowanie siê za-rodków. Pozosta³e zastosowane metody kultury okaza³y siê ciekawe ze wzglêdu nama³o typowe drogi tworzenia siê zarodków somatycznych, co umo¿liwia analizêrozwoju ich kolejnych stadiów ontogenetycznych na ekplantatach pierwotnych lubz pojedynczego protoplastu.

4. Analiza procesu somatycznej embriogenezy G. kurroo

Podstawowe narzêdzie pozwalaj¹ce na przeœledzenie procesu somatycznej em-briogenezy stanowi¹ nowoczesne metody mikroskopii skaningowej i elektronowej.Dziêki specjalnym technikom utrwalania materia³u mo¿liwe jest wykonanie ultracien-kich preparatów i uzyskanie bardzo dok³adnego obrazu zmian zachodz¹cych w ko-mórce podczas nabierania kompetencji (22,23). Na podstawie analizy ultrastruktu-

ralnej eksplantatów liœci G. kurroo implantowanych na po¿ywki z ró¿nymi stê¿enia-mi auksyn i cytokinin oraz zawiesin komórkowych zobrazowano kolejne etapy roz-woju zarodków somatycznych od pojedynczej komórki do stadium liœcieniowego.W zawiesinie komórkowej obserwowano zró¿nicowanie w budowie agregatów PEMw zale¿noœci od ich wielkoœci. Frakcja < 150 �m sk³ada³a siê z pojedynczych komó-rek oraz drobnych 2-6-komórkowych agregatów, których budowa by³a jednorodnai wskazywa³a na embriogeniczny charakter. Agregaty wielkoœci 150-300 �m wykazy-wa³y wiêksze zró¿nicowanie. W zewnêtrznych komórkach PEM wystêpowa³y du¿eamyloplasty wype³nione ziarnami skrobi, podczas gdy komórki wewnêtrzne by³ydu¿o mniejsze, u³o¿one w sposób zwarty, z mniej licznymi ziarnami skrobi, plasty-dami i licznymi lipidami. Oba wyró¿nione typy komórek posiada³y gêst¹ cytoplazmêi aktywne organelle komórkowe. W agregatach komórkowych wielkoœci powy¿ej


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 95-106 2006 99

300 �m obserwowano zró¿nicowanie komórek na trzy strefy: 1) zwakuolizowan¹(po³o¿on¹ centralnie), 2) skrobiow¹ (œrodkow¹), i 3) merystematyczn¹ (zewnêtrzn¹).W centrum znajdowa³y siê du¿e, starzej¹ce siê komórki z rzadk¹ cytoplazm¹. W du-¿ych agregatach komórki wewn¹trz ulega³y lizie powoduj¹c ich rozpad. W strefieskrobiowej komórki by³y mniejsze z charakterystycznymi, licznymi amyloplastamizawieraj¹cymi drobniejsze ziarna skrobi. W cytoplazmie wystêpowa³y drobne waku-ole o ró¿norodnym kszta³cie oraz du¿e j¹dra komórkowe. Najbardziej zewnêtrznastrefa komórek wyraŸnie oddziela³a siê od g³êbiej po³o¿onych warstw komórekskrobiowych pogrubionymi œcianami. S¹siaduj¹ce komórki w obrêbie tej strefy od-dzielone by³y od siebie cienkimi œcianami i po³¹czone licznymi plazmodesmami. Ko-mórki tej warstwy charakteryzowa³y siê wystêpowaniem gêstej cytoplazmy, szorst-kiego retikulum endoplazmatycznego, du¿ych j¹der komórkowych, licznych mito-chondriów, diktiosomów i drobnych wakuol. Mniej licznie, ni¿ w warstwie skrobio-wej wystêpowa³y tu amyloplasty zawieraj¹ce bardzo drobne ziarna skrobi. W du-¿ych agregatach, w wyniku kolejnych podzia³ów komórkowych, ju¿ w po¿ywce p³yn-nej dochodzi³o do formowania siê zarodków globularnych po stadium liœcieniowe.

W kulturach eksplantatów liœci obserwowano jednoczeœnie tworzenie siê korze-ni i zarodków somatycznych. Embriogeniczna tkanka kalusowa powstawa³a przedewszystkim z komórek epidermy i miêkiszu g¹bczastego. Dopiero póŸniej obserwo-wano formowanie siê struktur globularnych. Zarówno na eksplantatach liœci, jaki w zawiesinach komórkowych obserwowano charakterystyczne cechy zwi¹zanez indukowaniem procesu somatycznej embriogenezy oraz wygl¹dem komórek toti-potentnych, tj. izolowanie siê komórek grub¹ œcian¹, zanik po³¹czeñ plazmodesmo-wych, intensywne podzia³y, du¿e, centralnie po³o¿one j¹dro komórkowe, gêst¹ cy-toplazmê, liczne aktywne organella, drobne wakuole i nagromadzenie skrobi w amy-loplastach.

Na podstawie analizy skaningowej przeœledzono kolejne podzia³y komórkoweprowadz¹ce do powstania zarodków a¿ po stadium liœcieniowe. Dodatkowo w zawie-sinie komórkowej G. kurroo obserwowano, ¿e pojedyncze komórki i agregaty od-k³adaj¹ na zewn¹trz œcian grub¹ warstwê substancji bia³kowo-cukrowych. Podobnareakcja, w postaci otaczania siê komórek warstw¹ kalozy lub kutukuli uwa¿ana jestza jeden z markerów embriogenicznoœci (24).

W ostatnich latach coraz wiêksze zainteresowanie budz¹ próby identyfikacji ge-nów oraz kodowanych przez nie bia³ek bezpoœrednio zwi¹zanych z rozwojem po-szczególnych stadiów ontogenetycznych zarodka somatycznego i zygotycznegooraz uzyskiwaniem embriogenicznego charakteru przez pojedyncze komórki tka-nek roœlinnych (25,26). Badania tego typu mo¿liwe s¹ obecnie dziêki istnieniu no-woczesnych technik molekularnych. Dotychczas podobne analizy wykonywanom.in. dla rzodkiewnika (27,28), marchwi (29,30), kakaowca (31) i ogórka (32,33).Dwa pierwsze gatunki uznawane s¹ za roœliny modelowe dla tego typu badañ (34).Dotychczas zidentyfikowano kilka genów ulegaj¹cych ekspresji w warunkach streso-wych. Okaza³o siê, ¿e mog¹ byæ one jednoczeœnie zwi¹zane z procesem odró¿nico-



wywania i somatyczn¹ embriogenez¹. Do tego typu genów nale¿y m.in. wyizolowa-ny w kulturach marchwi SERK (ang. somatic embryogenesis receptor kinase), który jestsilnie specyficznym markerem aktywacji procesu somatycznej embriogenezy (29).

Doskona³ym narzêdziem pozwalaj¹cym na zobrazowanie zmian ekspresji genówzwi¹zanych z somatyczn¹ embriogenez¹ sta³a siê dwukierunkowa elektroforeza

bia³ek. Metoda ta oparta jest na podwójnym rozdziale materia³u w ¿elach akrylami-dowych, przy czym obraz pierwszego rozdzia³u uzale¿niony jest od gradientu pHdo którego dane bia³ko ma powinowactwo, a drugiego, od jego masy cz¹steczko-wej. Dotychczas dwukierunkowa elektroforeza bia³ek by³a czêœciej wykorzystywanado identyfikacji markerów izoenzymatycznych w hodowli roœlin (35-37) oraz bada-nia zmian ekspresji genów podczas rozwoju zarodka zygotycznego (37). Badaniewczesnych etapów embriogenezy by³o czêsto niemo¿liwe ze wzglêdu na trudnoœcinatury technicznej zwi¹zane z pozyskaniem wyrównanego materia³u bêd¹cego wewczesnych stadiach rozwoju zarodka. Jednak¿e dziêki podobieñstwom, jakie s¹ ob-serwowane w rozwoju zarodka zygotycznego i somatycznego mo¿liwe sta³o siê wy-korzystanie tych drugich jako alternatywnego Ÿród³a materia³u do badañ. Przypusz-czano, ¿e wzór ekspresji bêdzie podobny dla obu ich typów (38,39), a dodatkow¹zalet¹ w przypadku zarodków somatycznych jest mo¿liwoœæ idealnego wyrównaniamateria³u, np. poprzez izolacjê protoplastów i opracowanie systemu bezpoœredniejsomatycznej embriogenezy z pojedynczych komórek (40,41). Dwukierunkowa elek-troforeza bia³ek mo¿e byæ z powodzeniem stosowana do identyfikacji bia³ekzwi¹zanych z nabywaniem kompetencji komórek tkanki kalusowej jak i poszczegól-nymi etapami somatycznej embriogenezy (42-44). Metodê tê zastosowano równie¿w analizie zmian ekspresji genów poszczególnych stadiów rozwoju ontogenetycz-nego zarodków somatycznych G. kurroo izolowanych bezpoœrednio z zawiesiny ko-mórkowej. Do analizy bia³ek wybrano siedem stadiów rozwojowych zarodków so-matycznych. Rozszerzenie ich spektrum zwi¹zane by³o z du¿ymi ró¿nicami w wiel-koœci stadium liœcieniowego. Otrzymane na ¿elach peptydy mia³y wielkoœæ od 12 do70 kDa i lokowa³y siê w przedziale pH wynosz¹cym od 4 do 10. Wykazano, ¿e 130peptydów charakterystycznych dla prazarodków nie wystêpuje w stadium liœcienio-wym. Stadium drugie, tj. w pe³ni ukszta³towany zarodek somatyczny w stadium glo-bularnym, by³o reprezentowane przez 96 bia³ek charakterystycznych tylko dla tegostadium rozwoju ontogenetycznego. Podobnie w stadium wczesnoliœcieniowymokreœlono ich 66. Zarodki w stadiach liœcieniowych, ró¿ni¹ce siê d³ugoœci¹ liœcieni,tak¿e wykazywa³y liczne zmiany. Wyd³u¿anie siê liœcieni wyzwala³o ekspresjê no-wych genów, które dotychczas nie by³y aktywne, b¹dŸ hamowa³o ekspresje tych,które dotychczas jej ulega³y. Przeprowadzone eksperymenty mog¹ pos³u¿yæ do dal-szych badañ zwi¹zanych z identyfikacj¹ bia³ek i okreœleniem genów charaktery-stycznych dla poszczególnych etapów rozwoju zarodków somatycznych.

Uzyskane w wyniku somatycznej embriogenezy regeneraty G. kurroo przebadanopod k¹tem cytometrycznym i molekularnym. Wydawaæ by siê mog³o, ¿e roœliny uzy-skane na drodze somatycznej embriogenezy bêd¹ identyczne jak roœliny mateczne.


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 95-106 2006 101

Kultury in vitro indukuj¹ jednak ró¿norodne zmiany, które powoduj¹ zró¿nicowanieotrzymanego materia³u. W zale¿noœci od trwa³oœci powsta³ych zmian wyró¿nia siêdwa typy zmiennoœci: genetyczn¹ (dziedziczn¹), kiedy s¹ one przekazywane na na-stêpne pokolenie i epigenetyczn¹ (niedziedziczn¹), jeœli s¹ one krótkotrwa³e.

Poznano wiele czynników mog¹cych wp³ywaæ na to, czy i z jak¹ czêstotliwoœci¹zmiennoœæ jest indukowana. Nale¿¹ do nich: stopieñ odejœcia eksplantatu od zorgani-zowanego wzrostu merystematycznego (wiêksza zmiennoœæ wystêpuje w tkance kalu-sowej), wiek eksplantatu, genotyp, poziom ploidalnoœci, warunki kultury takie jak: ro-dzaj po¿ywki, wiek kultury, droga regeneracji, czêstoœæ pasa¿y, typ zastosowanejtechniki in vitro (45). Zmiennoœæ indukowana w kulturach in vitro dotyczy cech morfolo-gicznych, fizjologicznych, cytologicznych i molekularnych. Rodzaje zmian morfolo-gicznych s¹ bardzo ró¿norodne i obejmuj¹ zarówno cechy jakoœciowe, jak i iloœciowe.S¹ one zwi¹zane z mutacjami jednego lub niewielkiej liczby genów (46), a ich ocenanie wymaga skomplikowanych procedur. Najczêœciej obserwowanymi zmianami jako-œciowymi s¹: przebarwienia liœci, zmiana ich kszta³tu, kar³owatoœæ, wybuja³y wzrost.Do zmian iloœciowych zaliczamy: zmiany zawartoœci suchej masy, d³ugoœci okresu we-getacji, tolerancji na niekorzystne warunki œrodowiska, wysokoœci i pokroju roœlin,plonu (47). Zmiennoœæ zwi¹zana z cechami fizjologicznymi dotyczy reakcji na stresyabiotyczne i biotyczne, co powoduje koniecznoœæ oszacowania letalnych stê¿eñ czyn-nika wywo³uj¹cego stres i wyborem roœlin o najwy¿szej odpornoœci.

Zmiennoœæ na poziomie cytogenetycznym zwi¹zana jest ze zmianami ploidyzacjii zaburzeniami budowy chromosomów tkanek i roœlin pochodz¹cych z kultur in vitro.Zmiany ploidalnoœci roœlin regenerowanych na drodze somatycznej embriogenezys¹ zjawiskiem bardzo czêstym i mog¹ byæ wywo³ywane na skutek wyst¹pienia endo-reduplikacji lub spontanicznych fuzji protoplastów. Obserwuje siê, ¿e w kulturachembriogenicznej tkanki kalusowej zaindukowanej bezpoœrednio na eksplantatachpierwotnych, wraz z czasem, nastêpuje akumulacja przemian chromosomowych, za-równo iloœciowych jak i strukturalnych, przy jednoczesnym spadku jej zdolnoœci re-generacyjnych (48). Wyprowadzenie embriogenicznych zawiesin komórkowych,a nastêpnie uzyskanie roœlin w wyniku kultury ich protoplastów dodatkowo wy-d³u¿a czas kultury podczas której tkanka pobudzana jest do wzrostu poprzez obec-noœæ auksyn i cytokinin. W licznych pracach udowodniono, ¿e oba te czynniki pro-wadz¹ do podwy¿szenia zmiennoœci zarówno kultur zawiesinowych, jak i kaluso-wych (49-51). Poziom tych zmian mo¿na kontrolowaæ poprzez ocenê liczby chromo-somów za pomoc¹ licznych, opracowanych do tej pory metod (52) lub zawartoœciDNA z wykorzystaniem cytometrii przep³ywowej. Ta druga metoda opiera siê na za-stosowaniu odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego, który wi¹¿¹c siê z DNAumo¿liwia okreœlenie jego poziomu w j¹drze komórkowym badanych roœlin (53).Ocena regeneratów uzyskanych na drodze somatycznej embriogenezy za pomoc¹cytometrii przep³ywowej pozwala zatem na dobór takiego eksplantatu i metody kul-tury, które gwarantuj¹ uzyskanie najbardziej jednorodnego materia³u.



Na podstawie analizy cytometrycznej regeneratów G. kurroo wykazano zmianyzawartoœci j¹drowego DNA w zale¿noœci od zastosowanego eksplantatu i systemuregeneracji. Poœród 47 przebadanych roœlin zregenerowanych na drodze somatycz-nej embriogenezy na eksplantatach liœci nie zaobserwowano zmian iloœci DNA w po-równaniu z roœlinami kontrolnymi. Wœród regenerantów uzyskiwanych na eksplanta-tach siewek goryczek 7 wykaza³o podwojon¹ zawartoœæ DNA, przy czym 5 z nichotrzymano w kulturach hipokotyli. Równie¿ zawiesina pochodzenia hipokotylowegookaza³a siê bardziej niestabilna od liœcieniowej. Zmiany zawartoœci j¹drowego DNAw zawiesinach komórkowych kilku gatunków goryczek obserwowa³a tak¿e Miku³a(19). Autorka, podobnie jak to mia³o miejsce kulturach omawianej pracy, wykaza³apodwy¿szenie zawartoœci DNA w regenerowanych z nich roœlinach, wskazuj¹c jedno-czeœnie na najwy¿sz¹ niestabilnoœæ w obrêbie zawiesiny pochodzenia korzeniowego.Poœród 108 roœlin uzyskanych z kultur protoplastowych G. kurroo, 29 wykazywa³o po-dwojenie, a 3 potrojenie zawartoœci DNA. Zawartoœæ DNA by³a skorelowana z liczb¹chromosomów. Do ich liczenia zastosowano dwie metody: Feulgena i maceracji enzy-matycznej. U regenerantów 2C oraz roœlin kontrolnych obserwowano 26 chromoso-mów, natomiast u regeneratów 4C odpowiednio 52 chromosomy.

Znacznie wiêkszej precyzji w ocenie zmiennoœci indukowanej w kulturach in vitromo¿emy siê spodziewaæ po zastosowaniu markerów molekularnych (54). Najczêœ-ciej wykorzystywanymi dotychczas technikami pozwalaj¹cymi na ocenê stopniazró¿nicowania badanego materia³u na poziomie molekularnym s¹ analizy typu: RFLP(ang. Restriction Fragment Lenght Polymorphism), RAPD (ang. Randomly Amplified Poly-morphic DNA) i AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism). RAPD umo¿liwialosowe powielanie obszarów DNA, zawartych pomiêdzy starterami komplementar-nymi z obiema niæmi matrycowego DNA, których koñce 3’ s¹ zorientowane ku sobie(55). Czêsto jednak, ze wzglêdu na nisk¹ specyficznoœæ stosowanych dziesiêcionu-kleotydowych starterów oraz nisk¹ temperaturê komplementacji, obserwowany po-limorfizm pr¹¿ków jest niewielki lub nie ujawnia siê wcale (56-58). Pozosta³e dwiez wymienionych technik wykorzystuj¹ polimorfizm DNA uzyskiwany w wyniku tra-wienia jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi dwuniciowego DNA. RFLP by³adotychczas stosowana m.in. do porównania zmiennoœci somaklonalnej regeneran-tów trzciny cukrowej (59), palmy oleistej (60) i ry¿u (61). Jej wad¹ jest ma³a przydat-noœæ, gdy oczekujemy, ¿e poziom zmiennoœci bêdzie niski oraz wymagana du¿ailoœæ DNA wykorzystywanego do doœwiadczeñ (62). Metoda AFLP opracowana przezVosa i wsp. (63) ³¹czy cechy dwóch technik – powtarzalnoœæ charakterystyczn¹ dlaRFLP i wzmacnianie sygna³ów wykorzystywanych w reakcji PCR. Poza tym cechujej¹: a) wysoka wydajnoœæ generowania polimorficznych fragmentów, b) niski procentb³êdu (ok. 3%), c) stosunkowo niski koszt, d) niewielkie wymagania co do iloœci DNAi e) mo¿liwoœæ wykrycia zmiennoœci na poziomie metylacyjnym (64,65). ProceduraAFLP obejmuje kilka etapów. Pierwszym jest izolacja genomowego DNA, które na-stêpnie poddawane jest trawieniu dwoma enzymami restrykcyjnymi. Je¿eli celemjest ocena zmiennoœci wzorów metylacji musz¹ one byæ izoschizomerami ró¿ni¹-


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 95-106 2006 103

cymi siê wra¿liwoœci¹ na ten proces. Do najczêœciej stosowanych izoschizomerównale¿¹ MspI i HpaII (66-68). Oceny zmiennoœci sekwencji nukleotydowych mo¿na do-konaæ na przyk³ad za pomoc¹ trawienia parami restryktaz EcoRI/MseI lub PstI/MseI.Kolejny etap procedury stanowi przy³¹czenie do powsta³ych po trawieniu fragmen-tów restrykcyjnych – adaptorów, a nastêpnie zaprojektowanych na podstawie ichsekwencji nukleotydowych starterów. Startery posiadaj¹ dodatkowy nukleotyd na 3’koñcu umo¿liwiaj¹cy powielenie tylko tych fragmentów DNA (tzw. wstêpny PCR),które powsta³y z trawienia w³aœciwych miejsc restrykcji, specyficznych dla danej re-stryktazy. W dalszym etapie okreœlanym jako selektywny PCR, w przypadku któregomatryc¹ s¹ produkty wstêpnego PCR. Startery u¿yte do tego PCR posiadaj¹ dwa do-datkowe nukleotydy selekcyjne w porównaniu do wstêpnego PCR, dziêki czemumo¿liwa jest selekcja po¿¹danej liczby fragmentów. Detekcji namno¿onych i roz-dzielonych fragmentów DNA na ¿elu poliakrylamidowym dokonuje siê za pomoc¹radioaktywnego P32, którym znakowany jest 5’ koniec startera selektywnego.

Za pomoc¹ analizy molekularnej dokonano oceny zmiennoœci indukowanej w kul-turach in vitro na poziomie sekwencyjnym i metylacyjnym dla regenerantów G. kurroouzyskanych na drodze somatycznej embriogenezy z eksplantatów liœci, elementówsiewek i zawiesin komórkowych pochodzenia liœcieniowego. Zastosowano metodêAFLP. Do trawienia wykorzystano wczeœniej nie opisywane dla roœlin dwuliœciennychizoschizomery KpnI i Acc65I. Regeneranty przebadano w piêciu uk³adach selektyw-nych starterów AFLP. Uzyskane profile AFLP pozwoli³y na identyfikacjê pr¹¿ków se-lektywnych iloœci od 20 do 50 na pojedynczy rozdzia³, w zale¿noœci od rodzaju u¿y-tych starterów i pochodzenia regenerantów.

Ogólna zmiennoœæ identyfikowana dla regenerantów G. kurroo uzyskiwanychw kulturach eksplantatów liœci i siewek wynosi³a odpowiednio 11 i 18%, natomiastw kulturach zawiesin komórkowych 18,5%. Zmiennoœæ na poziomie sekwencyjnymby³a ni¿sza od zmiennoœci powodowanej metylacyj¹ cytozyny.

5. Podsumowanie

Rozmna¿anie roœlin w warunkach kultur in vitro daje mo¿liwoœæ szybkiego uzy-skania du¿ej iloœci jednorodnego materia³u. Somatyczna embriogeneza jest proce-sem morfogenetycznym, który stanowi najwydajniejsze Ÿród³o zarodków. Jednoczeœ-nie unikatowoœæ tego zjawiska, przypisywana tylko roœlinom, sk³ania badaczy doprowadzenia badañ maj¹cych na celu dok³adne poznanie omawianego procesu. Do-tychczas opracowane metody daj¹ mo¿liwoœæ przeœledzenia rozwoju zarodka soma-tycznego od pojedynczej komórki, ³¹cznie z identyfikacji genów i bia³ek specyficz-nych dla poszczególnych stadiów rozwojowych, a tak¿e analizy roœlin uzyskanychna drodze somatycznej embriogenezy. Zastosowanie niektórych z nich pozwoli³orównie¿ na przeœledzenie tego procesu u G. kurroo.



Literatura

1. Pierik R. L. M., (1987), In vitro culture of higher plants, Ed. Nihoff M., the Netherlands, 21-27.2. Rybczyñski J. J., (1991), Rozprawy Naukowe i Monografie, Wydawnictwo SGGW, Warszawa, 8-13.3. Momèiloviæ I., Grubišiæ D., Neškoviæ M., (2001), Biotechnology in Agriculture and Forestry Transgenic

Crops III, Ed. Bajaj Y. P. S., Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 48, 123-138.4. Morgan E. R., Butler R. M., Bicknell R. A., (1997), New Zeland Journal of Crop and Horticultural

Science, 25, 1-8.5. Sharma N., Chandel K. P. S., Paul A., (1993), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 34, 307-309.6. Vinterhalter B., Vinterhalter D., (1998), Arch. Biol. Sci., 50, 177-182.7. Skrzypczak-Pietraszek E., Skrzypczak L., Weso³owska M., (1993), Scientia Pharmaceutica, 62, 287-296.8. Yamada Y., Shoyama Y., Nishioka I., Kohda H., Namera A., Okamoto T., (1991), Chem. Pharm. Bull.,

39, 204-206.9. Lemproye A., Crevecoeur M., Kevers C., Gaspar T., (1987), Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent.,

52,1255-1257.10. Hosokawa K., Nakano M., Oikawa Y., Yamamura S., (1996), Plant Cell Rep., 15, 578-581.11. Hosokawa K., Oikawa Y., Yamamura S., (1998), Plant Cell Rep., 17, 747-751.12. Tabira H., (1994), International Horticultural Congress, Kyoto, Japonia, 21-28 VIII 1994.13. Miku³a A., Rybczyñski J. J., Tykarska T., Kuraœ M., (2001), Biol. Biulletin of Poznañ, 38, 47-53.14. Miku³a A., Tykarska T., Kuraœ M., Rybczyñski J. J., (2005), In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant., 41, 686-694.15. Paw³owska B., Bach A., (1995), V Ogólnopolski Zjazd Hodowców Roœlin Ogrodniczych, Skierniewice.16. Bach A., Paw³owska B., (2003), L. Acta Bot. Cracov., 45/2, 79-86.17. Miku³a A., Rybczyñski J. J., (2001), Acta Physiol. Plant., 23, 15-25.18. Miku³a A., Skierski J., Rybczyñski J., (2002 a), Acta Physiol. Plant., 24, 311-322.19. Miku³a A., Rybczyñski J. J., Skierski J., Latkowska M. J., Fiuk A., (2005 b), Liquid Culture Systems for in

vitro Plant Propagation, Eds. A. K. Hvoslef, E. W. Preil, 345-356.20. Miku³a A., Tykarska T., Kuraœ M., Iwanowska A., Rybczyñski J. J., (1996), Symposium Breeding Rese-

arch on Medicinal and Aromatic Plants, Quedlinburg, Germany, 290-295.21. Fiuk A., (2006), Zdolnoœci morfogenetyczne wielo- i jednokomórkowych eksplantatów goryczek, praca dok-

torska, Biblioteka Ogrodu Botanicznego – CZRB PAN, Powsin.22. Yeung E., (1995), In Vitro Embryogenesis in Plants, Ed. Thorpe A. T., Kluwer Academic Publishers, Dor-

drecht, 205-247.23. Kononowicz H., (1992), Post. Biol. Kom., 19, 35-44.24. Merkle S. A., Parrott W. A., Flinn B. S., (1995), In Vitro Embryogenesis in Plants, Ed. Thorpe A. T., Klu-

wer Academic Publishers, Dordrecht, 155-203.25. Fehér A., Pasternak T. P., Dudits D., (2003), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 74, 201-228.26. Kucharska M., (1994), Prace Ogrodu Botanicznego PAN, 5/6, 29-38.27. Shah K., Russinova E., Gadella W. J., Willemse J., de Vries S. C., (2002), Gene. Dev., 16, 1707-1720.28. Hecht V., Vielle-Calzada J.-P., Hartog M. M., Schmidt D. L., Boutilier K., Grossniklaus U., de Vries S. C.,

(2001), Plant Physiol., 127, 803-816.29. Schmidt D. L., Guzzo F., Toonen M., de Vries S. C., (1997), Development, 124, 2049-2062.30. Kitamiya E., Suzuki S., Sano T., Nagata T., (2000), Plant Cell Rep., 19, 551-557.31. Santos M., Romano E., Yotoko K. S., Tinoco M. L., Dias B. B., Aragão F. J., (2005), Plant Sci., 168,

723-729.32. Linkiewicz A., (2001), Izolacja i analiza genów ulegaj¹cych indukcji lub represji w pocz¹tkowych stadiach

somatycznej embriogenezy ogórka (Cucumis sativus L.), praca doktorska, Biblioteka SGGW, Warszawa.33. Filipecki M., Sommer H., Malepszy S., (1997), Plant Sci., 125, 63-74.34. Raghavan V., (2006), Curr. Sci., 10, 1336-1343.35. Kalinowski A., Wojciechowska B., (2003), Euphytica, 133, 201-207.36. Kalinowski A., Wojciechowska B., (2004), Acta Physiol. Plant., 26, 75-84.37. Higgins P., Bowles D. J., (1990), Plant Sci., 69, 239-247.38. Zimmerman J. L., (1993), Plant Cell., 5, 1411-1423.


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 95-106 2006 105

39. Lin X., Zimmerman J. L., (1999), J. Exp. Bot., 336, 1139-1147.40. Rybczyñski J. J., (1997), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 51, 159-170.41. Berrios E. F., Gentzbittel L., Mokrani L., Alibert G., Sarrafi A., (2000), Theor. Appl. Genet., 101,

606-612.42. Sallandrouze A., Faurobert M., Maataoui M., Espagnac H., (1999), Electroph., 20, 1109-1119.43. Chen L. J., Luthe D. S., (1987), Plant Sci., 48, 181-188.44. Stirn S., Jacobson H. J., (1987), Plant Cell Rep., 6, 50-54.45. Karp A., (1995), Euphitica, 85, 295-302.46. Peschke V., Phillips R., (1992), Adv. in Genet., 30, 41-75.47. Larkin P. J., Scowcroft W. R., (1981), Theor. Apppl. Genet., 60, 197-214.48. Ma³uszyñska J., (1994), Prace Ogrodu Botanicznego PAN, 5/6, 19-28.49. Orlikowska T., (1997), Regulatory roœlinne w kulturach in vitro. Regulatory wzrostu i rozwoju roœlin, red.

Jankiewicz L., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 219-248.50. Kumar P. S., Mathur V. L., (2004), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 78, 267-271.51. Mukhopadhyay M. J., Sengupta P., Mukhopadhyay S., Sen S., (2005), Scientia Horticulturae, 104, 1-9.52. Ma³uszyñska J., Olszewska M. J., (1999), Podstawy cytogenetyki roœlin, red. Olszewska M. J., Wydaw-

nictwo Naukowe PWN, Warszawa, 215-222.53. Ulrich I., Fritz B., Ulrich W., (1988), Plant Sci., 55, 151-158.54. Cloutier S., Landry B. S., (1994), In Vitro Cell Molecular Biology Reports, 30P, 32-39.55. Chwedorzewska K., (2000), Analiza zmiennoœci populacji ¿yta na poziomie molekularnym w aspekcie

d³ugotrwa³ego przechowywania i regeneracji ziarniaków, praca doktorska, Biblioteka Ogrodu Botanicz-nego – CZRB PAN Powsin.

56. Shoyama Y., Zhu X. X., Nakai R., Shiraishi S., Kohda H., (1997), Plant Cell Rep., 16, 450-453.57. Rani V., Parida A., Raina S. N., (1995), Plant Cell Rep., 14, 459-462.58. Fourré J. L., Berger P., Niquet L., André, (1997), Theor. Appl. Genet., 94, 159-169.59. Chowdhury M. K. U., Vasil I. K., (1992), Theor. Appl. Genet., 86, 181-188.60. Jaligot E., Beulé T., Rival A., (2002), Theor. Appl. Genet., 104, 1263-1269.61. Müller E., Brown P. T. H., Hartke S., Lörz H., (1990), Progress in Plant Cellular and Molecular Biology,

Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 153-156.62. Bednarek P., Chwedorzewska K., (2001), Biotechnologia, 1, 9-34.63. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rijans M., van de Lee T., Hormes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Ku-

iper M., Zabeau M., (1995), Nucleic Acids Res., 23, 4407-4414.64. Vendrame W. A., Kochert G., Wetzstein H. Y., (1999), Plant Cell Rep., 18, 853-857.65. Matthes M., Singh R., Cheah S.-C., Karp A., (2001), Theor. Appl. Genet., 102, 971-979.66. Peraza-Echeverria S., Herrera-Valencia V., James-Kay A., (2001), Plant Sci., 161, 359-367.67. Cervera M.-T., Ruiz-Garcia L., Martinez-Zapater J., (2002), Mol. Genet. Genomics, 268, 438-445.68. Raina R., Behera M. C., Chand R., Sharma Y., (2003), Current Science, 5, 667-670.



wykorzystanie metod wspó³czesnej analizy materia³u … · 1. wstêp somatyczna embriogeneza jest...

Documents