wyklad 9
TRANSCRIPT
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Globalny rynek enzymów
Wielkość rynku – około 3 mld $Tempo wzrostu – 12% rocznieIlość firm – około 400
Największe: Novozymes (Dania) 45%Danisco/Genecor (Dania/USA) 17%DSM (Holandia) 5%BASF (Niemcy) 4%
Sektory rynku enzymów: techniczny (63%), żywnościowy (31%), paszowy (6%)
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Podstawy Biotechnologii
Wytwarzanie enzymów
Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące sięwarunkami:
1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celówprzemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes)
2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości
Obecne tendencje w produkcji enzymów:
1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przezenzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkachnadprodukcji
2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojówekstremofilnych
3. Zastosowanie inżynierii białka – enzymy o zmienionych właściwościach
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Izolacja enzymów ze źródeł naturalnych90% z bakterii i grzybów. Inne źródła: roślinne i zwierzęce
Enzymy izolowane z roślin Źródło Enzym Zastosowanie Fasola (Canavalia ensiformis) Owoce papaya (Carica papaya) Figi (Ficus carica) Ananas (Ananas comosus) Chrzan (Armoracia rusticana) Migdały (Amygdalus communis) Pszenica (Triticum aestivum) Jęczmień (Hordeum vulgare) Soja (Glycine max)
Ureaza Papaina Ficyna Bromelanina Peroksydaza β-glikozydaza Esteraza β-amylaza β-amylaza
Diagnostyka Piekarnictwo, mleczarstwo, garbarstwo, kruszenie mięsa, usuwanie zmętnienia piwa Kruszenie mięsa Piekarnictwo Diagnostyka Badania naukowe Hydroliza estrów i synteza Piekarnictwo, syropy maltozowej.w.
Enzymy izolowane z tkanek zwierzęcych
Źródło Enzym Cielęta, bydło rzeźne, owce, trzoda chlewna Jaja kurze Mocz
Diastaza (amylaza), esteraza, lipaza, pepsyna, trypsyna, fitaza, chymozyna (renina), fosfolipaza Lizozym Urokinaza
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości, produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia Enzymy do celów technologicznych, wytwarzane w dużych ilościach (bulk)
Enzymy wysokiej czystości
Niewielki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki masy Surowe preparaty, często poniżej 10% białka Obecność innych enzymów Preparaty otrzymane w wyniku suszenia rozpyłowego lub stężone roztwory Brak stabilizatorów Niewiele etapów oczyszczania Próbki dostępne nieodpłatnie Minimalne zamówienie 1-2 kg
Wysoki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki aktywności enzymu Wysoka czystość, często powyżej 90% Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność określona ilościowo Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze siarczanu amonu Obecne stabilizatory Wiele etapów oczyszczania, w tym techniki chromatograficzne Brak takich próbek Szeroki zakres dostępnych ilości (poczynając od bardzo niewielkich)
Produkcja enzymów
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Enzymy używane do celów przemysłowych
Bacillus subtillisAspergillus oryzae,
Aspergillus nigerBacillus amyloliquefaciensTrichoderma, AspergillusAspergillus nigerStreptomyces lividansA. oryzae, A. nigerBacillus lichenoformisAspergillusA. oryzae, A. nigerB. lichenoformisA. oryzae, A. nigerB. LichenoformisA. niger, B. lichenoformis
BacillusAspergillus
BacillusTrichoderma reeseiAspergillus nigerStreptomycesCandida, FusariumBacillusAspergillusAspergillusBacillusŻołądki cieląt, MucorBacillusActinomadura
Browarnictwo (B)Piekarnictwo (P), B, Przemysł skrobiowy (PS)PSP, B, przemysł detergentów (PD)PSPS – syropy wysokofruktozoweP, przemysł mleczarski (PM)Przemysł owocowo-warzywny (PO)POPrzemysł paszowyPDPMPSPrzemysł drzewny i tekstylny
Dekarboksylaza acetylomleczanowaAmylaza
AmylazaCelulazaGlukoamylazaIzomeraza glukozowaLipazaLiaza pektynowaPektynazaFitazaAlkaliczna proteazaKwaśna proteazaPululanazaKsylanaza
Producent ekspresyjnyPierwotny producent
ZastosowanieRodzaj enzymu
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Ideowy schemat produkcji preparatów enzymatycznych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Dezintegracja komórek - problemy
Komórki zwierzęce – brak ściany; duże rozmiary; łatwość rozbiciaKomórki roślinne – ściana komórkowa (celuloza/ligniny/woski)
duże rozmiary; polifenole obecne w wakuolach Bakterie - sztywna ściana komórkowa + błona zewnętrzna (tylko Gram-);
niewielkie rozmiary; komórki sferyczne – szczególne problemykomórki rekombinowane – możliwe tworzenie ciał inkluzyjnych
Grzyby - bardzo sztywna ściana (chityna/glikan); aktywne enzymyproteolityczne
Problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmu w momencie rozbicia komórek; efekty cieplne związane z zastosowaniemmetod mechanicznych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Prasa Frencha
Zasada działania:
W wyniki parcia wywieranego na zawartość komory przez tłok naciskany za pośrednictwem prasy hydraulicznej, rośnie ciśnienie w komorze oraz ciśnienie wewnętrzne w komórkach. Podczas uwalniania zawartości komory przez wąską dyszę, następuje gwałtowny spadek ciśnienia w zawiesinie (na zewnątrz komórek) do atmosferycznego. Ciśnienie wewnątrzkomórkowe także spada, ale wolniej. W efekcie, gradient ciśnienia po dwóch stronach błony cytoplazmatycznejpowoduje jej pęknięcie, a w efekcie uwolnienie cytoplazmy.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Zatężanie roztworów białek
- w wyniku dodania do roztworu ziaren suchego, porowatego polimeru. Wielkość porów musi być tak dobrana, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek (Sephadex G-25, glikol polietylenowy - PEG);
-w wyniku usunięcia nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek poprzez dyfuzję przez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja, dializa wobec suchego Sephadex-u lub PEG);
-w wyniku usunięcia wody w niskiej temperaturze pod zmniejszonym ciśnieniem (liofilizacja);
- poprzez wytrącenie białka z roztworu (wysalanie, dodanie rozpuszczalnika organicznego i rozpuszczenie osadu w mniejszej objętości roztworu wodnego)
- poprzez oddzielne białka wytraconego w postaci ciał inkluzyjnych i jego naturację
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Naturacja białek z ciał inkluzyjnych
Problem tworzeniaagregatów podczasfałdowania białek
Mogą się tworzyćw bakteryjnychsystemach ekspresji
1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie wroztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Wytrącanie białek
Wytrącanie poprzez wysalanie
Wytrącanie poprzez dodatek rozpuszczalnika organicznego
Białka są wytrącane w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą, niedenaturującychrozpuszczalników organicznych.Najczęściej stosowane: aceton, etanol, rzadziej eter dietylowyOperacje prowadzi się w temperaturach poniżej 0° C.
Wytrącanie poprzez zmianę pH roztworu
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatograficzne metody separacji białekPodstawą separacji są różnice we właściwościach fizykochemicznych białek:
polarność chromatografia adsorpcyjnachromatografia hydrofobowa
charakter jonowy chromatografia jonowymiennachromatoogniskowanie
rozmiary cząsteczki chromatografia rozmiarów wykluczającychaktywność biologiczna chromatografia powinowactwa
W oczyszczaniu białek stosuje się techniki chromatograficznenisko-, średnio- i wysokociśnieniowe.
LPLC < 5 bar
MPLC 6 – 50 bar
HPLC > 50 bar
1 bar = 0.1 MPa
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Materiały stosowane jako nośniki (matryce) dla złóż chromatograficznych wykorzystywanych dla oczyszczania białek
tylko zawiesina
j.w.
2 – 12
2 – 12
3 - 14
2 – 14
2 – 11
bez ograniczeń
epichlorohydryna
epichlorohydryna
2,3-dibromopropanol
kopolimer dekstranu I agarozy
produkt polikondensacji
diwinylobenzen
Celuloza
Dekstran
Agaroza
Sepharose
Poliakrylamid
Polistyren
UwagiZakres stabilności (pH)Czynnik sieciującylub skład kopolimeru
Matryca
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatografia jonowymienna białek
Rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony)kationity (wymieniają kationy)
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatografia adsorpcyjna
Hydroksyapatyt: Ca10(PO4)6(OH)2- krystaliczny- sferoidalny- ceramiczny
Mechanizm adsorpcji: Wiązanie na powierzchni złoża, w którym uczestniczą jony Ca(II) i fosforanowe złoża oraz naładowane grupy funkcyjnebiałek
Warunki adsorpcji: bufor fosforanowy Na/K (<20 mM)pH obojętne
Warunki elucji: rosnący gradient skokowy lub ciągły buforu fosforanowego (zwykle 10 – 500 mM)
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatografia hydrofobowaInertne matryce funkcionalizowane grupami arylowymi lub alkilowymi.Matryce podstawione grupami alkilowymi są ogólnie bardziej hydrofobowe, niż matryce podstawione grupami arylowymi
Mechanizm wiązania białek: wykorzystuje się obecność domen hydrofobowych na powierzchni cząsteczek białka; siła napędowa – wzrostentropii układu; jest potęgowana w roztworach o dużej sile jonowej.
Złoża do chromatografii hydrofobowej FPLC
Parametry próbki nanoszonej na kolumnę:środowisko buforu o dużej sile jonowej;
Elucja: a/ bufor o zmniejszającej się sile jonowej;b/ gradient rozpuszczalnika organicznego(alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne) lubdetergentu niejonowego, np. Triton X-100
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatografia rozmiarów wykluczających
Zasada: Porowate ziarna złoża z materiału całkowicie inertnego (Sephadex,Sepharose, Superose, Superdex, poliakrylamid. Pory w ziarnach o kontrolowanej średnicy. Cząsteczki białek, w zależności od swoich rozmiarów wnikają do porów
(są zatrzymywane) lub przepływają obok.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Chromatografia powinowactwaPodstawą separacji są wysoce selektywne, specyficzne oddziaływania białko: ligand związany trwale ze złożem.
Ligandem może być np.: analog substratu, koenzymu, inhibitor kompetytywny, inhibitor allosteryczny.
Istnieje możliwość indywidualnego zaprojektowania i otrzymania złoża specyficznego wobec danego białkalub zakupu jednego z kilkuset komercyjnie dostępnych złóż o różnej specyficzności.
W niektórych przypadkach możliwe efektywne oczyszczenie białka w jednym etapie.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Schemat granulatora do otrzymywania granulatów enzymatycznych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Etapy procesu wytwarzania enzymu przemysłowego
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Schemat biosyntezy enzymów przemysłowych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Rodzaje białek terapeutycznych- białka stymulujące powstawanie komórek krwi- czynniki krzepliwości krwi i białka trombolityczne- interferony i cytokiny- hormony- enzymy- przeciwciała i ich pochodne- szczepionki (podjednostkowe)
Białka należące do czterech pierwszych grup można izolować ze źródeł naturalnych:krew ludzka i zwierzęca, organy zwierzęce. Wady – możliwość przenoszenia czynników infekcyjnych (wirus HIV, priony), ograniczony dostęp do zasobów
Obecnie wszystkie w/w białka są wytwarzane jako białka rekombinowane- produkty heterologicznej ekspresji genów kodujących białka ludzkie i znakomita ich większość jest w swojej ostatecznej postaci identyczna bądź też prawie identyczna z białkami występującymi w organizmie zdrowego człowieka lub z ich fragmentami.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Białka terapeutyczne - przykłady
Białka stymulujące powstawanie komórek krwiErytropoetyna
Etapy ERYTROPOEZY
a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO) d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Białka terapeutyczne - przykładyBiałka stymulujące powstawanie komórek krwi
ErytropoetynaLudzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem• sekwencji aminokwasów, • pozycji 2 mostków disiarczkowych, • 4 miejsc glikozylacji,• struktury drugorzędowej.
Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa cząsteczkowa - 30,4 kDa.
Białko zbudowane jest z 4 alfa-helis, które tworzą ścisłą pofałdowana strukturę białka.
Rekombinowane produkty nie różnią się pod względem budowy, można jednak zauważyć ilościowe różnice w glikozylacji.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Białka terapeutyczne - przykładyBiałka stymulujące powstawanie komórek krwi
ErytropoetynaKomórki ssaków transfekowanegenem EPO
Produkcja EPO rekombinowanejgenetycznie (rHu-EPO) in vitro
Komórki jajnika chińskiego chomika (CHO) są obecnie najbardziej powszechnie używane do produkcji rHu-EPO w skali przemysłowej.
rHu-EPO z całkowitą aktywnością biologiczną in vivo może być również otrzymywana z innych kultur komórek ssaków modyfikowanych genetycznie, takich jak komórki nerek młodych chomików BHK-21, albo komórki sutka myszy C127.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Białka terapeutyczne – przykładyHormony
InsulinaProdukowana w trzustce przez komórki β wysp trzustkowych
hormon o strukturze małego białka
Insulina obniża poziom glukozy we krwi, zwiększa zawartośćglikogenu w wątrobie, wzmaga biosyntezę aminokwasów, białek oraz kwasów tłuszczowych, wpływa na wnikanie glukozy do komórek mięśni i tkanki tłuszczowej
Cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów peptydowych A i B, połączonych ze sobą dwoma mostkami disiarczkowymi. ŁańcuchA zawiera 21, a łańcuch B 30 reszt aminokwasowych (w sumie 51reszt aminokwasowych)
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Insulina
Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast ThrCzęściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Gensulin (BIOTON)
Konstrukcja genu: sekwencja kodująca: Peptyd B-Lys-Arg-Peptyd A-Lys-peptyd nośnikowy
Ekspresja w Escherichia coliProdukt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnychEtapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacjaPółprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymiObróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem AOczyszczanie: chromatografia kolumnowaDalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazyProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacjaProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Wytwarzanie przeciwciał i leków opartych na przeciwciałach
Podstawowa struktura immunoglobuliny G (IgG)H – łańcuchy ciężkie; L – łańcuchy lekkie; Fab – region wiążący antygen; Fc – region krystalizowalny
Dwa główne typy odpowiedziimmunologicznej:
a/ odpowiedź humoralna –główny element: limfocyty Bb/ odpowiedź komórkowa –główny element: limfocyty T
Przeciwciała wytwarzane są przez limfocyty B
Struktura immunoglobuliny typu GVH, VL – domeny zmienne; CH1, CH2, CH3 – domeny stałe
Model struktury przestrzennej IgG
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Produkcja przeciwciał przez organizm immunizowany antygenem
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Przeciwciało monoklonalne – przeciwciało specyficzne wobec danego antygenu, o zdefiniowanej sekwencji łańcuchów polipeptydowych; wytwarzane przez komórkiklonalne (jednego genotypu) w hodowli tkankowej
Przeciwciała poliklonalne – zestaw przeciwciał monoklonalnych wiążących dany antygen, wytwarzanych przez immunizowany organizm zwierzęcy
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
ZASTOSOWANIA PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH
A. Oczyszczanie biomolekuł1. Immunochromatografia2. Immunoprecypitacja
B. Zastosowania diagnostyczne3. Testy ELISA4. Immunocytochemia5. Mikroskopia transmisyjna i konfokalna
C. Zastosowania terapeutyczne6. Immunotoksyny – chemoterapia przeciwnowotworowa7. Immunosupresja
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Przeciwciało (immunoglobulina)Przeciwciało (immunoglobulina)
Przeciwciałem nazywa się specyficzny rodzaj Przeciwciałem nazywa się specyficzny rodzaj białekbiałek wydzielanych przez wydzielanych przez komórki komórki plazmatyczneplazmatyczne (czyli pobudzone (czyli pobudzone limfocyty Blimfocyty B) w ) w przebiegu przebiegu odpowiedzi immunologicznejodpowiedzi immunologicznej, które , które mają zdolność do swoistego rozpoznawania mają zdolność do swoistego rozpoznawania antygenówantygenów. .
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Kompozycja przeciwciał stosowanych jako leki
Przeciwciała chimeryczneprodukty genów rekombinowanych kodujących regiony zmienne mysich i regiony stałe ludzkich przeciwciał;Przeciwciała humanizowaneregiony CDR mysie + reszta ludzka
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Humanizowane przeciwciała Humanizowane przeciwciała -- lekileki
TrastuzumabTrastuzumab ((HerceptinHerceptin)) –– lek, lek, w którym substancją czynną jest w którym substancją czynną jest przeciwciało humanizowane przeciwciało humanizowane skierowane przeciwko receptorom skierowane przeciwko receptorom HER2 (naskórkowy czynnik wzrostu). HER2 (naskórkowy czynnik wzrostu). Skuteczny w leczeniu nowotworu Skuteczny w leczeniu nowotworu płuc. płuc.
AlemtuzumabAlemtuzumab ((CampathCampath)) –– lek, w którym lek, w którym substancją czynną jest humanizowane substancją czynną jest humanizowane ludzkie przeciwciało monoklonalne ludzkie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko glikoproteinom CD52 skierowane przeciwko glikoproteinom CD52 obecnym na powierzchni limfocytów. obecnym na powierzchni limfocytów. Skuteczny w leczeniu białaczki limfocytowej.Skuteczny w leczeniu białaczki limfocytowej.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Immunotoksyny - leki
GemtuzumabGemtuzumab ((MylotargMylotarg)) –– lek, w którym substancją czynną lek, w którym substancją czynną jest przeciwciało połączone z substancją antybiotyczną jest przeciwciało połączone z substancją antybiotyczną ––kalichemicynąkalichemicyną ((oligosacharydoligosacharyd tworzącytworzący dwuniciowe dwuniciowe pęknięcia w DNA), wiążące się z glikoproteiną CD33. pęknięcia w DNA), wiążące się z glikoproteiną CD33. Skuteczny w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.Skuteczny w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.
Ibritumomab TiuxetanIbritumomab Tiuxetan ((ZevalinZevalin). ). ImmunokoniugatImmunokoniugat mysiego mysiego przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni zmienionych nowotworowo limfocytów B zzmienionych nowotworowo limfocytów B z tiuksetanemtiuksetanem, , selektywnym selektywnym chelatoremchelatorem InduIndu--111 oraz Itru111 oraz Itru--90.90.Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu o radioaktywne izotopy.o radioaktywne izotopy.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciukomórek hybrydowych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Hodowle tkankowe komórek ssaczych
Sposoby prowadzenia hodowli komórek ssaków
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Hodowle tkankowe komórek ssaczych
Hodowla komórkowa w butelkach obracanych (roller bottles)
Hodowla komórkowa na tacach w komorach inkubacyjnych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Hodowle tkankowe komórek ssaczych
Trójstopniowa instalacja przemysłowa do hodowli komórkowych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Hodowle tkankowe komórek ssaczych
Reaktory typu air-lift – szczególnie przydatne do przemysłowejhodowli komórek ssaczych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Etapy procesu otrzymywania immunobiofarmaceutyku
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Enzymy stosowane w przemyśle skrobiowym
Etapy produkcji amylazy
1. Fermentacja Aspergillus awamori2. Ekstrakcja wodą podłoża z grzybnią3. Wytrącenie etanolem z 0,2% CaCl2, 5°C4. Odwirowanie osadu, przemycie etanolem5. Suszenie próżniowe do 90% s.m.6. Zmielenie, dodanie wypełniacza
Skrobia
Zawiesina skrobi
woda
Upłynnianie
Para wodna α-amylaza
Maltodekstryny
Scukrzanie
Glukoamylaza/pululanaza
Izomeryzacja
Syrop maltozowySyrop glukozowy
Izomeraza glukozowa
Syrop fruktozowy
Rafinacja
Oczyszczanie
Syrop rafinowany
Syrop oczyszczony
Mieszanie
Materiał roś linny
Termostabilne amylazy – możliwośćdziałania w temperaturze bliskiej 100 °C
Produkcja izomerazy glukozowej
1. Fermentacja Bacillus lub Streptomyces2. Odwirowanie lub filtracja3. Rozbicie komórek4. Odwirowanie osadu5. Wytrącenie enzymu z roztworu6. ImmobilizacjaSchemat enzymatycznego rozkłądu skrobi