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Western Blot�Alejandra Lara Couto

�María Fernanda Ponce Hernández�

Alma Jessica Salazár Reyes�Sandra Pamela Reynoso Bistraín

�Amairani Villeda Rodríguez

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� También llamada 

´inmunoblottingµ fue utilizada por pr imer a vez por Towbin en 1979, yconsiste en la especificidad de la 

unión antígeno-anticuerpo queper mite la detección de una única proteína dentro de una 

mezcla compleja de otr asproteínas.

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� Es una técnica mediante la cual

se separ an proteínas por electroforesis en gel de

poliacr ilamida y después se

tr ansfieren electrofor éticamente a un papel de nitrocelulosa o una membr ana similar donde son

detectadas con anticuerpos quereconocen los antígenos que hay

en ellas.

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� El fundamento de Western blot es una discr iminación de los antígenos del VIH

frente a los que se dir igen losanticuerpos presentes.

� Básicamente se basa en la separ aciónde las proteínas (antígenos) obtenidasdel VIH-1 procedentes del lisado del

cultivo del vir us y pur ificadas por centr ifugación.

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Se realiza una eletroelución que se basa 

en la movilidad electrofor ética de lasproteínas for mando un sándwich entredos electrodos sumergidos en una 

solu

ció

n condu

ctor a

, cua

nd

o sesumerge en esta solución se aplica uncampo eléctr ico y gr acias a este las

proteínas migr an del gel a la 

membr ana y aquí quedan adher idas.

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� La eficacia de este proceso

depende de la capacidad de la proteína de migr ar al gel, su capacidad de adherencia, la 

consistenc

ia d

el gel y sieste est

a completamente en contacto con

la membr ana o un ba jo volta je en

la

corr iente

del c

ampo el

éctr 

ico.

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� par a revisar su eficacia se tiñela membr ana con un reactivo

llamado rojo Ponceau

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� en la membr ana se bloquean

sus sitios de unión par a reducir la unión inespecífica de las

proteínas, actualmente par a este bloqueo se crean

tampones desde leche hasta 

proteína

s específica

spur ificadas

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� la desventa ja es que estos tampones debenser específicos dependiendo de la proteína 

que se quiere localizar y de la enzima quese vaya a utilizar, este tampón se va a unir a todos los sitios de unión inespecífica de la membr ana eliminando todo el r uido de

fondo o bloquear los epitopos par a la uniónde los anticuerpos pr imar ios.

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� se debe de realizar un lavado par a eliminar el mayor r uido posible e incrementar la relación señal-r uido, se puede utilizar un

detergente llamado Tween-20 o el tampónque se vaya a utilizar diluido en detergente ,si este lavado es insuficiente habrá una gr an

cantidad de r uido pero si se hace unexceso de lavado se puede presentar una 

sensibilidad.

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� Par a escoger el tipo de tampón

que se debe utilizar se emplea la técnica de ´relación señal-r uidoµque consiste en obtener un

pequ

eñ

os fr a

gm

entosd

e esta

 membr ana y utilizar diferentestipos de tampones par a bloquear 

cada

pedaz

od

em

emb

r a

na

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no existe una car acterística enespecifico par a cada unión

antígeno-anticuerpo por lo que sedebe utilizar la mayor var iedad detampones posibles par a observar con cual existen mayor relación

señal-r uido.

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� Par a saber que anticuerpo pr imar ioutilizar es importante saber que

antígeno se desea detectar y de losanticuerpos disponibles par a este

antígeno (existe una gr an var iedad de

anticuerpos que ya son comerciales).� Se pueden utilizar antígenos

monoclonales (estos son fáciles de

produ

cir y t

ienen gr 

ana

finidad

por su

 antígeno) o policlonales (sonespecíficos

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� Anticuerpos Policlonales

Anticuerpos Monoclonales

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� Par a la selección del antígeno

secundar io depende de la fuente dela que se haya obtenido el anticuerpopr imar io y del marca je que se desea obtener, par a obtener esto se utiliza 

biotina, fluoroforos o enzimas

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� Par a utilizar fluoroforos se necesita unequipo especial par a observar la 

fluorescencia� Par utilizar enzimas se necesitan algunos

pasos extr a y son más sensibles las que seutilizan son: la fosfatasa alcalina y la 

peroxidasa de rábano que producen luz fluorescente o solo liber an luz.

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� Los sustr atos que se pueden utilizar dependen de la respuesta que se

desea obtener como fluorescencia oquimioluminicidad se utilizan junto con

la enzima y combinados se

tr ansfor man en productos coloreadosque actúan sobre la membr ana y el

mas utilizado es el naftol

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� Par a captur ar de los datosgener ados en un Western Blot se

utilizan cámar as CCD refr iger adaso las películas de autor adiogr afí ay su venta ja es la manipulación en

tiempo real de las imágenes

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