Imuno analisis, Western blot , ELISA

INTAN PIRANTI NAHAROTULNURUL EKY MEYANAOSSIE STEFFIANI S.

Imuno AnalisisImmunoassay mendeteksi

protein yang diproduksi dalam sel menurut informasi kode oleh

transgenik (GMO) DNA

Roundup Ready GM kedelai telah direkayasa secara genetik resisten

terhadap herbisida Roundup glyphosate melalui penyisipan gen yang mengkode

versi toleran glifosat dari enzim tanaman, CP4 EPSPs.

Injeksi pertama(3 minggu interval)

↓Injeksi Kedua - Tes pertama berdarah untuk

penilaian titer serum(3 minggu interval)

↓Injeksi Ketiga - Tes kedua darah

(3 minggu interval)↓

Injeksi Keempat – Tes Ketiga darah(3 minggu interval)

↓Booster injeksi

(1 minggu interval)↓

Tidak ada injeksi lanjut - tes Keempat darah

ATURAN IMUNISASI

Tujuan dari dilakukan tes darah berulang – ulang adalah Untuk mengukur tingkat antibodi dalam

darah dimana merupakan refleksi dari pengalaman masa lalu tubuh atau paparan antigen, atau

sesuatu yang tubuh tidak mengakui sebagai diri. Setiap sel hidup memiliki penanda protein

berbeda pada antigen permukaan disebut nya, dan sistem kekebalan tubuh mengidentifikasi sel-sel yang bukan bagian dari struktur oleh orang-

protein permukaan.

ANTIBODI ANTIGEN• Protein globulin gamma

yang bereaksi secara spesifik dengan antigen yang jumlahnya mencapai 20% dari total protein dalam plasma darah

• Sebuah zat yang merangsang respon imun, terutama dalam menghasilkan antibodi. Antigen biasanya berupa protein atau polisakarida, tetapi dapat juga berupa molekul lainnya, termasuk molekul kecil (hapten) yang bergabung dengan protein-pembawa atau carrier.

Analisis Protein secara imunologi

Western Blot dan ELISA

Antibodi dan antigen ini akan saling berikatan. Berdasarkan kespesifikan ikatan antigen dan antibodi dapat diketahui dengan menggunakan teknik imunologi yang sudah dikembangkan, seperti ELISA dan Western Blot.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) merupakan suatu uji biokimia yang digunakan untuk mendeteksi

keberadaan antibodi atau antigen dalam suatu sampel dengan pelabelan enzim yang biasa disebut enzim

immunoassay

Western Blot dipercaya sebagai sarana untuk melakukan screening antibodi terhadap agen virus

A C

BD

MACAM ELISA

TEKNIK ELISA

KELEBIHAN KEKURANGAN ELISA

KELEBIHAN• Teknik pengerjaan relatif sederhana• Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang

digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

• Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.• Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan

antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)

• Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

KEKURANGAN• Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik

ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

• Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

• Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

• Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

BLOTSuatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.

Metode penelitian dengan cara blot ada beberapa yaitu :Western Blot, Eastern Blot, Southern Blot , dan Northern Blot.

Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu iazophenylthioeter (DPT).

Keuntungan teknik blot adalah ;

a. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks. b. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan. c. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat.d. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis. e. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai 

WESTERN BLOTTeknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi.

.Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

SDS-PAGE Western Blot Method

-

--

-

-

Cells in Culture

Cell Removal

Human Cells Containing Protein

Cell Lysis by Detergents and

Sonication

Heat Denaturation of

Proteins

+

-Load Proteins on Gel

SDS or

LDS

Apply Electric Current

- - -

- -

Proteins Separate by Size

Detergents Bind Proteins

--

-

--- - -

--

- - -

- - Transfer or Blot Protein from Gel to

Nitrocellulose and/or PVDF Membrane

- - -

- -

Block Membrane with Non-

Specific Proteins

- - -

- -

- - -

- -

Incubate Membrane with 1o Antibody

1o Antibody Binds Antigen (i.e. Protein of Interest)

Non-Specific Proteins Bind to Unbound Regions of

Membrane

1o Antibody is a Rabbit Anti-Human b-Actin

Antibody

- - -

- -

- - -

- -

Add HRP-Conjugated 2o Antibody

- -

HRP

Luminol LightDetected by Film

Add Chemiluminescent

Substrate

2o Antibody is a Goat Anti-Rabbit-HRP-

Conjugated Antibody

b-Actin

Magic Mark XP Western Protein

Standard

2030405060

45

kDa

Invitrogen.com

Interpretasi hasil Western Blot dan ELISA

Pengertian parameter-parameter tersebut adalah sebagai berikut:Sensitifitas adalah kemampuan dari suatu uji untuk mendeteksi sejumlah kecil yang dianalisa.Spesifisitas adalah kemampuan dari uji tersebut untuk mengidentifikasi semua sampel yang tidak mengandung antibodi (tidak memberikan hasil positif palsu).Nilai Prediksi Positif adalah frekuensi dari sampel dengan Western Blot (+) diantara seluruh sampel dengan ELISA (+).Nilai Prediksi Negatif adalah frekuensi dari sampel dengan Western Blot (-) diantara seluru sampel dengan ELISA (-).

• Selain itu, terdapat nilai terhadap hasil positif palsu dan negatif palsu yaitu :

• Nilai Positif Palsu berarti prosentase perbandingan antara hasil ELISA (+) dan Western Blot (-) dengan seluruh hasil Western Blot (-).

• Nilai Negatif palsu berarti prosentase perbandingan antara hasil ELISA (-) dan Western Blot (+) dengan seluruh hasil Western Blot (+).