portal.szspraha1.czportal.szspraha1.cz/szs/portal.nsf/0/1f64730db385b295c... · web viewpříprava...
TRANSCRIPT
Příprava polyklonálních protilátek proti proteinu Human
Adiponectin
Absolventská práce
Eva Bače
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola
Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant
Vedoucí práce: Mgr. Daria Strouhalová, PhD.
Datum odevzdání práce: 16.4.2011
Datum obhajoby: 20. - 22.6. 2011
Praha 2011
Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny
jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů
informací.
Praha 5. dubna 2011
Děkuji Mgr. Darii Strouhalové, PhD. za odborné vedení a velkou pomoc při sepisování
absolventské práce. Dále děkuji Ing. Lence Veselé za pomoc s digitalizací laboratorních
výsledků a Michaele Grmolcové za technickou podporu. Děkuji také za vstřícný přístup a
možnost tuto absolventskou práci zpracovat v rámci společnosti BioVendor – Laboratorní
medicína a.s.
Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých
informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo
nábřeží 6.
ABSTRAKT
Bače Eva
Příprava polyklonálních protilátek proti proteinu Human Adiponectin
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: Mgr. Daria Strouhalová, PhD.
Absolventská práce, Praha: VOŠ a SZŠ, 2011, 79 stran
Nedávno objevený protein, lidský Adiponectin, je složen z 244 aminokyselin, je fyziologicky
aktivní a specificky exprimovaný tukovými buňkami. V krevním séru byl nalezen
Adiponectin ve formě homotrimerů, které tvoří jeho vyšší formy, komplexy. Adiponectin
působí prostřednictvím dvou receptorů, AdipoR1 (hojně exprimovaný v kosterních svalech) a
AdipoR2 (exprimovaný převážně v játrech). Hladiny Adiponectinu exprimované tukovou
tkání jsou nepřímo úměrné stupni obezity. Nízké hladiny Adiponectinu jsou spojovány
s inzulinovou rezistencí a onemocnění Diabetes Mellitus typ 2, s ischemickou chorobou
srdeční, s aterosklerózou a potenciálně i s nádorovým onemocněním. Imunizací podle
imunizačního schématu byla připravena králičí a ovčí polyklonální protilátka proti proteinu
Human Adiponectin. Následně byla zvířatům odebrána krev, ze které byly purifikovány
polyklonální protilátky metodou afinitní purifikace. Funkčnost králičí a ovčí polyklonální
protilátky byla ověřena pomocí metod jako je nepřímá ELISA, Western blot v redukčním
a neredukčním prostředí a metodou imunohistochemie.
Klíčová slova: Lidský Adiponektin, Obezita, Metabolický syndrom, Diabetes Mellitus typ 2,
Polyklonální protilátka, Western blot
ABSTRACT
Bače Eva
The Preparation of Polyclonal Antibodies against the Human Adiponectin Protein
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: Mgr. Daria Strouhalová, PhD.
Absolventská práce, Praha: VOŠ a SZŠ, 2011, 79 stran
The Human Adiponectin is a recently discovered 244 aminoacid protein, which is
physiologically active and specifically and highly expressed in adipose cells. Adiponectin
forms homotrimers, which are the building blocks for higher order complexes found
circulating in human serum. Adiponectin acts through two receptors, AdipoR1 (abundantly
expressed in skeletal muscle) and AdipoR2 (predominantly expressed in the liver). Adipose
tissue-expressed Adiponectin levels are inversely related to the degree of adiposity. Low
serum Adiponectin levels are associated with insulin sensitivity and type 2 Diabetes, coronary
artery disease, Atherosclerosis and potentionally even cancers. The rabbit and sheep
polyclonal antibodies against the Human Adiponectin protein were performed according to
the immunization schedule. The animals blood was collected and purified by the afinity
purification method to obtain polyclonal antibodies. The functionality of rabbit and sheep
polyclonal antibodies was verified by using methods like an indirect ELISA, Western blot
in reduced and non-reduced conditions and Immunohistochemistry.
Klíčová slova: Human Adiponectin, Obesity, Metabolic syndrome, Type 2 Diabetes,
Polyclonal antibody, Western blot
6
OBSAH
1.1 Charakteristika a výskyt Adiponectinu...........................................................................101.1.1 Úloha Adiponectinu v organismu.............................................................................121.1.2 Adiponectin a receptory AdipoR1 a AdipoR2..........................................................131.1.3 Adiponectin a T-Cadherin........................................................................................131.1.4 Adiponectin a inzulin...............................................................................................131.1.5 Adiponectin a inzulinová rezistence a Diabetes mellitus.........................................131.1.6 Adiponectin a kardiovaskulární komplikace obezity...............................................141.1.7 Adiponectin a hypoxie.............................................................................................151.1.8 Adiponectin a zánět..................................................................................................151.1.9 Adiponectin a oběhový systém................................................................................161.1.10 Adiponectin a metabolický syndrom......................................................................171.1.11 Adiponectin a dyslipidemie....................................................................................171.1.12 Adiponectin a polycystický ovariální syndrom .....................................................171.1.13 Adiponectin a onemocnění jater.............................................................................181.1.14 Adiponectin a metabolismus kostí.........................................................................191.1.15 Adiponectin a nádorová onemocnění.....................................................................19
1.2 Laboratorní diagnostika .................................................................................................211.2.1 Imunitní odpověď.....................................................................................................211.2.2 Imunoglobuliny........................................................................................................221.2.3 Imunizace zvířat.......................................................................................................251.2.4 Purifikace protilátek.................................................................................................261.2.5 Elektroforéza............................................................................................................271.2.6 Western blot..............................................................................................................291.2.7 ELISA......................................................................................................................311.2.8 Imunohistochemie....................................................................................................32
2. MATERIÁL A METODIKA.................................................................................................342.1 Imunizace........................................................................................................................34
2.1.1 Příprava antigenu.....................................................................................................352.1.2 Vlastní imunizace zvířat...........................................................................................352.1.3 Odběr krve................................................................................................................36
2.2 Zpracování krve..............................................................................................................372.3 Testování imunních sér...................................................................................................37
2.3.1 Vazba desek pro test nepřímá ELISA - vazba antigenu na desku............................382.3.2 Metoda nepřímá ELISA pro testování imunních sér................................................40
2.4 Purifikace polyklonálních protilátek...............................................................................422.5 Zpracování protilátek......................................................................................................42
2.5.1 Stanovení koncentrace bílkoviny (proteinu, protilátky) metodou BCA..................422.5.2 Nepřímá ELISA pro testování vypurifikovaných polyklonálních protilátek...........44
2.6 Elektroforéza (ELFO).....................................................................................................452.6.1 Příprava polyakrylamidových gelů pro ELFO.........................................................452.6.2 Příprava vzorků........................................................................................................482.6.3 Vlastní elektroforéza................................................................................................492.6.4 Barvení gelu.............................................................................................................522.7.1 Transfer proteinů z polyakrylamidového gelu na PVDF membránu.......................532.7.2 Barvení proužků se standardy amidočerní...............................................................552.7.3 Imunodetekce membrán s navázaným proteinem....................................................56
3. SOUHRN, VÝSLEDKY.......................................................................................................594. DISKUSE..............................................................................................................................69
7
5. ZÁVĚR.................................................................................................................................736. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ZDROJŮ INFORMACÍ........................................747. PŘÍLOHY.............................................................................................................................79
8
1. ÚVOD
Obezita a s ní spojená chronická a zhoubná onemocnění, která se vyskytují stále častěji, jsou
v současné době jedním z hlavních problémů řešených v lidské populaci. Z výsledků
výzkumu vědců vyplývá, že obezita je spojena s arteriální hypertenzí, koronární
aterosklerózou, se zánětlivými stavy, inzulinovou rezistencí a metabolickým syndromem, DM
typ 2 (Diabetes Mellitus typ 2) a i se zvýšeným výskytem nádorových onemocnění.
Pro kategorizaci obezity se používá buď výpočet Body Mass Index (BMI) nebo pro zjištění
abdominální obezity měření poměru obvodu pasu a boků tzv. Waist-to-Hip Ratio (WHR).
Obezita je podle WHR definována hodnotou 0,9 a více a podle BMI je obezita definována
jako BMI větší než 30 kg/m2 , zatímco nadváha jako BMI větší než 25 kg/m2 [16]. Tuková
tkáň byla dříve považována pouze jako zásobárna energie organismu, ale polovině v 90. let
20. století byla prokázána její další funkce a to, že produkuje hormony. Proto se v současné
době tuková tkáň považuje za endokrinní orgán.
Tuková tkáň se dělí na bílou tukovou tkáň a hnědou tukovou tkáň. Bílá tuková tkáň se dále
dělí na:
a) subkutální tukovou tkáň - ukládají se sem přebytečné kalorie pro použití v případě
potřeby organismu
b) viscerální tukovou tkáň - slouží k zásobování vnitřních orgánů energií
Rozdíly mezi oběma typy tukové tkáně jsou:
a) v mobilizaci lipidů - adipocyty syntetizují lipidy
b) produkci adipokinů (hormonů tukové tkáně) - syntetizují a uchovávají protizánětlivé
a zánětlivé cytokiny
c) diferenciaci adipocytů (buněk tukové tkáně)
Oba typy tukových tkání hrají důležitou roli v metabolismu celého organismu [13].
Většinu hormonů tukové tkáně produkuje bílá tuková tkáň, hnědá tuková tkáň je méně
metabolicky aktivní [16].
První objevený hormon tukové tkáně se nazývá Leptin a je řazen mezi cytokiny. Reguluje
příjem potravy. Leptin se váže na buňky přes specifické receptory, a tak ovlivňuje aktivitu
buněk. U zdravé populace se koncentrace Leptinu v séru pohybuje v rozmezí 4 – 16 ng/ml,
u obézních jedinců se tato hladina signifikantně zvyšuje, zatímco u hladovějících nebo
podvyživených jedinců hladina Leptinu velmi klesá, často ji není ani možno detekovat [16].
Další hormony tukové tkáně, které bývají spojovány s obezitou a tedy i metabolismem
glukózy, jsou např. Resistin, Chemerin, Visfatin, Omentin [32].
Jedním z nejdůležitějších adipokinů, který reguluje metabolismus glukózy a metabolismus
tuků je Adiponectin.
1.1 Charakteristika a výskyt AdiponectinuLidský Adiponectin je protein, který lze v literatuře najít i pod názvy Acrp30, GBP28
(Gelatine binding protein 28 kDa) nebo AdipoQ. Tento protein produkují adipocyty bílé
tukové tkáně a v menší míře i adipocyty hnědé tukové tkáně [16, 21]. V krvi zdravého člověka
se Adiponectin vyskytuje v rozmezí 0,5 – 30 μg/ml [16, 21] a podílí se 0,01% na zastoupení
všech proteinů v plasmě [30]. Existují rozdíly mezi hladinami adipokinů, a tedy
i Adiponectinu, u mužů a u žen – vysvětlením je rozdílné procento tělesného tuku mužů
(cca 25%) a žen (cca 30%) [16]. Na rozdíl od Leptinu zde platí opačná závislost. U obézních
jedinců se vzhledem k jedincům s normální hmotností u obézních jedinců se hladiny
Adiponectinu signifikantně snižují.
Gen kódující Adiponectin je lokalizován na chromozomu 3q27. Mutace tohoto genu vede
např. k. hypoadiponectinemii (snížená koncentrace Adiponectinu v séru).
Gen lidského Adiponectinu se sestává ze tří exonů a jednoho intronu. Adiponectin jako
protein tvoří globulární a fibrilární formu. Fyziologicky aktivní molekula Adiponectinu
obsahuje posttranslační modifikace jako hydroxylace, glykosylace a sialyzace, které jsou
zodpovědné za stabilitu molekuly a sekreci Adiponectinu z buňky [33, 34].
Protein Adiponectin je tvořen celkem 244 aminokyselinami a rozlišují se zde části viz Obr.1:
N-terminální hypervariabilní oblast (včetně signální sekvence), kolagenní doména
a C- terminální doména, která je homologní s C1q složkou komplementu [16, 21].
Obr. 1 Strukturální oblasti proteinu Human Adiponectin; modifikováno dle [34]
K expresi Adiponectinu dochází ve střední fázi adipogeneze (proces vzniku a dozrávání
adipocytů). V lidské plasmě se Adiponectin vyskytuje ve více formách. V krvi byl
Adiponectin prokázán ve formě trimeru (90 kDa) a hexametru (180 kDa) [10, 21], zatímco
monomerní forma Adiponectinu (30 kDa) nebyla za nativních podmínek nikdy detekována
[38]. Forma monomerní, trimerní a hexamerní bývá v literatuře též označována jako LMW
(Low Molecular Weight) Adiponectin. Dalšími formami prokázanými v krvi jsou HMW
(High Molecular Weight), což jsou multimery Adiponectinu s teoretickou molekulovou
hmotností více než 400 kDa viz Obr. 2 [25, 30]. Jednotlivé formy Adiponectinu jsou tvořeny
monomerními jednotkami Adiponectinu spojené pomocí disulfidických můstků. [16, 10, 21].
Různé formy Adiponectinu mohou mít různou biologickou aktivitu. Jako biologicky
nejaktivnější bývají považovány zejména hexametry a multimery [20, 21, 34].
Obr. 2 Schématické znázornění forem (multimerů) Adiponectinu a vazbu disulfidických
můstků; modifikováno dle [34]
1.1.1 Úloha Adiponectinu v organismu
Adiponectin se v organismu podílí na mnoha biochemických reakcích a biologických
procesech, které mohou být vzájemně propojeny.
Snížená hladina Adiponectinu v těle (Hypoadiponectinemie) se může spolupodílet na rozvoji
závažných onemocnění jako např. DM typ 2, hypertenze, ateroskleróza (viz Obr. 3). Naopak
vysoké hladiny Adiponectinu v krvi mohou být spolu s jinými biochemickými markery
důležitým signálem pro renální selhání, protože ledviny hrají hlavní roli metabolismu
a vylučování Adiponectinu [7, 21].
Obr. 3 Onemocnění způsobená hypoadiponectinémií (DM, Diabetes Mellitus; Hypertension,
arteriální hypertenze; Aterosclerosis, ateroskleróza; Cardiac Dysfunction, srdeční selhání;
NASH, nealkoholická steatohepatitis; Cancers, rakovina); modifikováno dle [24]
1.1.2 Adiponectin a receptory AdipoR1 a AdipoR2
Adiponectin působí přes vazbu na specifické receptory AdipoR1 a AdipoR2 popsané už v roce
2003 [21]. Oba tyto receptory jsou produkovány bílou i hnědou tukovou tkání, ale byly
detekovány také např. v hypothalamu [10, 21, 42]. Oba receptory jak AdipoR1, tak AdipoR2,
obsahují sedm transmembránových domén s intracelulární N-terminální doménou
a extracelulární doménou. Tyto receptory se účastní metabolismu lipidů včetně oxidace
mastných kyselin [26]. Receptor AdipoR1 je receptor specifický pro globulární formu
Adiponectinu a ve velkém množství se exprimuje v kosterním svalstvu [31]. Receptor
AdipoR2 se exprimuje v játrech a váže se s fibrilární i globulární formou Adiponectinu [10,
21, 42].
1.1.3 Adiponectin a T-Cadherin
Byla prokázána vazba oligomerních a fibrilárních forem Adiponectinu na molekulu
T - Cadherinu (protein, který se vyskytuje na různých typech buněk ), hlavně ve svalech nebo
myokardu [10].
1.1.4 Adiponectin a inzulinSekrece Adiponectinu je regulována hlavně inzulínem, TNFα (Tumor Necrosis Factor α)
a katecholaminy. Inzulín stimuluje sekreci Adiponectinu, zatímco TNFα významně jeho
sekreci potlačuje, a katecholaminy navozují inzulínovou rezistenci. TNFα koreluje s BMI
a hyperinzulinemií (zvýšená hladina inzulinu na počátku DM typ 2) [32].
Další faktory, které inhibují produkci Adiponectinu jsou IL-6 (Interleukin-6), glukokortikoidy
a ET-1 (Endothelin-1) [21]. IL-6 indukuje zánět nejen v endotelu a buňkách jater, ale také
v tukové tkáni [13]. Hladina IL-6 se zvyšuje: u obézních jedinců, při inzulinové rezistenci
a při chronickém zánětu u DM typu 2 [32].
1.1.5 Adiponectin a inzulinová rezistence a Diabetes mellitus
Inzulinová rezistence je definována jako stav, kdy β buňky slinivky břišní produkují
nedostatečné množství inzulinu, a tím je snížena funkce inzulinu v organismu. Je postižen
metabolismus odbourávání glukózy, metabolismus tuků a proteinů a taktéž diferenciace a růst
buněk, včetně endotelu [4]. Porucha funkce β buněk může způsobovat i např. lipotoxickou
apoptózu způsobenou ceramidy - adiponectin zde působí protektivně proti akumulaci
ceramidů [14]. Inzulinová rezistence může být podmíněna geneticky nebo získána během
života [4].
Hladiny Adiponectinu v krevním oběhu pozitivně korelují s inzulinovou senzitivitou.
Adiponectin stimuluje aktivaci AMPK (Adenosin monofosfát proteinkináza), ta stimuluje
fosforylaci acetyl CoA karboxylázu, a tím oxidaci volných mastných kyselin, a taktéž
stimulaci metabolismu glukózy a laktátu včetně redukce enzymů tvořených při
glukoneogenezi v játrech. Výsledkem je redukce hladiny glukózy [6, 36]. Vysoké koncentrace
Adiponectinu mohou pravděpodobně souviset se sníženým rizikem vzniku inzulinové
rezistence.
Do současné doby není známo, která z izoforem Adiponectinu je zodpovědná za rozvoj
inzulinové rezistence. Touto otázkou se zabývala několik studií jako např. multicentrická
studie obézních žen, která popisuje podávání nízkokalorické diety obézním ženám a měření
zastoupení nízko (trimery), středně (hexamery) a vysokomolekulárního (oligomery)
Adiponectinu u těchto žen před dietou, v průběhu a po dietě. Tato studie prokázala pouze
změnu zastoupení nízkomolekulárních forem Adiponectinu asi o 16,3 % (oproti stavu před
dietou). V zastoupení středně a vysokomolekulárních forem Adiponectinu nebyla zjištěna
žádná změna [30].
U osob s DM typ 2. byla popsána snížená exprese Adiponectinu v tukové tkáni (asi o 45%)
vzhledem ke zdravým jedincům [36]. V krvi osob s DM typ 2 byly rovněž prokázány nižší
koncentrace Adiponectinu na rozdíl od osob, které tímto onemocnění netrpí [6].
1.1.6 Adiponectin a kardiovaskulární komplikace obezity
Významným je rovněž vztah mezi Adiponectinem a PAI-1 (inhibitor aktivátoru
plasminogenu) a TNFα. PAI-1 je distribuován z mnoha regionů: játra, bílá tuková tkáň
a vaskulární endotel a v kombinaci s inzulinem a triglyceridy tlumí expresi Adiponectinu
v adipocytech bílé tukové tkáně. Výsledkem může být obezita s kardiovaskulárními
komplikacemi metabolického syndromu viz Obr. 4. TNFα se podílí na regulaci exprese PAI-1
a tím nepřímo na regulaci hladin Adiponectinu [27].
Obr. 4 Dysfunkční tuková tkáň při obezitě. FFA, volné mastné kyseliny; IL-6, Interleukin - 6;
MCP-1, Monocyte chemoattractant protein; PAI-1, inhibitor aktivátoru plasminogenu;
TNFα, Tumor necrosis factor α; modifikováno dle [18]
1.1.7 Adiponectin a hypoxie
Důležitým faktorem působícím tukovou tkáň je zásobování kyslíkem. V případě hypoxie,
tj. nedostatečné zásobování tukové tkáně kyslíkem, dochází ke změnám, které významně
ovlivňují metabolické pochody v organismu. Při normálním zásobování kyslíkem produkují
mitochondrie ATP (Adenosin trifosfát) a jeho syntéza je dokončena v cytosolu buňky. Pokud
dochází k hypoxii, funkce mitochondrií je snížena, a zvyšuje se glykolytická aktivita buňky.
Buňka se ale snaží kompenzovat inhibici mitochondrií. Výsledkem je zvýšená produkce
laktátu, to vede ke snížení pH v buňce (tkáni). Zvýšená koncentrace laktátu je rovněž
i indikátorem tkáňové hypoxie. Hlavním mediátorem inhibice mitochondrií je transkripční
faktor HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor Alpha), který se vyskytuje pouze v jádře buňky.
Množství HIF-1α je v normálních podmínkách rychle degradováno v proteozomu, ale při
hypoxii se jeho hladiny významně zvyšují [41]. Ve stavu hypoxie může v tukové tkáni
vzniknout zánět spolupůsobením prozánětlivých cytokinů TNFα a IL-6 a IL-8 (Interleukin-8)
[13].
1.1.8 Adiponectin a zánět
Prozánětlivé cytokiny (TNFα a IL-6 a IL-8) nejsou produkovány přímo adipocyty,
ale dostávají se do tukové tkáně spolu s makrofágy v procesu vzniku zánětu [13], kdy
vznikající nekrotické buňky podporují zvýšenou infiltraci makrofágů do tukové tkáně [41].
V tukové tkáni se vyskytují dva typy makrofágů: tkáňové (alternativně aktivované)
a zánětlivé. Ve viscerální tukové tkáni se vyskytuje vyšší počet makrofágů než v subkutální
tukové tkáni [13]. Při zánětu se také zvyšuje exprese adhezivní molekuly VCAM-1 (Vascular
Cell Adhesion Molecule - 1), ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule - 1) a molekuly
E - selectin. Makrofágy exprimují receptory MSRA (Macrophage Scavenger Receptor type
A), které modifikují lipoproteiny a mění adipocyty na tzv. pěnové buňky. Pěnové buňky
formují aterosklerotický plak. V případě odloučení části nebo celého aterosklerotického plaku
hrozí komplikace trombózy [19]. Adipocyty mohou zvětšit svůj obsah až na 0,7 – 0,8 μg
lipidů. Velké adipocyty jsou lipolytické a více rezistentnější k inzulinu a produkují více
zánětlivých cytokinů, ale méně Adiponectinu [13]. Adiponectin inhibuje vznik pěnových
buněk, protože reguluje akumulaci lipidů, inhibuje produkci MSRA, snižuje katalýzu
esterifikovaného cholesterolu a podporuje sekreci protizánětlivých cytokinů např. IL-10
(Interleukin-10) a tkáňového inhibitoru metaloproteázy-1, a tím pomáhá stabilizovat
aterosklerotický plak proti ruptuře [21, 24].
Inhibice produkce Adiponectinu je často spojována s výskytem chronického zánětu
u obézních.
1.1.9 Adiponectin a oběhový systém
Zánět se rovněž podílí na rozvoji angiogeneze a u obézních jedinců může vést až ke koronární
ateroskleróze. Glomerulární forma Adiponectinu potlačuje migraci koronárních arteriálních
endoteliálních buněk indukovaných endoteliálním růstovým faktorem [10]. Další látky
ovlivňující angiogenezi, mimo Adiponectin, jsou: angiotensinogen, lipoproteinová lipáza,
adipsin, IL-6, prostaglandin, TNFα a oxid dusný [11].
Byla prokázána korelace hladin Adiponectinu v plasmě s mikrovaskulárními komplikacemi
u diabetiků a také zvýšené hladiny Adiponectinu v moči diabetiků s nefropatií způsobenou
mikrovaskulárními komplikacemi [10].
Adiponectin přímo ovlivňuje i kardiomyocyty (buňky srdečního svalu) a to tak, že působí
antiapoptoticky (brání buněčné smrti), a tím je chrání [10]. Při infarktu myokardu je
redukována exprese receptoru AdipoR1 (viz kap. 1.1.2), a tím je omezena vazba
Adiponectinu. Ve stavu po infarktu Adiponectin redukuje rozsah apoptózy a produkci TNFα,
a tím redukuje hypertrofii a tvorbu fibrózní tkáně v myokardu [21].
Hladina vysokomolekulární formy Adiponectinu v krvi dává vyšší vypovídací schopnost
v prognostice faktoru pro selhání srdce, než stanovení množství celkového Adiponectinu
v krvi [21].
1.1.10 Adiponectin a metabolický syndrom
Metabolický syndrom je stav, který je charakterizován obezitou spojenou s hypertenzí,
dyslipemií, glukózovou intolerancí a inzulínovou rezistencí [13]. Vlivem působení všech výše
zmíněných faktorů současně vede k rozvoji DM typu 2 a kardiovaskulárních onemocnění [4,
13].
Podle definice WHO (Word Health Organization) z roku 1999 pro diagnózu metabolického
syndromu musí být splněna následující kritéria: WHR > 0,90 cm u mužů a >0,85 cm u žen,
množství triglyceridů v séru ≥ 1,7 mmol/l nebo koncentrace HDL (High Density Lipoprotein)
˂ 0,9 mmol/l u mužů a ˂ 1,0 mmol/l u žen, exkreci albuminu v moči >20 ng/min (30 mg/g
kreatininu) a krevní tlak ≥ 140/90 mmHg [4, 39]. V roce 2005 byla tato kritéria upravena IDF
(International Diabetes Federation) novou definicí, která zohledňuje tyto parametry pro různé
etnické skupiny [4].
S metabolickým syndromem je dále spojován polycystický ovariální syndrom a nealkoholická
steatóza jater. Snížené množství Adiponectinu pravděpodobně hraje důležitou roli při vzniku
metabolického syndromu [36].
Incidence metabolického syndromu se zvyšuje s věkem – výskyt metabolického syndromu lze
očekávat u osob nad 50 let věku. Postihuje více než 40% populace v USA a kolem 30%
populace v Evropě [4].
1.1.11 Adiponectin a dyslipidemie
Inhibice lipolýzy v tukové tkáni, která je vyvolaná inzulinovou rezistencí, vede k vyššímu
výskytu volných mastných kyselin v plasmě a následně i v játrech [4].
Adiponectin se podílí na metabolismu HDL (High Density Lipoprotein) a LDL (Low Density
Lipoprotein) tak, že snížení hladiny Adiponectinu vede k akumulaci lipidů, ale také ke
zvýšení aktivity jaterní lipázy, která redukuje HDL na LDL [21].
1.1.12 Adiponectin a polycystický ovariální syndrom
Polycystický ovariální syndrom je běžná endokrinní abnormalita žen ve fertilním věku.
Z dostupných informací lze říci, že může být způsobena anovulací (nepřítomnost ovulace)
nebo oligoovulací (ovulace v delších časových intervalech než je obvyklé),
hyperandrogenismem (zvýšená hladina mužských pohlavních hormonů - androgenů)
klinickým nebo biologickým a polycystickou ovariální morfologií [4].
Zdá se, že inzulinová rezistence a kompenzační hyperinzulinemie hrají v této problematice
významnou úlohu, stejně tak jako obezita [40]. Některé studie naznačují, že u žen
s inzulinovou rezistencí a polycystickým ovariálním syndromem je snížená koncentrace
Adiponectinu v krvi [40]. Další studie uvádí snížení koncentrace Adiponectinu u žen
s polycystickým ovariálním syndromem, ve srovnání s ženami bez této diagnózy s různě
vysokým BMI [40]. U žen s polycystickým ovariálním syndromem, s ohledem na věk a BMI,
lze předpokládat riziko metabolického syndromu dvakrát vyšší než je u běžné populace [4].
1.1.13 Adiponectin a onemocnění jater
Dlouhodobá konzumace alkoholu vede ke steatóze jater, která je považována za první stádium
poškození jater a je charakterizována akumulací triglyceridů v hepatocytech (buňky jater).
Dalším stádiem poškození jater je vznik steatohepatitidy, která se projeví hepatomegalií
(zvětšení jater) a infiltrací leukocytů (neutrofilů, monocytů/makrofágů, T a B lymfocytů) do
jater. Až u 50 % pacientů s touto diagnózou, dochází k fibrózním změnám v játrech, a to
působením prozánětlivých cytokinů a kolagenu I. a III. Následně dochází k cirhóze jater, kdy
je funkce jater výrazně snížena a kdy hepatocyty nejsou schopny regenerace. Výsledkem je
totální selhání jater, které může vést buď úmrtí pacienta nebo k transplantaci jater.
Podobný průběh onemocnění nastává po nákaze hepatitidou typu C [23], často se vznikem
hepatocelulárního karcinomu v posledním stádiu onemocnění.
Funkce Adiponectinu v játrech není zatím úplně objasněna. Ví se ale, že působení etanolu
tlumí expresi Adiponectinu, a tím se zvyšuje produkce TNFα Kupferovými buňkami
stimulovanými lipopolysacharidy v játrech. Dlouhodobé působení alkoholu na Kupferovy
bunňky vede ke zvýšení jejich senzitivity k endotoxinům [23]. Poklesu exprese Adiponectinu
v tukové tkáni napomáhá také hyperhomocysteinemie (vysoké hodnoty homocysteinu v krvi)
vznikající působením etanolu [42].
Aplikace fyziologicky vysokých dávek Adiponectinu myším, které byly vystaveny
dlouhodobé expozici etanolu, prokázaly snížení exprese TNFα v játrech, včetně poklesu
steatóz. Protizánětlivý účinek Adiponectinu byl zjištěn u globulární i fibrilární formy
Adiponectinu [23].
Kromě alkoholické steatózy existuje i nealkoholická steatóza s podobnou patologií.
Zvýšenou prevalenci pro nealkoholickou steatózu představuje metabolický syndrom.
U 98 % pacientů s nealkoholickou steatózou došlo ke zvýšení lipolýzy, zvýšení hladiny
volných mastných kyselin v krevním oběhu a inhibici glukózy pocházející z glukoneogeneze.
Zvýšené koncentrace glukózy a inzulinu v krvi vedou k syntéze mastných kyselin, ale zároveň
tlumí odbourávání mastných kyselin β oxidací. Tento proces vede k rozvoji jaterní steatózy.
Mechanismus dalších reakcí – zvýšení TNFα a pokles Adiponectinu – je stejný jako
u alkoholické steatózy jater [4].
1.1.14 Adiponectin a metabolismus kostí
Kostní remodelaci mimo výživy a fyzické zátěže ovlivňují také adipokiny produkované
tukovou tkání. Z klinických studií vyplývá, že Adiponectin má jednoznačně negativní
osteotropní efekt. Jeho působením dochází ke zrychlené remodelaci kostí a výsledkem je
snížená kostní densita. Bylo prokázáno, že deficit Adiponectinu ovlivňuje remodelaci kostí
jak u rostoucího oraganismu, tak i v dospělosti. Tento negativní účinek Adiponectinu na
kostní metabolismus vysvětluje nízký výskyt osteoporózy a fraktur u obézních
a nedostatečného nárůstu kostní hmoty u dívek s mentální anorexií [43].
Adiponectin má vliv i na klouby. Zde působí jako prozánětlivý faktor a může způsobovat
degradaci matrix kloubu, tím že selektivně indukuje IL-6 a metaloproteázu-1, které jsou
dvěma hlavními mediátory onemocnění revmatoidní artritidy. Ve sledování hladin
Adiponectinu v synoviální tekutině u zdravých pacientů a pacientů s revmatoidní artritidou
byla prokázána vyšší hladina Adiponectinu u pacientů s revmatoidní artritidou.
Z tohoto pohledu jsou vysoké koncentrace Adiponectinu v krvi rizikovým faktorem pro lidské
kosti a rozvoj degenerativních onemocnění kloubů [12].
1.1.15 Adiponectin a nádorová onemocnění
Klinické studie naznačují vztah mezi rizikem vzniku karcinomu prsu, endometria, prostaty,
ledvin a kolorektálního karcinomu s hladinami Adiponectinu v plasmě. Snížené hladiny
Adiponectinu v plasmě obézních jedinců zvyšují riziko nádoru, taktéž výskyt metabolického
syndromu u obézních koreluje se vznikem nádoru více než pouze obezita [18].
Klíčovou roli při vzniku nádoru hraje dysfunkční tuková tkáň, která indukuje zánět a ten
se podílí na rozvoji rakoviny [18]. Mechanismus, kterým se Adiponectin může podílet
na karcinogenezi je spojen s metabolismem inzulinu. Nízké hladiny Adiponectinu způsobují
inzulinovou rezistenci, a tím zvýšené hladiny inzulinu, které zvyšují hladiny IGF-1 (Insulin-
like Growth Factor 1) [28]. IGF- 1 taktéž může inhibovat apoptózu a tím podporovat
proliferaci buněk v mnoha tkáních a tak pomáhat v rozvoji kacinogeneze [18, 28]. Zatímco
vysoké hladiny Adiponectinu (globulární a zejména fibrilární forma Adiponectinu) ovlivňují
chování nádorových buněk tak, že inhibují nádorový růst. Fibrilární forma Adiponectinu
rovněž podporuje inhibici buněčného růstu při podání Doxorubicinu, a tím umožňuje snížit
podávanou dávku tohoto léku, a tak snížit riziko výskytu systémové toxicity po jeho podání
[16]. Adiponectin také inhibuje TNFα, tím se podílí na změně působení TNFα na proliferaci
nádorových buněk a angiogenezi. Adiponectin je také důležitým negativním regulátorem
hematopoeze a imunitního systému [28].
Byla prokázána spojitost mezi hodnotou WHR a velikostí adenomu tlustého střeva:
WHR ≥ 1 cm je asociován s vysokým rizikovým faktorem pro velký adenom, zatímco
WHR ˂ 1 cm souvisí s adenomy menších velikostí [28].
U onemocnění kolorektálním karcinomem jsou měřeny vysoké hladiny IL-6, TNFα a CRP
(C reaktivní protein), které korelují s větší velikostí tumoru. Bylo prokázáno, že nízké hladiny
Adiponectinu u pacientů s nemetastazujícím kolorektálním karcinomem nepřímo souvisí
s růstem nádorů a mohou predikovat recidivu onemocnění [28].
Studie zabývající se vlivem obezity na vznik karcinomu prostaty přináší rozporuplné
výsledky, které lze interpretovat tvrzením, že obezita snižuje riziko vzniku neagresivního
karcinomu prostaty, ale naproti tomu může zvyšovat riziko agresivního karcinomu prostaty
[16].
Pro všechny typy nádorů se zvyšuje poměr relativního rizika úmrtí ve vztahu k BMI [21].
Role Adiponectinu v etiologii nádorů nebyla ještě zcela objasněna. Porozumění pochopení
patofyziologie vztahu mezi metabolickým syndromem a nádorovými onemocněními může
vést k novým postupům prevence a léčby nádorů.
1.2 Laboratorní diagnostika
1.2.1 Imunitní odpověď
Velmi důležitá pro mnoho imunologických laboratorních metod je schopnost imunitní
odpovědi organismu po vstupu vnějšího činitele, imunogenu (bakterie, viry, proteiny atd.).
Součástí imunitní odpovědi stimulované imunogenem, je tvorba specifických protilátek. Pro
laboratorní diagnostiku se používají specifické protilátky připravené imunizací zvířat (ovce,
kozy, králíci, krysy a myši).
Na vzniku specifických protilátek v těle se podílí buňky prezentující antigen (APC, Antigen
Presenting Cells), T lymfocyty a B lymfocyty. APC navážou imunogen a zpracují jej na
fragmenty, které pak předloží jako komplexy společně s molekulami hlavního
histokompatibilního komplexu třídy II. (MHC, Major Histocompatibility Complex class II.)
prekurzorům pomocných T buněk (Th, T helper cells) [15]. Aktivované Th buňky po
rozpoznání obou předložených struktur vylučují faktory, pomocí kterých řídí činnost ostatních
lymfocytů. Jedním z těchto faktorů je Il-2 (Interleukin-2), který aktivuje prekurzory
cytotoxických buněk (Tc, Cytotoxic T cells). Funkce Tc buněk je rozpoznat imunogeny na
cílových buňkách a podílet se na likvidaci imunogenu. Th buňky také poskytují diferenciační
signály a podporují růst B lymfocytů. B lymfocyty se přemění na plazmatické buňky, které
vytváří protilátky (imunoglobuliny).
Vnějším činitelem je imunogen – molekula navozující imunitní odpověď. Termín antigen
vyjadřuje schopnost molekuly navodit tvorbu protilátek a reaguje s protilátkami. Důležitou
charakteristikou imunogenu je jeho imunogenicita tj. schopnost vyvolat imunitní odpověď,
která je závislá na stavu, biologických a genetických vlastnostech příjemce. Čím je molekula
více rozmanitá a složitá a má vyšší molekulovou hmotnost, tím je více imunogenní. Z celé
makromolekuly se však pouze malá část účastní reakce s protilátkou. Tyto aktivní oblasti jsou
nazývány epitopy a může jimi být kterákoli oblast povrchu molekuly (imunogenu), jejíž
struktura je obnažená a přístupná. Na molekule imunogenu může existovat i více epitopů.
Struktura epitopu je důležitá pro vazbu a specifitu protilátky.
Za nejúčinnější imunogeny jsou považovány proteiny. Imunogenem může být také
nízkomolekulární sloučenina – Hapten, která není přímo imunogenní, ale stane se
imunogenem až po vazbě na proteinový nosič.
Po vpravení imunogenu do organismu dojde k reakci organismu (imunitní odpovědi), což je
řetězec reakcí, jejichž výsledkem je tvorba protilátek (imunoglobulinů) [37].
1.2.2 Imunoglobuliny
Imunoglobuliny (protilátky) tvoří přibližně 20% celkových proteinů séra. Protilátky jsou
heterogenní molekuly a lze je dobře určit elektroforeticky. Jejich základními
charakteristickými vlastnostmi jsou specifita pro daný antigen a rozmanitost specifit
umožňující reakci se širokou škálou antigenních struktur. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny
tvořené polypeptidy a cukry. Polypeptidický řetězec, který je součástí protilátky, nese většinu
jejích biologických vlastností. Polypeptidický řetězec obsahuje variabilní část na N konci
svého řetězce, zbytek molekuly je konstantní částí. Základní jednotka imunoglobulinu se
nazývá monomer a obsahuje 4 polypeptidové řetězce, z nichž 2 řetězce jsou označovány jako
lehké neboli L (nižší molekulová hmotnost) a 2 řetězce jsou označovány jako těžké neboli H
(asi 2x vyšší molekulová hmotnost než je molekulová hmotnost lehkého řetězce) viz. Obr. 3.
Imunoglobuliny složené z více monomerů se nazývají polymery (dimer, trimer atd.) a jsou
vázány disulfidovými vazbami, které jsou nezbytné pro trojrozměrné uspořádání. V rámci
prostorového uspořádání imunoglobulinu se zde vyskytuje oblast citlivá k působení enzymu
nebo chemických činidel viz Obr. 3. Tuto oblast nazýváme otočná, sklopná oblast („Hinge“).
Intramolekulární disulfidové můstky vytváří na řetězcích globulární oblasti. Molekula
imunoglobulinu obsahuje také vazebné místo, které je tvořeno malým počtem aminokyselin,
na toto místo se pak váže antigen viz Obr. 3 [37].
Obr. 5 Zjednodušený model molekuly imunoglobulinu IgG demonstrující čtyřřetězcovou
strukturu. Označení C přísluší konstantním oblastem označení V přísluší variabilním
oblastem. Místa štěpení molekuly působením pepsinu a papainu jsou vyznačeny
vlnovkami, disulfidické můstky interřetězcové a intrařetězcové jsou vyznačeny
symbolem -S-S-; modifikováno dle [37]
Imunoglobuliny se dělí na 5 základních tříd [37]:
a) třída IgG - tvoří asi 75 % celkových imunoglobulinů v lidském séru. Třída IgG se
skládá z podtříd IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4. Vzájemný poměr zastoupení zmíněných
podtříd IgG je dán geneticky. V séru se IgG vyskytuje jako monomer.
b) třída IgM – představuje asi 10 % celkových imunoglobulinů v lidském séru. IgM je
protilátkou časné imunitní odpovědi na většinu antigenů, protože je hlavním
imunoglobulinem přítomným na povrchu B lymfocytů. V séru se nachází převážně
jako pentamer.
c) Třída IgD – v lidském séru je přítomno asi 0,2 % z celkového množství
imunoglobulinů. Spolu s IgM je hlavním povrchovým imunoglobulinem přítomným
na B lymfocytech. Jeho základní funkce zatím nebyla zcela objasněna. Předpokládá
se, že se podílí na diferenciaci B lymfocytů. V séru se nachází jako monomer.
d) Třída IgA – její podíl je asi 15 % z celkových imunoglobulinů v lidském séru.
Základní funkcí IgA je zabránit vstupu viru do buněk hostitele, a tak působit jako
důležitý obranný mechanismus proti lokálním infekcím. IgA je součástí slizničního
imunitního systému a vyskytuje se zejména ve slinách, bronchiálním sekretu, nosní
mukózní tkáni, slizničních sekretech tenkého střeva, vaginálním sekretu s prostatické
tekutině. V séru se nachází jako monomer.
e) Třída IgE – na celkovém množství sérových imunoglobulinů se podílí pouze 0,004 %.
Je zodpovědná za alergické reakce a rovněž hraje významnou úlohu v obraně
organismu proti parazitárním infekcím. V séru se vyskytuje jako monomer.
Podle typu se protilátky mohou také dělit na polyklonální protilátky a monoklonální
protilátky.
Polyklonální protilátky
Antigeny mohou být velké a komplexní molekuly a každá jednotlivá protilátka se může vázat
jen na malou, specifickou část (epitop) antigenu. Účinná imunitní odpověď vyvolává produkci
mnoha různých protilátek (produkovaných mnoha různými B lymfocyty) proti stejnému
antigenu. Odtud termín „polyklon“ – slovo „poly“ znamená mnoho a slovo „klon“ znamená
větvení nebo pučení. Skupina buněk, která má původ v jedné „mateřské buňce“ se nazývá
klon. Protilátky produkované při polyklonální imunitní odpovědi se nazývají polyklonální
protilátky. Na rozdíl od monoklonálních protilátek, které jsou identické a reagují proti
jednomu epitopu, jsou polyklonální protilátky heterogennější, reagují s více epitopy jednoho
antigenu [37].
Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky jsou protilátky, které reagují pouze s jedním epitopem antigenu. Jsou
považovány za specifičtější. Monoklonální protilátka lze připravit metodou hybridizace.
Principem metody je spojení (fúze) buněk produkujících protilátky (B lymfocyty)
od imunizovaného zvířete, nejčastěji myši s linií nádorových buněk, které nesmí produkovat
vlastní imunoglobuliny. Produkt takové buněčné fúze nazýváme hybridom, který má vlastnost
B lymfocytu (produkuje protilátku proti danému epitopu) a vlastnost nádorové buňky
(schopnost růstu a množit se). Hybridom produkuje chemicky, fyzikálně i imunologicky
homogenní protilátky – monoklonální protilátky [37].
1.2.3 Imunizace zvířat
Imunizace je postup, pomocí kterého se v organismu určitého jedince vyvolává stav imunity.
Uskutečňuje se buď v přirozených podmínkách nebo během jeho života anebo záměrným
podáváním antigenů (oslabené nebo usmrcené mikroorganismy, proteiny atd.) – tzv. očkování.
Očkování může být aktivní (do organismu se vpraví antigen a organismus si sám vytváří
specifické protilátky a výkonné lymfocyty), anebo pasivní (do organismu se podají specifické
protilátky případně lymfocyty, které vznikly v jiném jedinci). Aktivní imunizace se provádí
za účelem ochrany před určitým infekčním onemocněním (prevence) nebo za účelem přípravy
specifických protilátek např. pro laboratorní použití, zatímco pasivní imunizace je obvykle
léčebný zásah do již probíhajícího onemocnění [8]. Pro účinek imunogenu je rovněž důležitá
dávka (množství) a způsob jeho podání. Možné způsoby imunizace jsou: intradermální (do
kůže), subkutální (do podkoží), intramuskulární (do svalu) nebo intravenózní (do žíly).
Pro intenzivnější imunitní odpověď se antigen míchán s tzv. adjuvans. Adjuvans prodlužuje
retenci imunogenu v organismu, zvětšuje jeho účinnost a stimuluje přísun makrofágů
a lymfocytů do místa aplikace. Imunizace zvířat se provádí v pravidelných intervalech, které
jsou popsány v imunizačních schématech. Imunizační schéma je přizpůsobeno druhu zvířete,
velikosti zvířete. Rovněž je přizpůsobená dávka aplikovaného antigenu a množství adjuvans.
Pro zvýšení imunitní odpovědí se v těchto imunizačních schématech imunizuje v několika
aplikacích, a to většinou subkutálně. Jako adjuvans se pro první aplikaci nejčastěji používá
kompletní Freundovo adjuvans, které obsahuje emulzi oleje a vody s přítomností usmrcených
mykobakterií, v jejichž buněčných stěnách byla prokázána složka s adjuvantními strukturami
MDP (muramyl dipeptid). Pro následné aplikace se pak používá inkompletní Freundovo
adjuvans – o stejném složení jako má kompletní Freundovo adjuvans, vyjma usmrcených
mykobakterií. Po proběhnutí celého imunizačního cyklu se na závěr zvířeti odebere krev, ze
které se získá antisérum (proti antigenu, kterým bylo imunizováno).
V průběhu imunizace po aplikaci první dávky antigenu dochází v organismu k rychlému
vzestupu produkce protilátek. Následnými imunizacemi se tato vysoká hladina protilátek ještě
dále zvyšuje. Vysoké hladiny protilátek přetrvávají v krvi i několik měsíců viz Obr. 6 [37].
Obr.6 Primární a sekundární imunitní odpověď dle [37]
1.2.4 Purifikace protilátek
Dalším krokem při získání polyklonální protilátky je proces purifikace.
Purifikace může být:
a) nespecifická - tj. purifikují se všechny imunoglobuliny ze séra pomocí proteinu G nebo
proteinu A vázaných na nosič – vlastností obou proteinů je schopnost vázat Fc fragment
protilátky. Výsledkem purifikace je směs protilátek, které jsou nespecifické vůči proteinu,
kterým bylo imunizováno.
b) specifická – kdy se protilátky purifikují pomocí specifického ligandu (proteinu použitého
k imunizaci) navázaného na nosič. Výsledkem je specifická protilátka proti danému proteinu.
U obou typů purifikace se protilátky vážou na protein reverzibilně. V procesu purifikace se
využívá se různé síly vazby mezi ligandem navázaným na nosič a protilátkou při různém pH.
Při neutrálním (nebo slabě zásaditém) pH se protilátka váže na ligand a při pH nízkém (tj. asi
pH 1) se ruší vazba mezi ligandem a protilátkou. V praxi se nejdříve při neutrálním (slabě
zásaditém) pH vyvážou protilátky ze séra na ligand (protein) navázaný na nosič. Následně
dojde k promytí nosiče s ligandem roztokem s neutrálním pH, tím se odstraní zbytky séra. Po
promytí za použití roztoku se s nízkým pH dojde k eluci a následnému záchytu
vypurifikovaných protilátek. Vypurifikovaná protilátka je dále testována dalšími
biochemickými metodami [2]. Pro skladování protilátky je vhodná koncentrace asi 1 mg/ml
v pufru s neutrálním pH. Protilátku lze dlouhodobě skladovat zmrazenou, opakovaným
zmrazením může dojít k denaturaci protilátek [9].
Funkčnost takto připravené polyklonální protilátky je třeba ověřit pomocí dalších
laboratorních metod jako je elektroforéza, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),
Western blot nebo Imunohistochemie (IHC).
1.2.5 Elektroforéza
Pro ověření identity proteinů (i protilátek) se používá metoda zvaná SDS-PAGE elektroforéza.
Je to elektroforéza s využitím polyakrylamidového gelu s obsahem SDS (sodium dodecyl
sulfát). Polyakrylamidový gel se vytvoří polymerací dvou hlavních složek: akrylamidu
a N,N – methylenbisakrylamidu. Jako katalyzátor reakce se přidává peroxodisulfát amonný
(NH4)2S2O8 a N,N,N′,N′-tetramethylethylendiamin (TEMED). Dle vzájemného poměru
akrylamidu a N,N – methylenbisakrylamidu vzniká gel s póry o definované velikosti, proto je
určující pro rychlost průchodu proteinu gelem: procentuální zastoupení akrylamidu v gelu,
vzájemný poměr akrylamidu a a N,N – methylenbisakrylamidu, použitý elektroforetický pufr
a velikost proteinu. [29].
Funkcí SDS je denaturace proteinů a schopnost obalit protein, který tím získá negativní náboj.
Konečný náboj proteinu po vazbě s SDS je vždy negativní. Vazba SDS na proteinový řetězec
je 1,4 g SDS na 1,0 g proteinu [29]. Molekuly proteinů se pak pohybují v gelu na základě
velikosti ve směru elektrického gradientu. Proteiny o malé molekulové hmotnosti se pohybují
rychleji než proteiny s velkou molekulovou hmotností [2].
Elektroforeticky rozdělené proteiny v gelu je možné následně vizualizovat pomocí barvení
např. stříbrem, Amidočerň, Comassie Blue.
Pro přípravu a provedení elektroforézy se používá řada modifikací, jednou z nejčastěji
využívaných modifikací je modifikace podle Laemmliho [3]. SDS-PAGE se standardně
provádí ve vertikální elektroforetické vaně se speciálním zdrojem viz. Obr. 8 a Obr. 9.
Obr.8 Aparatura pro vertikální elektroforézu (zleva: stojan na nalévání gelu, rám k
upevnění skel, plastový hřebínek, skla pro vertikální elektroforézu, pomůcka k
aplikaci vzorku, upínací rám s elektrodami, elektroforetická vana); modifikováno
dle [35]
Obr.9 Obrázek způsobu nanášení vzorku na gel umístěný v aparatuře vertikální
elektroforézy; modifikováno dle [1]
1.2.6 Western blot
Metoda Western blot se používá pro detekci proteinů rozdělených pomocí elektroforézy
v polyakrylamidovém gelu a následně přenesených na speciální membránu pomocí
elektroforetického transferu. V této metodě se používá speciální membrána vyrobená
z nitrocelulózy nebo PVDF (polyvinyl difluorid). Nitrocelulózová membrána má vysokou
vazebnou kapacitu (249 μg/cm2) a malé póry, proto se hodí pro analýzu proteinů o malé
velikosti. Nitrocelulózová membrána může být do blotovacího pufru položena suchá,
po provedení Western blotu barvena mnoha z barvících postupů pro proteiny. Nelze ji použít
v kombinaci s organickými činidly. PVDF membrána má sice vazebnou kapacitu nižší
(172 μg/cm2), ale je mechanicky odolnější a vhodná pro imunobloty s imunodetekcí (detekce
protilátkou). Před vložením do blotovacího pufru je nezbytné PVDF membránu smočit
v methanolu.
Gel s elektroforeticky rozdělenými proteiny se položí na speciální membránu a následně se
vsune do blotovací cely. Za působení elektrického napětí a speciálního pufru dojde k přenosu
proteinu z gelu na membránu (membrána je otiskem gelu). Pro efektivní transfer v rámci 1-3
hodin by mělo být aplikováno 5-10 V/cm-1 [9]. Z polyakrylamidového gelu se působením
blotovacího roztoku a napětí proteiny uvolní, zbaví zbytků z gelu (SDS, glycin) a adsorbují na
membránu. Součástí blotovacího pufru pro PVDF membrány bývá také metanol, jehož
úkolem je rozvolnit komplex protein-SDS, a tím zvýšit afinitu vazby proteinu na membránu.
Za stejným účelem lze do blotovacího roztoku přidat SDS, který sníží vazebnou afinitu
proteinu k membráně, ale zvýší jeho mobilitu, a tím zvýší jeho migraci [3].
V praxi se používají dva typy Western blotu: mokrý a polosuchý. Mokrý blot tzv. “tank
blotting“ je časově náročnější, proto je třeba jej chladit a také se spotřebovává více
blotovacího pufru. Výhodou tohoto blotu je, že nedochází k rozpadu proteinů vlivem tepla,
proto je vhodnější jeho použití pro termolabilní proteiny. Polosuchý blot tzv. „semidry
blotting“ naopak chlazení nevyžaduje, má malou spotřebu blotovacího pufru a jeho provedení
je rychlejší [2].
Vzhledem k časové úspoře se častěji používá polosuchý blot, jehož schématické uspořádání je
znázorněno na Obr. 10.
Obr. 10 Schéma uspořádání polosuchého blotu: mezi katodu a anodu je umístěn gel
s membránou, na který je z obou stran přiložen filtrační papír navlhčený blotovacím
pufrem; modifikováno dle [9]
Detekce Western blotu je možná barvícími postupy pro barvení proteinů (např. Amidočerň,
Comassie Blue, koloidní zlato) nebo imunodetekcí. [3]. Pro imunodetekci se používá buď
jednokroková detekce tzn. protein na membráně je detekován přímo značenou protilátkou
a následně substrátem anebo dvoukroková (viz Obr. 11), kdy je použito primární protilátky,
sekundární značené protilátky a substrátu. Mezi jednotlivými kroky se membrána promývá
promývacím roztokem pro odstranění nespecifických vazeb. Dvoukroková detekce je
považována za citlivější a specifičtější [3].
Obr. 11 Princip dvoukrokové imunodetekce metodou Western blot antigenu protilátkou
(zahrnuje proces blokování, aplikace primární protilátky a následně sekundární
protilátky, detekce vhodným substrátem); modifikováno dle [5]
1.2.7 ELISA
Tuto metodu je možné použít v různém uspořádání (kompetitivní, sandwich), ale pro zjištění
základní interakce mezi proteinem a specifickou protilátkou proti tomuto proteinu je vhodný
systém sendvičové detekce (titrace protilátek) - nepřímá ELISA. Antigen (protein) vázaný na
pevnou fázi, což je speciální polystyrenová destička s hydrofilními vazebnými místy pro
kvalitní navázání biomolekul [22].
Na navázaný antigen se váže specifická protilátka, na kterou se po promytí naváže enzymem
značená sekundární protilátka (konjugát), která je vlastně protilátkou proti primární protilátce.
Takto vzniklý komplex je detekován vazbou substrátu na enzymem značenou protilátku za
vzniku barevného zabarvení roztoku. Celá reakce se ukončí přidáním stop roztoku. Intenzita
zbarvení roztoku se měří spektrofotometricky. Intenzita zbarvení vyjadřuje míru funkčnosti
protilátky.
Mezi jednotlivými kroky provedení nepřímé ELISA se pro eliminaci nespecifických vazeb
používají blokovací a promývací roztoky, které mohou obsahovat bovinní sérový albumin
(BSA) nebo sérum novorozených telat (NBCS) anebo detergenty jako např. Tween 20 [22].
1.2.8 Imunohistochemie
Imunohistochemie je metoda, při které jsou detekovány antigeny (proteiny) v tkáních za
pomocí specifických protilátek, které se vážou na cílový protein v tkáni a následně jsou
detekovány detekčním systémem obsahujícím sekundární protilátku. Následně dojde
k vizualizaci vzniklého komplexu např. fluorescenčně nebo enzymaticky za použití vhodného
substrátu.
Vzorky tkání, ve kterých se prokazuje přítomnost a distribuce proteinu, jsou buď nativní –
(vzorky se před přípravou řezů zmrazí) nebo denaturované (vzorky jsou uchovávány buď ve
formalínu nebo jsou zality v parafínu). Při přípravě denaturovaných vzorků prochází tkáň při
přípravě procesy, které ovlivňují kvalitu proteinů obsažených v tkáních – může dojít k jejich
denaturaci [17].
Tato metoda je často využívána v diagnostice nádorů.
Cíl práce
V době progresivního rozvoje řady disciplín lékařského a biologického výzkumu je nutno
rozvíjet metody, které tato odvětví potřebují a používají. Řada těchto metod je postavena na
využití zvířecích protilátek. Využití protilátek umožňuje zvýšit citlivost a specifitu řady
metod.
Jednou z civilizačních chorob současné doby je obezita spojená s dalšími negativními faktory
jako např. hypertenze, Diabetes Mellitus Typu 2. Proto se současný výzkum soustředí na
hledání genů (a následně proteinů), které jsou za tento problém zodpovědné. Jedním z těchto
proteinů je i Human Adiponectin. Studium hladin tohoto proteinu v krvi je v současné době ve
středu zájmu vědců. Intenzivní snahou je vyvinout metodu pro stanovení hladin Adiponectinu
v krvi. Jednou z vhodných metod je např. ELISA. Pro vývoj metody ELISA
(imunodiagnostická metoda) je nezbytné připravit kvalitní funkční protilátku. Funkční
protilátky bude možno následně využít v laboratorní diagnostice.
Cílem práce je:
1. připravit polyklonální protilátky (králičí a ovčí) proti proteinu Human Adiponectin.
Zvířata (králíci, ovce) budou imunizována proteinem Human Adiponectin podle
standardního imunizačního schématu s následným získáním imunních sér. Ze
získaných imunních sér budou izolovány polyklonální protilátky
2. Testování funkčnosti připravených polyklonálních protilátek pomocí laboratorních
metod jako je Western blot a IHC.
2. MATERIÁL A METODIKA
2.1 ImunizaceImunizace králíků byla provedena v akreditovaném zařízení pro chov laboratorních zvířat
firmy BioVendor – Laboratorní medicína, a.s. podle zákona 246/ 1992 Sb., na ochranu zvířat
proti týrání, ve znění pozdějších předpisů.
Imunizace ovcí byla provedena ve spolupráci s firmou Zooservis.
Pro proces přípravy imunního séra není podstatné plemeno ani pohlaví zvířete. Je dáván důraz
hlavně na odpovídající velikost a výborný zdravotní stav zvířete.
Zvířatům (králíkům i ovcím) byl před první aplikací antigenu proveden tzv. předimunizační
odběr (cca 2 - 5 ml) krve . Sérum z této krve se dál používalo jako kontrolní odběr (negativní
kontrola).
Jako imunizační antigen se použil recombinant Human Adiponectin (HEK) RD172023100 –
jedná se rekombinantní protein, který byl připraven v buněčné linii HEK293 (human
embryonic kidney cell cultures), to znamená eukaryotní expresí.
Chemikálie a pomůcky:
Inkompletní Freundovo adjuvans (ICFA) - Sigma
Kompletní Freundovo adjuvans (CFA) – Sigma
Imunizační antigen - recombinant Human Adiponectin (HEK) RD172023100 – dodán
v lyofilizované formě (BioVendor – Laboratorní medicína a.s.)
Aqua pro injectione infusia (Ardeapharma a.s.)
Betadine
50% etanol
Buničina
Tuby o objemu 50 ml
Injekční stříkačky pro aplikaci inzulínu
Injekční stříkačky o objemu 2 ml
Injekční jehly o průměru 0,45 mm a 0,9 mm
Kovové spojky
33
2.1.1 Příprava antigenu
Těsně před imunizací se potřebné množství imunizačního antigenu (antigen byl lyofilizovaný)
rozpustilo v injekční vodě na koncentraci 1 mg/ml. Vzniklá směs se smíchala s adjuvans
v poměru 1:1 viz. postup níže.
Postup:
1. Adjuvans se před použitím důkladně promíchalo.
2. Do injekční stříkačky o objemu 2 ml se pomocí injekční jehly, v případě první
imunizace natáhlo CFA adjuvans (množství potřebné na 1 králíka/ovci), v případě
dalších imunizací ICFA adjuvans (množství potřebné na 1 králíka/ovci) viz.
imunizační protokol.
3. Pomocí injekční jehly se do téže injekční stříkačky natáhlo příslušné množství
rozpuštěného antigenu.
4. Odstranila se injekční jehla a na stříkačku se nasadila kovová spojka. Pomocí spojky
se připojila další stříkačka (používaná pro aplikaci inzulínu) - na hrot druhé stříkačky
(2 ml) se nasadila tenkým koncem kovová spojka a širokým koncem se spojila
s hrotem stříkačky s podávanou látkou.
5. Střídavým stlačováním pístů obou stříkaček se směs promíchala až vznikla stabilní
emulze. Směs se ponechala ve stříkačce pro aplikaci inzulínu, odstranila se kovová
spojka a nasadila injekční jehla o průměru 0,45 mm.
6. Směs tak byla připravena k aplikaci dle imunizačního schématu.
2.1.2 Vlastní imunizace zvířatVšechny aplikace antigenu byly provedeny subkutálně (s.c.) dle imunizačního schématu
uvedeného níže. Dávky antigenu byly zvoleny s ohledem na velikost a druh zvířete.
Postup:
1. Před imunizací se zvířatům odebralo 2 ml (u králíků) nebo 5 ml (u ovcí) krve dle
postupu viz. kapitola 2.1.3. Získané sérum se při dalších testech používalo jako
negativní kontrola.
2. Následně se rozpuštěný antigen smíchal s kompletním Freundovým adjuvans – CFA
v poměru 1:1.
3. Místo vpichu se dezinfikovalo 50% etanolem.
34
4. Imunizace se provedla injekční soupravou pro aplikaci inzulínu s tenkou ostrou jehlou
o průměru 0,45 mm a tenkou stříkačkou o objemu 1 ml. Směs antigenu s CFA
se aplikovala do hřbetu králíka/ovce rovnoměrně do 2 míst (2 vpichy).
5. Po několika dnech se kolem míst vpichů může vytvořit zánětlivé ložisko, proto se tato
místa kontrolovala a ošetřovala přípravkem Betadine.
6. Další aplikace antigenu se prováděly rovněž subkutálně (s.c.). Rozpuštěný antigen
se smíchal s inkompletním Freundovým adjuvans – ICFA v poměru 1:1.
7. Dále se postupovalo viz body č. 2, 3, 4 tohoto postupu.
8. Poslední den imunizačního schématu se provedl odběr krve.
Imunizační schémata
Imunizační schéma pro imunizaci králíků
0. den Odběr kontrolní odběr 2 ml krve
1. den s.c. 200 µg antigenu + CFA
21. den s.c. 200 µg antigenu + ICFA
28. den s.c. 200 µg antigenu + ICFA
35. den s.c. 200 µg antigenu + ICFA
52. den Odběr 50 ml krve
Imunizační schéma pro imunizaci ovcí
0. den Odběr kontrolní odběr 5 ml krve
1. den s.c. 1000 µg antigenu + CFA
21. den s.c. 1000 µg antigenu + ICFA
28. den s.c. 1000 µg antigenu + ICFA
35. den s.c. 1000 µg antigenu + ICFA
52. den Odběr 500 ml krve
2.1.3 Odběr krve
Kontrolní odběry krve se provedly v případě králíka z ušního boltce - z středové ušní žíly (cca
2 ml), v případě ovce z vena jugularis (cca 5 ml). Produkční odběry krve se rovněž provedly u
králíka z ušního boltce a v případě ovce z vena jugularis.
Postup:
1. Místo odběru se dezinfikovalo 50% etanolem.
35
2. Vpich se provedl injekční jehlou o průměru 0,9 mm v protisměru toku krve v žíle.
3. Krev se odebírala do připravené označené zkumavky (tuba o objemu 50 ml) a podobu
odběru se kontrolovala intenzita vytékající krve a zapíchnutí jehly.
4. Po skončení odběru se krvácení zastavilo stisknutím žíly těsně před místem vpichu,
vytáhla se jehla, přiložila buničina a místo se opět dezinfikovalo 50% etanolem.
5. Zvířeti se zajistil dostatečný přísun tekutin.
2.2 Zpracování krve
Chemikálie a pomůcky:
Termostat s teplotou 37°C
Centrifuga U-320R BOECO
Tuby o objemu 50 ml
Postup:
1. Odebraná krev v tubách se nechala 20 minut srážet (v termostatu při 37 oC).
2. Ze sražené krve se odseparoval krevní koláč.
3. Tuby se sérem se ponechaly přes noc při 4 oC.
4. Následující den se vzorky centrifugovaly při 4000 otáčkách/při 4 oC - po dobu
20 minut.
5. Sérum se slilo do nové tuby a znovu se centrifugovalo při 4000 otáčkách/při 4 oC –
po dobu 20 minut.
6. Sérum se slilo do nové označené tuby.
7. Séra se uchovávala pro následné testy při - 20 °C.
2.3 Testování imunních sérPro testování imunních sér (jak králičích, tak ovčích) se používá metoda nepřímá ELISA.
V testu se využívá speciálně připravená destička s potaženým antigenem, který byl použit
k imunizaci. Imunní sérum (které obsahuje polyklonální protilátky) se pak následně ředí
v několika řadách (tzv. trojkové ředění) a aplikuje se na desku. Následně, po promytí,
se použije speciální konjugát (určený podle typu testovaného séra/protilátky) např. anti-králičí
nebo anti-ovčí a následně detekční roztok (což je látka, která se zbarví podle množství
a kvality protilátky v séru). Čím intenzivnější zabarvení, tím více protilátky. Celá reakce
se zastaví roztokem s kyselým pH (použití kyseliny sírové). Spolu se vzorkem imunního séra
se testuje i sérum z preimunního odběru. Intenzita zbarvení jednotlivých vzorků se následně
36
měří spektrofotometricky.
2.3.1 Vazba desek pro test nepřímá ELISA - vazba antigenu na desku
Chemikálie a pomůcky
Antigen recombinant Human Adiponectin (HEK), RD172023100 (BioVendor – Laboratorní
medicína a.s.), c=1 mg/ml (koncentrace stanovena metodou BCA viz. kap.2.5.1.)
Vazný roztok
Promývací roztok
Ředící a blokovací roztok
Mikrotitrační polystyrenové desky HIGH BINDING (Costar)
Sada pipet + multikanálová pipeta+špičky
Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5 ml)
Sada plastových zkumavek (13ml)
Gumové rukavice
Vaničky na reagencie (60 ml)
Promývačka mikrotitračních desek (Columbus Washer fy TECAN Austria G.m.b.H.)
Centrifuga U-320R BOECO
Laboratorní míchačka
pH metr
Ředící a blokovací roztok (TBS-Tween-Želatina)
Navážka na 1000 ml:
Tris-base (Fluka) 30,286 g
NaCl (Lach-Ner) 43,850 g
Tween 20 (Riedel-de Haen) 2,500 g
HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH = 7,2
(asi > 20 ml)
Rybí želatina – prášková (Sigma) 1,0 g
Thimerosal (Sigma) 0,2 g
Deionizovaná voda asi 1000 ml
Postup:
Tris-base a NaCl se rozpustily v 950 ml destilované vody a přídavkem HCl se upravilo pH na
hodnotu 7,2. Přidal se Tween 20 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 1000 ml.
37
Roztok se důkladně promíchal.
Za stálého míchání se přidala navážka želatiny a nechala se míchat až do úplného rozpuštění.
Následně se doplnil objem deionizovanou vodou na celkový objem 1000 ml, přidal se
Thimerosal a roztok důkladně se promíchal na míchačce.
Vazný roztok (0,1 M hydrogenuhličitanový roztok)
Navážka na 1000 ml:
NaHCO3 (Sigma) 8,2 g
Deionizovaná voda 1000 ml
Postup:
Navážka NaHCO3 se rozpustila v 900 ml deionizované vody a doplnila deionizovanou vodou
na objem 1000 ml a promíchala se na míchačce.
Promývací roztok (TBS-Tween)
Navážka na 1000 ml:
Tris-base (Fluka) 30,286 g
NaCl (Lach-Ner) 43,850 g
Tween 20 (Riedel-de Haen) 2,500 g
HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH = 7,2
(asi > 20 ml)
Deionizovaná voda asi 1000 ml
Postup:
Tris-base a NaCl se rozpustily v 950 ml destilované vody a přídavkem HCl se upravilo pH na
hodnotu 7,2. Přidal se Tween 20 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 1000 ml.
Roztok se důkladně promíchal.
Postup metody vazby antigenu na desku:
1. Do 10 ml Vazného roztoku se za stálého míchání na míchačce přikapával 0,25 ml
rozpuštěného antigenu (c=1 mg/ml) tak, aby nedošlo ke sražení antigenu.
2. Roztok se nechal míchat alespoň 20 minut.
3. Roztok rozmíchaného antigenu se vlil do vaničky na reagencie a pomocí
multikanálové pipety se naneslo do každé jamky mikrotitrační desky 100 μl roztoku
antigenu.
38
4. Deska se přikryla víčkem a nechala se inkubovat přes noc při 4°C
5. Další den se deska 1x promyla Promývacím roztokem na promývačce.
6. Deska se zablokovala přidáním Ředícího a blokovacího roztoku – pomocí
multikanálové pipety se do každé jamky naneslo 300 μl Ředícího a blokovacího
roztoku.
7. Deska se nechala inkubovat 30 minut při pokojové teplotě.
8. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem na promývačce.
9. Deska se nechala uschnout při laboratorní teplotě.
10. Následující den se deska zatavila do popsaného aluminiového sáčku.
Takto připravené desky se skladovaly při laboratorní teplotě a byly připraveny k následnému
testování imunních sér i vypurifikovaných protilátek.
2.3.2 Metoda nepřímá ELISA pro testování imunních sér
Chemikálie a pomůcky
Králičí imunní sérum a preimunní sérum
Ovčí imunní sérum a preimunní sérum
Mikrotitrační polystyrenová deska potažená příslušným antigenem (recombinant Human
Adiponectin (HEK) RD172023100)
Promývací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Ředící a blokovací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Zastavovací roztok
Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO) pro stanovení titru králičích protilátek
Anti Goat/Sheep – HRP (DAKO) pro stanovení titru kozích/ovčích
protilátek
Substrát: TMB Peroxidase Substrate (Seramun)
Sada pipet + multikanálová pipeta + špičky
Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5 ml)
Sada plastových zkumavek (13ml)
Gumové rukavice
Vaničky na reagencie (60 ml)
Promývačka mikrotitračních desek (Columbus Washer fy TECAN Austria G.m.b.H.)
Centrifuga U-320R BOECO
Analyzátor mikrotitračních desek (MRX II Dynex Technologies)
39
Zastavovací roztok (0,2 M H2SO4 )
Navážka na 1000 ml:
H2SO4 96% (Lach-Ner) 11,1 ml
Deionizovaná voda asi 1000 ml
Postup:
Odměřené množství 11,1 ml H2SO4 se přidalo k 950 ml deionizované vody. Objem se doplnil
deionizovanou vodou do celkového objemu 1000 ml a roztok se promíchal na míchačce.
Postup provedení metody Nepřímá ELISA
1. Vzorky imunních sér (jak ovčích, tak králičích) se předředily ve zkumavce v poměru
1:100 v Ředícím a blokovacím roztoku (10 l séra + 990 Ředícího a blokovacího
roztoku). Stejně se předředila i séra z kontrolních odběrů.
2. Na mikrotitrační desku (s navázaným antigenem) s potřebným množstvím stripů –
1 vzorek = 1 strip - se kromě řady A napipetovalo 100 l/jamka Ředícího
a blokovacího roztoku.
3. Do jamek A se napipetovaly předředěné vzorky 1:100 imunních a preimunních sér
v objemu 150 l/jamka.
4. Vzorek se naředil přenesením 50 l z řady A ke 100 l Ředícího a blokovacího
roztoku v řadě B, 5x se promíchal pipetou, odtud se přenesl opět 50 l do řady C,
5x se promíchal a takto se postupovalo až do řady G; posledních 50 l z řady G se jen
odebralo a dál již nepoužilo (tzv. trojkové ředění).
5. V řadě H zůstalo jen 100l Ředícího a blokovacího roztoku jako blank.
6. Deska se inkubovala 1h při pokojové teplotě.
7. Připravilo se potřebné množství adekvátního konjugátu - Anti Rabbit - HRP v ředění
1:2 000 pro stripy s králičími séry, Anti Sheep/goat - HRP v ředění 1:2 000 pro stripy
s ovčími séry. Konjugáty se ředily Ředícím a blokovacím roztoku (na 1 strip 1ml
roztoku konjugátu).
8. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem.
9. Do všech jamek se napipetovalo 100 l konjugátu/jamka.
10. Deska se inkubovala 1h při pokojové teplotě.
11. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem.
12. Do všech jamek se napipetovalo 100 l substrátu/jamka.
13. Deska se ponechala 10min. inkubovat (desku je třeba ochránit před světlem).
40
14. Po 10 min. inkubace se reakce zastavila přidáním Zastavovacího roztoku
100 l/jamku.
15. Deska se měřila na analyzátoru spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm.
2.4 Purifikace polyklonálních protilátekPurifikace polyklonálních protilátek imunního séra se provedla tzv. afinitní purifikací tzn.,
že se použila kolona naplněná nosičem s navázaným proteinem (imunizačním antigenem).
Po purifikaci imunního séra se získala králičí (ovčí) polyklonální protilátka, která byla použita
k dalším testům.
Postup přípravy kolony, stejně jako postup izolace protilátky jsou majetkem společnosti
Biovendor – Laboratorní medicína a.s.
2.5 Zpracování protilátek
2.5.1 Stanovení koncentrace bílkoviny (proteinu, protilátky) metodou BCAKe stanovení celkové koncentrace bílkoviny se využívá metody BCA. Jedná se
o kolorimetrickou detekci a kvantifikaci, která je založená na principu redukce iontů
dvojmocné mědi Cu2+ na jednomocnou Cu+. Jednomocná měď vytváří s kyselinou
bicinchoninovou (BCA) v alkalickém prostředí (při pH=10) stabilní ve vodě rozpustný
modrofialový komplex. Absorbance barevného komplexu, která je úměrná koncentraci
bílkoviny, se měří spektrofotometricky za použití interferenčního filtru o vlnové délce
562 nm. Koncentrace měřeného vzorku se odečítá z křivky vytvořené ze standardů o známé
koncentraci, které jsou naředěny ve stejném pufru jako měřený vzorek. Standardy jsou
připraveny z bovinního sérového albuminu a jejich koncentrace je v rozsahu v rozsahu
0,1 až 1,0 mg/ml. V případě, že je koncentrace měřeného vzorku vyšší než 1 mg/ml, je
potřeba vzorek naředit, a zopakovat měření.
Chemikálie a pomůcky
Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)
PBS pufr (0,1M; pH 7,2)
Centrifuga U-320R BOECO
Temperovaná třepačka na mikrotitrační desky (Thermostar - ASYS Hitech)
Analyzátor mikrotitračních desek s interferenčním filtrem 562 nm
Mikrotitrační deska: Typ P, polystyrenová s plochým dnem (Gama)
41
Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5 ml)
Sada plastových zkumavek (13ml)
Špičky pro pipety
Vaničky na reagencie (60 ml)
Gumové rukavice
PBS pufr (0,1M; pH 7,2)
Navážka na 1000 ml:
Na2HPO4 (Fluka) 56,80 g
NaH2PO4 (Sigma) 12,00 g
NaCl (Lach-Ner) 29,20 g
Deionizovaná voda 1000 ml
Postup:
Navážka Na2HPO4 se rozpustila za stálého míchání asi v 950 ml destilované vody. Po úplném
rozpuštění se přidala další navážka NaH2PO4 a nechala se dokonale se rozpustit. Dále byla
přidána navážka NaCl a objem byl doplněn deionizovanou vodou na celkový objem 1000 ml.
Postup provedení metody BCA:
Stanovení koncentrace protilátky se provedlo dle návodu výrobce přiloženého ke kitu firmy
Thermo Scientific. Jako standardy byly použity roztoky bovinního sérového albuminu (BSA),
které se připravily ředěním zásobního roztoku bovinního sérového albuminu o koncentraci
2000 g/ml (součást kitu) dle následujícího schématu:
Č. standardu Diluent Zásobní roztok (BSA) Finální koncentrace
1 250 l 250 l 1,0 mg/ml
2 300 l 200 l 0,8 mg/ml
3 350 l 150 l 0,6 mg/ml
4 400 l 100 l 0,4 mg/ml
5 450 l 50 l 0,2 mg/ml
6 475 l 25 l 0,1 mg/ml
7 500 l 0 l 0 mg/ml = Blank
Jako diluent se použil PBS (0,1M; pH 7,2). Z výsledků absorbance standardů se sestavila
kalibrační křivka, ze které byly podle dosažené absorbance odečteny koncentrace měřených
vzorků bílkovin (proteinů, protilátek).
42
2.5.2 Nepřímá ELISA pro testování vypurifikovaných polyklonálních protilátek
Vypurifikované polyklonální králičí a ovčí protilátky se rovněž testovaly v metodě Nepřímá
ELISA, stejně jako imunní séra. Pro stanovení titru připravené specifické králičí a ovčí
protilátky proti proteinu Human Adiponectin byla provedena nepřímá ELISA.
Chemikálie a pomůcky
Králičí polyklonální protilátka proti Human Adiponectin
Ovčí polyklonální protilátka proti Human Adiponectin
Mikrotitrační polystyrenová deska potažená příslušným antigenem (recombinant Human
Adiponectin (HEK) RD172023100)
Promývací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Ředící a blokovací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Zastavovací roztok (viz. kap. 2.3.2)
Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO) pro stanovení titru králičích protilátek
Anti Goat/Sheep - HRP (DAKO) pro stanovení titru kozích/ovčích
protilátek
Substrát: TMB Peroxidase Substrate (Seramun)
Sada pipet + multikanálová pipeta + špičky
Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5 ml)
Sada plastových zkumavek (13ml)
Gumové rukavice
Vaničky na reagencie (60 ml)
Promývačka mikrotitračních desek (Columbus Washer fy TECAN Austria G.m.b.H.)
Centrifuga U-320R BOECO
Analyzátor mikrotitračních desek (MRX II Dynex Technologies)
Postup provedení metody Nepřímá ELISA:
Vzorky musí být čiré – zákal může způsobit zkreslení metody. Pokud se ve vzorku objevil
zákal nebo sraženina bylo nutné vzorek v mikrozkumavce typu Eppendorf předem odstředit
v centrifuze při 15 000 otáčkách/při 4 oC - po dobu 20 minut.
1. Vypurifikovaná protilátka se na počátku testování předředila v Ředícím a blokovacím
roztoku na koncentraci 0,1 μg/ml na základě stanovené koncentrace metodou BCA
(viz. kap. 2.5.1).
43
2. Na mikrotitrační desku (s navázaným antigenem) s potřebným množstvím stripů –
1 vzorek = 1 strip - se kromě řady A napipetovalo 100 l/jamka Ředícího
a blokovacího roztoku.
3. Do jamek A se napipetovaly předředěné vzorky protilátek v objemu 150 l/jamka.
4. Vzorek se naředil přenesením 50 l z řady A ke 100 l Ředícího a blokovacího
roztoku v řadě B, 5x se promíchal pipetou, odtud se přenesl opět 50 l do řady C,
5x se promíchal a takto se postupovalo až do řady G; posledních 50 l z řady G se jen
odebralo a dál již nepoužilo (tzv. trojkové ředění).
5. Další postup se shodoval s postupem testování imunních sér v metodě Nepřímá ELISA
– viz. kap.2.3.2. Postup dle bodů č. 5 – 15 v kapitole 2.3.2.
2.6 Elektroforéza (ELFO)Je metoda, která se používá k rozdělení proteinů v elektickém poli podle molekulové
velikosti. Podle velikosti proteinu se volí koncentrace gelu. Elektroforéza se použila:
1. Pro stanovení a optimalizaci antigenu pro protein Human Adiponectin se použil
12% gel a nanášel se antigen v množství 1,25; 2,5 a 5 μg/dráhu v redukčním
a neredukčním prostředí.
2. Testovaly se připravené protilátky a jejich schopnost reagovat s antigenem Human
Adiponectin a s nativním Human Adiponectinem, který se prokazoval v lidském séru.
Zde sloužila elektroforéza k separaci proteinů a následně se gel použil pro detekci
v metodě Western blot. Pro tyto elektroforézy se použil 8% gel pro neredukční
prostředí a 12% gel pro redukční prostředí.
2.6.1 Příprava polyakrylamidových gelů pro ELFO
Gely pro elektroforézu se skládají ze 2 častí - gelu separačního a gelu zaostřovacího. Byl
použit 4% zaostřovací gel, pro separaci pak separační gely 8% a 12% zvolené na základě
molekulové hmotnosti vzorku a v závislosti na redukčním/neredukčním prostředí.
Chemikálie a pomůcky
40% Acrylamide solution (Bio-Rad)
2% Bis-Acrylamide solution (Bio-Rad)
10% Roztok SDS
Deionizovaná voda
Roztok Tris 1,5 M; pH 8,8
Roztok Tris 0,8 M; pH 6,8
44
pH metr
Laboratorní míchačka
Sada plastových zkumavek (13ml)
Láhve o objemu 1000 ml
Sada pipet + špičky
Gumové rukavice
10% Roztok SDS
Navážka na 100 ml:
SDS (Sigma) 10 g
Deionizovaná voda asi 100 ml
Postup:
SDS se rozpustil v 80 ml deionizované vody, mírně se zahřál. Následně byl objem doplněn
deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal na míchačce.
Roztok 1,5 M Tris (pH 8,8)
Navážka na 100 ml:
Tris–base (Fluka) 9,1 g
HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH=8,8
(asi 0,97 ml)
Deionizovaná voda asi 100 ml
Postup:
Tris se rozpustil v 50 ml deionizované vody. Přídavkem HCl bylo upraveno pH na hodnotu
8,8 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal
na míchačce.
Roztok 0,8 M Tris (pH 6,8)
Navážka na 100 ml:
Tris-base (Fluka) 3,0 g
HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH=6,8
Deionizovaná voda asi 100 ml
Postup:
45
Tris se rozpustil v 50 ml deionizované vody. Přídavkem HCl bylo upraveno pH na hodnotu
6,8 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal
na míchačce.
Zaostřovací gel (4% gel)
Na 100 ml gelu:
40% Acrylamide solution 9,6 ml
2% Bis-Acrylamide solution 5,2 ml
Roztok Tris 0,8 M; pH 6,8 25 ml
10% Roztok SDS 1 ml
Deionizovaná voda 58,4 ml
Postup:
Všechny složky gelu se smíchaly a rozplnily do plastových zkumavek po 4 ml. Zkumavky
s gely se uchovávaly při -20 oC.
Separační gel (8% gel)
Na 100 ml gelu:
40% Acrylamide solution 19,5 ml
2% Bis-Acrylamide solution 10,7 ml
Roztok Tris 1,5 M; pH 8,8 25 ml
10% Roztok SDS 1 ml
Deionizovaná voda 43,5 ml
Postup:
Všechny složky gelu se smíchaly a rozplnily do plastových zkumavek po 4 ml. Zkumavky
s gely se uchovávaly při -20 oC.
Separační gel (12% gel)
Na 100 ml gelu:
40% Acrylamide solution 29 ml
2% Bis-Acrylamide solution 16 ml
Roztok Tris 1,5 M; pH 8,8 25 ml
10% Roztok SDS 1 ml
Deionizovaná voda 28,5 ml
Postup:
46
Všechny složky gelu se smíchaly a rozplnily do plastových zkumavek po 4 ml. Zkumavky
s gely se uchovávaly při -20 oC.
2.6.2 Příprava vzorků
Chemikálie a pomůcky
Vzorkový pufr – neredukující
Vzorkový pufr – redukující
Roztok bromfenolové modři
Proteinový standard – (Bio-Rad kat. č. 161-0304)
Antigen recombinant Human Adiponectin (HEK), RD172023100 (BioVendor – Laboratorní
medicína a.s.), c=1 mg/ml (koncentrace stanovena metodou BCA viz. kap.2.5.1.)
Stříkačkový filtr 0,8 m a injekční stříkačky
Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5ml)
Sada pipet + špičky
Gumové rukavice
Roztok bromfenolové modři
Navážka na 100 ml:
Bromfenolová modř (Bio Basic) 100 mg
Deionizovaná voda 100 ml
Postup:
Bromfenolová modř se rozpustila ve 100 ml deionizované vody. Rozmíchala se na míchačce
a zfiltrovala přes filtr o velikosti pórů < 0.8 μm.
Vzorkový pufr – neredukující
Navážka na 10 ml:
Roztok 0,8 M Tris 2,4 ml
10% Roztok SDS 2,0 ml
Glycerol (Lach-Ner) 1,0 ml
Roztok bromfenolové modři 0,1 ml
Deionizovaná voda 4,5 ml
Postup:
Všechny složky se rozpustily a rozmíchaly na míchačce.
47
Vzorkový pufr – redukující
Navážka na 10 ml:
Roztok 0,8 M Tris 2,4 ml
10% Roztok SDS 2,0 ml
Glycerol (Lach-Ner) 1,0 ml
Roztok bromfenolové modři 0,1 ml
2-merkaptoetanol (Sigma) 0,5 ml
Deionizovaná voda 4,0 ml
Postup:
Všechny složky se rozpustily a rozmíchaly na míchačce.
Postup přípravy vzorků pro elektroforézu
Vzorky se připravily smícháním se Vzorkovým pufrem (redukčním nebo neredukčním)
v mikrozkumavkách typu Eppendorf a to tak, aby byl minimální poměr vzorku a Vzorkového
pufru 1:1 a byly zachovány zvolené konečné koncentrace proteinu Human Adiponectin.
1) Vzorky v redukčním pufru se zahřály až k varu ve vodní lázni a vařily se po dobu 4 minut.
Zahřátí se provedlo těsně před nanesením vzorku na gel. Směs vzorku s pufrem se po uvaření
hned ochladila v nádobce s ledem a okamžitě se nanesla podvrstvením do startovacích jamek
připraveného (zpolymerovaného gelu). Spolu se vzorky se připravoval a nanášel i komerčně
dodávaný Proteinový standard, který se nejdříve naředil v poměru 1:20 (1 l Proteinového
standardu + 19 l Vzorkového pufru – redukujícího). Po povaření 4 minuty se na gel nanášelo
6 l této směsi.
2) Vzorky, které se míchaly se Vzorkovým pufrem - neredukujícím se nezahřívaly, ale směs
se přímo nanesla podvrstvením do startovacích jamek zpolymerovaného gelu. Opět
se používal i Proteinový standard, který se nanášel spolu s neredukovanými vzorky. Standard
se i v tomto případě používal jako redukovaný (vařil se) viz. výše.
2.6.3 Vlastní elektroforéza
ELFO elektrodový pufr
Roztok persíranu amonného
TEMED (Fluka)
Isobutanol (Lachema) = a-butylalkohol p.a.
Souprava Mini PROTEAN 3System (Bio-Rad)
48
Zdroj napětí
Sada pipet + špičky
Gumové rukavice
Vzorky k testování (viz. kap. 2.6.2)
Roztok persíranu amonného
Navážka na 1 ml:
Persíran amonný (Bio-Rad) 100 mg
Deionizovaná voda 0,9 ml
Postup:
Persíran amonný se rozpustil v 0,9 ml deionizované vody. Rozmíchal se pipetou. Roztok byl
připraven těsně před použitím.
ELFO elektrodový pufr
Navážka na 1000 ml:
Tris-base (Fluka) 3,03 g
Glycin (Lach-Ner) 14,40 g
SDS (Sigma) 1,0 g
Deionizovaná voda asi 1000 ml
Postup:
Všechny složky se postupně rozpustily v 800 ml deionizované vody. Roztok se doplnil
deionizovanou vodou do objemu 1000 ml.
Provedení vlastní elektroforézy (pro gel 10 cm x 6,5 cm)
1. Připravila se 1 zkumavka zásobního roztoku separačního gelu příslušné hustoty
(8% nebo 12%) a 1 zkumavka zásobního roztoku zaostřovacího gelu (4%) - nechaly
se rozmrazit.
2. Sestavila se skla ze soupravy Mini PROTEAN 3System Bio-Rad a umístnila
se do nalévací vany.
3. Sestavila se elektroforetická souprava Mini PROTEAN 3System Bio-Rad
pro provedení elektroforézy, dle návodu výrobce.
4. K rozmraženému zásobnímu roztoku separačního gelu se přímo do zkumavky přidalo
40 μl roztoku persíranu amonného a 4 μl TEMED.
5. Po promíchání se separační gel nalil mezi sestavená skla umístěná v nalévací vaně -
49
asi 2 cm pod horní okraj.
6. Roztok gelu se opatrně rychle převrstvil isobutanolem nasyceným vodou v poměru 1:1
(připravuje se těsně před použitím)
7. Gel se nechal zpolymerovat při laboratorní teplotě po dobu asi 30 minut.
8. Převrstvený roztok se slil a hranice gelu se omyly destilovanou vodou (pomocí pipety)
9. K rozmraženému zásobnímu roztoku zaostřovacího gelu se přímo do zkumavky
přidalo 40 μl roztoku persíranu amonného a 4 μl TEMED.
10. Po promíchání se zaostřovací gel nalil na vrstvu zpolymerovaného separačního gelu –
nalil se až po horní okraj skel.
11. Rychle se do gelu zasunul hřebínek s potřebným množstvím drah (bez vytvoření
bublin).
12. Zaostřovací gel se také nechal zpolymerovat při laboratorní teplotě po dobu asi 30
minut.
13. Ze zpolymerovaného gelu se vyjmul hřebínek.
14. Do ELFO vany Mini PROTEAN 3System Bio-Rad se nalil ELFO elektrodový pufr
(používá se vždy čerstvý) tak, aby byly ponořeny elektrody, skla i okraj gelu - ELFO
pufr musel být i v jamkách gelu.
15. Za pomocí pipety se špičkou se opatrně promyly jamky přelitým pufrem – opatrným
opakovaným nasátím a vysátím.
16. Podvrstvením se nanesly vzorky a proteinový standard – objem vzorku závisí na
velikosti jamek (typu použitého hřebínku – 10 μl v případě deseti-jamkového hřebínku
a 5 μl v případě patnácti-jamkového hřebínku).
17. Sled vzorků na gelu se zaznamenal.
18. Souprava Mini PROTEAN 3System Bio-Rad se připojila ke zdroji napětí (napětí se
nastavilo na 100 V).
19. Elektroforéza se spustila a kontrolovalo se, zda gelem prochází proud – modrá barva
(vzorek) migroval ke spodní hranici gelu.
20. Poté, co modrá barva prošla zaostřovacím gelem (cca 10 min), zvýšilo se napětí na
200 V.
21. Elektroforéza se ukončila poté, co modrá barva doputovala asi 2 mm od spodního
okraje gelu (cca za 30 minut).
22. Zdroj se vypnul.
23. Skla se vyjmuly z vany pro elektroforézu.
50
24. Pomocí špachtle se opatrně odstranilo krycí sklo a odstranil se i zaostřovací gel.
25. Vlastní separační gel se opatrně přenesl ze skla do vaničky pro barvení gelů.
2.6.4 Barvení geluBarvící roztok
Odbarvovací roztok
Třepačka pro třepání gelů
Vaničky pro barvení gelů
Gel Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)
Gel, který se barvil
Sada pipet + špičky
Gumové rukavice
Barvící roztok Navážka na 1000 ml:
Etanol denaturovaný (Lihovar Kojetín) 450 ml
Kyselina octová (Lach-Ner) 100 ml
Coomassie Blue R-250 (Sigma) 0,5 g
Deionizovaná voda 450 ml
Postup:
Všechny složky se rozpustily a rozmíchaly na míchačce.
Odbarvovací roztok Navážka na 1000 ml:
Etanol denaturovaný (Lihovar Kojetín) 250 ml
Kyselina octová (Lach-Ner) 100 ml
Deionizovaná voda 650 ml
Postup:
Všechny složky se rozpustily a rozmíchaly na míchačce.
Postup při barvení gelu:
1. Gel, který se měl barvit, se vložil do vaničky pro barvení gelů.
51
2. Gel ve vaničce se zalil Barvícím roztokem a nechal se pomalu třepat na třepačce
30 - 45 minut.
3. Poté se Barvící roztok opatrně slil.
4. Ke gelu do vaničky se přilil Odbarvovací roztok (Odbarvovací roztok se během
odbarvování několikrát, podle potřeby, vyměnil) a nechal se pomalu třepat na třepačce
2 – 4 hodiny podle barvy bandů na gelu (bandy proteinů byly modré a pozadí
bezbarvé ).
5. Odbarvený gel se vyfotil na přístroji Gel Logic 1500 Imaging System (Carestream
Health, Inc.).
2.7 Western blot (WB)Pomocí připravených polyklonálních protilátek se Human Adiponectin prokazoval
v nativním materiálu (lidském séru). Pro tento průkaz se použilo lidské sérum od dárce –
parametry: muž, věk 28, BMI = 23, nekuřák, bez zdravotních potíží, které se ředilo
ve Vzorkovém pufru redukčním a to 1:10, 1:50 a 1:100 a také ve Vzorkovém pufru
neredukčním opět v ředění 1:10, 1:50 a 1:100. Pro detekci v redukčním prostředí se použil
12% polyakrylamidový gel, na který se nanášely vzorky předředěného lidského séra v objemu
6 µl spolu s vybranou koncentrací proteinu Human Adiponectin (0,05 μg/dráhu)
a proteinového standardu (příprava vzorku viz. kap. 2.6.2).
Taktéž se připravovaly vzorky v neredukčním prostředí, tzn. tři ředění lidského séra, protein
Human Adiponectin (0,05 μg/dráhu) a proteinový standard (příprava vzorku viz. kap. 2.6.2)
a tyto byly naneseny na 8% gel.
Byla provedena elektroforéza viz. kap. 2.6.3.
2.7.1 Transfer proteinů z polyakrylamidového gelu na PVDF membránu
Chemikálie a pomůcky
Separační gel (8% nebo 12%) se vzorky (v redukčním a neredukčním pufru), které byly
rozděleny za použití metody elektroforéza.
Blotovací roztok
Metanol (Lach-Ner)
Ředící a blokovací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Promývací roztok (viz. kap. 2.3.1)
PVDF Membrána pro Western blot – (Millipore)
52
Zdroj napětí
Souprava pro blotování (Bio Rad)
Laboratorní míchačka
Sada pipet + špičky
Buničina
Filtrační papír
Gumové rukavice
Vaničky pro barvení blotů
Pinzeta
Blotovací roztok pro polosuchý blot
Navážka na 1000 ml:
Tris-base (Fluka) 1,52 g
Glycin (Lach-Ner) 7,20 g
SDS (Sigma) 0,50 g
Metanol (Lach-Ner) 200 ml
Deionizovaná voda asi 800 ml
Postup:
Všechny složky se postupně rozpustily v 750 ml deionizované vody, přidal se metanol
a roztok se doplnil do objemu 1000 ml deionizovanou vodou. Pufr se vždy připravoval
čerstvý.
Postup pro vlastní provedení blotování na membránu:
1. PVDF membrána se ustřihla na velikost gelu a před použitím smáčela v metanolu
(asi 10 sekund) a následně v Ředícím a blokovacím pufru.
2. Ihned po ukončení elektroforézy se gel vyjmul z elektroforetické aparatury, odřízl se
a odstranil zaostřovací gel.
3. Označil (odříznul) se pravý dolní roh separačního gelu.
4. Na podložku se položila ta část blotovacího zařízení, která obsahuje katodu = záporný
pól.
5. Na katodu se položilo asi 10 vrstev filtračního papíru nasyceného Blotovacím pufrem.
6. Položila se další vrstva - silný chromatografický papír nasycený Blotovacím pufrem.
53
7. Položil se gel (uříznutým rohem - vlevo dole).
8. Na gel se položila nasycená PVDF membrána (viz. bod 1 tohoto protokolu).
9. Odstranily se bublinky - vzduch mezi gelem a membránou !
10. Membrána se opět pokryla silným chromatografickým papírem nasyceným
Blotovacím pufrem.
11. Následně se položilo dalších 10 vrstev filtračního papíru nasyceného Blotovacím
pufrem.
12. Nakonec se položila část blokovacího zařízení, kde se nachází anoda = kladný pól.
13. Blotovací zařízení se připojilo ke zdroji napětí a zvolil se výkon 500 mA.
14. Blotování probíhalo po dobu 30 min.
15. Po ukončení blotování se označil roh membrány (ustřižením) – stejný, který byl
ustřižen i na gelu.
16. Po ukončení blotování se provedla kontrola provedení metody – odstřihl se proužek
membrány se standardem (opět odstřižením označen roh tohoto proužku).
17. Kontrolní barvení membrány – proužku se standardem – se provádělo separátně
od membrány se vzorky (postup viz. kap. 2.7.2.)
18. Membrána se vzorky se blokovala - vložila do vaničky a zalila se Ředícím
a blokovacím roztoku. Blokování probíhalo přes noc; při 4 O C.
19. Další den se membrána promyla 2x po 5 minutách v Promývacím roztoku
20. Takto připravená membrána se ihned imunochemicky detekovala.
2.7.2 Barvení proužků se standardy amidočerní
Amidočerní se barvil proužek (s proteinovým standardem), který se ustřihl z membrány
pro provedení blotování.
Chemikálie a pomůcky
Roztok amidočerni
Roztok 5% kyseliny octové
Třepačka pro třepání gelů
Sada pipet + špičky
54
Gumové rukavice
Deionizovaná voda
Vaničky pro barvení blotů
Pinzeta
5% Roztok kyseliny octové
Navážka na 100 ml:
Kyselina octová (BAKER) 5 ml
Deionizovaná voda 95 ml
Postup:
Kyselina octová se rozpustila v 95 ml deionizované vody. Roztok se dobře promíchal.
Roztok amidočerni
Navážka na 50 ml:
5% Kyselina octová 50 ml
Amidočerň (Fluka) 0,125 g
Postup:
Amidočerň se navážila a rozpustila v 50 ml 5% kyseliny octové. Roztok se dobře promíchal.
Postup pro barvení proužku se standardem amidočerní:
1. Proužek membrány se vložil do vaničky a barvil se po dobu 30 min. v roztoku
amidočerni za třepání na třepačce.
2. Odbarvení se následně provádělo v Odbarvovacím roztoku tak dlouho, až zůstaly
zřetelné pouze bandy standardu.
2.7.3 Imunodetekce membrán s navázaným proteinem
Chemikálie a pomůcky
Promývací roztok (viz. kap. 2.3.1)
Ředící a blokovací roztok (viz. kap. 2.3.1)
PBS pufr (0,1M; pH 7,2) (viz. kap. 2.5.1)
Králičí polyklonální protilátka proti lidskému Adiponectinu
Ovčí polyklonální protilátka proti lidskému Adiponectinu
Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO)
55
Anti Goat/Sheep - HRP (DAKO)
Substrátový roztok DAB
Třepačka pro třepání gelů
Gel Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)
Sada pipet + špičky
Sada plastových zkumavek (13ml)
Gumové rukavice
Deionizovaná voda
Vaničky pro barvení blotů
Pinzeta
Substrátový roztok DAB (3,3-diaminobenzidin)
Navážka na 10 ml:
DAB (Sigma) 8 mg
PBS pufr 10 ml
30% Peroxid vodíku (Lach-Ner) 10 μl
Postup:
Navážený DAB se rozpustil v 10 ml PBS pufru. Těsně před použitím se přidal peroxid
vodíku.
Postup detekce:
1. Protilátky se naředily v Ředícím a blokovacím roztoku na koncentraci 1 μg/ml
(na 1 membránu se počítá s objemem 10 ml) v plastových zkumavkách (zkumavky
se popsaly).
2. Promytá membrána se vložila do vaničky s roztokem protilátky a umístila na třepačku.
3. Membrány se v roztocích protilátek třepaly dobu 1 hodiny.
4. Poté se odstranil z vaničky roztok s protilátkou a na membránu se nalilo 10 ml
Promývacího roztoku. V něm se membrána ponechala po dobu 3-5 minut a zároveň
se třepala na třepačce.
5. Promývací roztok se z vaničky slil a postup se opakoval celkem 5x.
6. Připravil se roztok konjugátu – Anti Rabbit - HRP i Anti Goat/Sheep - HRP
konjugát se dle doporučení výrobce naředil v Ředícím a blokovacím roztoku v poměru
56
1:2 000 (na 1 membránu bylo potřeba 10 ml naředěného konjugátu).
7. Roztok konjugátu se vlil do vaničky s membránou a promíchal.
8. Vanička s membránou se nechala třepat po dobu 1 hodiny.
9. Roztok konjugátu se odstranil.
10. Opakovalo se promytí membrány viz. bod 4. a 5. tohoto postupu.
11. Těsně před použitím se připravil Substrátový roztok DAB viz. výše a roztok se nalil
namembránu ve vaničce.
12. Vyčkalo se až se na membráně objevily bandy.
13. Vyvolávání se ukončilo namočením membrány do deionizované vody.
14. Membrána po vyjmutí z vaničky s deionizovanou vodou se nechala volně vyschnout
na filtračním papíru.
15. Vysušené detekované membrány se sestavily společně s proužkem standardů, který
se barvil amidočerní, a převedly se do elektronické podoby vyfocením na přístroji Gel
Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)
2.8 Imunohistochemie (IHC)Vyizolované králičí protilátky se rovněž testovaly v imunohistochemicky. Testování bylo
provedeno ve spolupráci s Oddělením patologie nemocnice Sv. Zdislavy v Mostišti,
zastoupeným primářem MUDr. Václavem Vagundou, PhD., který testování přímo provedl.
Vzhledem k tomu, že nebyl dostupný detekční systém pro ovčí protilátky, testovala se pouze
králičí polyklonální protilátka.
Králičí polyklonální protilátky se testovaly na řezech ze vzorků pocházejících z lidského
benigního lipomu. Použil se formol-parafinový materiál. Antigeny se revitalizovaly
v citrátovém pufru (vařeno 20 min. při 93°C). Řezy byly blokovány roztokem Protein Block,
Serum Free (DAKO) 5 – 10 minut při pokojové teplotě.
Pro detekci se použila koncentrace polyklonální králičí protilátky 6 g/ml, inkubace přes noc
při 4°C a detekční systém Alkalická fosfatáza – Fuchsin (EnVision Kit, DAKO).
Připravené vzorky byly odečítány mikroskopicky a následně převedeny do elektronické
podoby za použití fotoaparátu Canon S70.
57
3. SOUHRN, VÝSLEDKY
Obr. 12 Srovnání absorbance králičího imunního a neimunního séra
Tabulka 1 Data pro Obr. 12
58
Obr. 13 Srovnání absorbance ovčího imunního a neimunního séra
Tabulka 2 Data pro Obr. 13
59
Obr. 14 Závislost absorbance na koncentraci králičí polyklonální protilátky
Tabulka 3 Data pro Obr. 14
Koncentrace protilátkyAbsorbance
protilátky1004,238503,683251,92812,50,8466,250,3213,1250,1231,5630,052blank0,024
Obr. 15 Závislost absorbance na koncentraci ovčí polyklonální protilátky
Tabulka 4 Data pro Obr. 15
60
Koncentrace protilátkyAbsorbance
protilátky1002,718501,308250,5212,50,1946,250,0833,1250,0491,5630,031blank0,035
Obr. 16 recombinant Human Adiponectin 12% SDS-PAGE ELFO:
Dráha 1: recomb. Antigen 5 µg/dráhu, redukční
Dráha 2: recomb. Antigen 2,5 µg/dráhu, redukční
Dráha 3: recomb. Antigen 1,25 µg/dráhu, redukční
proteinový standard (Bio-Rad)
Dráha 4: recomb. Antigen 1,25 µg/dráhu, neredukční
Dráha 5: recomb. Antigen 2,5 µg/dráhu, neredukční
Dráha 6: recomb. Antigen 5 µg/dráhu, neredukční
61
Obr. 17 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (neredukční
podmínky), detekce králičí polyklonální protilátkou:
proteinový standard (Bio-Rad)
Dráha 1: recomb. Antigen 0,05 µg/dráhu, neredukční
Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, neredukční
Dráha 3: lidské sérum v ředění 1:50, neredukční
Dráha 4: lidské sérum v ředění 1:10, neredukční
62
Obr. 18 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (redukční
podmínky), detekce králičí polyklonální protilátkou:
proteinový standard (Bio-Rad)
Dráha 1: recomb. Antigen 0,05 µg/dráhu, redukční
Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, redukční
Dráha 3: lidské sérum v ředění 1:50, redukční
Dráha 4: lidské sérum v ředění 1:10, redukční
63
Obr. 19 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (neredukční
podmínky), detekce ovčí polyklonální protilátkou:
proteinový standard (Bio-Rad)
Dráha 1: recomb. Antigen 0,05 µg/dráhu, neredukční
Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, neredukční
Dráha 3: lidské sérum v ředění 1:50, neredukční
Dráha 4: lidské sérum v ředění 1:10, neredukční
64
Obr. 20 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (redukční
podmínky), detekce ovčí polyklonální protilátkou:
proteinový standard (Bio-Rad)
Dráha 1: recomb. Antigen 0,05 µg/dráhu, redukční
Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, redukční
Dráha 3: lidské sérum v ředění 1:50, redukční
Dráha 4: lidské sérum v ředění 1:10, redukční
65
Obr. 21 Lidský benigní lipom – formol-parafinový materiál, detekční systém Alkalická
fosfatáza - Fuchsin (EnVision Kit, DAKO), (zvětšeno 20x)
66
4. DISKUSENa počátku se rozpustil lyofilizovaný antigen Human Adiponectin (HEK) v deionizované
vodě. V roztoku rozpuštěného antigenu se stanovila koncentrace bílkoviny metodou BCA
komerčně dodávaným kitem firmy Thermo Scientific. Koncentrace se stanovila za pomocí
standardní křivky, která se sestavila z absorbancí jednotlivých standardů BSA, naředěných
v deionizované vodě podle návodu výrobce. Výsledná koncentrace Human Adiponectin
(HEK) byla stanovena 0,114 mg/ml viz. Příloha 1. Tato koncentrace se používala jako
výchozí pro ostatní testy.
S výše uvedeným rozpuštěným antigenem se imunizovala zvířata (králík, ovce). Nejdříve se
odebral preimunní odběr krve, následně se zvířata imunizovala dle imunizačních schémat. Na
závěr imunizačních schémat se provedl produkční odběr krve. Odebraná krev se zpracovala
na sérum. Sérum z preimunního odběru i produkčního odběru se následně testovalo paralelně
vedle sebe na přítomnost specifických protilátek proti Human Adiponectin.
Ze získaných výsledků (viz Obr. 12 a Tabulka 1, Obr. 13 a Tabulka 2) je jasné, že při
základním ředění (100x) vykazovalo, jak králičí, tak ovčí preimunní sérum velmi nízkou
absorbanci (v případě králíka < 0,100 a v případě ovce < 0,300), zatímco imunní sérum
(králičí i ovčí) i při ředění více než 700 000x ještě stále vykazovalo absorbanci vyšší než
1,000. Z měření absorbancí jednotlivých ředění preimunních a imunních sér obou typů zvířat
je znát, že imunitní odpověď zvířat na aplikovaný antigen (Human Adiponectin) byla
adekvátní a získané imunní sérum obsahuje polyklonální protilátky proti Human Adiponectin
(HEK).
Z imunních sér se izolovaly pomocí specificky navázané kolony (s Human Adiponectin
(HEK)) specifické polyklonální protilátky. Pro další testování bylo třeba stanovit koncentraci
protilátek. Opět se použila metoda BCA s komerčně dodávaným kitem firmy Thermo
Scientific. Výsledná koncentrace králičí protilátky Human Adiponectin (HEK) byla stanovena
0,380 mg/ml viz. Příloha 2. Výsledná koncentrace ovčí protilátky Human Adiponectin (HEK)
byla stanovena 0,419 mg/ml viz. Příloha 2. Obě koncentrace se používaly jako výchozí pro
další testy.
Obě vypurifikované protilátky se naředily z výše zmíněných koncentrací tak, aby konečná
koncentrace byla 0,1 µg/ml. Takto naředěné protilátky se dále testovaly v metodě Nepřímá
ELISA, kde byly ještě dále postupně ředěny (viz. Obr. 14 a Tabulka 3, Obr. 15 a Tabulka 4).
Protilátky i při vysokých ředěních vykazovaly významný rozdíl v absorbancích ředěných
protilátek a blanku. V případě králičí protilátky při koncentraci protilátky 6,25 ng/ml byla
67
absorbance > 0,300 vzhledem k blanku, jehož absorbance byla 0,024. U ovčí protilátky byla
absorbance > 0,500 vzhledem k blanku, kde byla absorbance 0,035. I když na první pohled se
zdá, že králičí protilátka je lepší (citlivější), tzn., že při vyšším ředění vykazuje vyšší
absorbanci než ovčí protilátka, nemusí tomu tak být. Důvodem je použití různých typů
konjugátů v metodě Nepřímá ELISA (králík/anti-králičí konjugát; ovce /anti-ovčí konjugát),
které mohou být rozdílně citlivé k protilátkám. Proto nelze kvalitu obou protilátek (od
různých druhů zvířat) srovnávat. Výsledná kvalita protilátky a vhodnost pro použití v dalších
metodách je nutno vždy otestovat.
Rekombinantní protein Human Adiponectin (HEK) se testoval v metodě Elektroforéza (viz.
Obr. 16). Důvody byly dva:
1) snaha o optimalizaci koncentrace tohoto proteinu pro následnou metodu Western blot
2) zjištění zastoupení jednotlivých forem Adiponectinu v rekombinantním proteinu
Pro testování se použil 12% polyakrylamidový gel a protein o různých koncentracích
v redukčním a neredukčním pufru. Na gel byl nanesen redukovaný Adiponectin o koncentraci
1,25 μg/dráhu, 2,5 a μg/dráhu, 5 μg/dráhu a neredukovaný Adiponectin o koncentraci
1,25 μg/dráhu, 2,5 a μg/dráhu, 5 μg/dráhu. Redukovaný Adiponectin o všech třech
koncentracích vykazoval band mezi hmotnostními markery o velikosti 31 - 45 kDa účinkem
redukčního pufru a zahřátím vzorku došlo k rozrušení disulfidických můstků a a rozpadu na
monomerní jednotky Adiponectinu. Neredukovaný Adiponectin vykazoval ve všech ředěních
několik bandů (od sebe ne dobře odlišitelných) v molekulové velikosti mezi hmotnostními
markery 66 – 97 kDa, jedná se s největší pravděpodobností o dimer a trimer Adiponectinu.
Rovněž se v neredukovaném Adiponectinu, ve všech ředěních, vyskytují bandy
s molekulovou hmotností vyšší než 97 kDa, jedná se pravděpodobně o formy Adiponectinu
větší než je forma trimeru. V literatuře se uvádí rozdílná molekulová hmotnost pro různé
formy Adiponectinu (pro monomer 30 kDa, dimer 60 kDa, trimer 90 kDa …), než která byla
zjištěna na provedených gelech. Důvodem může být to, že v literatuře se používá predikovaná
(teoreticky spočítaná dle počtu aminokyselin) molekulová hmotnost, která může být rozdílná
od prakticky zjištěné molekulové hmotnosti. Rovněž v metodě Elektroforéza použitý
Adiponectin byl připraven kultivací v tkáňové kultuře linie HEK293. Jedná se o eukaryotní
tkáňovou linii, a proto získaný Adiponectin obsahuje posttranslační modifikace typu
hydroxylace, glykosilace, sialyzace. Tyto posttranslační modifikace mohou vést k změně
rychlosti průchodu proteinu (Adiponectinu) gelem.
Funkčnost získaných protilátek se testovala i v metodě Western blot. Detekoval se
68
Adiponectin přítomný v lidském séru. Použilo se lidské sérum v ředění 1:10, 1:50 a 1:100.
V redukčním prostředí se použil 12% gel a v neredukčním prostředí 8% gel. Koncentrace
polyakrylamidového gelu se zvolila dle optimalizace rekombinantního Human Adiponectinu
v elektroforéze. Ke vzorkům sér na oba typy gelů se rovněž přidal jako pozitivní kontrola pro
ověření správnosti provedení metody recombinant Human Adiponectin o koncentraci
0,05 μg/dráhu a proteinový standard pro zjištění molekulové velikosti detekovaných bandů.
Připravily se celkem dva 12% gely a dva 8% gely. Oba typy gelů se následně blotovaly a
získané membrány s navázaným proteinem se detekovaly připravenými polyklonálními
protilátkami o koncentraci 1µg/ml. Každou polyklonální protilátkou se detekoval, jak
Adiponectin na 12% gelu (redukčním), tak na 8% gelu (neredukčním).
V neredukčním prostředí byly králičí protilátkou (viz. Obr. 17) na membráně detekovány (ve
všech třech ředěních séra) nejasně definované bandy o velikosti nad 45 kDa, tzn. že nelze
přesně určit molekulovou hmotnost a může se jednat o komplexy různých forem
Adiponectinu, které se vyskytují v lidském séru [25, 30]. Rekombinantní protein Human
Adiponectin vykazoval band o velikosti 31 – 45 kDa, což odpovídá monomerní formě. Aby se
potvrdilo, že vysokomolekulární komplexy prokázané v lidském séru, jsou komplexy
Adiponectinu, byla provedena detekce králičí protilátkou v redukčním prostředí (viz Obr. 18).
V redukčním prostředí (došlo k rozrušení disulfidických můstků) byl prokázán band ve všech
ředěních lidského séra o molekulové hmotnosti v rozmezí 31 – 45 kDa. Band o stejné
molekulové velikosti byl prokázán i ve standardu rekombinantního Adiponectinu. Z výsledků
se dá usuzovat, že králičí polyklonální protilátka detekuje lidský Adiponectin v séru, jak
v redukčním, tak neredukčním prostředí. Nejasně definované bandy prokázané v lidském séru
(v neredukčním prostředí) mohou být označeny jako komplexy vyšších forem Adiponectinu.
Zároveň v nativním materiálu (lidském séru) v neredukčním prostředí nebyla detekována
monomerní forma (na rozdíl od rekombinantního proteinu), což naznačuje shodu s výsledky
dalších autorů, že se v krvi nevyskytuje monomerní forma Adiponectinu [38].
V testování ovčí polyklonální protilátka v metodě Western blot bylo dosaženo podobných
výsledků (viz. Obr. 19 a Obr. 20).
V případě srovnávání výsledků blotů, které byly detekovány oběma typy protilátek, stejně
jako v případě metody Nepřímá ELISA, se musí zohlednit to, že byly použity dva různé
konjugáty, takže intenzita bandu na membráně Western blotu nemusí odpovídat kvalitě
protilátky.
Pro další potvrzení funkčnosti protilátek se použila pouze králičí protilátka (detekční systém
69
pro ovčí protilátku nebyl k dispozici) pro detekci v metodě IHC. Byly pozitivně detekovány
adipocyty pocházející z lidského benigního lipomu (viz. Obr. 21).
Vzhledem k výše zmíněným výsledkům lze usuzovat, že králičí polyklonální protilátka a ovčí
polyklonální protilátka jsou funkční a lze je použít pro průkaz Adiponectinu v dalších
laboratorních metodách.
70
5. ZÁVĚR
Výsledkem této práce byla příprava dvou typů polyklonálních protilátek, které byly úspěšně
testovány v metodě Western blot a imunohistochemii. Dle získaných výsledků je možno oba
typy protilátek považovat za specifické protilátky proti Human Adiponectin, které rozlišují
tento protein i v nativních materiálech (lidské sérum, lidská tkáň) a v budoucnu je možné
jejich úspěšné použití v laboratorní diagnostice.
71
6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ZDROJŮ INFORMACÍ
[1] BRUCE, Albert; JOHNSON, Alexander; LEWIS, Julian a kol. Molecular Biology
of the Cell, 4th edition. New York: Garland Science, 2002. ISBN 10: 0-8153-3218-
1.
[2] DOONAN, Shawn Methods in Molecular Biology Vol 59: Protein Purification
Protocols. New Jersey: Humana Press Inc., 1996. ISBN 0-89603-336-8.
[3] DUNBAR, B.S. Protein Blotting. Oxford: Oxford University Press, 1996. ISBN 0-19-
963437-8.
[4] DUVNJAK, L.; DUVNJAK, M. The Metabolic Syndrome – an Ongoing Story. J.
Physiol. Pharmacol., 2009, roč. 60(7), s. 19-24, ISSN 0867-5910.
[5] Elec-intro.com [online] Shenzen: Elec-intro.com [cit.11-04-05] Dostupné z www:
http://www.elec-intro.com/western-blots
[6] ESTEVE, E.; RICART, W.; FERNÁNDEZ-REAL, J.M. Adipocytokines and Insulin
Resistance. Diabetes Care, 2009, roč. 32(2), s. S362-S367, ISSN 1935-5548.
[7] EYNATTEN, M.; LIU, D.; HOCK, C. a kol. Urinary Adiponectin Excretion A Novel
Marker for Vascular Damage in Type 2 Diabetes. Diabetes, 2009, roč. 58, s. 2093-
2099, ISSN 1939-327X.
[8] FERENČÍK, Miroslav; ROVENSKÝ, Jozef; NYULASSY, Štefan IMUNOLÓGIA
Základné termíny a definície. Bratislava:Tlač FABER, 1999. ISBN 80-88908-38-8.
[9] FRANKS, Felix Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization.
New Jersey: Humana Press Inc., 1993. ISBN0-89603-230-2.
[10] GOLDSTEIN, B.J.; SCALIA, R.G.; MA, X.L. Protective vascular and myocardial
effects of adiponectin. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2009, roč. 6(1), s. 27-35,
ISSN 1759-5002.
[11] GOMES, F.; TELO, D.F.; SOUZA, H.P. A kol. Obesity and Coronary Artery Disease:
Role of Vascular Inflammation. Arq. Bras. Cardiol., 2010, roč. 94(2), s. 255-261, ISSN
1678-4170.
72
[12] GOMEZ, R.; LAGO, F.; GOMEZ-REINO, J. a kol. Adipokines in the skeleton:
influence on cartilage function and joint degenerative diseases. J. Mol. Endocrinol.,
2009, roč. 43, s. 11-18, ISSN 0952-5041.
[13] GUSTAFSON, B. Adipose Tissue, Inflammation and Atherosclerosis. J. Atheroscl.
Thromb., 2009, roč. 17(4), s. 332-341, ISSN 1880-3873.
[14] HOLLAND, W.L.; SCHERER, P.E. PAQRs: A Counteracting Force to Ceramides?
Mol. Pharmacol., 2009, roč. 75 (4), s. 740-7743, ISSN 1521-0111.
[15] HOŘEJŠÍ, Václav; BARTŮŇKOVÁ, Jiřina Základy Imunologie. Praha: Triton, 1998.
ISBN 80-85875-73-X.
[16] HOUSA, D.; HALUZÍK, M.; VERNEROVÁ, Z. a kol. Obezita, adipocytokiny a
karcinom prostaty. Urolog. Pro Praxi, 2007, roč. 1, s. 10-14, ISSN 1213-1768.
[17] JUNQUEIRA, L. Carlos; CARNEIRO, José; KELLEY, Robert O. Základy histologie.
Z angl. orig. přel. Richard Jelínek Jihlava: Tisk EKON Jihlava, 1999, ISBN 80-85787-
37-7.
[18] KRUIJSDIJK, R.C.M.; WALL, E.; VISSEREN, F.L.J. Obesity and Cancer: The role
of Dysfunctional Adipose Tissue. Cancer. Epidemiol. Biomarkers. Prev., 2009, roč. 18,
s. 2569-2578, ISSN 1055-9965.
[19] LIBBY, P.; OKAMOTO, Y.; ROCHA, V.Z. a kol. Inflammation and Atherosclerosis:
Transition From Theory to Practice. Circ. J., 2010, roč. 74, s. 213-220, ISSN 1347-
4820.
[20] LIU, D.; SCHUSTER, T.; BAUMANN, M. a kol. Comparison of Immunoassays for
the Selective Measurement of Human High-Molecular Weight Adiponectin. Clin.
Chemistry, 2009, roč. 55(3), s. 568-572, ISSN 0009-9147.
[21] MAIA-FERNANDEZ, T.; RONCON-ALBUQUERQUE JR., R.; LEITE-MOREIRA,
A. Cardiovascular Actions of Adiponectin: Pathophysiologic Implications. Rev. Port.
Cardiol., 2008, roč. 27(11), s. 1431-1450, ISSN .0870-2551.
73
[22] MANČAL, Petr Metody enzymové imunoanalýzy. Ústav sér a očkovacích látek o.p.
Praha; WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Rapid Viral
Diagnosis. Praha: Sevac, 1987, ISSN (nemá).
[23] MANDAL, P.; PRITCHARD, M.T.; NAGY, L.E. Anti-inflammatory pathways and
alcoholic liver disease: Role of an adiponectin/interleukin-10/heme oxygenase-1
pathway. World. J. Gastroenterol., 2010, roč. 16(11), s. 1330-1336, ISSN 1007-9327.
[24] MATSUZAWA, Y. Establishment of a concept of visceral fat syndrome and discovery
of adiponectin. Proc. Jpn. Acad., 2010, roč. 86(B), s. 131-141, ISSN 0021-4280.
[25] NAKANO, Y.; TAJIMA, S.; YOSHIMI, A. a kol. A novel enzyme-linked
immunosorbent assay specific for high-molecular-weight adiponectin. J. Lipid
Research, 2006, roč. 47, s. 1572-1582, ISSN 1539-7262.
[26] O΄LEARY, V.B.; JORETT, A.E.; MARCHETTI, CH.M. a kol. Enhanced adiponectin
multimer ratio and skeletal muscle adiponectin receptor expression following exercise
training and diet in older insulin-resistant adults. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.,
2007, roč. 293, s. E421-E427, ISSN 0193-1849.
[27] OLLER DO NASCIMENTO, C.M.; RIBEIRO, E.B.; OYAMA, L.M. Metabolism and
secretory function of white adipose tissue: effect of dietary fat.. An. Acad. Bras. Cienc.,
2009, roč. 81(3), s. 453-466, ISSN 0001-3765.
[28] PAIS, R.; SILAGHI, H.; SILAGHI, A.C. a kol. Metabolic syndrome and risc of
subsequent colorectal cancer. World. J. Gastroenterol., 2009, roč. 15(41), s. 5141-
5148, ISSN 1007-9327.
[29] PAZOUREK, J.: Skripta: Elektroforetické analytické metody. 2.6.2003, s.10-14
[cit.11-02-22] Dostupné z www:
<http://faf.vfu.cz/export/sites/faf/struktura-fakulty/sekce_ustavy/
ustav_chemickych_leciv/vyuka/analyticka-chemie/elforeza.pdf>
[30] POLAK, J.; KOVACOVA, Z.; HOLST, C. a kol. Total adiponectin and adiponectin
multimeric complexes in relation to weight loss-induced improvements in insulin
sensitivity in obese women: the NUGENOB study. Eur. J. Endocrinol., 2008, roč. 158,
74
s. 533-541, ISSN 0804-4643.
[31] PUNYADEERA, CH.; ZORENC, A.H.G.; KOOPMAN, R. a kol. The effects of
exercise and adipose tissue lipolysis on plasma adiponectin concentration and
adiponectin receptor expression in human sceletal muscle.. Eur. J. Endocrinol., 2005,
roč. 152, s. 427-436, ISSN 0804-4643.
[32] RABE, K.; LEHRKE, M.; PARHOFER, K.G. a kol. Adipokines and Insuline
Resistance. Mol. Med., 2008, roč. 14(11-12), s. 741-751, ISSN 1528-3658.
[33] RAHMOUNI, K.; SIGMUND, C.D. Id3, E47 and SREBP-1c: Fat Factors Controlling
Adiponectin Expression.. Circ. Res., 2008, roč. 103(6), s. 565-567, ISSN 0009-7330..
[34] RICHARDS, A.A.; STEPHENS, T.; CHARLTON, H.K. a kol. Adiponectin
Multimerization Is Dependent on Conserved Lysines in the Collagenous Domain:
Evidence for Regulation of Multimerization by Alterations in Posttranslational
Modifications. Mol. Endocrinol., 2006, roč. 20(7), s. 1673-1687, ISSN 0021-972X.
[35] State University of New York [online] New York: State University of New York
Oswego [cit.11-04-05] Dostupné z www:
http://www.oswego.edu/academics/colleges_and_departments/departments/
interdisciplinary/maspec.html
[36] STEJSKAL, D.; RŮŽIČKA, V.; ADAMOVSKÁ, S. a kol. Adiponectin Concentrations
as a Criterion of Metabolic Control in Persons with Type 2 Diabetes Mellitus?.
Biomed. Papers., 2003, roč. 147(2), s. 167-172, ISSN 1804-7521.
[37] STITES, Daniel P.; TERR, Abba I. Základní a klinická imunologie. Z angl. orig. přel.
Karel Barnet a kol. Praha: Victoria Publishing, 1994, ISBN 80-85605-37-6.
[38] ŠKOP, V.; KONTROVÁ, K.; ZÍDKOVÁ, J. a kol. Adipocytokiny – nedávno objevené
hormony tukové tkáně. Chem. Listy, 2009, roč. 103, s. 187-192, ISSN 1213-7103.
[39] TEPLAN, V. Metabolický syndrom v nefrologii. Med. pro praxi, 2010, roč. 7(5), s.
209-215, ISSN 1803-5310.
[40] TOULIS, K.A.; GOULIS, D.G.; FARMAKIOTIS, D. a kol. Adiponectin levels in
75
women with polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Hum.
Reprod. Update., 2009, roč. 15, s. 297-307, ISSN 1460-2369.
[41] YE, J. Emerging Role of Adipose Tissue Hypoxia in Obesity and Insulin Resistance.
Int. J. Obes. (Lond), 2009, roč. 33(1), s. 54-66, ISSN 1476-5497.
[42] YOU, M.; ROGERS, CH.Q. Adiponectin: A Key Adipokine in Alcoholic Fatty Liver.
Exp. Biol. Med., 2009, roč. 234, s. 850-859, ISSN 1535-3699.
[43] ŽOFKOVÁ, I. Vztah hormonů tukové tkáně a ghrelinu ke kostnímu metabolismu.
Vnitř. Lék., 2009, roč. 55(6), s. 560-56č, ISSN 0042-773X.
76
7. PŘÍLOHY
Příloha 1: Protokol o provedení metody BCA
Stanovení koncentrace antigenuHuman Adiponectin (HEK)
Standardní křivka
Lineární regrese y = k * x + qx y1 y2 y y teor
počet nstandard (mg/ml) Abs1 Abs2 prům Abs prům Abs k = 1,2159983
1 0,0 0,092 0,084 0,088 0,1352 0,1 0,245 0,250 0,248 0,256 q = 0,13477223 0,2 0,411 0,398 0,405 0,378 R = 0,99703484 0,4 0,648 0,692 0,670 0,6215 0,6 0,859 0,871 0,865 0,864 R2 = 0,99407856 0,8 1,095 1,160 1,128 1,1087 1,0 1,308 1,313 1,311 1,351 St.lin.regr.= 0,0384021
77
Výpočet koncentrace vzorků:
vzorek Abs1 Abs2prům Abs
koncentrace (mg/ml) ředění
výsledná koncentrace
(mg/ml)Adiponectin 0,272 0,274 0,273 0,114 1 0,114
Příloha 2: Protokol o provedení metody BCA
Stanovení koncentrace protilátek
Název vzorku: králičí a ovčí protilátka proti proteinu Human Adiponectin (HEK)
Standardní křivka:
Lineární regrese y = k * x + qx y1 y2 y y teor
počet nstandard (mg/ml) Abs1 Abs2 prům Abs
prům Abs k = 0,9796075
1 0,0 0,077 0,071 0,074 0,1032 0,1 0,206 0,194 0,200 0,201 q = 0,10260243 0,2 0,314 0,302 0,308 0,299 R = 0,9984734 0,4 0,516 0,513 0,515 0,4945 0,6 0,732 0,698 0,715 0,690 R2 = 0,99694836 0,8 0,886 0,883 0,885 0,8867 1,0 1,062 1,056 1,059 1,082 St.lin.regr.= 0,0221769
78
Výpočet koncentrace vzorků:
vzorek Abs1 Abs2prům Abs
koncentrace (mg/ml) ředění
výsledná koncentrace
(mg/ml)ovčí protilátka 0,501 0,526 0,5135 0,419 1 0,419králičí protilátka 0,472 0,475 0,4735 0,379 1 0,380
79