vytauto didŽiojo universitetas€¦ · molekulinė sandara, ląstelės dydis, forma, terpės...
TRANSCRIPT
VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS
GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOLOGIJOS KATEDRA
Rokas Mickus
ELEKTROSULIEJIMO METODO TAIKYMAS PELĖS HEPATOMOS
MH-22A LĄSTELIŲ LINIJAI
Magistro baigiamasis darbas
Taikomosios biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas
6211FX013
Biotechnologijos studijų kryptis
Vadovas (- ė): dr. Rita Saulė ____________ ___________
(Moksl. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)
Apginta: prof. dr. Saulius Mickevičius ____________ ___________
(Fakulteto/studijų instituto dekanas/direktorius) (Parašas) (Data)
Kaunas, 2019
2
SANTRUMPOS
DMEM – Dulbeko modifikuota Iglio terpė (angl. Dulbecco‘s modified Eagle‘s medium)
MH-22A – pelės hepatokarcinomos ląstelių linija
DNR – deoksiribonukleorūgštis
FBS – embrioninis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum)
DPBS – Dulbeko fosfatais buferizuotas tirpalas be Ca+2 ir Mg+2 jonų
EDTA – etilendiamino-tetraacetatas
DEP – dielektroforezė
AC – kintamoji srovė (angl. Alternating current)
DC – pastovioji srovė (angl. Direct current)
3
TURINYS SANTRAUKA ................................................................................................................................ 4
ABSTRACT ................................................................................................................................... 5
ĮVADAS ......................................................................................................................................... 6
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................................ 7
1. LITERATŪROS APŽVALGA.................................................................................................... 8
1.1. Elektroporacija ..................................................................................................................... 8
1.2. Elektrochemoterapija ............................................................................................................ 9
1.3. Elektroporacija maisto perdirbimo procesuose ...................................................................... 9
1.4. Dielektroforezė ................................................................................................................... 10
1.5. Dielektroforezės panaudojimas ........................................................................................... 10
1.5.1. Onkologiniai tyrimai .................................................................................................... 10
1.5.2. Kamieninės ląstelės ...................................................................................................... 11
1.5.3. Vaistų pernaša .............................................................................................................. 12
1.5.4. Virusai ......................................................................................................................... 14
1.6. Ląstelių suliejimas PEG metodu ......................................................................................... 15
1.7. Ląstelių elektrosuliejimas ................................................................................................... 15
2. METODIKA ............................................................................................................................. 18
2.1. Tirpalai ir reagentai............................................................................................................. 18
2.2. Ląstelių persėjimas ir jų suspensijos paruošimas ................................................................. 18
2.3. Elektroporuotų ląstelių dalies nustatymas ........................................................................... 20
2.4. Ląstelių elektrosuliejimo eiga ............................................................................................. 20
2.5. ECM 2001 elektromanipuliatorius ...................................................................................... 21
2.6. Eksperimentinių rezultatų apdorojimas ............................................................................... 21
3. REZULTATAI.......................................................................................................................... 22
3.1. Ląstelių dydžių įvertinimas ................................................................................................. 22
3.2. Kintamo elektrinio lauko stiprio nustatymas ląstelių dielektroforezei .................................. 24
3.3. Ląstelių permeabilizavimo efektyvumo nustatymas ............................................................ 26
3.4. Elektrinio impulso amplitudės optimizavimas ląstelių elektrosuliejimui .............................. 27
4. IŠVADOS ................................................................................................................................. 31
LITERATŪROS ŠALTINIAI ....................................................................................................... 32
4
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Rokas Mickus
Magistro darbo pavadinimas: ELEKTROSULIEJIMO METODO TAIKYMAS PELĖS
HEPATOMOS MH-22A LĄSTELIŲ LINIJAI
Vadovas: dr. Rita Saulė
Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas,
Kaunas, 2019
Puslapių skaičius: 39
Lentelių skaičius: 0
Paveikslų skaičius: 18
Literatūros šaltinių skaičius 114
Priedų skaičius: 0
Elektrosuliejimas yra dviejų sąlygų procesas: (I) turi būti glaudus ląstelių fizinis kontaktas ir
(II) ląstelių membranos turi būti susiliejimo būsenoje.
Fizinis ryšys tarp ląstelių gali būti pasiektas dielektroforezės (DEP) pagalba, kuri yra
inicijuojama taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką. Antroji elektrosuliejimo sąlyga -
membranos susiliejimo būsena - pasiekiama naudojant elektrinį impulsą, dėl kurio įvyksta
struktūrinis lipidų dvigubo sluoksnio pertvarkymas.
Rezultatai parodo, kad efektyviausias pelės hepatomos MH-22A ląstelių elektrosusiliejimas
būna tuomet, kai yra naudojami devyni stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės 100 µs trukmės
elektriniai impulsai ir DEP yra taikoma 120 sekundžių. Susiliejusių ląstelių dalis yra 8,80 ± 0,6%.
Mažiausiai susilieja ląstelių (1,33 ±0,2%), kuomet naudotas elektrinio lauko stipris yra 600 V/cm.
5
ABSTRACT
Author of Master Thesis: Rokas Mickus
Full title of Master Thesis: Appilication of the Electrofusion Method in Mouse Hepatoma
MH-22A Cell Line
Supervisor: ph.D. Rita Saulė
Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Natural Science,
Kaunas, 2019.
Number of pages: 39
Number of tables: 0
Number of pictures: 18
Nuber of references 114
Number of appendices: 0
Electrofusion is a process of two conditions: (I) there must be close physical contact
between cells and (II) cell membranes must be in the state of fusion.
The physical contact between cells can be achieved by the force of dielectrophoresis
(DEP), which is initiated by an alternating current of the electric field. The second condition of the
electrofusion, the cell membranes being in the state of fusion, is achieved by the electric pulse
resulting in structural rearrangement of the lipid bilayer.
The results show that the most effective electrofusion of mouse hepatoma MH-22A cell
line occurs when nine rectangular 1.5 kV/cm amplitude, 100 µs duration electric pulses are used
and dielectrophoresis is applied for 120 seconds. The percentage of fused cells is 8.80 ± 0.6%. The
least percentage of fused cells (1.33 ± 0.2%) is when the electric field strength is 600 V/cm.
6
ĮVADAS
Taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką yra inicijuojama dielektroforezės
(DEP) jėga, kuri veikia dalelių judėjimą, sukurdama poliarizacijos gradientą tarp dalelių ir
suspenduojančios terpės. DEP metodas naudoja ląstelės mechanines ir elektrines savybes bei
baltymų ir ląstelių paviršiaus jungimosi savybes, kad būtų galima išskirtinai skatinti ląstelių
judėjimą. Kai ląstelės ar dalelės yra veikiamos šio netolygaus elektrinio lauko, tarp ląstelių ir
aplinkinės terpės atsiranda dvi skirtingos jėgos, dėl kurių ląstelės ar dalelės juda (Rahman ir kt.,
2016).
Pastaruosius kelis dešimtmečius žinoma, kad ląsteles paveikus trumpais, bet labai stipriais
elektriniais impulsais, vyksta pakitimai ląstelės plazminėje membranoje, dėl ko padidėja jos
pralaidumas įvairiems junginiams. Toks reiškinys buvo pavadintas elektroporacija (Kinosita ir
Tsong, 1977). Tai sukėlė didelį mokslininkų susidomėjimą, nes po impulso ląstelės membranoje
susiformavusios poros išnyksta ir ląstelė vėl gali normaliai funkcionuoti (Rols ir Teissie, 1998).
Elektroporacijos metodas dėl savo paprastumo yra taikomas daugelyje sričių: molekulinėje
biologijoje, biotechnologijoje ir net medicinoje. Elektrinio impulso pagalba į ląsteles ar audinius
galima pernešti jonus, vaistus, dažiklius, antikūnus taip siekiant sustabdyti piktybinius navikus
(Gehl, 2003).
Vėliau pastebėta, kad panaudojus elektroporaciją, galima sulieti skirtingo tipo ląsteles, kas
lėmė pažangą imunoterapijos srityje ir leido sukurti naujas vėžio terapijas, pagrįstas imuniniu
atsaku, įskaitant monokloninius antikūnus ir ląstelių vakcinas. Efektyvus ląstelių suliejimas
reikalingas hibridomų gamybai, ląstelių vakcinos paruošimui, žinduolių klonavimui (Wilmut ir kt.,
1997; Kanduser M. ir Ušaj M., 2014). Tačiau norint efektyviai sulieti ląsteles, tarp ląstelių
pirmiausia turi būti glaudus fizinis kontaktas, o tam dažniausiai naudojama dielektroforezė (Teissie
ir Rols, 1986; Kanduser M. ir Ušaj M., 2014).
Todėl Vytauto Didžiojo universiteto, Biologijos katedros, ląstelių kultūrų laboratorijoje
buvo pradėti ląstelių elektrosuliejimo in vitro tyrimai su pelės hepatomos MH-22A ląstelių linija
naudojant ECM 2001 elektromanipuliatorių siekiant išsiaiškinti, ar elektromanipuliatoriaus
parametrai yra pajėgūs sulieti ląsteles, nes iki šiol niekas nebandė to daryti su ląstelių kultūromis.
Priklausomai nuo rezultatų, vėliau galima būtų tirti membranos paviršiaus ploto pokyčius, vezikulių
formavimąsi, medžiagų mainų kinetiką tarp ląstelių ar net porų formavimąsi.
7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
TIKSLAS
Nustatyti pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimui tinkamus ECM 2001
ląstelių elektromanipuliatoriaus parametrus.
UŽDAVINIAI
1. Nustatyti tinkamus kintamojo elektrinio lauko parametrus efektyviai dielektroforezei.
2. Nustatyti ląstelių elektro permeabilizacijos efektyvumą.
3. Nustatyti elektroporacijos elektrinių impulsų amplitudę ir skaičių, reikalingą efektyviam
ląstelių suliejimui.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Elektroporacija
Elektroporacija yra terminas, naudojamas apibūdinti porų formavimąsi dirbtinėse arba
ląstelių membranose dėl padidėjusios transmembraninės įtampos, kurią sukelia elektrinis laukas.
Metodo pradininku laikomas profesorius E. Neuman su kolegomis, kurie sugebėjo pasitelkę
elektrinius lauko impulsus perkelti į ląstelę svetimą DNR. Pagrindinius elektroporacijos bruožus
apima: (I) trumpų elektrinių impulsų panaudojimas, (II) dvisluoksnės lipidų membranos įkrovimas,
(III) greitas, lokalizuotas membranos molekulinės struktūros pertvarkymas, (IV) porų formavimasis,
kurios prasiskverbia pro membraną ir yra užpildytos vandens molekulėmis, (V) padidėjęs jonų ir
molekulių laidumas pro membraną (Yarmush,2014; Weaver,2003).
Nustatyta, kad elektroporacijos efektyvumui turi įtakos tokie veiksniai: ląstelės membranos
molekulinė sandara, ląstelės dydis, forma, terpės joninė sudėtis, osmosinis slėgis, temperatūra,
elektrinio lauko stipris, impulso forma ir trukmė, paleidžiamų elektrinių impulsų skaičius (Rols ir
kt., 1998; Rols ir Teissie, 1990; Lebar ir Miklavčič, 2001; Kotnik ir kt., 2001).
Elektroporacijos metodas dėl savo paprastumo yra taikomas daugelyje sričių: ląstelės
biologijoje, biotechnologijoje, medicinoje. Elektrinio impulso pagalba į ląsteles ar audinius galima
pernešti jonus, vaistus, dažiklius, antikūnus taip siekiant sustabdyti piktybinius navikus (Gehl,
2003). Per pastaruosius keturis dešimtmečius atlikti tyrimai ir pasiekimai pagrindinėje ir
eksperimentinėje elektroporacijoje leido technologijas pritaikyti klinikoje (Yarmush ir kt., 2014).
Ląstelių elektroporaciją galima suskirstyti į dvi kategorijas: grįžtama ir negrįžtama.
Ląstelės, kurios patiria grįžtamą elektroporaciją, ją išgyvena ir po impulso praėjus tam tikram laikui
ląstelės membranoje susiformavusios poros išnyksta, tuo tarpu ląstelės, kurios yra paveikiamos
negrįžtamos elektroporacijos, neišgyvena. Negrįžtama elektroporacija atsiranda elektriniam laukui
viršijus ląstelės membranos tam tikrą ribinę vertę (Rols ir Teissie, 1998). Ląstelių išgyvenamumas
taip pat priklauso nuo naudojamų impulsų skaičiaus. Nors konkretus mechanizmas paaiškinantis
ląstelių mirtį dar nėra žinomas, yra visuotinai pripažinta, kad negrįžtami defektai susidaro per
pirmąsias kelias sekundes po elektroporacijos ir ląstelės toliau miršta valandos bėgyje (Argus F. Ir
kt., 2017).
9
1.2. Elektrochemoterapija
Elektrochemoterapijoje (ECT) trumpi, bet intensyvūs elektriniai impulsai yra perduodami į
naviką in vivo, naudojant specifinius elektrodus, kad elektroporuotų vėžinių ląstelių membranas ir
tokiu būdu galima tiesiogiai patekti į citozolį (Miklavčič ir kt., 2006; Sersa ir kt., 1998). Tokiomis
sąlygomis citotoksiniai vaistai, pavyzdžiui, bleomicinas, kuris yra hidrofilinis ir neturi efektyvių
įsisavinimo mechanizmų, gali lengvai patekti į ląsteles. Padidėjęs įsisavinimas yra tik elektrinių
impulsų naudojimo vietoje, ECT iš esmės yra lokalus gydymas. Bleomicinas ląstelės viduje veikia
kaip fermentas, sukuriantis viengrandžių ir dvigrandžių DNR trūkius. Bleomicinas veikia tik
ląsteles, kurioms vyksta mitozė (Mir ir kt., 1988; , Orlowski ir kt., 1988). Cisplatina yra dar vienas
citotoksinis vaistas, sėkmingai naudojamas ECT (Sersa ir kt., 1995; Sersa ir kt., 2000). Audinių tūrį,
kuriame vyksta elektroporacija, lemia elektrinio lauko pasiskirstymas, kurį galima reguliuoti
elektrodų skaičiumi, tipu ir padėtimi, pasirinkta elektros impulso amplitude esant tam tikram
impulsų skaičiui ir trukmei (Miklavčič ir kt., 1998). Kliniškai vartojami citotoksiniai vaistai labiau
veikia aktyviai besidalijančias vėžines ląsteles ir mažiau veikia normalių ląstelių populiaciją
aplinkiniuose audiniuose (Gehl ir Geertsen, 2006; Marty ir kt., 2006).
1.3. Elektroporacija maisto perdirbimo procesuose
Pradiniai bandymai elektroporuoti augalų audinius, siekiant pagerinti sulčių gavybą, buvo
nesėkmingi dėl nekontroliuojamo maisto temperatūros padidėjimo, dėl didelio elektrinių laukų
intensyvumo, produkto kokybė pablogėjo. Tačiau pastaraisiais metais augalų ląstelių membranos
elektroporavimas buvo efektyvus, nes pritaikant vidutinišką elektros impulsų amplitudę, galima
išvengti pernelyg didelio temperatūros padidėjimo (Kalamiza ir kt., 2014).
Kai kurie produktai, kuriems buvo nustatytas elektroporacijos efektyvumas, yra liucernos,
obuoliai, morkos, paprikos, bulvės ir cukriniai runkeliai (Gachovska ir kt., 2006; Donsi ir kt., 2010;
Vorobievas ir Lebovka 2010). Buvo įrodyta, kad elektroporacinis ekstraktas suteikia didesnę sulčių
išeigą iki 70%, kai naudojamas kaip vienintelis apdorojimo būdas, pagerinantis sulčių kokybę
grynumo požiūriu (lyginant su terminiu apdorojimu), taip pat didinantis vertingų sulčių tirpiklių
koncentraciją, tokių kaip baltymai, mineralai, b-karotinas ir kiti iki 60% (Gachovska ir kt., 2006;
Grimi ir kt., 2007).
Keletas vertingų metabolitų, kurie gali būti randami augalų ląstelėse, ir ląstelių organelėse,
pvz., vakuolėse, kelia didelį komercinį susidomėjimą. Elektroporacija buvo tiriama kaip priemonė
padidinti dažiklių (pigmentų), antioksidantų (pvz., polifenolių), flavonoidų ir kitų antrinių
metabolitų, cukrų ir lipidų (pvz., aliejų) išgavimą iš augalų ir mikrodumblių. Nustatyta, kad taikant
elektroporaciją prieš ekstrahavimą pagerėja chlorofilų, karotinoidų, betalinų ir flavonoidų, ypač
10
antocianinų, išsiskyrimas. Pavyzdžiui, Chlorella vulgaris mikrodumblių tyrimai parodė, kad
pagerėjo chlorofilo ir karotinoidų išgavimas atitinkamai 80 ir 52% po elektrinių impulsų
panaudojimo (Donsi ir kt.,. 2010; Vorobiev ir Lebovka 2010; Puertolas ir kt., 2012).
Negrįžtamą elektroporaciją galima pritaikyti sterilizacijai. Buvo įrodyta, kad bakterijų
suspensiją paveikus stipriu, bet trumpu elektrinio lauko impulsu, žūva iki 99,99% bakterijų (Sale ir
Hamilton, 1967). Toks metodas buvo pritaikytas skystų maisto produktų sterilizacijai (Zhang ir kt.,
1994).
1.4. Dielektroforezė
Dielektroforezė – tai elektrostatinis reiškinys, aprašomas kaip suspenduotų dalelių
judėjimas, atsirandantis dėl poliarizacijos jėgų, atsiradusių dėl nehomogeninio elektrinio lauko
(Pohl, 1951).
Biologinių medžiagų reakciją į elektrinius laukus tikriausiai pirmą kartą ištyrė Muthas
1927 metais, kuomet riebalinių dalelių emulsiją paveikė aukštais dažniais ir pastebėjo perlų
grandinės formavimąsi. Liebesny 1939 metais taip pat stebėjo tokius pat grandinėlių formavimus su
eritrocitais aukšto dažnio elektriniame lauke. 1960 metais Helleris su kolegomis tyrinėjo įvairių
organizmų atsakus elektriniame lauke ir pastebėjo perlų grandinės formavimąsi, orientaciją,
preferencinį judėjimą, greitą sukimąsi ir dažnio optimą. Schwan su kolegomis pristatė teorinius
perlų grandinės formavimosi ir biologinių dalelių orientavimo metodus, bei apžvelgė audinių ir
ląstelių suspensijų elektrines savybes. Jo pranešimai paskatino Pohl ir Hawk taikyti selektyvią
dielektroforezę tokiai suspensijai. Buvo nustatyta, kad naudojant tinkamo dažnio ir laidumo derinį
galima atskirti gyvas ir negyvas mielių ląsteles ir netgi sukelti fizinį atskyrimą (Pohl ir Crane,
1971).
DEP jėga yra inicijuojama taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką, kuris veikia
dalelių judėjimą, sukurdamas poliarizacijos gradientą tarp dalelių ir suspenduojančios terpės. DEP
metodas naudoja ląstelės mechanines ir elektrines savybes bei baltymų ir ląstelių paviršiaus
jungimosi savybes, kad būtų galima išskirtinai skatinti ląstelių judėjimą. Kai ląstelės ar dalelės yra
veikiamos šio netolygaus elektrinio lauko, tarp ląstelių ir aplinkinės terpės atsiranda dvi skirtingos
jėgos, dėl kurių ląstelės ar dalelės juda (Rahman ir kt., 2016).
1.5. Dielektroforezės panaudojimas
1.5.1. Onkologiniai tyrimai
Onkologija yra medicinos mokslo šaka, skirta vėžio diagnostikai ir gydymui. Onkologinių
tyrimų tikslas yra kuo anksčiau nustatyti vėžį ir jo stadijas. Vėžys yra nenormalus piktybinių
11
ląstelių augimas, kuris gali metastazuoti ir nukeliauti į netoliese esančius audinius ar kitas kūno
dalis (Hanaham ir Weinberg, 2011). Gydymas yra daugiapakopis ir daugiarūšis, priklausomai nuo
vėžio tipo ir stadijos. Onkologijoje taip pat svarbu sumažinti šalutinį poveikį, patirtą gydymo metu.
(Aapro ir kt., 2014). Svarbūs onkologinių tyrimų uždaviniai yra retų vėžinių ląstelių atskyrimas nuo
kompleksinių mėginių (t. y. kraujo), vėžio tipo patvirtinimas ir diferenciacija, gydymo pažangos
stebėjimas, įvertinant ląstelių morfologiją. Vėžines ląsteles sunku aptikti ir izoliuoti nuo sveikų
ląstelių dėl genų mutacijų, todėl jų aptikimui reikalingi specialūs biomarkeriai (angl. biomarkers)
(Garnett ir kt., 2012). Sekvenavimas, ląstelių rūšiavimas ir tėkmės citometro naudojimas vėžio
detekcijai reikia aukštos kvalifikacijos darbuotojų ir brangios įrangos kas reikalauja didelių išlaidų
(Khan ir kt.2005; Zharov ir kt., 2006; Galanzha ir kt., 2009). Skirtingos ląstelės yra skirtingo
dydžio, paviršiaus ploto ir morfologijos. Dėl ląstelių unikalių elektrinių savybių, panaudojus DEP,
jas galima ne tik atskirti, bet ir charakterizuoti (Gascoyne ir Shim, 2014). Nepaisant ląstelių savitojo
dažnio, ląstelių diferenciacijai, naudojant dielektroforezę, didelį poveikį turi suspenduojančios
terpės jonų laidumas. Tam tikras vidutinis laidumas gali būti reguliuojamas labai siauroje AC
dažnių juostoje (Alshareef ir kt., 2013; Gascoyne ir Shim, 2014).
Kadangi DEP technika gali diferencijuoti sveikas ir patologines ląstelių būsenas,
panaudodama ląstelių dielektrines savybes, DEP kaip alternatyva buvo naudojama keliuose
onkologiniuose tyrimuose:
Cirkuliuojančių navikinių ląstelių izoliavimui iš kraujo (Gascoyne ir Shim, 2014)
Žmogaus burnos vėžio ląstelių charakterizavimui (Liang ir kt., 2014)
Osteosarkomos (kaulų vėžio ląstelės) heterogeniškumo nustatymui ir stebėjimui (Ismail ir
kt., 2015)
Krūties ir kolorektalinio vėžio ląstelių diferenciacijai (Alshareef ir kt., 2013)
Retų vėžinių ląstelių (prostatos vėžys) izoliavimui iš kraujo (Ismail ir kt., 2015)
DEP yra greita ir biomarkerių nereikalaujanti technologija ir gali pagerinti vėžio ląstelių
atrankos efektyvumą, kai ji derinama su kitais prietaisais. Todėl DEP gali būti naudojama siekiant
sumažinti dabartinių vėžio ląstelių identifikavimo metodų sudėtingumą ir trukmę bei sumažinti
tyrimų kainą.
1.5.2. Kamieninės ląstelės
Kamieninės ląstelės yra nediferencijuotų ląstelių klasė, kuri gali diferencijuotis į
specializuotus ląstelių tipus. Jas galima rasti embrionuose ir suaugusiųjų audiniuose (Passier ir
Mummery, 2003; Orkin ir Zon, 2006; Wang ir Wagers, 2011). Suaugusiųjų kamieninės ląstelės, dar
vadinamos somatinėmis kamieninėmis ląstelėmis, yra nediferencijuotos ląstelės, aptinkamos tarp
12
diferencijuotų ląstelių audinyje arba organe. Pagrindinės suaugusiųjų kamieninių ląstelių funkcijos
yra organizmo audinių palaikymas ir atstatymas (Passier ir Mummery, 2003). Kamieninės ląstelės
laikomos ląstelių hierarchijos viršuje, iš jų kyla progeninės ląsteles (nesubrendusios ląstelės),
kuriose diferenciacija ir proliferacija vyksta tol, kol tampa brandžiomis specializuotomis ląstelėmis
(Wobus ir Boheler, 2005; Wang ir Wagers, 2011).
Kamieninės ląstelės tapo mokslinių tyrimų susidomėjimo ebjektu dėl jų gebėjimo
diferencijuoti ir likti kamieninėmis ląstelėmis arba tapti specializuotomis ląstelėmis, tokiomis kaip
raumenų ląstelės, raudonieji kraujo kūneliai ir kepenų ląstelės. Kamieninės ląstelės gali būti
naudojamos žaizdų gijimui, ląstelių terapijai ir vaistų terapijoms gydyti ir turėti potencialą
išsivystyti į dirbtinius organus (Arwert ir kt., 2012; Jin ir kt., 2013; Choi ir kt.,2013; Leonardi ir kt.,
2012). Keletas mokslininkų pasinaudojo DEP technologija kamieninių ląstelių izoliavimui ir
atskyrimui. Naujausi DEP taikymai moksliniams tyrimams apima:
Kamieninių ląstelių diferenciaciją (Nourse ir kt., 2014; Song ir kt., 2015; Bajaj ir kt., 2013).
Ląstelių frakcionavimą (Vykoukal ir kt., 2008).
Ląstelių izoliavimą ir išskirstymą (Flanagan ir kt., 2008)
Kamieninių ląstelių tyrimuose labai svarbu diferenciacija, frakcionavimas, izoliavimas ir
rūšiavimas. Kamieninės ląstelės turi būti diferencijuojamos nuo progeninių, diferencijuotų ir kitų
ląstelių. Komercializuotoms ląstelių rūšiavimo sistemoms, pvz., tėkmės citometrijos, fluorescencija
aktyvintų ląstelių skirstymui (angl, fluorescence-activated cell sorting, sutr. FACS) (Mayer ir kt.,
2010) ir magnetu žymėtų ląstelių skirstymui (angl. magnetic-activated cell sorting, sutr. MACS)
(Cumova ir kt., 2010) reikia ląstelių paruošimo, o DEP – tai paprastas ir ekonomiškas būdas, kurį
galima naudoti šioje srityje.
DEP gali būti naudojama kamieninių ląstelių stebėjimui, charakterizavimui, atskyrimui ir
rūšiavimui net kompleksinėse kultūrose. DEP metodas turi daugiau privalumų ląstelių
identifikavimui ir diferenciacijai, lygintant su kitais metodais (Flanagan ir kt., 2008).
1.5.3. Vaistų pernaša
Vaistų absorbciją ląstelėse lemia vaisto fizikinės ir cheminės savybės ir formulė. Kuo
mažesni dalelių dydžiai, tuo lengviau vaistai absorbuojami sistemoje. Kiti veiksniai, turintys įtakos
absorbcijos spartai, apima molekulės lipidų tirpumą, dydį, jonizacijos laipsnį ir absorbcinio
paviršiaus plotą (Labiris ir kt., 2003; Farokhzad ir Langer 2009; Fang ir kt., 2013). Vaistai gali būti
absorbuojami į ląsteles pasyviosios difuzijos, palengvintos difuzijos, aktyvaus transportavimo arba
pinocitozės būdu. Pasyvi difuzija įvyksta tada, kai vaistai išsklaido ląstelių membraną nuo didelės
koncentracijos iki mažos koncentracijos, pavyzdžiui, narkotikų sklaidos nuo virškinimo trakto
13
skysčių iki kraujo. Difuzijos greitis priklauso nuo koncentracijos gradiento (Thomas ir kt., 2004;
Danhier ir kt., 2010).
Dauguma vaistų yra silpnos organinės rūgštys arba bazės, o kai kurie vaistai yra tirpūs
lipiduose. Vaisto fizikinės ir cheminės savybės lemia patekimo greitį (Lipinski ir kt., 2012).
Supaprastinta difuzija atsiranda tada, kai vaistų molekulės, turinčios mažai tirpių lipidų, įsiskverbia
į ląstelių membraną, sudarydamos nešiklio substrato kompleksą ir išsklaidydamos į ląsteles. Kita
vertus, aktyviam transportui reikia energijos, kad vaistus būtų galima transportuoti į ląstelę.
Aktyvus transportas yra selektyvus ir gali apimti vaistų transportavimą prieš koncentracijos
gradientą, pavyzdžiui, nuo mažos koncentracijos pusės iki didelės koncentracijos pusės (Bermejo ir
Gonzalez-Alvarez, 2008). Aktyvus transportas paprastai vyksta su endogeninėmis medžiagomis,
pvz., vitaminais, cukrumi ir amino rūgštimis. Pinocitozė pasitaiko retai, išskyrus vaistus, kurių
sudėtyje yra baltymų. Pinocitozės metu ląstelių membrana įsigaubia ir uždaro skystį ar daleles, o
tada vėl susijungia, suformuodama pūslę, kuri vėliau atsiskiria ir juda į ląstelių vidų (Griffiths ir
Campbell, 2015).
Įrodyta, kad DEP metodas yra naudingas vertinant ir analizuojant vaistus. DEP buvo
naudojamas kaip neinvazinis diagnostikos metodas, skirtas įvertinti vaisto pristatymą. Naudojant
DEP, membranos ir citoplazmos laidumas gali būti nustatomi pagal ląstelių elektrofiziologinį
aktyvumą. Kaip jau minėta, ląstelių membranos joninis disbalansas sukuria potencialo gradientą,
sukeldamas ląstelių membranos elektrinės talpos pokyčius, įtakojančius vaisto įvedimo į ląsteles
efektyvumą. Vaistų pristatymo tyrimuose DEP metodas buvo naudojamas siekiant įvertinti vaistų
veiksmingumą, ląstelių gyvybingumą ir vaistų perfuziją į ląsteles. DEP gali būti taikomas kaip
naujas in vivo metodas, skirtas stebėti toksiškumą, pristatymą, vystymąsi ir atranką vienos ląstelės
lygiu (Hsiung ir kt., 2011; Pethig, 2013; Chan ir kt., 2013).
DEP metodas buvo naudojamas stebėti vaistinio preparato sąveiką ląstelėje, keičiant
ląstelių membranos talpą (Mahabadi ir kt., 2014). Be to, mikroelektrodų matricos sukūrė silpnus
elektroterminius sūkurius, kurie palaiko efektyvų vaisto maišymą ir greitą ląstelių imobilizavimą.
Dėl to vaistų poveikis gali būti tiesiogiai vaizduojamas ir kiekybiškai įvertinamas, kad būtų galima
atlikti realaus laiko analizę ir kiekybinį užprogramuotos ir atsitiktinės ląstelės mirties tyrimą
(Khoshmanesh ir kt., 2011). Kalbant apie vaistų tikrinimą, vienodam ląstelių modeliavimui ir
stabiliam vaistų perfuzijos pritaikymui, buvo naudojamos DEP plokščios interdigituotos žiedo
elektrodų (angl. planar interdigitated ring electrode, sutr. PIRE) matricos. Rezultatai buvo
lygiaverčiai tradiciniam metodui; tačiau taikant DEP metodą bandymui atlikti reikia tik nedidelio
kiekio ląstelių, o tai labai svarbu klinikiniuose tyrimuose (Hsiung ir kt., 2011).
14
1.5.4. Virusai
Virusai yra labai maži nanometrinio dydžio organizmai. Tai paprasčiausia organizmų
forma, nes jos struktūra turi tik genetinę medžiagą. Daugeliu virusų arba virionų (virusų dalelių) yra
trys pagrindinės dalys – nukleino rūgštis, kapsidė ir apvalkalas. Priklausomai nuo viruso tipo,
virusai turi genetines medžiagas kaip RNR arba DNR, nes kapsidės arba baltymo funkcija yra
padengti ir apsaugoti nukleino rūgštį. Apvalkalo struktūra yra tik tam tikruose virusuose, siekiant
apsaugoti kapsides (Kieff ir kt., 1979; Rossmann ir kt., 1989; Chandran ir Nibert, 2003).
Virusai dauginasi šeimininkų ląstelių viduje. Paprastai virusai įdeda savo genetinę
medžiagą į šeimininko ląsteles ir pradeda daugintis (Turner ir kt., 1999). Kai ląstelės šeimininkės
lizuoja, virusas užkrečia kitas ląsteles ir galiausiai įsiveržia į šeimininko organą arba sistemą. Kai
kurie virusai gali išlikti neaktyvūs užkrėstose ląstelėse ilgą laiką be jokių akivaizdžių jų ląstelių
šeimininkių pokyčių; tačiau kai būklė tampa palanki, infekcija gali vėl pasikartoti (Carr ir kt.,
2001). Atlikti virusų DEP tyrimai:
Virusų detekcijai ir sulaikymui (Nakano ir kt., 2015).
Virusų izoliavimui, detekcijai ir viruso sukoncentravimui (Ding ir kt., 2016).
Virusų išgryninimui (Masuda ir kt., 2014).
Kadangi virusai yra nedideli, kai kurios ūminės virusinės infekcijos gali sukelt i
asimptomines sąlygas (Virgin, 2014; Prill ir kt., 2012). Be to, mažos virusų koncentracijos mėginiai
gali sukelti klaidingus neigiamus rezultatus. Yra daug imunologinių metodų ir tyrimų su jautriais
virusų aptikimo detektoriais, tokiais kaip radioimunoanalizė (angl. radioimmunoassay, sutr. RIA),
srauto įpurškimo analizė (angl. flow injection analysis, sutr. FIA), fermento imunologinis tyrimas
(angl. enzyme immunoassay, sutr. EIA) ir su fermentu susijęs fluorescencijos tyrimas (angl. enzyme-
linked fluorescence assay, sutr. ELFA) (Krejcova ir kt., 2012; Barzon ir kt., 2013; Heiat ir kt., 2014;
Heirichs ir kt., 2016). Nepaisant visų šių tradicinių brangių, aukštos kvalifikacijos reikalaujančių
diagnostikos metodų, DEP parodė perspektyvius rezultatus, nustatant, koncentruojant ir atskiriant
virusais užkrėstas ir sveikas ląsteles, matuojant ląstelių elektrines savybes (Rahman ir kt., 2016).
Neseniai mokslininkai pradėjo naudoti virusų gaudymą ir aptikimą naudojant
dielektroforezės impedanso matavimo (angl. dielectrophoretic impedance measurement, sutr.
DEPIM) metodą (Nakano ir kt., 2013; Nakano ir kt., 2015). Keičiant suspensijos skysčio elektrinį
laidumą ir elektrinio lauko dažnį, sugautų virusų skaičius keičiasi. DEP impedanso pakeitimas
atspindi įstrigusių virusų skaičių. Be to, dalelių koncentracijai buvo panaudotas optimizuotas
gradiento izoliatoriaus DEP (angl. gradient insulator-based DEP, sutr. g-iDEP) įtaisas (Ding ir kt.,
2016). G-iDEP skirtas selektyviai fiksuoti įvairias biodaleles įvairiose kanalo vietose. Be to,
aprašytas metodas taikė DEP ir elektrostatines jėgas ant nusodintų vienos sienos anglies
15
nanovamzdelių (angl. single-walled carbon nanotubes, sutr. SWCNTs), kurie gali būti naudojami
kaip imunosensoriai (Singh ir kt., 204). Matavimai buvo atlikti kaip normalizuotas imunosensoriaus
atsparumo padidėjimas, veikiant virusams. IDEP jėga, sukurta sureguliuojant tirpalo laidumą ir
įtampos dažnį, palengvino efektyvų viruso transportavimą neperžengiant elektrodo.
Pastaruoju metu mokslininkai naudojo taškinius elektrodus, skirtus dengės virusu
infekuotoms ląstelėms atskirti (Yafouz ir kt., 2016). Ląstelių dielektrinės savybės buvo kiekybiškai
įvertintos analizuojant šviesos intensyvumo pokytį elektrodo taškiniame regione, remiantis
kaupiamojo modalinio intensyvumo poslinkio (angl. cumulative modal intensity shift) vaizdo
analizės metodu. Unikalus DEP spektras buvo užfiksuotas kiekvienai sveikai ir virusu užsikrėtusiai
ląstelei. Pagrindinis šio metodo privalumas yra tas, kad virusų aptikimas yra netiesioginis,
naudojant DEP atsakų skirtumus užkrėstoms ląstelėms, o ne tiesiogiai aptinkant mažus virusus. Šis
metodas vengia naudoti sudėtingus ženklinimo ir vaizdavimo metodus.
1.6. Ląstelių suliejimas PEG metodu
Polietilenglikolis (PEG) – tai labai hidratuotas, didelės molekulinės masės polimeras,
plačiai naudojamas ląstelių suliejimui. PEG naudojamas somatinių ląstelių hibridų, įskaitant
hibridomas, gamybai (Davidson ir Gerald 1976), kurios yra neatsiejama priemonė genų
identifikavimui, genų ekspresijos ir funkcijos analizei bei vakcinų ir antikūnių gamybai (Lane ir kt.,
1984; Kamarck ir kt., 1984; Cho ir kt, 2002). PEG sukelia ląstelių agliutinaciją ir kontaktą su
ląstelėmis, dėl to atsiranda ląstelių susiliejimas. Tačiau ląstelių susiliejimo išsamūs mechanizmai
nėra žinomi (Lee ir Lentz, 1997).
Dėl savo paprastumo ir atkuriamumo, ląstelių suliejimas su PEG yra geriau nei kiti agentai,
tokie kaip inaktyvuotas Sendai virusas (Harris ir Watkins, 1965) ir lizolecitinas (Croce ir kt., 1971).
Tačiau PEG efektyviai sulieja žinduolių ląsteles per labai siaurą koncentracijos intervalą, jei
koncentracija per didelė arba ląstelės paveikiamos per ilgai, tai ląstelių mirtingumas būna labai
didelis. Dar vienas apribojimas yra tai, kad šiuo būdu sunku sujungti ląsteles, esančias suspensijoje
(Davidson ir Gerald, 1976).
1.7. Ląstelių elektrosuliejimas
Ląstelių suliejimas mokslininkus domina ne tik kaip esminis procesas ląstelės biologijoje,
bet ir kaip naudingas metodas biotechnologijoje ir medicinoje. Dirbtinai sulietos ląstelės gali būti
naudojamos tirti ir gydyti įvairias ligas kaip diabetą (McClenaghan, 2007; McCluskey ir kt., 2011;
Yanai ir kt., 2013), regeneruoti centrinės nervų sistemos aksonus (Sretavan ir kt., 2005) ir gaminti
ląsteles su norimomis savybėmis, pavyzdžiui, kaip ląstelių vakcinos vėžio imunoterapijai (Guo ir
kt., 2008; Koido ir kt.,2010; Avigan ir kt., 2012).
16
Tačiau pirmasis ir labiausiai žinomas ląstelių suliejimo taikymas yra hibridomų
technologija monokloninių antikūnų gamybai, kur hibridinės ląstelių linijos (hibridomos) susidaro
suliejant specifinius antikūnus, gaminančius B limfocitus, su mielomos (B limfocitų vėžiu) ląstelių
linija. Mielomos ląstelės buvo pasirinktos dėl jų gebėjimo augti kultūroje, nes B limfocitai
neišgyvena už savo natūralios aplinkos (Trontelj ir kt., 2008; Vor dem Esche ir kt., 2011).
Iš pradžių naudojant hibridomų technologiją, ląstelių suliejimui buvo naudojamas
polietilenglikolis (PEG) (Golestani ir kt., 2010). Tačiau ląstelių suliejimas, pagrįstas ląstelių
membranos elektroporacija, buvo pasiūlytas kaip veiksmingesnis metodas (Karsten ir kt.,1988; Hui
ir Stenger, 1993; Yu ir kt., 2008). Elektrosuliejimas lyginant su PEG suliejimu pagerino ne tik gautų
susiliejusių ląstelių skaičių, bet ir hibridomų augimo greitį, jos augo geriau nei naudojant PEG
metodą (Karsten ir kt., 1988). Elektrosuliejimas taip pat turi labai didelį potencialą naudoti
hibridomas klinikinėje aplinkoje, nes šiam metodui nereikia virusinių ar cheminių priedų.
Pagal apibrėžimą elektrosuliejimas yra dviejų sąlygų procesas: (I) turi būti glaudus ląstelių
fizinis kontaktas ir (II) ląstelių membranos turi būti susiliejimo būsenoje (Teissie ir Rols, 1986).
Fizinis ryšys tarp ląstelių gali būti pasiektas įvairiais būdais, nors plačiausiai naudojama
dielektroforezė, kurioje ląstelės išsidėsto grandinėlėmis naudojant kintamąjį elektrinį lauką
(Zimmermann, 1982). Dielektroforezė yra dažniausiai naudojama ypač hibridomų technologijoje ir
ląstelių vakcinų gamybai dėl glaudaus ląstelių kontakto suspensijoje (Kanduser M. ir Ušaj M.,
2014).
Antroji elektrosuliejimo sąlyga – membranos susiliejimo būsena – pasiekiama naudojant
elektrinį impulsą, dėl kurio įvyksta struktūrinis lipidų dvisluoksnio pertvarkymas. Pripažįstama, kad
transmembraninis potencialas, kuris susidaro ląstelės membranoje dėl didelio elektrinio lauko,
sumažina energijos barjerą hidrofilinių porų susidarymui lipidų dvisluoksnyje (Kotnik ir kt., 2012),
nors ir kiti aiškinimai gali būti tikėtini (Teissie ir kt., 2005). Šis reiškinys vadinamas elektroporacija
ir yra susijęs su eksperimentiniu būdu pastebimu membranos pralaidumo padidėjimu (Teissie ir kt.,
2005; Kotnik ir kt., 2012). Tuo pačiu metu membranos suliejimas koreliuoja su elektroporacija
(Teissie ir Ramos, 1998). Tiek elektroporacija, tiek susiliejimas gali būti reguliuojami impulsų
amplitude, trukme ir skaičiumi. Būtent minėtų impulsų parametrų didinimas sukelia didesnį
membranos elektroporacijos lygį ir dėl to didesnį susiliejusių ląstelių skaičių (Teissie ir Ramos,
1998). Tačiau elektrinių impulsų parametrai turi būti kruopščiai parinkti taip, kad būtų užtikrinta,
jog elektroporacija yra grįžtama, t. y. ląstelės išgyvena. Nepaisant tokių parametrų, atsiranda
negrįžtama elektroporacija, o tai sumažina ląstelių gyvybingumą.
Tinkamas elektrinio lauko stipris priklauso ir nuo ląstelės dydžio (Sixou ir Teissie, 1990;
Kotnik ir kt., 2012). Vienas iš pagrindinių elektrosuliejimo privalumų yra galimybė optimizuoti
17
elektroporacijos sąlygas kiekvienai ląstelių linijai atskirai. Deja, ląstelių linijų suliejimas, kurios
labai skiriasi savo dydžiu, kelia didelių iššūkių. Elektriniai impulsai, kurie paprastai naudojami
elektrosuliejimui, svyruoja nuo 10 iki 100 ms, tai užtikrina ląstelių membranų įkrovimą impulsų
metu. Esant tokiomis sąlygomis, indukuotas transmembraninis potencialas yra proporcingas ląstelių
spinduliui, o tai reiškia, kad mažos ląstelės elektroporuojamos didesniais elektrinio lauko stiprumais
(Sixou ir Teissie, 1990).
Elektrosuliejimo efektyvumas priklauso ne tik nuo impulso parametrų, bet ir nuo terpės
sudėties (Yu ir kt., 2008), osmoliariškumo (Schmitt ir Zimmermann, 1989; Usaj ir kt., 2013),
temperatūros (Rubene ir Rubinsky, 2017), ląstelių inkubacijos po elektroporacijos (Teissie ir Rols,
1986) ir kitų veiksnių (Blangero ir Teissie, 1985; Perkins ir kt., 1991; Neil ir Zimmermann,1993).
18
2. METODIKA
2.1. Tirpalai ir reagentai
Ląstelės buvo auginamos steriliuose flakonuose augimo terpėje, kuri buvo ruošiama iš
Dulbeko modifikuotos Iglio (sutr. DMEM) terpės (angl. Dulbecco‘s modified Eagle‘s medium;
Produkto nr. D5546, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija), kuri buvo papildoma
fetaliniu veršelio serumu (angl. Fetal bovine serum; sutr. FBS; Produkto nr. F7524, Sigma-Aldrich,
Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija) iki 10 %, ir glutaminu (Produkto nr. G5713, Sigma-Aldrich,
Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija) iki 1 % terpės tūrio. Senos terpės ir žuvusių ląstelių
pašalinimui prieš pakeliant flakone augančių ląstelių viensluoksnį buvo užpilamas 1 ml Dulbeko
fosfatais buferizuotas tirpalas (sutr. DPBS) be Ca+2 ir Mg+2 jonų.
Ląstelės viensluoksnio pakėlimui buvo naudojamas 0,25 % tripsino – 0,02 %
etilendiamino-tetraacetato (EDTA) tirpalas (Produkto nr. T4049, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH,
Steinheim, Vokietija).
Ląstelių suspensijos skiedimui mėgintuvėliuose eksperimentų metu buvo naudojamas 272
mM sacharozės tirpalas (Produkto nr. S9378, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim,
Vokietija). Ląstelių dažymui koncentracijai suspensijoje nustatyti bei eksperimentams, kurių metu
buvo nustatoma elektroporuotų ląstelių dalis, buvo naudojamas 0,4 % tripano mėlio (Produkto nr.
T8154, Sigma-Aldrich, Irvine, Jungtinė Karalystė) dažų tirpalas.
2.2. Ląstelių persėjimas ir jų suspensijos paruošimas
Mikroskopu (Eclipse TS2, Nikon, Tokijas, Japonija) įvertinama, ar ląstelių viensluoksnis
tinkamas eksperimentui. Pradedama ruošti suspensija. Nupilama auginimo terpė. Senos terpės ir
žuvusių ląstelių pašalinimui užpilamas 1 ml Dulbeko fosfatinis buferizuotas tirpalas (sutr. DPBS)
be Ca+2 ir Mg+2 jonų. Turinys išpilamas. Ląstelės užpilamos 2 ml 0,25 % tripsino – 0,02 %
etilendiamino-tetraacetato (EDTA) tirpalu ir inkubuojamos 2 minutes, kad ląstelės atkibtų nuo
flakono paviršiaus. Išimtos ląstelės, po inkubacinio laikotarpio, lengvai papurtomos, kad visos
ląstelės atkibtų nuo paviršiaus. Neatkibimo atveju ląstelės vėl gali būti trumpam laikui
inkubuojamos, tačiau kuo ilgiau ląstelės laikomos tripsino tirpale tuo didesnė tikimybė pažeisti
ląstelių membraną, nes tripsino-EDTA tirpalas ardo ląstelių membranos baltymus (Hadi ir kt.,
2014). Tripsino inaktyvacijai įpilama 2 ml ląstelių augimo terpės. Visas turinys yra perpilamas į 15
ml talpos sterilų eppendorf mėgintuvėlį, kuris centrifuguojamass 1 min. 1000 aps./min centrifugoje
(LMC-3000, Biosan, Latvija). Nusėdusios ląstelės matomos mėgintuvėlio dugne. Jeigu
mėgintuvėlyje esantis tirpalas yra neskaidrus, reikia dar kartą nucentrifuguoti 1 min. prie 1000
19
aps./min. Gautas supernatantas automatinės eppendorf pipetės pagalba nusiurbiamas. Ant ląstelių
užpilamas 272mM sacharozės tirpalas. Gaunama ląstelių suspensija. Tačiau prieš eksperimentuojant
turi būti įvertintas ląstelių skaičius, esantis suspensijoje.
2.2.1 pav. Ląstelių suspensijos paruošimas. (Modifikuota, šaltinis:
http://www.irvinesci.com/protocol-for-amniotic-fluid-stem-cell-expansion)
Tam padaryti naudojamas Neubauerio hemocitometras (Neubauer improved, Heinz Herenz
Medizinalbedarf, Hamburgas, Vokietija). 90 μl 0,4 % tripano mėlio dažų tirpalas sumaišomas su
10μl paruoštos suspensijos. Turinys gerai išpipetuojamas ir įleidžiamas į jau paruoštą Neubauerio
hemocitometrą.
Pro mikroskopą suskaičiuojamos gyvos ląstelės. Gyvos ląstelės išlieka baltos, o žuvusios
nusidažo mėlyna spalva. Apskaičiuojama ląstelių koncentracija mililitre pagal formulę (2.2.2 pav.).
Įvertinamas ląstelių skaičius. Pagal poreikį įpilama sacharozės tirpalo į paruoštą ląstelių suspensiją,
kad tyrimų metu suspensiją sudarytų 2,5 milijonai ląstelių 1 mililitre.
n= A * B * 104, (2.2.2 pav.)
kur n – gyvų ląstelių skaičius, esantis pradinės suspensijos mililitre, A – vidutinis ląstelių skaičius
Neubauerio hemocitometro kameros kampiniame laukelyje (t. y. vidutinis ląstelių skaičius 0,0001
ml), B – suspensijos praskiedimo tripano mėliu laipsnis.
Į 25 cm2 ploto, 15 ml tūrio flakono (Produkto Nr. 90026, TPP Techno Plastic Products,
Trasadingen, Šveicarija) persėjama ląstelių linija, prieš tai į jį įpilama 4 ml ląstelių augimo terpės
papildytos 10 % embrioniniu jaučio serumu ir 1 % L –glutamino tirpalu. Lengvais judesiais terpė su
ląstelėmis paskirstoma po flakono paviršių ir patalpinama į inkubatorių (INCOmed, Memmert,
20
Vokietija), kur palaikoma didelė drėgmė (95 %), optimali 37 oC temperatūra ir 5 % CO2
koncentracija.
2.3. Elektroporuotų ląstelių dalies nustatymas
Iš paruoštos ląstelių suspensijos paimama 20 μl ląstelių suspensijos ir patalpinama tarp
elektrodų (BTX, Holliston, JAV). Svarbu, kad suleidžiama ląstelių suspensija liestų abu elektrodus.
Paleidžiami nustatyto skaičiaus nustatytos amplitudės stačiakampio formos elektriniai impulsai. Po
elektrinio impulso greitai išimama ląstelių suspensiją ir patalpinama į centrifūginį mėgintuvėlį su
jau įpiltais tripano mėlio dažais. Turinys gerai išpipetuojamas ir įleidžiamas į jau paruoštą
Neubauerio hemocitometrą. Mikroskopu įvertinamas nusidažiusių ir nenusidažiusių ląstelių
skaičius.
2.4. Ląstelių elektrosuliejimo eiga
Iš paruoštos ląstelių suspensijos, sacharozės tirpale, paimamas 20 µl tūris ir perkeliamas
tarp elektrodų. Paleidžiama pasirinktos įtampos ir laiko dielektroforezė su jau nustatytais
elektroporacijos parametrais (impulsų skaičius, trukmė ir amplitudė). Po elektroporacijos vėl
paleidžiama kintamoji srovė pasirinktą laiką. Pasibaigus dielektroforezei iš elektrodų paimama
ląstelių suspensija ir perkeliama į Petri lėkštelę, inkubuojama 10 minučių. Po inkubacijos ląstelės
perkeliamos į Neubauerio kamerą tam, kad būtų galima ląsteles skaičiuoti vienodame plote visų
eksperimentų metu.
2.4.1 pav. Pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimo tyrimų schema.
21
2.5. ECM 2001 elektromanipuliatorius
Elektrosuliejimui yra labai svarbūs elektromanipuliatoriaus techniniai duomenys.
Eksperimentų metu naudotas ECM 2001 elektromanipuliatorius (BTX ECM 2001, Holliston, JAV)
yra su fiksuotu 1 MHz dažniu, o kintamąją srovę dielektroforezei galima leisti nuo 0 iki 99
sekundžių reguliuojant įtampą nuo 0 iki 75 V. Galima nustatyti kintamosios srovės paleidimą po
elektroporacijos nuo 0 iki 9 sekundžių, tačiau kiekvieną sekundę įtampa sumažėja 1/10 dalimi.
Elektroporacijos įtampą galima nustatyti nuo 10 iki 3000 V, jei elektrinio impulso trukmė
yra nuo 1 iki 99 µs, o jeigu impulso trukmė yra nuo 0,01 iki 99 ms, tuomet įtampą galima reguliuoti
10 – 500 V intervale. Be to galima nustatyti elektroporacijos impulsų skaičių nuo 0 iki 9 kartų.
Elektrosuliejimui naudoti BTX nerūdijančio plieno elektrodai pritvirtinti prie stiklinės
plokštelės. Tarpas tarp elektrodų 1 mm. Tokie elektrodai dažniausiai naudojami ląstelių suliejimui.
2.5.1 pav. ECM 2001 elektromanipuliatorius 2.5.2 pav. Elektrodai ant objektyvinio stikliuko
2.6. Eksperimentinių rezultatų apdorojimas
Gauti eksperimentiniai rezultatai atvaizduojami grafikais, padarytais su SigmaPlot 12.0
(Systat Software, Point Richmond, CA, USA) programa. Apskaičiuotas gautų rezultatų imties
vidurkio standartinis nuokrypis ir imties vidurkio paklaidos, įvertintas duomenų patikimumas.
Imties vidurkio standartinis nuokrypis (2.6.1) apskaičiuotas pagal formulę:
(2.6.1)
Kur n – matavimų skaičius, – eksperimentų vertės, – matavimų vidurkis:
22
3. REZULTATAI
3.1. Ląstelių dydžių įvertinimas
Šio darbo tikslas buvo optimizuoti dielektroforezės ir elektroporacijos parametrus siekiant
nustatyti geriausias sąlygas pelės hematomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimui.
Eksperimentams naudojamas izotoninis sacharozės tirpalas, kuriame paruošiama ląstelių
suspensija tam, kad dielektroforezės metu būtų išvengta konvekcijos.
Pirmiausia, atliekami ląstelių diametro matavimai, siekiant įvertinti ar eksperimento eigoje
ląstelės esančios sacharozės tirpale nekeičia savo dydžio, nes ląstelės paviršiaus plotas turi įtakos
ląstelių elektrosuliejimo efektyvumui. Buvo paruošta ląstelių suspensija DMEM terpėje ir ląstelių
suspensija sacharozės tirpale. Ląstelių suspensija esanti sacharozės tirpale buvo matuojama du
kartus, t.y. iškart po suspensijos paruošimo ir praėjus vienai valandai. Kiekvienu atveju buvo
išmatuota 100 ląstelių naudojant Infinity Analyze (Luminera Software, Otava, Kanada) programą
bei apskaičiuotos standartinės paklaidos.
Išmatavus ląsteles, nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A vidutinis ląstelių diametras
sacharozės tirpale iš karto po suspensijos (3.1.1 pav.) paruošimo yra 13,73 ±1,5 µm, o atitinkamai
vidutinis spindulys 6,87 ±0,8 µm. Mažiausias išmatuotas skersmuo buvo 10,38 µm, didžiausias –
17,01 µm. Ląstelių vidutinis diametras sacharozės tirpale po valandos (3.1.2 pav.) buvo 13,75 ±1,9
µm, o vidutinis spindulys 6,88 ± 0,1 µm. Mažiausias išmatuotas skersmuo 10,12 µm, didžiausias –
19,91 µm.
3.1.1 pav. Ląstelių pasiskirstymas pagal dydį
sacharozės tirpale. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis nuokrypis lygus 13,73 ±1,5 µm.
3.1.2 pav. Ląstelių pasiskirtymas pagal dydį
sacharozės tirpale po valandos. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis nuokrypis lygus 13,75 ±1,9
µm.
23
Išmatuotų ląstelių vidutinis diametras ląstelių augimo terpėje paruoštoje DMEM pagrindu
(3.1.3 pav.) yra 13,82 ±2,1 µm. Didžiausias išmatuotas skersmuo – 21,51 µm, mažiausias – 8,50
µm, spinduliai atitinkamai 8,55 µm ir 4,25 µm.
3.1.3 pav. Ląstelių pasiskirstymas pagal dydį DMEM terpėje. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis
nuokrypis lygus 13,82 ±2,1 µm.
3.1.4 pav. Pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos vidurkiai. 1 – Ląstelių diametrų vidurkis, kuomet ląstelių suspensija paruošta sacharozės tirpale. 2 – Ląstelių suspensija DMEM augimo terpėje. 3 – Ląstelių
diametrų vidurkiai paskaičiuoti po 1 valandos sacharozės tirpale.
Gauti rezultatai (3.1.4 pav.) parodo, kad ląstelių, esančių sacharozės tirpale, vidutinis
diametras nekinta laike lyginant su vidutiniu ląstelių diametru DMEM terpėje, tai rodo, kad
paruoštas sacharozės tirpalas yra izotoninis.
24
3.2. Kintamo elektrinio lauko stiprio nustatymas ląstelių dielektroforezei
Išmatavus ląstelių diametro pokyčius sacharozės tirpale ir nustačius, kad sacharozės
tirpalas neturi įtakos ląstelių diametrui eksperimentų eigoje, toliau reikėjo nustatyti, kokiam
kintamo elektrinio lauko stipriui esant ląstelės pradeda išsidėstyti sacharozės tirpale į „perlų“
grandinėles. Ląstelių dielektroforezės efektyvumui nustatyti buvo naudojamas 1MHz dažnio, 30 ir
60 sekundžių trukmės, įvairių amplitudžių kintamas elektrinis laukas. Dielektroforezės trukmės
buvo pasirinktos 30 ir 60 sekundžių atsižvelgiant į padarytus eksperimentus su CHO ląstelių linijos
elektrosuliejimu (Usaij ir kt.,2012).
Iš turimos ląstelių suspensijos imama 20 µl ląstelių suspensijos ir patalpinama tarp
elektromanipuliatoriaus elektrodų – svarbu, kad suleidžiamas tirpalas liestų abu elektrodus.
Paleidžiama nustatyta kintamosios srovės įtampa atitinkamą laiką.
Gauti rezultatai parodo, kad naudojant 10 V/cm ir 20 V/cm kintamojo elektrinio lauko
stiprį ir srovę paleidus 30 sekundžių (3.2.1 pav.), galima pastebėti, kad pavienės ląstelės sukimba
tarpusavyje, tačiau ląstelių suspensijoje ląstelės neišsidėsto į „perlų grandinėles“, o tai rodo, kad
dielektroforezė nėra efektyvi ir ląstelių elektrosuliejimui netinka.
3.2.1 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 10 V/cm, trukmė
30 sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 20 V/cm, trukmė 30 sekundžių.
Panaudojus 30 V/cm ir 40 V/cm kintamojo elektrinio lauko stiprį 30 sekundžių (3.2.2
pav.), galima pastebėti, kad ląstelės pradeda formuoti „perlų grandinėles“, tačiau tik maža dalis
ląstelių susikimba tarpusavyje. Tai neužtikrina glaudaus ląstelių fizinio kontako, reikalingo ląstelių
elektrosuliejimui suspensijoje.
25
3.2.2 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 30 V/cm, trukmė 30
sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 40 V/cm, trukmė 30 sekundžių.
Kintamojo elektrinio lauko stiprį padidinus iki 50 V/cm, ląstelės išsidėsto sacharozės
tirpale per maždaug 20 sekundžių, tačiau per visą 30 sekundžių periodą susidariusios „perlų
grandinėlės“ yra pavienės ir suspensijoje dar yra likusi didelė nesukibusių ląstelių dalis (pav. 3.2.3).
Prailginus kintamosios srovės tekėjimo laiką iki 60 sekundžių, pastebima, kad ląstelių suspensijoje
beveik nebelieka pavienių ląstelių.
3.2.3 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 50 V/cm, trukmė 30
sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 50 V/cm, trukmė 60 sekundžių
Nors 50 V/cm kintamojo elektrinio lauko stipris leidžiamas 60 sekundžių užtikrina glaudų
fizinį kontaktą tarp ląstelių, buvo nuspręsta išbandyti ir didesnes kintamosios srovės įtampas. Gauti
rezultatai (3.2.4 pav.) parodė, kad dar efektyvesnį DEP reiškinį, kai kintamojo elektrinio lauko
stipris yra 100 V/cm ir leidžiamas 30 bei 60 sekundžių. Ląstelių suspensijoje beveik nebelieka
pavienių ląstelių, o „perlų grandinėlės“ sukimba tarpusavy, taip užtikrindamos fizinį kontaktą
tarpusavyje.
26
3.2.4 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 100 V/cm,
trukmė 30 sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 100 V/cm, trukmė 60 sekundžių.
Taip pat buvo išbandytos ir aukštesnės įtampos, tačiau kai buvo 15 V AC įtampa
(kintamojo elektrinio lauko stipris 150 V/cm) leidžiama 30 sekundžių, eksperimento eigoje
sacharozės tirpalas dėl konvekcijos įkaista ir išgaruoja.
3.3. Ląstelių permeabilizavimo efektyvumo nustatymas
Siekiant optimizuoti ląstelių elektrosuliejimą, pirmiausia buvo atlikti ląstelių
elektroporacijos efektyvumo tyrimai. Elektroporacija buvo nustatoma pagal permeabilizavimo
tripano mėliui efektyvumą. Žinoma, kad po elektrinio impulso, ląstelės membranoje
susiformavusios poros, išnyksta ne iš karto (Weaver, 1994). Priklausomai nuo elektrinio impulso
parametrų, porų išnykimo procesą galima suskirstyti į tris grupes: (I) greitas porų dydžio
sumažėjimas (< 1 s); (II) lėtas porų dydžio sumažėjimas (kelios minutės); (III) visiškas porų
išnykimas (> 10 min.) (Saulis ir kt., 1991). Todėl efektyvumui nustatyti buvo naudojami tripano
mėlio dažai, kurie prasiskverbia pro membraną, kai ji yra pažeista. Po elektroporacijos, ląstelių
suspensija išimta iš elektrodų buvo iš kart talpinama į centrifūginius mėgintuvėlius su dažais ir pro
mikroskopą įvertinamas nusidažiusių ląstelių skaičius.
Gauti rezultatai rodo (3.3.1 pav.), kad elektro permeabilizacijos tripano mėliui
efektyvumas ląsteles paveikus stačiakampio formos 600 V/cm aplitudės, 100 µs trukmės vienu
elektriniu impulsu siekia tik 7,25 ±3,2%, o paveikus ląsteles devyniais, tokios pačios amplitudės ir
trukmės elektriniais impulsais – elektroporacijos efektyvumas išauga iki 84,70 ±1,6% . Panaudojus
vieną stačiakampio formos 1.5 kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektrinį impulsą,
elektroporacijos efektyvumas siekia 61,49 ±8,9%, o impulsą paleidus devynis kartus, efektyvumas
išauga iki 97,81 ±0,8%. Atsižvelgus į rezultatus, vėlesniems eksperimentams buvo nuspręsta
naudoti po 5 ir 9 tų pačių amplitudžių ir trukmės elektrinius impulsus.
27
3.3.1 pav. Elektroporacijos efektyvumas nustatytas permeabilizacijos tripano mėliui metodu. Elektrinių impulsų trukmė 100 µs, dažnis 1MHz. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas
eksperimentinis taškas yra 3 eksperimentų vidurkis ± vidutinis standartinis nuokrypis.
3.4. Elektrinio impulso amplitudės optimizavimas ląstelių elektrosuliejimui
Nustačius tinkamiausią elektrinio lauko stiprį dielektroforezei, reikėjo nustatyti tinkamą
impulso amplitudę elektroporacijai, siekiant sulieti ląsteles. Tam buvo naudojami stačiakampio
formos 0,6, 0,8, 1 1,2 ir 1,5 kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektriniai impulsai. Elektrosuliejimo
efektyvumą lemia ne tik elektrinio lauko stipris, ląstelės forma, dydis, temperatūra, bet ir
paleidžiamų elektrinių impulsų skaičius, bei ląstelių inkubacija po jų (Yu ir kt., 2008; Teissie ir
Rols, 1986).
Tačiau norint sužinoti, kad DEP pritaikymas lemia efektyvenį ląstelių susiliejimą, reikėjo
išsiaiškinti kokiu efektyvumu ląstelės susilieja netaikant dielektroforezės. Todėl buvo atlikti
eksperimentai su stačiakampio formos 0,6, 1 ir 1.2k V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektriniais
impulsais. Pasirinktas impulsų skaičius buvo 5 ir 9, nes naudojant vieną 100 µs trukmės
stačiakampio formos elektrinį impulsą, elektroporacijos efektyvumas nedidelis.
28
Gauti rezultatai parodė (3.4.1 pav.), kad efektyviausiai ląstelės susilieja panaudojus 9
stačiakampio formos 1.2kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus, susiliejusių
ląstelių dalis – 2,25 ±0,2%, mažiausiai susiliejusių ląstelių buvo panaudojus 5 stačiakampio formos
600V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus, susiliejusių ląstelių dalis – 1,17 ±0.2%.
3.4.1 pav. Ląstelių elektrosusiliejimas nenaudojant DEP. Ląstelėms sulieti buvo naudojami skirtingų amplitudžių elektriniai impulsai po 5 (●)ir 9 (■)kartus. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas
eksperimentinis taškas yra 3 eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.
Siekiant maksimaliai efektyvaus ląstelių susiliejimo dielektroforezė buvo naudojama ne tik
prieš elektroporaciją, bet ir po jos. Po elektroporacijos vėl pradėti dielektroforezę vidutiniškai
užtrunka 5 sekundes.
Eksperimentams atlikti naudoti 5 ir 9 stačiakampio formos 0,6, 0,8, 1,0, 1.2 ir 1.5 kV/cm
amplitudės, 100 µs trukmės elektriniai impulsai. Pasirinktas dielektroforezės laikas 30 ir 60
sekundžių prieš ir po elektroporacijos, todėl pilnas dielektroforezės laikas yra 60 ir 120 sekundžių.
Pirmiausia atlikti bandymai buvo naudojant 5 elektrinius impulsus su skirtingais elektrinio
lauko stipriais. Kintamoji srovė buvo leidžiama 30 ir 60 sekundžių.
Gauti rezultatai parodo (3.4.2 pav.), kad daugiausiai ląstelių susilieja – 5,27 ±0,2%, kai
stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinis impulsas yra paleidžiamas 5
kartus, o DEP taikomas 60 sekundžių prieš ir po elektroporacijos. Mažiausia susiliejusių ląstelių
dalis – 1,01 ±0,1%, kai stačiakampio formos 600 V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinis
impulsas yra paleidžiamas 5 kartus, o DEP taikomas 30 sekundžių prieš ir po elektroporacijos.
Panaši ląstelių elektrosusiliejimo dalis gauta, kai dielektroforezė taikyta 30 ir 60 sekundžių
29
naudojant penkis stačiakampio formos 800 V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus,
susiliejusių ląstelių dalis buvo 1,92 ±0,3% ir 1,90 ±0,6 atitinkamai.
3.4.2 pav. MH-22A ląstelių elektrosusiliejimo priklausomybė nuo elektrinio lauko stiprio ir dielektroforezės
laiko. Elektrinis impulsas taikytas 5 kartus. Eksperimento metu buvo naudojama 30 sekundžių (■) DEP ir 60
sekundžių (●) DEP. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3
eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.
Kuomet elektroporacijai naudojami devyni elektriniai impulsai, rezultatai parodo (3.4.3
pav.), kad didžiausia susiliejusių ląstelių dalis (8,80 ± 0,6%) gaunama, kai panaudojami devyni
stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektriniai impulsai kartu su 60
sekundžių dielektroforeze prieš ir po elektroporacijos. Mažiausia susiliejusių ląstelių dalis – 1,33
±0,2% gaunama, kai elektrinio lauko stipris 600 V/cm, o dielektroforezė taikoma 30 sekundžių
prieš ir po elektroporacijos.
3.4.3 pav. Ląstelių elektrosuliejimo priklausomybė nuo elektrinio lauko stiprio ir dielektroforezės laiko.
Elektrinis impulsas taikytas 9 kartus. Eksperimento metu buvo naudojama 30 sekundžių (■) DEP ir 60 sekundžių (●) DEP. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3
eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.
30
Ląstelių susiliejimą galima suskirstyti i tris pagrindines fazes: (A) tarp ląstelių turi būti
glaudus fizinis kontaktas, (B,C) ląstelių citoplazmų susiliejimas, kai ląstelių membranos yra
susiliejimo būsenoje, (D) pilnas ląstelių membranų ir susiliejimas.
3.4.4 pav. Ląstelių susiliejimo fazės. (A) Glaudus fizinis kontaktas tarp ląstelių, (B,C) Citoplazmų
susiliejimas, (D) Pilnas ląstelių susiliejimas.
Palyginus visus gautus rezultatus, matoma, kad efektyviausias ląstelių elektrosusiliejimas
vyksta, kuomet stačiakampio formos 1.5kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektrinis impulsas
paleidžimas 9 kartus, o dielektroforezė taikoma 60 sekundžių prieš ir po elektroporacijos.
Mažiausiai susiliejusių ląstelių pastebima, kuomet stačiakampio formos 600V/cm amplitudės, 100
µs trukmės elektrinis impulsas paleidžiamas 5 kartus, o dielektroforezė taikoma 30 sekundžių prieš
ir po elektroporacijos.
3.4.5 pav. Ląstelių elektrosusiliejimo efektyvumo palyginimas. (A) Dielektroforezė taikoma 30 ir 60
sekundžių, naudoti 5 elektriniai impulsai su skirtingomis stačiakampio formos elektrinio impulso
amplitudėmis. (B) Dielektroforezė taikoma 30 ir 60 sekundžių, naudoti 9 elektriniai impulsai su skirtingomis stačiakampio formos elektrinio impulso amplitudėmis. Elektrinio impulso trukmė 100 µs, dielektroforezės
dažnis 1Mhz. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3
eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.
31
4. IŠVADOS
1. Nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A ląstelių liniją paveikus 100 V/cm kintamosios
srovės elektriniu lauku 30 ir 60 sekundžių, ląstelės efektyviai išsidėsto į „perlų“ grandinėles,
o perlų grandinėlės dar jungiasi tarpusavyje taip sukurdamos fizinį kontaktą tarp ląstelių.
2. Nustatyta, kad efektyviausias ląstelių elektro permeabilizavimas vyksta, kuomet yra
naudojami 5 ir 9 elektriniai impulsai. Mažiausias ląstelių elektro permeabilizavimas
naudojant 9 elektrinius impulsus, kuomet elektrinio lauko stipris 600 V/cm buvo 84,61 ±3,2
%, didžiausias – 97.80 ± 0,8%, kai elektrinio lauko stipris 1500 V/cm.
3. Nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A ląstelių liniją paveikus devyniais 1,5 kV/cm
amplitudės 100 µs trukmės elektriniais impulsais taikant dielektroforezę 60 sekundžių prieš
ir po elektroporacijos, efektyviausias ląstelių elektrosusiliejimas siekia 8,8±0,6%.
32
LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Aapro M., Arends J., Bozzetti F., Fearon K., Grunberg S.M., Herrstedt J., Hopkinson J.,
Jacquelin-Ravel N., Jatoi A., Kaasa S., Strasser F. (2014) Early recognition of malnutrition
and cachexia in the cancer patient: A position paper of a European School of Oncology Task
Force. Annals of Oncololy., 25: 1492–1499
2. Alshareef M., Metrakos N., Perez E.J., Azer F., Yang F., Yang X., Wang G. (2013)
Separation of tumor cells with dielectrophoresis-based microfluidic chip. Biomicrofluidics,
7, 011803.
3. Arwert E.N., Hoste E., Watt F.M. (2012) Epithelial stem cells, wound healing and cancer.
Nature Reviews Cancer, 12: 170–180
4. Avigan D., Rosenblatt J., Kufe D. (2012) Dendritic/Tumor Fusion Cells as Cancer Vaccines.
Seminars in Oncology 39(3): 287–295
5. Bajaj P., Marchwiany D., Duarte C., Bashir R. (2013) Patterned Three-Dimensional
Encapsulation of Embryonic Stem Cells using Dielectrophoresis and Stereolithography.
Advanced Healthcare Matererials, 2: 450–458
6. Barzon L., Pacenti M., Franchin E., Pagni S., Martello T., Cattai M., Cusinato R., Palù G.
(2013) Excretion of West Nile virus in urine during acute infection. The Journal of
Infectious Diseases., 208, 1086–1092.
7. Bermejo M., Gonzalez-Alvarez I. (2008) How and where are drugs absorbed?
Pharmaceutical Sciences Encyclopedia: Drug Discovery, Development, and Manufacturing
8. Blangero C. ir Teissie J. (1985) Ionic modulation of electrically induced fusion of
mammalian cells. The Journal of Membrane Biology. 86(3): 247–253
9. Carr D.J., Härle P., Gebhardt B.M. (2001) The immune response to ocular herpes simplex
virus type 1 infection. Experimental Biology and Medicine, 226: 353–366
10. Chan C.Y., Huan, P.H., Guo F., Ding X., Kapur V.. Mai J.D., Yuen P.K., Huang T.J. (2013)
Accelerating drug discovery via organs-on-chips. Lab on Chip, 13: 4697–4710
11. Chandran K., Nibert M.L. (2003) Animal cell invasion by a large nonenveloped virus:
Reovirus delivers the goods. Trends in Microbiology, 11:374–382
12. Cho M. S., Yee H., ir Chan S. (2002) Establishment of a human somatic hybrid cell line for
recombinant protein production. Journal of Biomedical Science, 9: 631–638.
13. Choi S.M., Kim Y., Shim J.S., Park J.T., Wang R.H., Leach S.D., Liu J.O., Deng C., Ye Z.,
Jang Y.Y. (2013) Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease
using patient-specific stem cells. Journal of Hepatology, 57: 2458–2468
14. Croce C., Sarvicki W., Kritchevsky D., Koprowski H. (1971). Experimental Cell Research,
67: 427-435
15. Cumova J., Kovarova L., Potacova A., Buresova I., Kryukov F., Penka M., Michálek J.,
Hajek R. (2010) Optimization of immunomagnetic selection of myeloma cells from bone
marrow using magnetic activated cell sorting. International Journal of Hematology, 92:
314–319
33
16. Danhier F., Feron O., Preat V. (2010) To exploit the tumor microenvironment: Passive and
active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. Journal of Controlled
Release, 148: 135–146
17. Davidson R. L. ir Gerald P. S. (1977) Induction of mammalian somatic cell hybridization by
polyethylene glycol. Methods in Cell Biology, 15: 325 - 338
18. Ding J., Lawrence R.M., Jones P.V., Hogue B.G., Hayes M.A. (2016) Concentration of
Sindbis virus with optimized gradient insulator-based dielectrophoresis. Analyst, 141: 1997–
2008.
19. Fang J., Nakamura H., Maeda H. (2011) The EPR effect: Unique features of tumor blood
vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect.
Advanced Drug Delivery Reviews, 63: 136–151
20. Farokhzad O.C., Langer R. (2009) Impact of nanotechnology on drug delivery. ACS Nano,
3, 16–20
21. Flanagan L.A., Lu J., Wang L., Marchenko S.A., Jeon N.L., Lee A.P., Monuki E.S. (2008)
Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem
Cells, 26: 656–665
22. Gachovska T.K., Ngadi M.O., Raghvan G.S.V. (2006) Pulsed electric field assisted juice
extraction from alfalfa. Canadian Biosystems Engineering, 48:3.33–3.37
23. Galanzha E.I., Shashkov E.V., Spring P.M., Suen J.Y., Zharov V.P. (2009) In vivo,
noninvasive, label-free detection and eradication of circulating metastatic melanoma cells
using two-color photoacoustic flow cytometry with a diode laser. Cancer Research, 69:
7926–7934
24. Garnett M.J., Edelman E.J., Heidorn S.J., Greenman C.D., Dastur A., Lau K.W., Greninger
P., Thompson I.R., Luo X., Soare J. (2012) Systematic identification of genomic markers of
drug sensitivity in cancer cells. Nature, 483: 570–575
25. Gascoyne P.R., Shim S. (2014)Isolation of circulating tumor cells by dielectrophoresis.
Cancers, 6: 545–579.
26. Gehl J. (2003) Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene
therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica, 177: 437-447
27. Gehl J., Geertsen P.F. (2006) Palliation of haemorrhaging and ulcerated cutaneous tumours
using electrochemotherapy. European Journal of Cancer - Supplement, 4(11): 35–37
28. Golestani R., Pourfathollah A. A., Moazzeni S. M. (2007) Cephalin as an efficient fusogen
in hybridoma technology: can it replace poly ethylene glycol? Hybridoma. 26(5): 296–301
29. Griffiths S.K. ir Campbell J.P. (2015) Placental structure, function and drug transfer.
Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care and Pain, 15: 84–89
30. Grimi N., Praporscic I., Lebovka N., Vorobiev E. (2007) Selective extraction from carrot
slices by pressing and washing enhanced by pulsed electric fields. Separation and
Purification Technology, 58:267–273
34
31. Guo W., Guo Y., Tang S., Qu H., Zhao, H. (2008) Dendritic Cell-Ewing’s Sarcoma Cell
Hybrids Enhance Antitumor Immunity. Clinical Orthopaedics and Related Research.
466(9): 2176–2183
32. Hadi N.R., Yusif F.G., Yousif M., Jaen K.K. (2014) Both Castration and Goserelin Acetate
Ameliorate Myocardial Ischemia Reperfusion Injury and Apoptosis in Male Rats. ISRN
Pharmacology 2014: 206951
33. Hanahan D., Weinberg R.A. (2011) Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, 144:
646–674
34. Harris H., ir Watkins J. F. (1965) Hybrid cells derived from mouse and man: Artificial
heterokaryons of mammalian cells from different species, Nature 205: 640-646
35. Heiat, M., Ranjbar, R., Alavian, S.M. (2014) Classical and modern approaches used for viral
hepatitis diagnosis. Hepatitis Monthly., 14, e17632
36. Hsiung L. C., Chiang C. L., Wang C. H., Huang Y. H., Kuo C. T., Cheng J. Y., Lin C. H.,
Wu V., Chou H. Y., Jong D. S., Lee H., Wo A.M. (2011) Dielectrophoresis-based cellular
microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab on Chip,
11: 2333–2342
37. Hui S. W., Stenger D. A. (1993) Electrofusion of cells: Hybridoma production by
electrofusion and polyethylene glycol. Methods in Enzymololy 220: 212–227
38. Ismail A., Hughes M., Mulhall H., Oreffo R., Labeed F. (2015) Characterization of human
skeletal stem and bone cell populations using dielectrophoresis. Journal of Tissue
Engineering and Regenerative Medicine, 9: 162–168
39. Yafouz B., Kadri N.A., Rothan H.A., Yusof R. Ibrahim F. (2016) Discriminating dengue-
infected hepatic cells (WRL-68) using dielectrophoresis. Electrophoresis, 37: 511–518
40. Yanai G., Hayashi T., Zhi Q., Yang K.C., Shirouzu Y., Shimabukuro T., Hiura A., inoue K.,
Sumi Sh. (2013) Electrofusion of Mesenchymal Stem Cells and Islet Cells for Diabetes
Therapy: A rat model. PLoS ONE 8(5): e64499
41. Yarmush M.L., Golberg A., Serša G., Kotnik T., Miklavič D., (2014) Electroporation Based
Technologies for Medicine: Principles, Applications, and Challenges. Annual Review of
Biomedical Engineering, 16: 295-320
42. Yu X., McGraw P. A., House F. S., Crowe Jr, J. E. (2008) An optimized electrofusionbased
protocol for generating virus-specific human monoclonal antibodies. Journal of
Immunological Methods, 336(2): 142–151
43. Jin H.J., Bae Y.K., Kim M., Kwon S.J., Jeon H.B., Choi S.J., Kim S.W., Yang Y.S., Oh W.,
Chang J.W. (2013) Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone
marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood as sources of cell therapy. International
Journal of Mololecular Sciences, 14: 17986–18001
44. Kalamiza M. S., Vorobiev E., Miklavčič D. (2014) Electroporation in food processing and
biorefinery. Journal of Membrane Biology, 247: 1279-1304
45. Kamarck M. E., Barker P. E., Miller R. L., Ruddle F. H. (1984) Somatic cell hybrid
mapping panels. Experimental Cell Research, 152: 1–14
35
46. Kanduser M. ir Ušaj M. (2014) Cell electrofusion: Past and future perspectives for antibody
production and cancer cell vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11(12): 1-14
47. Karsten U., Stolley P., Walther I., Papsdorf G., Wber S., Conrad L., Pasternak L., Kopp J.
(1988) Direct comparison of electric field-mediated and PEG-mediated cell fusion for the
generation of antibody producing hybridomas. Hybridoma 7(6): 627–633
48. Khan S.S., Solomon M.A., McCoy J.P. (2005) Detection of circulating endothelial cells and
endothelial progenitor cells by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 64:
1–8
49. Khoshmanesh K., Akagi J., Nahavandi S., Skommer J., Baratchi S., Cooper J.M., Kalantar-
Zadeh K., Williams D.E., Wlodkowic D. (2011) Dynamic analysis of drug-induced
cytotoxicity using chip-based dielectrophoretic cell immobilization technology. Analytical
Chemistry, 83: 2133–2144
50. Kieff E., Given D., Powell A.L.T., King W., Dambaugh, T., Raab-Traub N. (1979) Epstein-
Barr virus: Structure of the viral DNA and analysis of viral RNA in infected cells.
Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer, 560: 355–373
51. Kinosita K. ir Tsong T.Y. (1977) Voltage-induced pore formation and hemolysis of human
erythrocytes.Biochimica et Biophysica Acta. 471: 227-242
52. Koido S., Homma S., Hara E., Namiki Y., Takahara A., Komita H., Nagasaki E., Ito M.,
Ohkusa T., Gong J., Tajiri H. (2010) Regulation of Tumor Immunity by Tumor/Dendritic
Cell Fusions. Clinical Developmental Immunology. 2010: 516768
53. Kotnik T., Kramar P., Pucihar G., Miklavcic D., Tarek M. (2012) Cell Membrane
Electroporation—Part 1: The Phenomenon. IEEE Electrical Insulation Magazine 28: 14–23
54. Kotnik T., Mir L. M., Flisar K., Puc M., Miklavcic D. (2001) Cell membrane
electropermeabilization by symmetrical bipolar rectangular pulses. Part I. Increased
efficiency of permeabilization. Bioelectrochemistry. 54: 83-90
55. Krejcova L., Dospivova D., Ryvolova M., Kopel P., Hynek D., Krizkova S., Hubalek J.,
Adam V., Kizek R. (2012) Paramagnetic particles coupled with an automated flow injection
analysis as a tool for influenza viral protein detection. Electrophoresis, 33: 3195–3204
56. Labiris N., Dolovich M. (2003) Pulmonary drug delivery. Part I: Physiological factors
affecting therapeutic effectiveness of aerosolized medications. British Journal of Clinical
Pharmacology, 56: 588–599
57. Lane R. D., Crissman R. S., Lachman M. F. (1984) Comparison of polyethylene glycols as
fusogens for producing lymphocyte-myeloma hybrids. Journal of Immunology Methods 72:
71–76
58. Lee J., ir Lentz B. R. (1997) Outer leaflet-packing defects promote poly(ethylene glycol)-
mediated fusion of large unilamellar vesicles. Biochemistry 36: 421–431
59. Leonardi D., Oberdoerfer D., Fernandes M.C., Meurer R.T., Pereira-Filho G.A., Cruz, P.,
Vargas M., Camassola M., Nardi N.B. (2012) Mesenchymal stem cells combined with an
artificial dermal substitute improve repair in full-thickness skin wounds. Burns 38: 1143–
1150
36
60. Liang X., Graham K., Johannessen A., Costea D., Labeed F. (2014) Human oral cancer cells
with increasing tumorigenic abilities exhibit higher effective membrane capacitance.
Journal of Integrative Biology, 6: 545–554
61. Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W., Feeney P.J. (2012) Experimental and
computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and
development settings. Advanced Drug Delivery Reviews, 64: 4–17
62. Maček A. Ir Miklavčič D. (2001) Cell electropermeabilization to small molecules in vitro:
control by pulse parameters. Radiology and Oncology. 35(3): 193-202
63. Mahabadi S., Hughes M.P., Labeed F.H. (2014) Measurement of Gifinitib (ZD1839) effect
on electrophysiological properties of head and neck cancer cells using Dielectrophoresis
(DEP). Cancer Research, 74 (Suppl. S19): 3490
64. Mayer G., Ahmed M.S.L., Dolf A., Endl E., Knolle P.A., Famulok M. (2010) Fluorescence-
activated cell sorting for aptamer SELEX with cell mixtures. Nature Protocols, 5: 1993–
2004
65. Marty M., Sersa G., Garbay J.R., Gehl J., Collins C.G., Snoj M. (2006)
Electrochemotherapy—an easy, highly effective and safe treatment of cutaneous and
subcutaneous metastases: results of ESOPE (European Standard Operating Procedures of
Electrochemotherapy) study. European Journal of Cancer - Supplement, 4(11):3–13.
66. Masuda T., Maruyama H., Honda A., Arai F. (2014) Virus Enrichment for Single Virus
Infection by Using 3D Insulator Based Dielectrophoresis. PLoS ONE, 9, e94083
67. McClenaghan N. H. (2007) Physiological Regulation of the Pancreatic B-cell: Functional
Insights for Understanding and Therapy of Diabetes. Experimental Physiology 92(3): 481–
496
68. McCluskey J. T., Hamid M., Guo-Parke H., McClenaghan N. H., Gomis R., Flatt P. R.
(2011) Development and Functional Characterization of Insulin-releasing Human Pancreatic
Beta Cell Lines Produced by Electrofusion. Journal of Biological Chemistry. 286(25):
21982-21992
69. Miklavcic D., Beravs K., Semrov D., Cemazar M., Demsar F., Sersa G. (1998) The
importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of
tissues. Biophysical Journal, 74(5):2152–2158
70. Miklavcic D., Corovic S., Pucihar G., Pavselj N. (2006) Importance of tumour coverage by
sufficiently high local electric field for effective electrochemotherapy. European Journal of
Cancer - Supplement, 4(11): 45–51
71. Mir L.M., Banoun H., Paoletti C. (1988) Introduction of definite amounts of nonpermeant
molecules into living cells after electropermeabilization: direct access to the
cytosol. Experimental Cell Research, 175(1): 15–25.
72. Nakano M., Ding, Z., Suehiro J. (2015) Dielectrophoresis and dielectrophoretic impedance
detection of adenovirus and rotavirus. Japanese Journal of Applied Physics, 55: 017001
73. Nakano M., Obara R., Ding Z., Suehiro J. (2013) Detection of norovirus and rotavirus by
dielectrophoretic impedance measurement. In Proceedings of the 2013 Seventh International
Conference on Sensing Technology (ICST),Wellington, New Zealand, 3–5 December; pp.
374–378
37
74. Neil G. A. ir Zimmermann U. (1993) Electrofusion. Methods in Enzymololy 220: 174–196
75. Nourse J., Prieto J., Dickson A., Lu J., Pathak M., Tombola F., Demetriou M., Lee A.,
Flanagan, L.A. (2014) Membrane biophysics define neuron and astrocyte progenitors in the
neural lineage. Stem Cells, 32: 706–716
76. Orkin S.H., Zon L.I. (2008) Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.
Cell, 132: 631–644
77. Orlowski S., Belehradek J., Paoletti C., Mir L.M. (1988) Transient electropermeabilization
of cells in culture. Increase of the cytotoxicity of anticancer drugs. Biochemical
Pharmacology, 37(24): 4727–4733
78. Passier R., Mummery C. (2003) Origin and use of embryonic and adult stem cells in
differentiation and tissue repair. Cardiovascular Research, 58: 324–335
79. Perkins S., Zimmermann U., Foung S. K. (1991) Parameters to enhance human hybridoma
formation with hypoosmolar electrofusion. Human Antibodies. 2(3): 155–159
80. Pohl H. A. (1951) The motion and precipitation of suspensoids in divergent electric fields.
Journal of Applied Physics, 22(7): 869–871
81. Pohl H. A. Ir Crane J. S. (1971) Dielectrophoresis of cells. Biophysical Journal. 11: 711-727
82. Prill M.M., Iwane M.K., Edwards K.M., Williams J.V., Weinberg G.A., Staat M.A., Willby
M.J., Talbot H.K., Hall C.B., Szilagyi P.G., Griffin M.R., Curns A.T., Erdman D.D. (2012)
Human coronavirus in young children hospitalized for acute respiratory illness and
asymptomatic controls. Pediatric Infectious Disease Journal, 31: 235–240
83. Rahman N., Ibrahim F., Yafouz B. (2016) Dielectrophoresis for biomedical sciences
application: a review, Sensors, 17(3): 449
84. Rols M.P., Teissie J. (1998) Electropermeabilization of Mammalian Cells to
Macromolecules: Control by Pulse Duration. Biophysical Journal, 75: 1415-1423
85. Rols M.P., Teissie J., Electropermeabilization of mammalian cells. Quantitative analysis of
the phenomenon, Biophysical Journal 58 (1990): 1089–1098
86. Rossmann M.G., Johnson J.E. (1989) Icosahedral RNA virus structure. Annual Review of
Biochemistry, 58: 533–569
87. Rubene D.R., ir Rubinsky B. (2017) The effect of temperature on the critical electric field
for electroporaion; A single cell electroporation device study. Journal of Engineering
Sciences and Innovation, 1(2): 83-99
88. Saulis G., Venslaukas M.S., Naktinis J. (1991) Kinetics of pore resealing in cell membranes
after electroporation. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial
Electrochemistry, 321: 1-13
89. Schmitt J. J. ir Zimmermann U. (1989) Enhanced hybridoma production by electrofusion in
strongly hypo-osmolar solutions. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 983(1):
42–50
38
90. Sersa G., Cemazar M., Miklavcic D. (1995) Antitumor effectiveness of electrochemotherapy
with cis diamminedichloroplatinum(II) in mice. Cancer Research, 55(15): 3450–3455
91. Sersa G., Stabuc B., Cemazar M., Jancar B., Miklavcic D., Rudolf Z. (1998)
Electrochemotherapy with cisplatin: potentiation of local cisplatin antitumour effectiveness
by application of electric pulses in cancer patients. European Journal of Cancer., 34(8):
1213–1218
92. Sersa G., Stabuc B., Cemazar M., Miklavcic D., Rudolf Z. (2000) Electrochemotherapy with
cisplatin: clinical experience in malignant melanoma patients. Clinical Cancer
Research, 6(3):863–867.
93. Singh R., Sharma A., Hong S., Jang J. (2014) Electrical immunosensor based on
dielectrophoretically-deposited carbon nanotubes for detection of influenza virus H1N1.
Analyst, 139: 5415–5421
94. Sixou S. ir Teissie J. (1990) Specific electropermeabilization of leucocytes in a blood
sample and application to large volumes of cells. Biochimica et Biophysica Acta –
Biomembranes 1028(2): 154–160
95. Song H., Rosano J.M., Wang Y., Garson C.J., Prabhakarpandian B., Pant K., Klarmann G.J.,
Perantoni A., Alvarez L.M., Lai E. (2015) Continuous-flow sorting of stem cells and
differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on Chip, 15: 1320–1328
96. Sretavan D.W., Chang W., Hawkes E., Keller C., Kliot M. (2005) Microscale Surgery on
Single Axons. Neurosurgery 57: 635–646
97. Teissie J., Golzio M., Rols M. P. (2005) Mechanisms of cell membrane
electropermeabilization: a minireview of our present (lack of?) knowledge. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1724(3): 270–280
98. Teissie J. ir Ramos C. (1998) Correlation between Electric Field Pulse Induced Long-lived
Permeabilization and Fusogenicity in Cell Membranes. Biophysical Journal. 74: 1889–1898
99. Teissie J., Rols M. P. (1986) Fusion of mammalian cells in culture is obtained by creating
the contact between cells after their electropermeabilization. Biochemical and Biophysical
Research Communications. 140(1): 258–266
100. Thomas J., Wang L., Clark R.E., Pirmohamed M. (2004) Active transport of
imatinib into and out of cells: Implications for drug resistance. Blood, 104: 3739–3745
101. Trontelj K., Reberšek M., Kandušer M., Šerbec V. Č., Šprohar M., Miklavčič D. (2008)
Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse
heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74(1): 124–129
102. Turner P.E., Chao L. (1999) Prisoner’s dilemma in an RNA virus. Nature, 398: 441–443
103. Usaj M., Flisar K., Miklavčič D., Kanduser M. (2012) Electrofusion of B16-F1 and CHO
cells: the comparison of the pulse first and contact first protocols. Bioelectrochemistry 89:
34–41
104. Virgin H.W. (2014) The virome in mammalian physiology and disease. Cell, 157: 142–150
39
105. Vykoukal J., Vykoukal D.M., Freyberg S., Alt, E.U., Gascoyne P.R. (2008) Enrichment of
putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab
on Chip, 8: 1386–1393
106. Vor dem Esche U., Huber M., Zgaga-Griesz A., Grunow R., Beyer W., Hahn U., Bessler
W. G. (2011) Passive Vaccination with a Human Monoclonal Antibody: Generation of
Antibodies and Studies for Efficacy in Bacillus anthracis Infections. Immunobiology 216(7):
847–853
107. Zhang Q., Monsalve-Gonzalez A., Barbosa-Canovas G. V., and Swanson B. G. (1994)
Inactivation of E. coli and S. cerevisiae by pulsed electric fields under controlled
temperature conditions. Transactions of the ASAE, 37: 581-587.
108. Zharov V.P., Galanzha E.I., Shashkov E.V., Khlebtsov N.G., Tuchin, V.V. (2006) In vivo
photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast
agents. Optics Letters, 31: 3623–3625
109. Zimmermann U. (1982) Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Biomembranes. 694(3): 227–277
110. Wang L.D., Wagers A.J. (2011) Dynamic niches in the origination and differentiation of
haematopoietic stem cells. Nature Reviews Molecular Cell biology, 12: 643–655
111. Weaver J.C. (1994) Molecular Basis for Cell Membrane Electroporation. Annals of the
New York Academy of Sciences, 720: 141-152
112. Weaver J. C. (2003) Electroporation of Biological Membranes from Multicellular to Nano
Scales. IEEE Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation, 10(5): 754-768
113. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H (1997) Viable offspring
derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385(6619): 810-813
114. Wobus A.M., Boheler K.R. (2005) Embryonic stem cells: Prospects for developmental
biology and cell therapy. Physiological Reviews, 85: 635–678