VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚBRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHOPROSTŘEDÍ

FACULTY OF CHEMISTRYINSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

STANOVENÍ LÉČIV V KALECH Z ČISTÍREN ODPADNÍCH VOD

BAKALÁŘSKÁ PRÁCEBACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE RADEK HÁJEKAUTHOR

BRNO 2013

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ

FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

STANOVENÍ LÉČIV V KALECH Z ČISTÍREN ODPADNÍCH VOD ASSESSMENT OF DRUGS IN SETTLINGS WITH WASTE WATER TREATMENT

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR´S THESIS

AUTOR PRÁCE RADEK HÁJEK AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc. SUPERVISOR

BRNO 2013

- 3 -

ABSTRAKT

Tato bakalářská práce se zabývá problematikou stanovení léčiv v čistírenských kalech.

Stanovovány byly látky erythromycin a clarithromycin ze skupiny makrolidových antibiotik

a ibuprofen, naproxen a diklofenak ze skupiny nesteroidních protizánětlivých látek.

Analýze byl podroben vzorek kalu z městské čistírny odpadních vod v Brně-Modřicích.

Pro izolaci analytů z matrice byly zvoleny metody extrakce kapalinou za zvýšeného

tlaku (PSE) a extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Přečištění a zakoncentrování extraktů bylo

provedeno metodou extrakce tuhou fází (SPE). Pro kvantitativní stanovení zkoumaných látek

byla použita ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) s detekcí pomocí

diodového pole (UV-VIS-DAD).

ABSTRACT

This bachelor thesis is focused on asessment of pharmaceuticals in wastewater treatment

plant sludge. Two macrolide antibiotics (erythromycin and clarithromycin) and three non-

steroidal anti-inflammatory drugs (ibuprofen, naproxen and diclofenac) were assessed.

Sample of sludge was taken in municipal wastewater treatment plant in Brno-Modřice.

Analytes were obtained using pressurized solvent extraction (PSE) or ultrasonic solvent

extraction (USE). Clean-up was performed by solid phase extraction (SPE). Ultra high

performance liquid chromatography followed by UV-VIS diode array detection was used for

quantitative determination of the analytes.

KLÍ ČOVÁ SLOVA

UHPLC, kal, makrolidy, nesteroidní protizánětlivé látky

KEYWORDS

UHPLC, sewage sludge, macrolides, non-steroidal anti-inflammatory drugs

- 4 -

HÁJEK, R. Stanovení léčiv v kalech z čistíren odpadních vod. Brno: Vysoké učení technické

v Brně, Fakulta chemická, 2013. 49 s. Vedoucí bakalářské práce prof. RNDr. Milada

Vávrová, CSc.

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární

zdroje jsem správně a úplně citoval. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty

chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího

práce a děkana FCH VUT.

.............................................

podpis studenta

Poděkování:

Rád bych poděkoval paní prof. RNDr. Miladě Vávrové, CSc. za její vstřícnost, cenné rady

a přípomínky. Velký dík patří rovněž Ing. Janě Oborné za vlídné slovo a pomoc při řešení

problémů v experimentální části.

- 5 -

1 Úvod ............................................................................................................................... 7

2 Teoretická část................................................................................................................ 8

2.1 Léčiva – definice základních pojmů....................................................................... 8

2.2 Léčiva v životním prostředí.................................................................................... 8

2.3 Antibiotika a antibakteriální látky........................................................................ 10

2.3.1 Historie antibiotik......................................................................................... 11

2.3.2 Rozdělení antibiotik ..................................................................................... 11

2.3.3 Nežádoucí účinky......................................................................................... 13

2.3.4 Rezistence..................................................................................................... 13

2.4 Makrolidy ............................................................................................................. 14

2.4.1 Mechanismus účinku.................................................................................... 14

2.4.2 Farmakokinetika........................................................................................... 15

2.4.3 Charakteristika vybraných makrolidů .......................................................... 15

2.5 Analgetika ............................................................................................................ 16

2.5.1 Historie analgetik ......................................................................................... 16

2.5.2 Rozdělení analgetik ...................................................................................... 17

2.6 Nesteroidní protizánětlivé látky ........................................................................... 18

2.6.1 Mechanismus účinku.................................................................................... 19

2.6.2 Farmakokinetika........................................................................................... 19

2.6.3 Charakteristika vybraných nesteroidních protizánětlivých látek ................. 20

2.7 Mechanismy odstranění........................................................................................ 21

2.7.1 Fotodegradace .............................................................................................. 21

2.7.2 Sorpce........................................................................................................... 21

2.7.3 Biodegradace................................................................................................ 22

2.7.4 Chemická oxidace ........................................................................................ 22

2.7.5 Membránové metody.................................................................................... 22

2.7.6 Aktivní uhlí .................................................................................................. 22

2.7.7 Fytoremediace, kořenové ČOV.................................................................... 22

2.8 Stanovení léčiv v čistírenských kalech................................................................. 23

2.8.1 Extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku ....................................................... 23

2.8.2 Extrakce pomocí ultrazvuku......................................................................... 24

2.8.3 Extrakce tuhou fází....................................................................................... 24

2.8.4 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie................................................... 25

3 Experimentální část ...................................................................................................... 29

3.1 Použité přístroje a zařízení ................................................................................... 29

3.2 Software použitý ke zpracování a prezentaci dat................................................. 29

- 6 -

3.3 Použité chemikálie a standardy ............................................................................ 30

3.3.1 Chemikálie ................................................................................................... 30

3.3.2 Standardy...................................................................................................... 30

3.4 Analyzovaná matrice............................................................................................ 30

3.5 Sledované analyty ................................................................................................ 30

3.6 Postup stanovení................................................................................................... 30

3.6.1 Odběr vzorků................................................................................................ 30

3.6.2 Příprava vzorků a izolace analytu ................................................................ 31

3.6.3 Přečištění a zakoncentrování extraktu, SPE................................................. 31

3.6.4 Identifikace a kvantifikace analytů .............................................................. 32

4 Výsledky a diskuze....................................................................................................... 34

4.1 Optimalizace chromatografických podmínek ...................................................... 34

4.1.1 Stanovení makrolidů .................................................................................... 34

4.1.2 Nesteroidní protizánětlivé látky ................................................................... 35

4.2 Porovnání použitých extrakčních metod .............................................................. 36

4.3 Analýza reálného vzorku...................................................................................... 38

5 Závěr............................................................................................................................. 40

6 Seznam použitých zdrojů ............................................................................................. 41

7 Seznam použitých zkratek............................................................................................ 46

8 Přílohy .......................................................................................................................... 47

- 7 -

1 ÚVOD

Léčiva jsou přirozenou součástí lidského bytí. Pokrok v medicínských oborech každým

dnem přináší nové objevy, na což je farmaceutický průmysl nucen reagovat vývojem nových

účinných látek. Zlepšující se diagnostické možnosti a neustále se zvyšující střední délka

lidského života přitom vede k rostoucí spotřebě léčiv v humánní medicíně. Nelze však

opomenout ani používání veterinárních léčiv. Do životního prostředí se tak dostává velké

množství látek, jejichž komplexní vliv na ekosystém není dopředu znám.

Charakter léčivých látek a jejich metabolitů vede k tomu, že byly po boku nechvalně

proslulých xenobiotik typu polychlorovaných bifenylů (PCB) nebo chlorovaných pesticidů

zařazeny mezi tzv. perzistentní organické polutanty (POPs). Vzhledem k rostoucímu zájmu

o tyto látky byla vytvořena nová kategorie, kdy se hovoří o tzv. PPCPs (Pharmaceutical and

Personal Care Products as Pollutants), mezi něž kromě léčiv patří např. syntetické vonné látky

(MUSK) nebo látky používané v kosmetickém průmyslu. Detekovaná množství těchto látek

zpravidla nepřesahují hodnotu 1 mg·l-1. Zato jsou rezidua léčiv zjišťována prakticky ve všech

složkách prostředí a také téměř na všech místech planety. V nejvyšších koncentracích se

nacházejí v odpadních vodách, přičemž v čistírnách odpadních vod (ČOV), jejichž

technologie není selektivně přizpůsobena pro odstraňování kontaminantů, nedochází k jejich

úplnému odstranění. ČOV se tak stávají významným bodovým zdrojem znečištění životního

prostředí.

Cílem této bakalářské práce je zjistit, zda jsou rezidua léčiv schopna sorbovat se na

čistírenských kalech. Pro posouzení tohoto problému byly vybrány látky ze skupiny

makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých látek. Analyzován byl vzorek kalu

z ČOV odebraný v Brně-Modřicích, který byl extrahován metodou extrakce za zvýšeného

tlaku (PSE) a metodou extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Množství detekovaných analytů

bylo stanoveno pomocí kapalinového chromatografu s detektorem diodového pole (UHPLC-

DAD).

- 8 -

2 TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Léčiva – definice základních pojmů

Léčiva (též farmaka) jsou látky nebo jejich směsi, případně léčivé přípravky určené pro

podání lidem nebo zvířatům, a to za účelem prevence chorob, k léčení chorob a mírnění jejich

příznaků, případně k diagnostice a ovlivňování fyziologických funkcí [1].

Léčivé látky (substance) jsou látky přírodního nebo syntetického původu, které způsobují

farmakologický nebo imunologický účinek léčivého přípravku nebo látky ovlivňující

metabolismus [1, 2].

Léčivé přípravky jsou produkty získané technologickým zpracováním účinných substancí

a pomocných látek (excipientů) do určité lékové formy. Dělí se na humánní a veterinární.

Léčivý přípravek podaný osobě nebo zvířeti z důvodu preventivního, terapeutického nebo

diagnostického se nazývá lék [1, 2].

Léková forma je způsob úpravy léčiva do formy vhodné pro léčebné použití (tablety,

želatinové tobolky, dražé, čípky, implantáty, injekce, infuze, kapky a roztoky, masti, krémy

nebo gely). Podle způsobu podání lze lékové formy rozdělit na enterální (podáváné

prostřednictvím trávicí trubice), parenterální (podávané mimo trávicí trubici) a topické

(aplikované lokálně, např. na kůži nebo sliznice) [1].

Z hlediska původu se léčiva dělí na dva typy:

Originální léčivo bylo vyvinuto původním výzkumem tzv. inovativních farmaceutických

společností a vztahuje se na něj časově omezená patentová ochrana.

Generické léčivo (generikum) je legální „kopie“ originálního léčiva, která může být volně

vyráběna ostatními firmami, a to až po vypršení patentové ochrany. Výroba generik má

výrazný vliv na snížení ceny léčiv [1].

Rezidua léčiv jsou zbytky aktivních látek nebo jejich metabolitů.

2.2 Léčiva v životním prostředí

Do životního prostředí se léčiva nebo produkty jejich přeměny dostávají dvěma základními

cestami. V lidském organismu se určitý podíl léčivé látky metabolizuje, přebytek prochází

tělem v nezměněné podobě a z těla odchází prostřednictvím moči nebo exkrementů.

Nepoužité léky často nesprávně končí ve směsném komunálním odpadu. V odpadních vodách

ze zdravotnických zařízení a domácností tyto polutanty putují do čistírny odpadních vod, kde

část z nich degraduje (především v biologickém stupni čištění), část zůstává zachycena

v kalech a část odtéká s přečištěnou vodou do recipientu. Kaly mohou být použity jako

hnojivo pro zlepšení vlastností povrchové vrstvy půdy. Působením dešťových srážek dochází

k vymývání svrchní vrstvy půdy a transportu ve vodě rozpustných látek do povrchových nebo

podzemních vod. Neméně zanedbatelným zdrojem znečištění je aplikace veterinárních léčiv,

- 9 -

kdy část odchází přímo do odpadních vod, část se díky hnojení trusem dostává do půdy a dále

do vod.

Moderní farmakochemie produkuje celou škálu léčivých přípravků, které je možné rozdělit

do skupin podle indikace. Tyto léčivé přípravky jsou obsaženy v běžně dostupných lécích,

a proto je jejich zastoupení v životním prostředí nejvýznamnější, což znázorňuje Obrázek 1.

Antidiabetika3% Ostatní

1%Veterinární lé čiva3%

β2-Adrenergika3%

Rentgenov ě-kontrastní látky

3%Antacida

3%Cytostatika

4%Antihypertenziva

4%Antidepresiva

4%Anxiolytika

4%β-Antiadrenergika

8%

Antiepileptika8%

Hormony9%

Hypolipidemika12%

Analgetika16%

Antibiotika15%

Obrázek 1: Relativní zastoupení látek detekovaných v životním prostředí

(podle 134 článků publikovaných od roku 1997 do roku 2009) [3]

• Analgetika jsou látky primárně užívané pro potlačení bolesti.

• Antibiotika jsou látky působící proti bakteriálním infekcím.

• Hypolipidemika jsou látky snižující hladinu lipoproteinů, především cholesterolu,

v krevní plazmě. Ukládání tuků v cévních stěnách způsobuje většinu

kardiovaskulárních onemocnění. Podle mechanismu účinku se tato léčiva dělí do

několika skupin: pryskyřice schopné vázat žlučové kyseliny, léčiva ovlivňující

syntézu lipoproteinů, léčiva podporující vylučování lipoproteinů, inhibitory HMG-

CoA-reduktázy a léčiva potlačující absorpci cholesterolu z tenkého střeva. Mezi

nejvýznamnější účinné látky patří simvastatin (obsažen v léčivém přípravku

SIMVACARD) nebo atorvastatin (SORTIS, TORVACARD) [1].

• Hormony jsou látky, které se tvoří v endokrinních žlázách. Společně tvoří

endokrinní systém, který řídí a ovlivňuje periferní systém a řadu dalších funkcí

lidského těla (např. růst, metabolismus) [1]. Z pohledu ochrany životního prostředí

- 10 -

přináší největší riziko používání hormonální antikoncepce u žen. V publikovaných

studiích je poukazováno na to, že estrogenní hormony obsažené ve splaškových

vodách mohou způsobit nevratné poruchy sexuálního vývoje u vodních živočichů,

zejména u ryb [4].

• Antiepileptika jsou látky určené k léčbě epilepsie. Tato nemoc se projevuje

opakovaným výskytem záchvatů vyvolaných abnormálními výboji v šedé kůře

mozkové. U postiženého dochází ke stavům zmatenosti až ke ztrátě vědomí, které

často doplňují křeče kosterního svalstva. Epilepsií trpí přibližně 1 % světové

populace [1].

• β-Antiadrenergika (Beta-Blockers) působí tak, že potlačují stimulační vliv

katecholaminů na srdeční činnost, přičemž dochází ke snížení síly a frekvence

srdečních kontrakcí. Používají se k léčbě hypertenze, glaukomu, anginy pectoris

a při srdečních arytmiích. Patří mezi ně látky ze skupiny aryloxyaminopropanololů

nebo arylethylaminů. β2-Adrenergika (β2-Sympathomimmetics) jsou uplatňována

především v terapii průduškového astmatu. Jejich zástupcem je např. klenbuterol

(BRONCODIL, CONTRASPASMIN) [1, 5].

• Antidepresiva a anxiolytika patří mezi psychofarmaka, což jsou látky ovlivňující

lidskou psychiku; používají k léčení duševních poruch. Potlačují deprese a stavy

sklíčenosti, odstraňují duševní napětí, úzkost a strach [1].

• Antihypertenziva jsou látky, které jsou aplikovány při zvýšeném krevním tlaku

(hypertenzi).

• Rentgenově-kontrastní látky (X-ray contrast media) se používají při vyšetřování

pomocí rentgenových paprsků. Většinu z nich tvoří deriváty 2,4,6-trijodobenzoové

kyseliny. Tyto látky patří k nejvíce odolným polutantům, protože více než 99 % se

vyloučí z těla v nezměněné podobě [6].

Relativně méně zastoupené skupiny léčiv detekovaných v životním prostředí tvoří

cytostatika (Antineoplastics), používaná k léčbě onkologických onemocnění a antacida,

která se podávají při chorobách gastrointestinálního traktu, dále veterinární léčiva a přípravky

pro léčbu cukrovky.

2.3 Antibiotika a antibakteriální látky

Antibiotika a antibakteriální látky se používají při léčbě infekčních chorob vyvolaných

patogenními mikroorganismy. Princip jejich účinku spočívá ve zničení nebo zpomalení růstu

původce onemocnění, přičemž, pokud možno, nedochází k poškození hostitelského

organismu. Antibiotika jsou látky primárně produkované mikroorganismy, zasahující do růstu

jiných mikroorganismů. Naproti tomu se chemoterapeutika syntetického původu označují

jako antibakteriální látky. Přesto se za antibiotika považují i některé substance získané

syntetickými postupy, které však strukturně vycházejí z původních přírodních látek. Proto

není toto terminologické rozdělení v běžné praxi striktně dodržováno [1, 5].

- 11 -

2.3.1 Historie antibiotik

Chemické látky byly užívány lidmi k léčení odnepaměti, aniž by však byla známa podstata

jejich účinku. Základním kamenem pro hlubší vědecké poznání se stal van Leeuwenhoekův

vynález mikroskopu, který umožnil zkoumání látek a organismů pouhým okem neviditelných.

Pojmenování bakterie zavedl r. 1838 německý vědec Christian Gottfried Ehrenberg (1795–

1876). Vycházel z řeckého výrazu bakterion, který označoval tyčinku nebo hůlku (první

pozorované bakterie měly podobu malých tyčinek) [7].

Roku 1877 popsal Louis Pasteur (1822–1895) antagonistické působení některých

anaerobních bakterií na růst bacilu B. anthracis a poukázal na možnost využití tohoto

poznatku v medicíně. Zanedlouho potom německý organický chemik Paul Ehrlich (1854–

1915) formuloval tuto zásadní hypotézu: pokud lze nalézti chemikálii, která se selektivně váže

na bakterie a nikoliv na lidské buňky, mohla by se na tyto bakterie vázat látka jedovatá a tak

zabíjet bakterie bez poškození buněk lidského těla. Tato myšlenka je podstatou chemoterapie

a většiny oblastí moderního farmakologického výzkumu. Ehrlichovy výzkumy v oblasti

vývoje nových textilních barviv zúročil r. 1935 Gerhard Domagk (1895–1964), který objevil

červené barvivo Prontosil rubrum, obsahující účinnou část sulfanilamid – strukturní základ

sulfonamidů.

Skutečným milníkem se však stal r. 1929 Flemingův proslulý objev penicilinu a jeho

antibiotických účinků. Jeho příprava byla technologicky zdokonalena Howardem Walterem

Floreym (1898–1968) a Ernstem Borisem Chainem (1906–1979). Díky tomuto objevu se

společně stali v roce 1945 laureáty Nobelovy ceny. Následovaly další zásadní objevy v této

oblasti: streptomycin (1944), bacitracin (1945), chloramfenikol (1947), chlortetracyklin

(1948), erythromycin (1952) a dalších. Dnes jsou známy stovky izolovaných

a charakterizovaných antibiotik. Většímu využití v medicíně však zpravidla brání jejich

vysoká toxicita [1, 8].

2.3.2 Rozdělení antibiotik

Antibiotika tvoří velmi rozmanitou skupinu látek. Na základě jejich vlastností je možné

rozdělit je do určitých kategorií.

2.3.2.1 Podle spektra účinnosti

Antibiotika s úzkým spektrem účinku – působí jen na malý počet mikrobiálních druhů

(např. antituberkulotika).

Antibiotika se širokým spektrem účinku – působí proti většímu počtu patogenních kmenů

(např. tetracykliny, chloramfenikol aj.) [5, 9].

2.3.2.2 Podle struktury

Existuje několik základních strukturních typů antibiotik:

- 12 -

Makrolidy obsahují makrocyklický laktonový kruh složený nejčastěji ze 14 až 16 atomů,

ke kterému jsou navázány dva sacharidy.

β-laktamová antibiotika mají ve své struktuře β-laktamový kruh kondenzovaný

s heterocyklem – např. thiazolidinem (peniciliny), dihydrothiazinem (cefalosporiny,

cefamyciny) a thiazolinem (penemy).

Tetracykliny a anthracykliny jsou širokospektrá antibiotika produkovaná houbami rodu

Streptomyces. Strukturně se jedná o částečně hydrogenované deriváty naftacenu. Protože se u

nich mohou projevit vedlejší nežádoucí účinky, nedoporučuje se jejich dlouhodobé podávání

malým dětem a těhotným ženám.

Aminoglykosidy patří mezi oligosacharidová antibiotika modifikovaná navázanou

aminoskupinou. Patrně nejvýznamnějším zástupcem aminoglykosidů je streptomycin, který se

osvědčil jako lék proti tuberkulóze a dalším gramnegativním bakteriím.

Peptidová antibiotika jsou tvořena nízkomolekulárními proteiny a oligopeptidy, často

sestávajícími z aminokyselin, které se v běžných živočišných a rostlinných proteinech

nevyskytují. Jejich zástupci bacitracin (FRAMYKOIN), polymyxiny a gramicidiny jsou

zpravidla ve formách mastí nebo zásypů určených k zevnímu použití [1].

2.3.2.3 Podle typu a mechanismu účinku

Jestliže léčivá látka inhibuje další množení původce, hovoří se o bakteriostatickém účinku.

Pokud látka mikrobiální buňky usmrcuje, hovoří se o baktericidním účinku [5, 9].

Tabulka 1: Účinky antibakteriálních látek [5, 9]

Mechanismus účinku Typ účinku Příklad

Inhibice syntézy buněčné stěny baktericidní penicilin

cefalosporiny

Poškození buněčné membrány baktericidní polypeptidy

(polymyxin)

Inhibice syntézy kyseliny tetrahydrolistové většinou bakteriostatický

sulfonamidy

trimethoprim

diaminopyridin

Interference s bakteriální DNA baktericidní

chinolony

nitroimidazol

rifampicin

bakteriostatický

makrolidy

chloramfenikol

tetracykliny Inhibice proteosyntézy

baktericidní aminoglykosidy

- 13 -

Obrázek 2: Místa působení antibakteriálních látek v buňce [5]

2.3.3 Nežádoucí účinky

Kromě léčivých vlastností mohou antibiotika vykazovat celou řadu nežádoucích účinků.

Jako u jiných druhů léčiv je požadován velký rozdíl mezi dávkou účinnou a dávkou toxickou.

Z toho důvodu dochází k intoxikaci buď při předávkování, nebo v případě, že pacient trpí

postižením jater nebo ledvin. Po podání některých druhů antibiotik může dojít k alergické

reakci, která se projevuje kožní vyrážkou, ve vážných případech až anafylaktickým šokem.

Běžná je alergie např. na peniciliny (asi 3 % populace), cefalosporiny nebo sulfonamidy.

Z biologických nežádoucích účinků stojí za zmínku ovlivnění přirozené mikroflóry

organismů, což se projevuje průjmy nebo vaginálními infekcemi [9].

2.3.4 Rezistence

Vznik rezistence lze považovat za významný problém provázející používání

antibakteriálních látek. Vlivem léčby dochází k rozvoji rezistentních kmenů mikrobů, a proto

- 14 -

je nutné vyvíjet stále nové účinné látky. Přehled mechanismů vedoucích ke vzniku rezistence

uvádí Tabulka 2 [5, 9].

Tabulka 2: Mechanismy vzniku rezistence na antibiotika

Mechanismus Zástupci

změna cílové molekuly β-laktamy, makrolidy, linkosamidy

zhoršený průnik do buňky aminoglykosidy, tetracykliny, chinolony

aktivní vyčerpávání z buňky aminoglykosidy, tetracykliny, chinolony

inaktivace vlivem enzymů aminoglykosidy, β-laktamy

2.4 Makrolidy

Z chemického hlediska se jedná o makrocyklické laktony. Základem jejich struktury je

makrolidový kruh, který je tvořen 14-16 atomy. Na tento cyklus se vážou dvě molekuly méně

obvyklých deoxysacharidů, které jsou zodpovědné za antibiotický účinek.

Erytromycin produkují bakterie Sacharopolyspora erythraea (dříve mylně považované za

bakterie rodu Streptomyces). Používá se jako alternativa při rezistenci nebo alergii vůči

penicilinu, a to při infekcích vyvolaných grampozitivními koky (stafylokoky, streptokoky,

pneumokoky). Je relativně málo toxický, nesmí se však kombinovat s protichůdně působícími

léky (β-laktamová antibiotika nebo linkosamidy). Novějšími semisyntetickými analogy

erythromycinu jsou roxithromycin (RULID, SURLID) a clarithromycin (KLACID), které

mají oproti svému předchůdci lepší účinnost proti některým mikrobům. Strukturu i podobné

spektrum účinků jako erythromycin má azithromycin (SUMAMED). Za zmínku stojí jeho

poměrně dlouhý biologický poločas (60 hodin). Proti houbovým infekcím se používají

polyenová antibiotika, jejichž zástupcem je amfotericin B (FUNGIZONE). Chemickou

modifikací erythromycinu vzniká nový typ léčiv – ketolidy. Jejich nejvýznamnější zástupce

telithromycin je účinnější než starší účinné látky ze skupiny makrolidů. Působí i proti těm

mikrobům, u nichž se vyvinula rezistence na erythromycin nebo clarithromycin [1, 5, 9].

Ve veterinární medicíně se používá širokospektrální antibiotikum tylosin.

2.4.1 Mechanismus účinku

Makrolidová antibiotika patří do skupiny antibakteriálních látek, které tlumí proteosyntézu.

Princip spočívá v blokování posunu ribozomu na mRNA po vzniku peptidové vazby, tj.

v nemožnosti navázání na následující triplet komplex tRNA + aminokyselina. Makrolidy

působí v důsledku toho bakteriostaticky, spektrum účinku se podobá spektru penicilinu G

[5, 9].

- 15 -

2.4.2 Farmakokinetika

K eliminaci erythromycinu v lidském organismu dochází převážně žlučí. Biologický

poločas činí 1,5 až 2,5 hodiny. Vzhledem ke svým acidobazickým vlastnostem (volná báze) je

nestálý v kyselém prostředí. Působením žaludečních šťáv se vytváří mezi šestým a devátým

atomem uhlíku enolether, čímž dochází ke ztrátě antibakteriálních vlastností. Záměrným

vytvořením esteru (erythromycin-ethylsukcinát) nebo soli vyšší mastné kysliny

(erythromycin-stearát) se brání inaktivaci v žaludeční šťávě. U ostatních analogů

erythromycinu není kyselinou podmíněná transformace možná. Obecně lze říci, že se ostatní

makrolidy eliminují pomaleji, což umožňuje dávkování léků ve větších časových intervalech.

Velmi pomalu se vylučuje azithromycin (pro udržení čtrnáct dnů trvající antibakteriální

koncentrace postačuje podávání v prvních třech dnech) [5].

2.4.3 Charakteristika vybraných makrolid ů

• Erythromycin

Obrázek 3: Strukturní vzorec erythromycinu

• Sumární vzorec: C37H67NO13

• Registrační číslo CAS: 114-07-8

• Relativní molekulová hmotnost: Mr = 733,92

• bílá nebo lehce nažloutlá krystalická látka, hořká, bez zápachu, volně rozpustný v

ethanolu, methanolu, acetonitrilu aj. [10]

- 16 -

• Clarithromycin

Obrázek 4: Strukturní vzorec clarithromycinu

• Sumární vzorec: C38H69NO13

• Registrační číslo CAS: 81103-11-9

• Relativní molekulová hmotnost: Mr = 747,95

• bílá krystalická látka, bez zápachu, stabilní při kyselém pH, rozpustná v methanolu

aj. [10]

2.5 Analgetika

Analgetika patří mezi nejstarší používaná léčiva. Tyto látky snižují pocit bolesti, aniž by

však výrazně ovlivňovaly smyslové vnímání a vědomí. Bolest je reakce těla na impulz

(popálení, pořezání apod.), který aktivuje příslušné nervové receptory. Impulz přechází

nervovými vlákny do míchy a do mozku, kde dochází k uvědomění si bolesti. Vznik impulzu

lze potlačit snížením vnímavosti receptorů bolesti (podáním inhibitorů syntézy

prostaglandinů) nebo potlačením procesu podráždění podáním lokálních anestetik. Zvládání

těžších stavů (např. bolestivých tumorů) usnadňují opiáty, jejichž podání snižuje míru

uvědomění si bolesti [5]. Podněty způsobující poškození tkání způsobují bolest dvojího

druhu. „Prvá“ bolest se váže k určitému místu poškození a vyvolává okamžitou reakci (např.

odtažení dlaně z rozpálených kamen). Impulz je veden do míchy rychlostí asi 10 m·s-1. Jako

„druhá“ bolest se označuje stav, kdy dochází k uvědomění si nepříjemných pocitů

s několikasekundovým zpožděním, neboť se vzruch odpovědnými nervovými vlákny šíří nižší

rychlostí, asi 1 m·s-1. Jejím smyslem je upoutání pozornosti postiženého za účelem ošetření

poškozené tkáně [8].

2.5.1 Historie analgetik

Příznaky bolesti se lidé snažili potlačit odnepaměti. Proto není příliš překvapující, že léky

proti bolesti patří mezi nejstarší používaná léčiva vůbec. Oblibu si získaly především různé

přírodní látky nebo jejich směsi. Již staří Řekové používali ke zmírnění horečky a pocitů

bolesti šťávu z vrbové kůry obsahující účinnou látku kyselinu salicylovou, jejíž deriváty se ve

značném množství používají dodnes. Její název pochází z latinského označení pro vrbu –

salix. Oblibě se těšilo též opium, což je bílá, na vzduchu tuhnoucí šťáva, která vytéká

- 17 -

z naříznutých nezralých makovic tropických odrůd máku. Známý německo-švýcarský

středověký lékař Paracelsus (1493–1541) objevil přípravek zvaný laudanum, který získával

rozpuštěním opia v alkoholu. Problém s rozdílnou mírou účinnosti u různých vzorků opia

napomohl vyřešit tehdy šestnáctiletý Němec Friedrich Sertürner (1783–1841), který jako

první izoloval z opia bílý prášek, později nazvaný morfin (podle řeckého boha snů Morphea).

Surové opium se dnes již v lékařství nepoužívá, čistý morfin se získává syntetickou cestou.

Koncem devatenáctého století uvedla německá firma Bayer na trh látku heroin vyrobenou

pozměněním struktury přírodního morfinu. Tato látka však vyvolává silnou psychickou

i fyzickou závislost, doplněnou velmi nepříjemnými abstinenčními příznaky po přerušení

přívodu opiátu, což její analgetické účinky poněkud přebíjí.

Počátek moderní éry nenarkotických analgetik se datuje do první poloviny devatenáctého

století, kdy byla izolována již zmíněná kyselina salicylová. Její nežádoucí účinky na žaludeční

sliznici podnítily objev acetylsalicylové kyseliny, k pacientům příznivější. Pod názvem

ASPIRIN se jí v USA denně spotřebuje asi padesát tun. Alternativou k aspirinu se stal

paracetamol, který byl do praxe zaveden firmou Sterling-Winthorp v roce 1953. Nedlouho

poté byla patentována látka ibuprofen (1961), objeven byl také naproxen (1976) a diklofenak

[8]. Poměrně novou skupinou nesteroidních protizánětlivých látek jsou oxikamy, které byly

na trh uvedeny koncem sedmdesátých let [1].

2.5.2 Rozdělení analgetik

Podle míry a mechanismu účinku se dělí na:

• narkotická (opioidní) analgetika

• nenarkotická analgetika

Nenarkotická analgetika se dále dělí na:

• analgetika-antipyretika

• nesteroidní protizánětlivé látky (antiflogistika)

• antirevmatika

Jako narkotická analgetika neboli opiáty (někdy označované též jako anodyna) se označují

léčiva, jejichž účinek lze srovnat s účinkem hlavního opiového alkaloidu – morfinu. Používají

se ke zvládnutí silné bolesti. Ve vyšších dávkách mají narkotické účinky. Při dlouhodobém

užívání může dojít ke vzniku závislosti, a proto smí být podávány jen krátkodobě (maximálně

po dobu 2 týdnů). Z přírodních látek se nejčastěji používají morfin a kodein (CODEIN), ze

syntetických např. tramadol (TRAMAL).

Nenarkotická analgetika se používají k tlumení mírnější bolesti, kromě toho však působí

i antipyreticky (proti horečce) nebo antiflogisticky (protizánětlivě). Mezi nejpoužívanější

antipyretika patří deriváty p-aminofenolu, jejichž zástupcem je hojně užívaná látka

paracetamol (PARALEN, PANADOL). V naléhavých případech se podávají pyrazolonové

deriváty, které však mají celou škálu nežádoucích účinků. Jejich zástupcem je metamizol.

- 18 -

Druhá zmíněná skupina farmak – antiflogistika – se dnes také označuje jako nesteroidní

protizánětlivé látky, protože se pro jejich pojmenování uvádí zkratka NSAID (= Non-

Steroidal Anti-Inflamatory Drugs). V některých publikacích jsou mezi analgetika zařazována

také antirevmatika , což jsou léčiva, která se obvykle podávají dlouhodobě, ve snaze zpomalit

nebo zastavit revmatický proces [1, 5].

2.6 Nesteroidní protizánětlivé látky

Do skupiny nesteroidních protizánětlivých látek patří různé chemické sloučeniny. Jejich

společným znakem je to, že mají v molekule obsaženu karboxylovou skupinu COOH, jedná

se proto o karboxylové kyseliny. Výjimku tvoří skupina novějších antiflogistik ze skupiny

oxikamů (aniontických enolátů), které však při fyziologickém pH vytvářejí anionty a mají

proto také kyselý charakter.

Kyselina salicylová se vzhledem ke svým nepříznivým účinkům na žaludeční sliznici

k léčbě bolesti již nepoužívá. Zato její deriváty, především pak kyselina acetylsalicylová

(ASPIRIN, ACYLPYRIN), patří k volně dostupným analgetikům a antipyretikům první

volby. Ve vyšších dávkách vykazuje též antiflogistický účinek. Dlouhodobé používání však

přináší zvýšené riziko vedlejších nežádoucích účinků, zejména tvorbu žaludečních

a dvanáctníkových vředů nebo zvýšenou krvácivost, a proto byla při léčbě revmatizmu

nahrazena modernějšími nesteroidními antirevmatiky. Nedoporučuje se také dlouhodobé

pravidelné podávání tohoto léku těhotným ženám. Snížení agregační schopnosti krevních

destiček se využívá při prevenci infarktu myokardu a mozkové mrtvice (ANOPYRIN – směs

kyseliny acetylsalicylové s uhličitanem vápenatým).

Obrázek 5: Kyselina acetylsalicylová

Skupinu amfifilních, arylalkanových kyselin zastupují diklofenak (VOLTAREN,

DOLMINA) a 2-arylpropanové kyseliny, mezi něž patří masově oblíbený, volně prodejný

ibuprofen (IBALGIN, NUROFEN, BRUFEN, DOLGIT), naproxen (NAPROSYN,

NAXEN), případně ketoprofen (KETOFEN, MEPROFEN). Spektrum analgetických,

antiflogistických, antipyretických, ale také nežádoucích účinků se u těchto léčivých látek

velmi podobá. Výběr vhodného farmaka závisí v daném případě na poměru mezi

terapeutickým a nežádoucím účinkem látky.

- 19 -

Syntéza ibuprofenu z isobutylbenzenu probíhá v několika krocích:

Obrázek 6: Syntéza ibuprofenu [1]

Oxikamy se strukturně řadí mezi aniontické enoláty. Terapeutické spektrum je sice výrazně

menší než u výše jmenovaných kyselin, jejich výhodu však lze spatřit ve vyšší účinnosti a

dlouhém biologickém poločasu rozpadu (přibližně 40 hodin). Nejznámnějšími zástupci jsou

piroxikam (ARTHREMIN) nebo novější meloxikam (MOBIC) [1, 5].

2.6.1 Mechanismus účinku

Mechanismus účinku nesteroidních protizánětlivých látek spočívá v inhibici

cyklooxygenázy (COX-1 a COX-2). U kyseliny acetylsalicylové probíhá inhibice COX tak,

že se její snadno uvolnitelná acetátová skupina kovalentně váže na makromolekulu COX,

čímž dojde k její trvalé inaktivaci. Protizánětlivého účinku je dosaženo blokací COX-2.

Inhibice COX-1 naproti tomu způsobuje podráždění žaludku a další komplikace. Snahou je

proto objevit takové léčivo, které selektivně inhibuje pouze COX-2 [5].

2.6.2 Farmakokinetika

Do krve se kyselina acetylsalicylová dostává prostřednictvím žaludeční a střevní sliznice,

přitom dochází k rychlému odštěpení acetátové skupiny. Uvolněná kyselina salicylová se váže

na bílkoviny, v játrech se konjuguje s glycinem a kyselinou glukuronovou nebo se oxiduje na

kyselinu gentisovou. Při běžném dávkování činí eliminační poločas kyseliny salicylové asi

3 hodiny. Eliminace naproxenu probíhá (pomalou) demethylací v poloze 6 a uvolněním OH

skupiny pro konjugaci. Stejným způsobem dochází k eliminaci ibuprofenu, liší se pouze

rychlostí. V důsledku toho se ibuprofen používá pro terapii akutních bolestivých stavů.

Krátký eliminační poločas má rovněž diklofenak (1 až 2 hodiny) [5].

- 20 -

2.6.3 Charakteristika vybraných nesteroidních protizánětlivých látek

• Ibuprofen

Obrázek 7: Strukturní vzorec ibuprofenu

• Sumární vzorec: C13H18NO2

• Systematický název: (RS)-2-(4-(2-methylpropyl)fenyl)propanová kyselina

• Registrační číslo CAS: 15687-27-1

• Relativní molekulová hmotnost: Mr = 206,28

• bílý krystalický prášek, dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech

• Naproxen

Obrázek 8: Strukturní vzorec naproxenu

• Sumární vzorec: C14H14O3

• Systematický název: (+)-(S)-2-(6-methoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina

• Registrační číslo CAS: 22204-53-1

• Relativní molekulová hmotnost: Mr = 230,259

• bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu

- 21 -

• Diklofenak

Obrázek 9: Strukturní vzorec diklofenaku

• Sumární vzorec: C14H11Cl2NO2

• Systematický název: 2-(2-(2,6-dichlorofenylamino)fenyl)octová kyselina

• Registrační číslo CAS: 15307-86-5

• Relativní molekulová hmotnost: Mr = 296,148

• bílý nebo lehce nažloutlý prášek, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu, slabě

hygroskopický

2.7 Mechanismy odstranění

Děje vedoucí k odstranění reziduí léčiv z povrchových vod odpovídají eliminacím

ostatních organických látek a dají se v principu rozdělit na dva druhy, na degradace (biotické

nebo abiotické) nebo sorpce [11].

2.7.1 Fotodegradace

Abiotickou fotochemickou degradaci lze považovat za hlavní mechanismus vedoucí

k odstranění farmak z povrchových vod. Lze ji rozlišit na dva základní typy. Příčinou přímé

fotolýzy je absorpce slunečního záření molekulou léčiva, přičemž dochází k rozpadu na

jednodušší látky. Účinnost závisí na absorpčním spektru dané molekuly, na intenzitě

slunečního záření a na případném zákalu vody. Radikálový rozpad probíhá v důsledku

působení hydroxylového radikálu (• OH), alkylperoxidového radikálu (• RO2) nebo

atomárního kyslíku [11]. Komplexy makrolidů s trojmocným železem podléhají přímé

fotolýze s poločasem rozpadu 40 dnů. Vlivem strukturních změn pravděpodobně mizí jejich

toxicita, protože pseudoerythromycinové deriváty vykazují velmi nízkou antibakteriální

aktivitu [12].

2.7.2 Sorpce

Sorpce na aktivovaný kal nebo sediment je dána dvěma základními mechanismy. Při

adsorpci se vlivem působení elektrostatických sil mezi nabitými skupinami léčiv a pevnou

- 22 -

matricí zvyšuje koncentrace látek na jejím povrchu. Při absorpci pronikají látky dovnitř

matrice, kde jsou vlivem hydrofobní interakce vázány k lipofilním částem kalu. Sorpční

schopnosti dané látky charakterizuje distribuční koeficient KD, který je definován jako poměr

koncentrací v pevné a kapalné fázi [13, 14]. Tento mechanismus se uplatňuje v běžných

evropských čistírnách odpadních vod [11].

2.7.3 Biodegradace

Biodegradace se definuje jako biologicky katalyzované snížení komplexity chemických

sloučenin. Organické látky jsou rozkládány až na jednoduché anorganické sloučeniny uhlíku,

dusíku, fosforu a síry, které se uvolňují do prostředí [15]. V čistírnách odpadních vod se tento

proces uplatňuje díky mikrobiální aktivitě aktivovaného kalu. Vzhledem k nízkým

koncentracím reziduí léčiv v odpadních vodách však nedochází k úplné degradaci. Stupeň

degradace závisí na stáří kalu v aktivaci, dostupnosti farmak, pH a dalších faktorech [11].

2.7.4 Chemická oxidace

Principem je tvorba silných oxidačních činidel (• OH, O3) během čištění a jejich následná

reakce s přítomnými polutanty. Degradace farmak pomocí chemické oxidace se podobá

fotodegradaci, neboť probíhá rovněž radikálově. Výhodné je použití této techniky u již

vyčištěné vody, tj. na odtoku do recipientu, kde díky ozonizaci dochází navíc

k dezinfekci [14].

2.7.5 Membránové metody

Pomocí mikrofiltrace nebo ultrafiltrace lze zlepšit kvalitu vyčištěné vody tak, aby mohla

být použita jakou užitková voda v zemědělství. Díky výhodným sorpčním vlastnostem

prokazují sice vysokou účinnost především při odstraňování estrogenních hormonů, nejsou

však schopny zachytit většinu ostatních skupin léčiv, pro jejichž účinnou separaci je nutné

použít nanofiltraci nebo reverzní osmózu, tj. metody, které zatím nacházejí uplatnění spíše při

úpravě pitné vody [14].

2.7.6 Aktivní uhlí

Aktivní uhlí v podobě prášku nebo granulí se používá k zachycení organických polutantů

zejména nepolárního charakteru. Výhoda této metody spočívá v tom, že při ní nevznikají

žádné vedlejší produkty. K oxidační degradaci látek dochází při vystavení adsorbentu teplotě

převyšující 650 °C [14].

2.7.7 Fytoremediace, kořenové ČOV

Fytoremediace využívá zelených rostlin a s nimi asociovaných mikroorganismů pro

odstranění nebo transformaci kontaminantů ze životního prostředí. U povrchových nebo

splaškových vod se uplatňuje tzv. rhizofiltrace, kdy dochází k precipitaci nebo k absorpci

- 23 -

přímo v kořenech vodních nebo mokřadních rostlin (orobinec, různé druhy řas). Tato relativně

levná metoda je velmi výhodná v případě znečištění velkých objemů vody malým množstvím

kontaminantů. Používá se k odstranění těžkých kovů, hydrofobních organických látek nebo

radionuklidů [16].

2.8 Stanovení léčiv v čistírenských kalech

Vzorky pro stanovení léčiv se odebírají zpravidla do polyethylenových lahví, ve kterých se

uchovávají při teplotě do 5 °C. Následně se provádí extrakce sledovaných analytů z matrice;

výsledný extrakt se přečistí a zakoncentruje. Jak makrolidová antibiotika, tak také nesteroidní

protizánětlivé látky patří mezi semivolatilní látky. K jejich stanovení se proto obvykle

používá kapalinová chromatografie se spektrometrickou detekcí [20, 21, 23, 24, 26].

Množství zkoumaného analytu se nejčastěji detekuje pomocí hmotnostního spektrometru

(HPLC-MS, HPLC-MS-MS), vzhledem k jeho univerzálnosti a nízkým detekčním limitům.

Také je možné použít spektrofotometrické nebo fluorescenční detektory. V této práci bylo

použito stanovení ultra-vysoce účinným kapalinovým chromatografem s UV-VIS

spektrofotometrickou detekcí pomocí diodového pole (UPLC-DAD).

2.8.1 Extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku

Extrakce je důležitou součástí při stanovení léčiv v čistírenských kalech. Pro extrakci

z pevné matrice byla dříve vesměs používána extrakce Soxhletova. Tato metoda se sice

vyznačuje poměrně vysokou účinností, jejími hlavními nevýhodami jsou však relativně

vysoká spotřeba převážně toxických organických rozpouštědel a především dlouhá doba

extrakce (několik hodin). Proto byly vyvinuty modernější metody, jakými jsou mikrovlnná

extrakce (MAE), extrakce pomocí ultrazvuku (USE), superkritická fluidní extrakce (SFE) a

především extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (PSE, PLE, ASE, PFE) [18]. Soxhletova

extrakce však nadále zůstává metodou referenční [19].

První zmínky o PSE pochází z roku 1996. Richter a spol. aplikovali tuto novou metodu pro

stanovení PAU a PCB z pevných vzorků [17]. Alikvotní množství vzorku smíchané

s tzv. hydromatrix se vloží do extrakční patrony a ta se přemístí do pícky. Hydromatrix brání

agregaci částeček vzorku v cele a redukuje volný objem mezi nimi. Po předehřátí se cela

naplní rozpouštědlem, následně dojde k nárůstu teploty a tlaku a jejich udržení na konstantní

hodnotě podle požadavků zadaných operátorem. Hodnoty teploty a tlaku mohou dosahovat až

200 °C, resp. 200 bar. Po uplynutí nastaveného času je extrakt přemístěn do sběrné vialky,

kde je shromažďován společně s čistým rozpouštědlem použitým k vypláchnutí extrakční

patrony. Tento cyklus je možné několikrát opakovat. Obvyklá délka celé extrakce se pohybuje

v rozmezí 15-45 minut. Při PSE dochází ke zvýšení tlaku v extrakční cele, díky čemuž je

možné dosáhnout vyšší teploty, než je teplota varu rozpouštědla při atmosférickém tlaku.

Použití PSE je ekonomičtější i ekologičtější než použití Soxhletovy metody. V porovnání

s požadavky extrakce prostřednictvím MAE není PSE omezena použitím solventů, které

- 24 -

absorbují mikrovlnné záření. Na charakteru vzorku však závisí i selektivita extrakce, protože

společně s cílovými analyty mohou být vyextrahovány různé interferující látky. Při použití

většího množství extrakčních cyklů může dojít ke zředění extraktu [18, 19]. Proto je zpravidla

nutné extrakt zakoncentrovat, např. odpařením přebytečného rozpouštědla na vakuové

odparce a přečistit (clean-up), k čemuž se nejčastěji používá extrakce tuhou fází (SPE)

[20, 21, 22, 23, 24, 25, 26], gelová permeační chromatografie (GPC) nebo kolonová

chromatografie.

Obrázek 10: Schéma tlakového kapalinového extraktoru [17]

2.8.2 Extrakce pomocí ultrazvuku

Alternativní extrakční metodou je extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Ta je založena na

působení ultrazvukových vln na matrici suspendovanou v solventu. Použití USE usnadňuje

přechod analytů z pevných environmentálních vzorků do rozpouštědla. Mechanickým

vymýváním dochází ke kombinaci abrazivního efektu na povrchu částeček matrice a zároveň

k efektivnějšímu prostupu solventu dovnitř částeček, což napomáhá k separaci cílených

látek [27].

2.8.3 Extrakce tuhou fází

Extrakce tuhou fází (SPE) slouží k přečištění a zakoncentrování extraktu získaného během

PSE na základě jeho fyzikálních a chemických vlastností. Kolonka připomínající plastovou

injekční stříkačku bez pístu je naplněna pevnými částečkami (např. práškový silikagel), na

které se chemicky navážou hydrofobní organické funkční skupiny. Nejběžnější je použití

uhlíkového řetězce s 18 uhlíky (oktadecylsilikagel). Dostupné jsou však i iontoměničové

náplně nebo adsorbenty (florisil, alumina).

- 25 -

Před použitím je nutno SPE kolonku kondicionovat malým množstvím (5 ml)

rozpouštědla. K tomu se používá např. methanol [20, 24, 25] nebo acetonitril [26], doplněný

malým množstvím (5ml) miliQ vody. Potom se extrakt z PSE aplikuje na kolonku. K zajištění

konstantního průtoku slouží přetlak vzniklý působením pístu nebo podtlak produkovaný

vývěvou. Potenciálně interferující látky je možné z kolonky odstranit promytím miliQ vodou,

zatímco hydrofobní organické látky zůstanou navázané na náplni kolonky. Pokud se

promývací činidlo a eluent vzájemně nemísí, je nutné kolonku před elucí vysušit proudem

plynu. Nakonec se analyty eluují z kolonky vhodným rozpouštědlem a eluát se podle potřeby

zakoncentruje [19, 28]. Nakonec se eluát vysuší proudem dusíku a rekonstituuje přidáním

rozpouštědla na objem přibližně 1 ml [20].

Obrázek 11: Princip extrakce tuhou fází [29]

2.8.4 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Tradičně se makrolidy analyzovaly pomocí mikrobiologických metod, které se však

obvykle vyznačují nízkou specifitou nebo citlivostí. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

(HPLC) se proto stala preferovanou technikou pro stanovení nízkých koncentrací této skupiny

antibiotik [30]. Univerzálnost této metody umožňuje její využití pro relativně jednoduché

a rychlé stanovení širokého spektra léčiv [25, 31].

- 26 -

2.8.4.1 Princip vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Chromatografie je separační technika, která je založena na distribuci analyzovaných látek

mezi mobilní a stacionární fázi na základě jejich fyzikálně-chemických vlastností. Ačkoli se

retenční mechanismy u různých typů chromatografie liší, všechny jsou založeny na vytvoření

formální rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. V případě vysokoúčinné kapalinové

chromatografie (HPLC) se vzorek nadávkuje do kolony naplněné částečkami stacionární fáze

a solventem. Mobilní fáze prochází kolonou, přičemž dochází k interakcím přítomných

analytů s oběma fázemi. Pokud je distribuce analytů mezi obě fáze dostatečně rozdílná,

dochází k jejich separaci. Na separaci mají vliv i případné interakce mezi mobilní

a stacionární fází. Existují čtyři základní typy separačních mechanismů:

• adsorpce

• rozdělování

• výměna iontů

• sítový efekt

Účinnost separace může být vyjádřena pomocí počtu tzv. teoretických pater. Teoretické

patro reprezentuje pomyslnou část kolony, ve které dochází k ustavení rovnováhy mezi

mobilní a stacionární fází. Výškový ekvivalent teoretického patra je roven délce kolony

podělené počtem teoretických pater. Vysokou účinnost separace podmiňuje velký počet

výškových ekvivalentů teoretického patra [28].

Chromatografické kolony jsou zpravidla vyrobeny z nerezové oceli. Běžně dostupné

kolony pro HPLC mají délku v rozmezí od 50 mm do 300 mm, jejich vnitřní průměr činí

obvykle 2 mm až 5 mm. Nejčastější rozměry částeček náplně jsou 3,5 µm, 5 µm nebo

10 µm [33].

Důležitá je rovněž volba použité mobilní fáze. Pro makrolidy se používá například gradient

binární směsi octan amonný a acetonitrilu [21, 26] nebo miliQ voda s přídavkem kyseliny

octové (pH 2,9) a acetonitrilu [22].

- 27 -

Obrázek 12: Schéma HPLC: 1-zásobníky mobilní fáze, 2-odplyňovač, 3-ventil pro řízení

gradientu mobilní fáze, 4-směšovací nádoba, 5-vysokotlaká pumpa, 6-dělicí ventil, 7-

dávkovací smyčka, 8-předkolona (ochranná kolona), 9-kolona, 10-detektor, 11-PC pro

vyhodnocení dat, 12-odpadní nádoba [32]

2.8.4.1 Detektory používané při vysokoúčinné kapalinové chromatografii

Při HPLC je nutné sledovat složení eluátu kontinuálně. V detektorech dochází k převodu

určité vlastnosti eluátu (absorbance, vodivosti apod.) na elektrický signál, který se následně

pomocí počítače vyhodnotí.

• UV-VIS spektrofotometrický detektor – založený na měření absorpce záření

v oblasti ultrafialového a viditelného světla. Jako zdroje záření slouží deuteriová

(UV) a wolframová (VIS) lampa. Kombinace s detekcí pomocí diodového pole

(UV-VIS-DAD) umožňuje měření spojitých spekter.

• Fluorescenční detektor – selektivnější a citlivější než UV-VIS detektor (detekční

limity až 1210− gramů v 1 litru). Měří se intenzita fluorescence.

• FTIR detektor – selektivní, zpracovává infračervená spektra látek v eluátu.

• Refraktometrický detektor – univerzální detektor založený na měření indexu

lomu. Nevýhodou je nižší citlivost, závislost na teplotě a nemožnost využití

gradientové eluce.

• Elektrochemický detektor (ECD) – založený na měření elektrických veličin

(elektrodový potenciál, proud). Citlivostí je srovnatelný s fluorescenčním

detektorem používá se pro detekci elektroaktivních látek.

• Vodivostní detektor – založený na měření vodivosti eluátu [28].

V současnosti se pro determinaci environmentálních polutantů hojně využívá též detekce

pomocí jednoduché nebo tandemově zapojené hmotnostní spektrometrie

[20, 21, 23, 24, 25, 26, 31].

- 28 -

Obrázek 13: UV-VIS-DAD detektor kapalinového chromatografu

Agilent 1290 Infinity [34]

2.8.4.2 Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Cílem kapalinové chromatografie je separovat pokud možno co nejvíce analytů v co

nejkratším čase. Proto v současnosti dochází k rozvoji moderní výkonné separační metody,

ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UPLC, UHPLC). Základním rozdílem proti

klasické HPLC je použití menších částeček stacionární fáze (< 2 µm, ideálně okolo 1,7 µm),

což znesnadňuje průtok mobilní fáze kolonou. Z tohoto důvodu je nutné zvýšení pracovního

tlaku v koloně (maximálně na 1200 bar). Tyto podmínky umožňují zkrácení kolony (oproti

HPLC kolonám) při současném zachování nebo dokonce zvýšení účinnosti kolony [35].

Hlavními přednostmi UPLC jsou:

• kratší doba analýzy

• snížení spotřeby mobilní fáze

• zvýšení účinnosti kolony

• snížení meze detekce

• zvýšení meze citlivosti

Převod metody z HPLC na UPLC je poměrně jednoduchý, je pouze třeba přizpůsobit

objemový průtok mobilní fáze, nástřik a dobu analýzy (gradient) [36].

- 29 -

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1 Použité přístroje a zařízení

• Analytické váhy HR-120-EC, A&D Instruments, Japonsko

• pH metr inoLab® 730, WTW Series, WTW, Německo

• Zařízení pro přípravu miliQ vody Mili-Q® Academic, Millipore, Francie

• Ultrazvuková vodní lázeň Teson 4, Tesla, Česká republika

• PSE extraktor onePSE, Applied Separations, USA

• Rotační vakuová odparka Büchi Rotavapor® R-205 s vyhřívanou lázní B-409

a elektronickým regulátorem vakua V-800, Büchi Labortechnik, Švýcarsko

• SPE extraktor

• SPE kolonky Oasis® HLB (60 mg) Extraction Cartridge, Waters, USA

• SPE kolonky Oasis® HLB (200 mg) Extraction Cartridge, Waters, USA

• Stříkačkové filtry LUT Syringe Filters PTFE; 13 mm, 0,45 µm, pk/100, Labicom,

Česká republika

• Stříkačkové filtry Cronus Syringe Filters PTFE; 4 mm, 0,2 µm, pk/100, SMI-LabHut,

Velká Británie

• Kapalinový chromatograf Agilent 1290 Infinity, Agilent, USA

• binární pumpa

• automatický dávkovač

• termostat kolon

• In-Line Filtr 0,3 µm

• kolona ZORBAX Eclipse Plus C18, Rapid Resolution HD 2,1x50 mm; velikost

částic 1,8 µm, Agilent, USA

• DAD-detektor: zdroj UV-VIS záření – deuteriová lampa, rozsah vlnových délek

190-640 nm, diodové pole (1024 prvků)

• Běžné laboratorní vybavení

3.2 Software použitý ke zpracování a prezentaci dat

• ChemStation for LC & LC/MS Systems, version 32.1, Agilent, USA

• ChemSketch, version 10.0, ACD/Labs, Kanada

• Microsoft Office Word 2003, Microsoft, USA

• Microsoft Office Excel 2003, Microsoft, USA

• Kreslení, Microsoft, USA

- 30 -

3.3 Použité chemikálie a standardy

3.3.1 Chemikálie

• Acetonitril, CHROMASOLV® čistota gradient grade for HPLC, ≥ 99,9 %, Sigma-

Aldrich, Německo

• Amoniumacetát, čistota p. a., for HPLC, > 99,0 %, Fluka, Německo

• Dusík stlačený, čistota 4.7, SIAD, Česká republika

• Kyselina chlorovodíková 35 %, čistota p. a., Penta, Česká republika

• Kyselina mravenčí ≥ 98 %, čistota p. a., Sigma-Aldrich, Německo

• Methanol absolutní, LC-MS, čistota min. 99,95 %, Biosolve, Nizozemsko

• Deionizovaná voda upravená přístrojem Mili-Q® Academic o specifické vodivosti

0,055 µS·cm-1 při teplotě 24 °C

3.3.2 Standardy

• Clarithromycin, čistota ≥ 95 % (HPLC), Sigma-Aldrich, Německo

• Diklofenak, sodná sůl, Sigma-Aldrich, Německo

• Erythromycin, Biotechnology Performance Certified, Sigma-Aldrich, Německo

• Ibuprofen, sodná sůl, Sigma-Aldrich, Německo

• Naproxen, Pharmaceutical Secondary Standard, Fluka, Německo

3.4 Analyzovaná matrice

Pro analýzu byl zvolen vyhnilý stabilizovaný kal z ČOV Brno-Modřice. Po odvodnění,

které se provádí pomocí odstředivek, je kal transportován šnekovým dopravníkem do sušárny.

Teplota v sušárně (100 °C po dobu více než 3 hodin) zajišťuje jeho pasterizaci a hygienizaci.

3.5 Sledované analyty

Pro posouzení problematiky kontaminace čistírenských kalů rezidui léčiv byla vybrána

léčiva ze skupiny makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých látek. První

skupinu zastupují látky erythromycin a clarithromycin, druhou skupinu reprezentují hojně

používaná léčiva ibuprofen, naproxen a diklofenak.

3.6 Postup stanovení

3.6.1 Odběr vzorků

Vzorek kalu byl odebrán ve čtvrtek 14. března 2013 v 11.30 v ČOV Brno-Modřice. Vzorek

byl umístěn do polyethylenové vzorkovnice o objemu 1 litr a uzavřen víkem rovněž

z polyethylenu. Po odběru byl vzorek uchován v chladicím boxu při teplotě 5 °C.

- 31 -

3.6.2 Příprava vzorků a izolace analytu

Vysušený kal bylo nutné před samotnou extrakcí nejprve rozmělnit. K tomuto účelu byl

použit hmoždíř a třecí miska se zdrsněným povrchem. Jako metoda izolace analytů ze vzorku

byla zvolena tlaková extrakce kapalinou (PSE) následovaná extrakcí tuhou fází (SPE).

Do spodní části extrakční patrony byl nejprve nasypán nerozetřený hydromatrix. Vrstva

o výšce přibližně 1 cm eliminovala riziko ucpávání patrony při extrakci. Dále bylo smícháno

10 g kalu s 10 g rozetřeného hydromatrixu a tato směs byla kvantitativně převedena do

extrakční patrony. Jako extrakční činidlo byl zvolen methanol. Podmínky pro PSE jsou

uvedeny v Tabulka 3.

Vyzkoušena byla rovněž metoda extrakce pomocí ultrazvuku (USE). V tomto případě bylo

5 g kalu suspendováno ve 25 ml methanolu a extrahováno po dobu 30 minut v ultrazvukové

lázni. Vzniklá suspenze byla zfiltrována. Dále bylo s přefiltrovaným extraktem zacházeno

jako při použití PSE, pouze s vynecháním kroku zakoncentrování a přečištění pomocí SPE.

Tabulka 3: Podmínky pro PSE

Množství vzorku 10 g

Extrakční činidlo methanol

Teplota 40 °C

Tlak 140 bar

Počet cyklů 3

Pre-heat 5 min

Statická fáze 5 min

Proplach rozpouštědlem 1 min

Sušení dusíkem 4 min

3.6.3 Přečištění a zakoncentrování extraktu, SPE

Extrakt získaný metodou PSE byl zfiltrován přes hladký filtr a odpařen na rotační vakuové

odparce. Vzniklý odparek byl rozpuštěn ve 2 ml methanolu a 50 ml okyselené miliQ vody

(pH bylo upraveno pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 2).

Rozpouštění bylo podpořeno ponořením baňky do ultrazvukové lázně.

K zakoncentrování extraktu získaného metodou PSE byla použita metoda extrakce tuhou

fází (SPE). Kolonky s nižším obsahem sorbentu vykazovaly tendenci k ucpávání. Na základě

toho byly použity větší SPE kolonky Oasis® HLB (200 mg). Kolonky byly nejprve

aktivovány 15 ml methanolu a 10 ml 0,01 M HCl. Potom byl na kolonku kvantitativně

převeden připravený extrakt (pH = 2). Následovalo promytí 10 ml miliQ vody a vysušení

proudem vzduchu. Analyty byly eluovány 15 ml methanolu. Eluáty byly odpařeny právě

dosucha na rotační vakuové odparce, rekonstituovány 2 ml methanolu a vysušeny pod

- 32 -

dusíkem. Zbytek po sušení byl rozpuštěn v 1 ml methanolu. Nerozpuštěné látky byly

odstraněny filtrací přes stříkačkové filtry (0,45 µm a 0,2 µm). Takto upravený vzorek byl

analyzován pomocí UHPLC.

Tabulka 4: Podmínky pro SPE

Kolonka Oasis® HLB (200 mg)

Aktivace 15 ml methanolu

Promytí 10 ml 0,01 M HCl

Nanesení vzorku

Promytí 10 ml miliQ vody

Eluce 15 ml methanolu

3.6.4 Identifikace a kvantifikace analytů

Přečištěný extrakt byl analyzován metodou ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie

na přístroji Agilent 1290 Infinity. K separaci byla použita kolona ZORBAX Eclipse Plus C18.

Analyty byly detkovny pomocí detektoru diodového pole. Pro kvalitativní analýzu byly

sledovány retenční časy jednotlivých analytů, jejich množství pak bylo určeno integrací ploch

příslušných píků při charakteristických vlnových délkách. Kvantifikace byla provedena

metodou kalibrační křivky.

Analýza probíhala za následujících podmínek:

• Mobilní fáze methanol / 10 mM amoniumacetát (pH = 2,96)

• Nástřik vzorku 0,5 µl

• Průtok mobilní fáze 0,3 ml·min-1

• Teplota 40 °C

• Doba analýzy 8,5 min

Tabulka 5: Gradient mobilní fáze

t (min) MeOH (%) CH3COONH4 (%)

0 50 50

5,0 50 50

6,0 70 30

8,3 80 20

- 33 -

Tabulka 6: Parametry sledovaných analytů

Analyt Vlnová délka (nm) Retenční čas (min)

Ibuprofen 214 6,839

Naproxen 230 3,027

Diklofenak 275 6,609

Erythromycin 215 ---

Clarithromycin 288 ---

- 34 -

VÝSLEDKY A DISKUZE

3.7 Optimalizace chromatografických podmínek

Pro stanovení jednotlivých druhů léčiv bylo nejprve zapotřebí optimalizovat podmínky

chromatografické separace a analýzy pomocí UV-VIS-DAD detektoru. Bylo zjištěno, že

vzhledem k vlastnostem zástupců makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých

látek je vhodnější metodu optimalizovat pro každou skupinu zvlášť.

3.7.1 Stanovení makrolidů

Pro stanovení makrolidových antibiotik byly připraveny roztoky standardů erythromycinu

a clarithromycinu o koncentraci 1 mg·ml-1 v methanolu a také v acetonitrilu. Jako mobilní

fáze byla nejprve použita binární směs acetonitrilu s 10 mM amoniumacetátem, potom rovněž

s 1% kyselinou mravenčí. Kromě toho byla také vyzkoušena směs methanolu a kyseliny

mravenčí, a to v různé koncentraci. Makrolidy však při zvolených vlnových délkách

(erythromycin 215 nm, clarithromycin 275 nm a 288 nm) nevykazovaly takřka žádnou odezvu

na detektoru, base-line byla velmi kostrbatá a šum převyšoval samotný signál. V souladu s již

publikovanou studií se prokázalo, že použití UHPLC ke stanovení makrolidů je nevhodné,

neboť tyto látky postrádají vhodný chromofor, který by umožnil jejich detekci pomocí UV-

VIS-DAD detektoru [30]. Tyto látky však je možné analyzovat jinými metodami, např.

s využitím hmotnostní spektrometrie.

Tabulka 7: Vyzkoušené mobilní fáze pro stanovení makrolidů

1. složka 2. složka

acetonitril 10 mM amoniumacetát

acetonitril 1% kyselina mravenčí

methanol 0,1% kyselina mravenčí

methanol 0,01 M kyselina mravenčí

methanol 0,1 M kyselina mravenčí

- 35 -

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

1

2

3

4

5

DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_03_27_RH\STANDARD000004.D)

Obrázek 14: Příklad chromatogramu clarithromycinu (mobilní fáze acetonitril + 10 mM

amoniumacetát, vlnová délka 275 nm)

3.7.2 Nesteroidní protizánětlivé látky

Standardy nesteroidních protizánětlivých látek (NSAID) byly rozpuštěny v methanolu.

Byly vyzkoušeny dvě hodnoty nástřiku: 0,7 µl a 0,5 µl. Při menším nástřiku došlo k zeslabení

tendence k chvostování píků, proto byl pro analýzu vhodnější. Jako mobilní fáze se osvědčila

směs methanolu a amoniumacetátu. Pro potřeby UHPLC byla upravena metoda stanovení

NSAID, která byla vypracována v rámci dizertační práci Ing. Vydrové na ÚCHTOŽP FCH

VUT v BRNĚ [37]. Byly ověřovány dva gradienty mobilní fáze.

Tabulka 8: Gradient mobilní fáze – varianta č. 1

t (min) methanol (%) amoniumacetát (%)

0 35 65

2,3 50 50

5,0 50 50

6,6 70 30

8,3 80 20

- 36 -

Tabulka 9: Gradient mobilní fáze – varianta č. 2

t (min) methanol (%) amoniumacetát (%)

0 50 50

5,0 50 50

6,0 70 30

8,3 80 20

Optimálního tvaru píků byl dosaženo při použití první varianty gradientu, kterou popisuje

Tabulka 9.

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1AF-0601.D)

Obrázek 15: Chromatogram diklofenaku při použití mobilní fáze methanol +

10 mM amoniumacetát, vlnová délka 275 nm

3.8 Porovnání použitých extrakčních metod

Pro izolaci sledovaných analytů z matrice byla použita nejprve metoda extrakce kapalinou

za zvýšeného tlaku (PSE) následovaná přečištěním a zakoncentrováním pomocí extrakce

tuhou fází (SPE). Výtěžnost této metody však byla velmi nízká. U ibuprofenu a naproxenu ve

většině případů nepřesáhla 35 %, u diklofenaku došlo (s jednou výjimkou) ke ztrátám větším

než 80 %. Ztráty lze přičíst jak významnému matričnímu efektu, tak také nedostatečně

optimalizované metodě. Z důvodů technické závady na přístroji PSE, resp. z důvodů časových

v případě SPE, nemohla být metoda zcela její optimalizována. V případě použití PSE se navíc

vyskytly potíže s ucpáváním frity v extrakční patroně jemnými částečkami kalu. Řešení

problému spočívalo v nasypání vrstvy nerozetřené hydromatrix do spodní části extrakční

patrony, čímž se ucpávání frity zamezilo.

Diklofenak

- 37 -

Druhou použitou metodu představovala extrakce ultrazvukem (USE). Výtěžnost této

metody byla v porovnání s kombinací PSE+SPE lepší. Za nevýhodu lze považovat menší

čistotu extraktu. Tento problém by bylo možné vyřešit použitím optimalizované metody SPE.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00

c (mg/ml)

Výtěžn

ost

Ibuprofen - PSE Ibuprofen - USE

Obrázek 16: Ibuprofen - porovnání výtěžností PSE a USE

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00

c (mg/ml)

Výtěžn

ost

Naproxen - PSE Naproxen - USE

Obrázek 17: Naproxen - porovnání výtěžností PSE a USE

- 38 -

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00

c (mg/ml)

Výtěžn

ost

Diklofenak - PSE Diklofenak - USE

Obrázek 18: Diklofenak - porovnání výtěžností PSE a USE

3.9 Analýza reálného vzorku

Pro určení koncentrace léčiv ve vzorku byly sestrojeny kalibrační křivky. Pomocí

ovládacího softwarového programu bylo stanoveno množství analytů ve vzorku. Ze šumu

základní linie byly vypočteny hodnoty meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ).

Nejprve byla odečtena výška píku sledovaného analytu z nejnižšího bodu kalibrace, která

odpovídá výšce signálu S. Dále bylo náhodně vybráno 15 píků reprezentujících šum, jejichž

průměrná výška odpovídá výšce signálu šumu N. Mez detekce představuje koncentraci

analytu, jejíž odezva na detektoru bude mít poměr signálu k šumu větší než 3 a mez

stanovitelnosti představuje koncentraci analytu, jejíž odezva na detektoru bude mít poměr

signálu k šumu větší než 10.

( ) ( )

⋅⋅=⋅

−−

N

Sc

LOD1

1 mlmgmlmg 3

( ) ( )

⋅⋅=⋅

−−

N

Sc

LOQ1

1 mlmgmlmg 10

Tabulka 10: Meze detekce a meze stanovitelnosti

mez detekce

LOD (mg·ml-1)

mez stanovitelnosti

LOQ (mg·ml-1)

Ibuprofen 0,0048 0,0161

Naproxen 0,0003 0,0011

Diklofenak 0,0012 0,0041

(1)

(2)

- 39 -

y = 22305x + 30,912

R2 = 0,9968

y = 2790,5x + 60,404

R2 = 0,9978

y = 2431x - 2,9141

R2 = 0,9996

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 1 2 3 4 5

c (mg/ml)

Plo

cha

píku

Naproxen Diklofenak Ibuprofen

Obrázek 19: Kalibrační křivka pro nesteroidní protizánětlivé látky

- 40 -

4 ZÁVĚR

Tato práce byla zaměřena na stanovení léčiv v kalech z čistíren odpadních vod. Na základě

zpracované rešerše byly zvoleny dvě skupiny nejvíce používaných léčiv. Makrolidová

antibiotika byla zastoupena erythromycinem a clarithromycinem, z nesteroidních

protizánětlivých látek (NSAID) byly vybrány ibuprofen, naproxen a diklofenak. Izolace

analytů z matrice byla provedena pomocí extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku (PSE)

a paralelně také metodou extrakce ultrazvukem (USE). Účinnost extrakčních metod byla

posuzována metodou standardního přídavku. K přečištění a zakoncentrování extraktu

získaného pomocí metody PSE byla použita metoda extrakce tuhou fází (SPE). K finálnímu

stanovení léčiv byla použita metoda ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC)

s detekcí pomocí diodového pole (UV-VIS-DAD).

Byla provedena optimalizace podmínek pro chromatografickou separaci NSAID. Kromě

toho byly vypočteny meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ) těchto látek.

Pro makrolidy nebyla metoda UHPLC s UV-VIS-DAD detektorem vhodná, protože tyto látky

postrádají chromoforovou skupinu, která by umožnila jejich detekci. Jejich stanovení je však

možné pomocí jiných typů detektorů, z nichž jako optimální lze doporučit hmotnostní

spektrometr.

Kal z ČOV vykazuje jako matrice značný matriční efekt. Nízká výtěžnost prokázána při

extrakci pomocí PSE byla pravděpodobně způsobena následným zařazením čisticího kroku

kroku SPE. Dodatečně provedenou optimalizací by bylo možné ztráty zmenšit; bohužel však

došlo k poruše přístroje. Proto nebylo jednoznačně možné posoudit jejich případnou

kontaminaci léčivy.

Nesporné výhody lze zjištěné při řešení této bakalářské práce lze spatřovat v nahrazení

dříve používané vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) jejím modernějším

nástupcem v podobě UHPLC. Za zmínku stojí především zkrácení doby analýzy, zvýšení

účinnosti separace a snížení množství použitých rozpouštědel pro mobilní fáze.

- 41 -

5 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJ Ů

[1] HAMPL, F., RÁDL S., PALEČEK J. Farmakochemie. 2. rozš. vyd. Praha: VŠCHT, 2007,

450 s. ISBN 978-80-7080-639-5.

[2] Česká republika. Zákon o léčivech: o léčivech a o změnách některých souvisejících

zákonů. In: Sbírka zákonů České republiky. 2007, č. 378.

[3] SANTOS, L., ARAÚJO, A. N., FACHINI, A., PENA, A., DELERUE-MATOS, C.,

MONTENEGRO, M. C. B. S. M. Ecotoxicological aspects related to the presence of

pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of Hazardous Materials. roč. 175, 1-3, s.

45-95. ISSN 03043894.

[4] PURDOM, C. E., HARDIMAN, P. A., BYE, V. V. J., ENO, N. C., TYLER C. R.,

SUMPTER, J. P. Estrogenic Effects of Effluents from Sewage Treatment Works. Chemistry

and Ecology. roč. 8, č. 4, s. 275-285. ISSN 0275-7540.

[5] LÜLLMANN, H., MOHR K., WEHLING, M. Farmakologie a toxikologie: překlad 15.,

zcela přepracovaného vydání. Vyd. 2. české. Praha: Grada, 2004, 725 s. ISBN 80-247-0836-

1.

[6] TERNES, T. A., HIRSCH, R. Occurrence and Behavior of X-ray Contrast Media in

Sewage Facilities and the Aquatic Environment. Environmental Science. roč. 34, č. 13,

s. 2741-2748. ISSN 0013-936x.

[7] HARPER, D. Bacteria (n.). The Online Etymology Dictionary [online]. © 2001-2012

[cit. 2013-02-20]. Dostupné z: http://www.etymonline.com/index.php?term=bacteria

[8] STONE, T., DARLINGTONOVÁ G. Léky, drogy, jedy. Vyd. 1. Překlad Vratislav

Schreiber. Praha: Academia, 2003, 440 s. ISBN 80-200-1065-3.

[9] VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie obecná. 2., přepr. vyd. Brno: Neptun, 2005, 351 s.

ISBN 80-868-5000-5.

[10] The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biological. 13th Ed. S.l.:

Merck and Co., INC., 2001, Přer.str. ISBN 0-911910-13-1.

- 42 -

[11] KOTYZA, J., SOUDEK, P., KAFKA, Z., VANĚK, T. Léčiva - „nový“ environmentální

polutant. Chemické listy. Praha: Česká společnost chemická, 2009, roč. 103, č. 7, s. 540-547.

ISSN 0009-2770.

[12] VIONE, D., FEITOSA-FELIZZOLA, J., MINERO, C., CHIRON, S.

Phototransformation of selected human-used macrolides in surface water: Kinetics, model

predictions and degradation pathways. Water Research. roč. 43, č. 7, s. 1959-1967.

ISSN 00431354.

[13] SCHWARZENBACH, R., GSCHWEND, P., IMBODEN, D. Environmental Organic

Chemistry. 2nd ed. Hoboken: John Wiley, 2005. ISBN 04-717-4399-2.

[14] SUÁREZ, S., CARBALLA, M., OMIL, F., LEMA, J. M. How are pharmaceutical and

personal care products (PPCPs) removed from urban wastewaters?. Reviews in Environmental

Science and Bio/Technology. roč. 7, č. 2, s. 125-138. ISSN 1569-1705.

[15] HORÁKOVÁ, D. Bioremediace [online]. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2007

[cit. 2013-04-24]. Elportál. ISSN 1802-128X.

[16] SOUDEK, P., PETROVÁ, Š., BENEŠOVÁ, D., KOTYZA, J., VANĚK, T.

Fytoremediace a možnosti zvýšení jejich účinnosti. Chemické listy. Praha: Česká společnost

chemická, 2008, roč. 102, č. 5, s. 346-352. ISSN 0009-2770.

[17] RICHTER, B. E., JONES, B. A., EZZELL, J. L., PORTER, N. L., AVDALOVIC, N.,

POHL, Ch. Accelerated Solvent Extraction: A Technique for Sample Preparation. Analytical

Chemistry. 1996, roč. 68, č. 6, s. 1033-1039. ISSN 0003-2700.

[18] NIETO, A., BORRULL, F., POCURULL, E., MARCÉ, R. M. Pressurized liquid

extraction: A useful technique to extract pharmaceuticals and personal-care products from

sewage sludge. Trends in Analytical Chemistry. 2010, roč. 29, č. 7, s. 752-764. ISSN 0165-

9936.

[19] REEVE, R. N. Introduction to Environmental Analysis. Chichester: John Wiley and Sons

Ltd., 2002, 301 s. ISBN 04-714-9295-7.

[20] JELIĆ, A., PETROVIĆ, M., BARCELÒ, D. Multi-residue method for trace level

determination of pharmaceuticals in solid samples using pressurized liquid extraction

- 43 -

followed by liquid chromatography/quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. Talanta.

2009-11-15, roč. 80, č. 1, s. 363-371. ISSN 00399140.

[21] GÖBEL, A., THOMSEN, A., MCARDELL, C. S., ALDER, A. C., GIGER, W., THEIß,

N., LÖFFLER, D., TERNES, T. A. Extraction and determination of sulfonamides,

macrolides, and trimethoprim in sewage sludge. Journal of Chromatography A. 2005,

roč. 1085, č. 2, s. 179-189. ISSN 00219673.

[22] NIETO, A., BORRULL, F., MARCÉ, R. M., POCURULL, E. Selective extraction of

sulfonamides, macrolides and other pharmaceuticals from sewage sludge by pressurized

liquid extraction. Journal of Chromatography A. 2007, roč. 1174, 1-2, s. 125-131.

ISSN 00219673.

[23] RADJENOVIĆ, J., JELIĆ, A., PETROVIĆ, M., BARCELÓ, D. Determination of

pharmaceuticals in sewage sludge by pressurized liquid extraction (PLE) coupled to liquid

chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Analytical and Bioanalytical

Chemistry. 2009, roč. 393, 6-7, s. 1685-1695. ISSN 1618-2642.

[24] GROS, M., RODRÍGUEZ-MOZAZ, S., BARCELÒ, D. Fast and comprehensive multi-

residue analysis of a broad range of human and veterinary pharmaceuticals and some of their

metabolites in surface and treated waters by ultra-high-performance liquid chromatography

coupled to quadrupole-linear ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography

A. 2012, roč. 1248, s. 104-121. ISSN 00219673.

[25] GÓMEZ, M. J., PETROVIĆ, M., FERNÁNDEZ-ALBA, A. R., BARCELÓ, D.

Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and

liquid chromatographyâ tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent

wastewaters. Journal of Chromatography A. 2006, roč. 1114, č. 2, s. 224-233.

ISSN 00219673.

[26] ABUIN, S, CODONY, R., COMPAÑÓ, R., GRANADOS, M., DOLORS PRAT, M.

Analysis of macrolide antibiotics in river water by solid-phase extraction and liquid

chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2006, roč. 1114, s. 73-81.

ISSN 00219673.

[27] MASON, T. Sonic and ultrasonic removal of chemical contaminants from soil in the

laboratory and on a large scale. Ultrasonics Sonochemistry. 2004, vol. 11, 3-4, s. 205-210.

- 44 -

[28] CHRISTIAN, G. D. Analytical chemistry. 5th ed. New York: John Wiley, 1994, 812 s.

ISBN 04-715-9761-9.

[29] LUCCI, P., PACETTI, D., NÚÑEZ, O., FREGA, N. G. Chromatography - The Most

Versatile Method of Chemical Analysis: Current Trends in Sample Treatment Techniques for

Environmental and Food Analysis [online]. InTech, 24. October, 2012 [cit. 2013-04-01].

ISBN 978-953-51-0813-9. Dostupné z: http://www.intechopen.com/books/chromatography-

the-most-versatile-method-of-chemical-analysis/current-trends-in-sample-treatment-

techniques-for-environmental-and-food-analysis

[30] GONZÁLEZ DE LA HUEBRA, M.J., VINCENT, U. Analysis of macrolide antibiotics

by liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005,

roč. 39, 3-4, s. 376-398. ISSN 07317085.

[31] GRABIC, R., FICK, J., LINDBERG, R. H., FEDOROVA, G., TYSKLIND, M. Multi-

residue method for trace level determination of pharmaceuticals in environmental samples

using liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry. Talanta. 2012,

roč. 100, s. 183-195. ISSN 00399140.

[32] HPLC apparatus. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA):

Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2013-04-02].

Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus.svg

[33] Chromatografická kolona a kapiláry. DOUŠA, M. HPLC.CZ [online]. [2011] [cit. 2013-

04-03]. Dostupné z: http://www.hplc.cz/Tip/column_capilar.htm

[34] AGILENT TECHNOLOGIES, Inc. Performance characteristics of the Agilent 1290

Infinity Diode Array Detector: Technical Overview [online]. April 1, 2010 [cit. 4.4.2013].

Dostupné z: http://www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5990-5601 EN

.pdf

[35] MAJORS, R. E. Fast and Ultrafast HPLC on sub-2 µm Porous Particles – Where Do We

Go From Here?. LC GC Europe. 2006, vol. 19, issue 6. ISSN 1471-6577.

[36] Základy UPLC. DOUŠA, M. HPLC.CZ [online]. [2011] [cit. 2013-04-03]. Dostupné z:

http://www.hplc.cz/UPLC/

- 45 -

[37] VYDROVÁ, Lucie Využití separačních metod pro studium biologicky aktivních látek ve

vodách: The Usage of separation methods for research of biologically active substances in

waters. Brno: Vysoké učení technické, Fakulta chemická, 2011. 118 s. Dizertační práce.

Vedoucí práce Milada Vávrová.

- 46 -

6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

� ČOV čistírna odpadních vod

� DAD detektor diodového pole

� ECD elektrochemický detektor

� GPC gelová permeační chromatografie

� HMG-CoA -reduktáza 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreduktáza,

klíčový enzym syntézy cholesterolu

� HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

� FTIR detektor zpracovávající infračervené záření

� MAE extrakce mikrovlnným zářením

� mRNA mediátorová ribonukleová kyselina

� MS hmotnostní spektrometrie

� MUSK syntetické vonné látky

� NSAID nesteroidní protizánětlivé látky

� PAU polycyklické aromatické uhlovodíky

� PCB polychlorované bifenyly

� POP perzistentní organické polutanty

� PPCP léčiva a produkty osobní potřeby

� PSE extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (synonyma: PLE, ASE, PFE)

� SFE superkritická fluidní extrakce

� SPE extrakce tuhou fází

� tRNA transferová ribonukleová kyselina

� UHPLC

(UPLC) ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie

� USE extrakce pomocí ultrazvuku

� ÚCHTOŽP Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí, Fakulta

chemická, Vysoké učení technické v Brně

- 47 -

7 PŘÍLOHY

Obrázek 20: UV spektrum ibuprofenu

Obrázek 21: UV spektrum naproxenu

nm220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

*DAD1, 4.128 (477 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D

nm220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

*DAD1, 7.408 (150 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D

- 48 -

Obrázek 22: UV spektrum diklofenaku

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

DAD1 C, Sig=214,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D)

Obrázek 23: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 214 nm

nm220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

*DAD1, 7.141 (415 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D

Ibuprofen

- 49 -

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

DAD1 D, Sig=230,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D)

Obrázek 24: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 230 nm

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D)

Obrázek 25: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 275 nm

Naproxen

Diklofenak