VIRUSNI VEKTORI U GENSKOJ TERAPIJI

Andrea Hloušek-Kasun

2. god. preddiplomskog studija Molekularne biologije

Prirodoslovno-matematički fakultet

Sveučilište u Zagrebu

Osnovno o virusima

• Virusi su zarazni uzročnici koji sadrže samo jedan tip nukleinske kiseline omotane u proteinski omotač (virusnu kapsidu) koji može biti izgrađen od jedne ili nekoliko vrsta proteina

• Složeniji virusi ponekad sadrže i virusnu ovojnicu koja je staničnog porijekla i stoga lipoproteinskog sastava, a može sadržavati i ugljikohidrate

• Virusi namedu stanicama svoju genetičku informaciju, te za njezinu ekspresiju koriste enzimske mehanizme domadina

• Neki se ugrađuju u genom te tako postaju latentni ili perzistentni, a neki transformiraju genom domadina, remete kontrolne mehanizme rasta stanice i uzrokuju tumore

5 faza životnog ciklusa virusa

1. Adsorpcija (prihvadanje virusa za površinu ciljnih stanica)

2. Ulaženje virusne čestice u stanicu (penetracija) (ulaz genoma u metabolički aktivne stanice (potrebna E), uglavnom ulaze u

citoplazmu a neki i u jezgru)

3. Sinteza osnovnih građevnih jedinica virusne čestice

4. Sastavljanje novih virusnih čestica

5. Izlaženje virusa iz stanice ( za vedinu neomotanih virusa izlazak je litički, a omotani pupaju kroz

membranu)

GENSKA TERAPIJA

Ključni korak genske terapije je uvođenje kloniranog gena u ljudske stanice.

Metode prijenosa kloniranog gena su podijeljene na:

- VIRALNE – izrazito učinkovito kod monogenskih bolesti

- NEVIRALNE ( Koriste se lipidne vezikule u kojima se nalazi DNA od interesa. Lipidne vezikule u stanice ulaze

endocitozom. Njihovom razgradnjom

DNA se otpušta u citosol, nakon čega

ulazi u jezgru, te se

integrira u kromosom.)

EX VIVO

Genetički materijal uvodi se prvo u stanice u kulturi. Kontroliran proces. Stanice su autologne – uzimaju se iz pacijenta i potom vračaju natrag

IN SITU

Vektor se uvodi na lokalizirano i dostupno mjesto u tijelu (npr. Liječenje melanoma)

IN VIVO

Vektor se uvodi izravno u tijelo pacijenta. Prilično nasumičan proces, mala mogudnost kontrole. Za tkiva koja se ne mogu uzgajati in vitro.

Invazivnost genske terapije

VIRALNE METODE

• Najčešde korišteni virusi su: retrovirusi, adenovirusi i parvovirusi

• Genetičkom modifikacijom ovih virusa dobivamo odlične vektore koje posjeduju kapacitet inficiranja stanica i tkiva, ali za razliku od virusa divljeg-tipa ne posjeduju mogudnost replikacije

• U stanicu ulaze endocitozom, nakon čega se virusni omotač degradira, a viralni genom oslobađa u citoplazmu a zatim putuje u jezgru

• Ili u stanicu injeciraju samo svoj genetički materijal

ds DNA

ds DNA

ss DNA

RETROVIRUSI • Ekotropni – inficiraju samo mišje stanice, za ulaz koriste

receptore kojih nema na ljudskim stanicama (MoMLV)- testiranje na miševima

• Amfotropni –inficiraju vedinu stanica sisavaca, u stanicu ulaze

putem natrij- ovisnih

fosfatnih transportera

• Retrovirusni genom ne može prodi kroz cjelovitu jezgrinu ovojnicu – kod stanica koje se dijele dolazi do pucanja jezgrine ovojnice pa virusni genom može doprijeti do kromosoma i ugraditi se (Lentivirusi nemaju ova ograničenja)

TEMELJNE MODIFIKACIJE • 1. Provirusni ekspresijski konstrukt koji sadrži mutaciju u

mjestu za pakiranje

• 2. Eksperimentalni vektor koji sadrži ciljni gen i mjesto za pakiranje

• Kotranfekcijom nastaju svi potrebni proteini iz provirusa

• Jedina genomska RNA koja se pakira potječe iz defektnih virusnih čestica

Virioni koji se ne mogu replicirati

Virioni inficiraju ciljnu stanicu, virusni genom se ugrađuje u kromosom i eksprimira se gen od interesa, ali se virus ne može replicirati

Packaging cells

• Modifikacijom retrovirusne ovojnice ugradnjom specifičnih proteina može se postidi :

- infekcija što vedeg broja tipova stanica

- infekcija specifičnih tipova stanica

ADENOVIRUS • Virusi bez ovojnice

• Uzrokuju upale dišnog sustava, probavnog sustava te očiju

• Ne dolazi do integracije virusnog genoma u genom domadina

• Ekspresija je prolazna (5-10 dana), potrebna je dugotrajna i učestala aplikacija

• Mogudi je upalni i imunološki odgovor

• 12 niti poput antena služe za prihvadanje virusa

MODIFIKACIJE ZA GENSKU TERAPIJU

• Delecija E1A gena (nemogudnost propagacije)

• Uklanjanje vedine virusnih proteina (sprječavanje imunološkog odgovora)

• Uklanjanje virusnih proteina koji bi mogli biti homologni s divljim tipom (sprječavanje rekombinacije)

1. PRIHVAĆANJE ADENOVIRUSA NA CAR RECEPTOR

2. INTERNALIZACIJA PUTEM INTEGRINA

CAR je važan za međustaničnu adheziju, kad je ona prekinuta CAR je dostupniji Prijenos u oštedeno tkivo je učinkovitije

Adenovirusi su učinkoviti u liječenju cistične fibroze Genetički modificirani adenovirusi sa funkcionalnim CFTR genom unose se putem aerosola u pluda oboljeloga Udahnuti adenovirusi ulaze u pludne stanice gdje se potom sintetizira protein koji nedostaje

• http://2009.igem.org/Team:Tsinghua/Background#Viral_Methods