vigilancia de la resistencia a los antimicrobiana y...
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Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobiana y Técnicas de
Biología Molecular
Dr. Juan Carlos Hormazábal O.
Subdepto. Enfermedades Infecciosas
Agenda:Agenda:
GeneralidadesGeneralidades
BiologBiologíía Molecular en Bacteriologa Molecular en Bacteriologíía:a:DiagnDiagnóósticosticoCaracterizaciCaracterizacióónn
Vigilancia y confirmaciVigilancia y confirmacióón n K. K. pneumoniaepneumoniae productora de productora de CarbapenemasaCarbapenemasa
Resistencia Antimicrobiana
Una Amenaza Global
Impacto Transversal
Paciente
Salud Pública
Económico
Social
LaboratorioMDR TBC
Leptospira
HCV
S pneumoniae ResistenteBrucella
E. Coli STEC
Rikettsia
Bartonella
Ehrlichia
SAMR Comunitario
Bartonella
Virus Influenza
Virus Fiebre Amarilla
Virus Nilo Occidental
Coxiella burnetii
Plasmodium
SARS
Cambio Climático
Pob. Susceptible
Inmigración, Viajes
Intercambio comercial
Uso Antimicrobianos
Vibrios
Resistencia AntimicrobianaResistencia Antimicrobiana
HospitalHospital
IAASIAASComunidadComunidad
Mundo AnimalMundo Animal
AmbienteAmbiente
VisiVisióónn IntegradaIntegrada
Nuevas formas de resistencia antimicrobiana como resultado del amplio uso de antimicrobianos.
La determinación genética de los mecanismos de resistencia ha permitido el uso de métodos de Biología Molecular.
La bacteriología clínica clásicamente se subdivide en dos importantes componentes:
Identificación (diagnóstico)
Tipificación
La biología molecular ha sido el gran responsable de una profunda revolución en el entendimiento del comportamiento de las poblaciones bacterianas teniendo un directo impacto en el diagnóstico y tipificación de agentes infecciosos.
1. Diagnóstico
La ventajas de las técnicas moleculares radican en su sensibilidad, especificidad y bioseguridad. Este ultimo aspecto se fundamenta en que estas metodologías no requieren la presencia del agente infeccioso vivo, ya que las pruebas moleculares se pueden realizar en muestras o extractos sometidos a procesos químicos de inactivación
Tradicionalmente la identificación taxonómica de agentes bacterianos:
Cultivo
Microscopía o morfología
Características bioquímicas y serológicas
Genero y Especie Bacteriana
Áreas de desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de agentes infecciosos bacterianos.
Identificación rápida de agentes infecciosos en pacientes críticos.
Identificación rápida de agentes infecciosos fastidiosos o de lento cultivo en que los métodos tradicionales no presentan un buen desempeño (microbiológicos y/o serológicos)
Identificación de agentes no viables o no cultivables.
Determinación rápida de resistencia antimicrobiana.
Diagnóstico de agentes infecciosos de alto riesgo biológico
Técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico bacteriano
• Hibridación• Amplificación, Reacción de la Polimerasa en Cadena• PCR en Tiempo Real• Hibridación Reversa• Métodos Basados en secuenciación
Espectrometría de MasasMaldiTof
Métodos genéticos pueden entregar resultados en menor tiempo
Útil en agentes de crecimiento lento.
Solo útil si se conoce la genética del mecanismo de resistencia.
Métodos convencionales detectan resistencia en forma global.
Potenciales Ventajas de Métodos Genéticos:
Se pueden realizar directamente sobre muestras clínicas.
Genotipo Expresión Fenotípica.
Determinación genotípica mas veloz que la fenotípica
(organismos de crecimiento lento).
Utilidad en agentes no cultivables.
Menor riesgo biológico frente a agentes peligrosos.
EstEstáándaresndares
CalidadCalidad
Desventajas de Métodos Genéticos en Susceptibilidad.
Métodos genéticos podrían detectar resistencia expresada a un nivel que no sea clínicamente relevante.
Falsos positivos por contaminación de la muestra.
Estandarización y control de calidad multicéntrico aún en etapas iniciales.
Desventajas de Métodos Genéticos en Susceptibilidad.
Falta de sensibilidad si concentración de organismos es baja en la muestra.
Diferentes pruebas son requeridas para cada antimicrobiano.
Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios mecanismos asociados involucrando diferentes genes de resistencia.
Para algunos agentes, los mecanismos genéticos son aún desconocidos.
PCR en la Detección de Resistencia Antimicrobiana.
•Biología Molecular clave en el entendimiento de los mecanismos de resistencia bacteriana.
•PCR permite detectar resistencia en cepas y directamente en muestras clínicas.
•Presencia del gen v/s expresion.
PCR en la Detección de Resistencia Antimicrobiana.
Agente Resist. Gen blanco
S. aureus y coag. negat. Meticilina , mecAMeticilino resist. atb Betalactam.
Enterococcus spp. Vancomicina vanA, vanB, vanC1, vanC2, VanC3.
Enterobacterias product. Cefalosporinas SHV, TEM -lactamasas expectro expandido
M. tuberculosis Isoniacida kat-G, inhA, ahpCRifampicina rpoB
La PCR es una herramienta integral en Biología Molecular, que debido a su versatilidad y fácil estandarización se ha convertido en una pieza clavetanto en el área de la investigación como en eldiagnóstico.
PCR: Reacción de la Polimerasa en Cadena.
Historia de la PCR:
1983 Kary Mullis inventa la PCR.
1985 Primera Publicación Científica.
1986 Cetus Corp. y Perkin Elmer inician desarrollos de reactivos e instrumentos para PCR.
1988 Se publica el uso de la Taq Polimerasa en PCR. (Saiki et Al.)
1990/1993 Gran batalla por los derechos de fabricación de reactivos para PCR.
1993 Kary Mullis recibe el Premio Nobel en Química.
Cadena libre ADN madre3’ 5’
5’ 3’ADN polimerasa
dNTPs
Primer
PCR.
Buffer
MgCl
95ºC
72ºC
55ºC
Denaturación inicial
Ciclo1
Ciclo2 Etc., etc…
Tiempo
Ciclos Térmicos de la PCR.
Temp.
Acumulación Teórica de Productos de Amplificación.
N°Ciclos N°Copias doble hebra0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 51210 102411 204812 409613 819214 1638415 3276816 6535617 13107218 26214419 52428820 1048576
PCR Gel Image
Enterococcus spp. Detección de Genotipo Van
Enterobacteriaceae:E. coli, K. pneumoniae
BLEE
TEM SHV OXA CTX-M PER VEB TLA SFO GES
Isoelectric focusing of SHV-25 and SHV-26 carriers and the E. coli strains into which SHV-25 and SHV-26 were cloned. Lane 1, TEM-1 and SHV-1 standard; lane 2, SHV-26 carrier; lane 3, SHV-25 carrier; lane 4, cloned SHV-26 carrier; lane 5, cloned SHV-25 carrier. The numbers indicate pI values
Determinación BLEE: Punto isoeléctrico.
2. Las herramientas moleculares en tipificación bacteriana pueden clasificarse en cuatro principales categorías:
Tipificación por patrones de restricción
Tipificación por amplificación
Tipificación por secuenciación
Tipificación por hibridación
Tipificación por patrones de restricción
Esta metodología de tipificación discrimina las bacterias estudiadas en base a diferencias en el tamaño de los fragmentos de ADN generados por amplificación o por cortes producidos por enzimas de restricción.
Electroforesis de campo pulsado (PFGE)
Esta tecnica se basa en la digestión específica del ADN genómico de la bacteria por enzimas endonucleasas o de restricción, las cuales reconocen sitios específicos en el cromosoma generando largos fragmentos de ADN (10kb a 10Mb)La aplicación de un complejo sistema de pulsos electricos alternantes, en diversos angulos, permite separar en el gel de agarosa estos grandes fragmentos, generando un patron de bandas llamado huella digitalbacteriana o fingerprinting
PFGE
Modelo
Categoría Nº bandas diferentes
Nº eventos genéticos
Interpretación epidemiológica
Indistinguible 0 0 Aislamiento es parte del brote
Muy relacionado 2\3 1 Aislamiento probablemente es parte del brote
Posiblemente relacionado
4\6 2 Aislamiento posiblemente es parte del brote
Diferente >=7 >=3 Aislamiento no es parte del brote
Criterios de Tenover para la interpretación de perfiles de PFGE
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.
A B C D E
0 3 3 2 2
Lane
Nº of diferences
PFGEgel
Kb
600
500
400
200
100
75
400 250\150 600 450 350Fragmentos resultantesFragmentos resultantes
PFGE : Cambios en los patrones frente a eventos genéticos
Cambios en el ganancia de \pérdida de inserción de \deleción deFragmento de 400 kb ninguno sitio de restricción un fragmento de 50 kb
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.
PFGE de brote de Serratia marcescens
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.
RibotipificaciónEs una variante del RFLP, en que el area a analizar se circunscribe al operón ribosomal que se compone de tres genes (16S, 23S y 5S) y que codifican el RNA ribosomal (rRNA).
Debido a su rol vital en la síntesis polipeptídica bacteriana estos genes se caracterizan por presentar secuencias altamente conservadas
Esta metodología incluye un proceso de digestión por enzimas de restricción de alta frecuencia de sitios de reconocimiento, seguido de separación de fragmentos por electroforesis, transferencia a membrana de nitrocelulosa o nylon y posterior hibridación con sondas marcadas.
Esta metodología permite tipificar geneticamente los agentes bacterianos con un poder resolutivo menor que la PFGE.
Tipificación por secuenciación
Durante los últimos años, con la disponibilidad de secuenciadores automáticos cada vez más veloces y accesibles, las técnicas de tipificación basadas en secuencias nucleotídicas han alcanzado un mayor desarrollo
Tipificación por secuenciación de multilocus MLST
Esta metodología se basa en la secuenciación de fragmentos internos de siete housekeeping genes, es decir genes altamente conservados ya que codifican pasos metabólicos fundamentales para la vida de la bacteria
Estos fragmentos de 450-500 bp son secuenciados e ingresados a una base de datos en línea (www.mlst.net)
Herramientas Epi-MolTipificación Genética.
MLST PFGE
Tiempo evolutivo medido en cambios.
MLST: Gold Standard para relaciones evolutivasPFGE: Gold Standard para análisis de brotes
RIBOTIP.
Confirmación y Caracterización Genética
SUB SISTEMAS DE VIGILANCIA
Vigilancia de Agentes EtiológicosVigilancia de Resistencia Antimicrobiana
.
Vigilancia Universal Caso a CasoVigilancia Basada en CentinelaVigilancia de Brotes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
Control de AnimalesControl de VectoresMonitoreo Ambiental: agua, aire, suelo, vivienda.Control de Alimentos
Vigilanciade Morbilidad
Vigilancia de Laboratorio
Vigilancia Ambiental
VIGILANCIAENFERMEDADESTRANSMISIBLES
RED DE VIGILANCIA ENFERMEDADES TRANSMISIBLESRED DE VIGILANCIA ENFERMEDADES TRANSMISIBLESRED DE VIGILANCIA ENFERMEDADES TRANSMISIBLES
Confirmación de Carbapenemasas en Enterobacterias
Aislamientos estudiados en el Instituto de Salud Pública
Al 31 de Diciembre del 2012, el Laboratorio de Referencia del ISP ha confirmado 7 aislamientos blaKPC (6 K. pneumoniae, 1 E. coli ) correspondientes a 6 casos
Región Año 2011 2012
XV 18 30
I 1 4
II 2 20
III 0 2
IV 4 26
V 65 67
RM 185 503
VI 4 20
VII 2 26
VIII 10 9
IX 23 59
X 3 50
XI 0 2
XIV 21 49
Total aislamientos 338 867
Instituto de Salud Pública:
Confirmación de Carbapenemasas en Enterobacterias
1. Detección de Carbapemasas por PCR:
blaVIM (261 pb)
blaIMP (587 pb)blaKPC (331 pb)
blaSME (831 pb)
E.coli K. p C (+) C (-)
Yigit et al. 2011. AAC. 45 : 1151-1161
blaKPC
2. Determinación tipo blaKPC por amplificación y secuenciación
3. Subtipificación por PFGE
4. Determinación de linaje genético por Secuenciación de Multilocus (MLST), según protocolo y base de datos internacional Instituto Pasteur, Francia.
Diancourt L, J Clin Microbiol. 2005, Aug;43(8):4178-82.
ST: Tipo de Secuencia
MLST Tipificación por Secuenciación de Multilocus
Secuenciación de fragmentos internos de 7 genes altamente conservados
K. pneumoniae
Fragmentos
Secuenciar
Perfil Alélico
MLST
DataBase
ST
Secuenciación de multilocus (MLST) revela ST relacionados a ST258
14 de Marzo de 2012Caso importado de EuropaKlebsiella pneumoniaeKPC-2 ST 101
14 de Abril de 20121º Caso Autóctono en Chile
Klebsiella pneumoniaeKPC-2 ST11E. coliKPC-2
Instituto de Salud PúblicaConfirmación de Enterobacterias portadoras de KPC en Chile
Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública
Paciente 2 (Primer caso autóctono KPC)
Paciente Sexo masculinoFecha informe: 14 de Abril de 2012Muestra: Prótesis vía biliarProcedencia: Centro Hospitalario 2 Región Metropolitana.Resultados:Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST 11E. coli KPC-2 positivoTipificación por MLST, en proceso.
Paciente 3
Paciente sexo masculinoFecha de Informe: 19/04/2012Muestra: Aspirado endotraqueal.Procedencia: Centro Hospitalario 2 Región Metropolitana.Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST 11
Paciente 4Paciente sexo femeninoFecha Informe: 26/04/2012Muestra: Expectoración.Procedencia: Centro Hospitalario 3 Región Metropolitana Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST258
Paciente 5Paciente sexo masculinoFecha Informe: 26/04/2012Muestra: Sangre.Procedencia: Centro Hospitalario 3 Región MetropolitanaResultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST:ST25
Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública
Paciente 6Paciente sexo femeninoFecha informe: 01/06/2012 Muestra: SecreciónProcedencia: Centro Hospitalario 1 TemucoResultado: Klebsiella pneumoniae. KPC-2 positivaTipificación MLST: ST11
Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública
Paciente 7Paciente sexo masculinoFecha Informe: 27/03/2013Muestra: OrinaProcedencia: Centro Hospitalario 5 Región MetropolitanaResultado: Klebsiella pneumoniae KPC (Pendiente)Tipificación por MLST: Pendiente
Paciente 8Paciente sexo masculinoFecha Informe: 27/03/2013Muestra: OrinaProcedencia: Centro Hospitalario 5 Región MetropolitanaResultado: Klebsiella pneumoniaeKPC(pendiente)Tipificación por MLST (Pendiente)
Casos Autóctonos Confirmados por ISP Año 2013
Paciente 9Paciente 9Procedencia Centro Hospitalario RMProcedencia Centro Hospitalario RMResultado Resultado K. K. pneumoniaepneumoniae KPCKPCMLST ST Nuevo en curaciMLST ST Nuevo en curacióón base de datosn base de datos
SubtipificaciSubtipificacióón Molecular n Molecular K. pneumoniaeK. pneumoniae KPC positivas por KPC positivas por PFGE. ISP, 2012 PFGE. ISP, 2012 -- Marzo 2013Marzo 2013
El Instituto de Salud Pública
Confirma la presencia de K. pneumoniaeproductora de carbapenemasa en 8 casos autóctonos
La electroforesis de campo pulsado revela polimorfismo (bajo componente clonal)
El aislamiento corresponde a Klebsiella pneumoniae KPC-2 y tipo de secuencia ST11, ST25, ST258 en el análisis de MLST (Multilocus Sequence Typing, según base de datos Instituto Pasteur, Francia)
El clon de Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST258, ha sido reconocido internacionalmente como el mayor responsable de la diseminación mundial de Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa
En nuestro país se han detectado tres aislamientos ST11, los cuales se integran al complejo clonal ST258, es decir se establecen genéticamente cercanos a Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST258
¡¡Gracias!Gracias!