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FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

Analysemethode Méthode d’analyse

I-MET-LFSAL-099 & 099a Analyse des avermectines et des milbémycines dans le foie par HPLC-FLUO

Techniek Technique

HPLC-Fluorimétrie

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

Foie

Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation

19/01/2009


• Résumé des critères de performance :

CCα & CCβ : §3 (page 4) et §4 (page 5), dossier de validation du 19/01/2009 (édition 1).

Rendement apparent : §5 (page 5 et 6), dossier de validation du 19/01/2009 (édition 1).

Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire, §6 (page 7 et 8), dossier de validation du 19/01/2009 (édition 1).

• La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180

• Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres :

CCα & CCβ : maximum 10 % relatif supérieur aux CCα & CCβ de la

présente validation ou selon spécifications de la Décision 2002/657/CE.

Rendement apparent : teneur > 10 ppb 80-110% ; 1 ppb <teneur≤ 10 ppb 70-110 % ou mêmes règles après ajout dosé (§5.2 page 6).

Reproductibilité intra-laboratoire : doit satisfaire à l’équation d’Horwitz

• Historique de validation:

Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 M. Evrard / 02-2012 Adaptation au

nouveau template Adaptation au nouveau template du dossier de validation du 19/01/2009 avec annexe photos


LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 1/9

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d’analyse

I-MET-LFSAL-099 & 099a Analyse des avermectines et des milbémycines dans le foie par HPLC-FLUO

Techniek Technique

HPLC-FLUO

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

Foies

Type validatie Type de validation

Totale

Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction)

Ir MARC EVRARD, chef de section

Opgesteld door Rédaction par

Evrard Marc 19/01/2009

Handtekeningen - Signatures: Sé

Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction)

C. Haudestaine / L. Keyaert /Y. Bouamar Experts techniques

Periode van validatie Période de validation

Start - Début: 29/08/2008 Einde - Fin: 19/01/2009 Adaptation du dossier de validation au template : février 2012

Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par

Ir Marc Evrard Chef de section

Handtekeningen - Signatures: Sé

Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.



Dossier de validation des avermectines et milbemycines dans le foie par HPLC-Fluorimétrie.

Les avermectines et les milbemycines sont des substances autorisées reprises dans la Directive 96/23/CE. La validation est à la fois qualitative et quantitative selon la décision 2002/657/CE par rapport aux MRLs imposées (annexe I du règlement 2377/90). Les paramètres dont il faut tenir compte sont : La linéarité ; L’exactitude : rendement apparent (biais) ; La précision : répétabilité et reproductibilité intralaboratoire à 50, 100, 150 % de la MRL ; La sélectivité/spécificité ;

La limite de décision (CCα) et la capacité de détection (CCβ) ; La stabilité. Une validation a été réalisée sur du foie de porc (FP) ; des validations complémentaires ont été réalisées sur du foie de mouton (FM) et du foie de bœuf (FB). 1.MRL dans les foies (au 32/12/2006) Porc (ppb) Bœuf (ppb) Mouton (ppb) Abamectine / 20 25 Doramectine 100 100 100 Eprinomectine / 1500 / Ivermectine 100

15 au 20/01/2008

100 100 15 au 20/01/2008

Moxidectine / 100 100 2.La linéarité Le modèle linéraire à été retenu. Les critères concernant la linéraité sont les suivants :

- Un coefficient de détermination ≥ 0.99 ; - La gamme de concentration de la droite dans la validation comme en routine doit couvrir les valeurs des pic détectés ; des dilutions des extraits finaux sont, le cas échéant, effectuées.



- Un écart maximum de chaque point ≤ 10 % (pourcentage résiduel) par rapport au modèle ; le cas échéant, jusqu’à 2 des 6 points de la droite peuvent être éliminés ;

100% ×=−

théorique Valeur

estimée Valeurthéorique Valeurrésiduel

Les résultats de validation sont tous calculés à partir de régressions linéaires au sens des moindres carrés respectant les 3 critères énoncés ci-dessus.

3.La limite de décision CCα

Pour les substances autorisées, le CCα est la concentration au delà de laquelle on peut conclure que

l’échantillon est non conforme (positif) avec une erreur α de 5 %.

3.1. Validation principale sur foies de porc

Le CCα a été déterminé conformément à la décision 2002/657 CE. Au moins 20 matériaux blancs (ici 3*11) ont été supplémentés à la limite autorisée (LMR). La limite de décision est égale à la limite autorisée plus 1.64 fois l’écart type de reproductibilité intralaboratoire (à la LMR).

Dans les cas ou aucune LMR n’est fixée, c’est la LOQ qui fait office de CCα. 3 niveaux de concentration ont été utilisés lors de la validation dans le foie de porc en 3 répliques à des moments différents à 0.5 , 1 et 1.5 x la LMR (ou à des concentrations adéquates si pas de LMR) : 0.5 x MRL (ppb) 1 x MRL (ppb) 1.5 x MRL (ppb) Abamectine 12.5 25 37.5 Doramectine 50 100 150 Eprinomectine 25 50 75 Ivermectine 50 100

15 au 20/01/2008 150

Moxidectine 25 50 75 Les chiffres en gras représentent les molécules pour lesquelles une LMR a été établie dans le foie de porc.



3.2.Validations complémentaires sur foies de bœuf et mouton. Pour la validation complémentaire, pour chaque espèce (bœuf ou mouton), 11 échantillons ont été dopé à la

LMR ; Dans les cas ou aucune LMR n’est fixée, c’est la LOQ qui fait office de CCα. Ces 11 échantillons ont été analysés dans des conditions de répétabilité c’est-à-dire le même jour par le même laborantin avec le même matériel. Les chiffres en gras représentent les molécules pour lesquelles une LMR a été établie.

1 x MRL, FM (ppb) 1 x MRL, FB (ppb) Abamectine 25 20 Doramectine 100 100 Eprinomectine 15 1500 Ivermectine 100

15 au 20/01/2008 100

Moxidectine 100 100

Les valeurs obtenues pour les CCα sont reprises dans le tableau ci dessous : CCα (ppb) FP

n= 3*11 CCα (ppb) FM n=1*11

CCα (ppb) FB n=1*11

Abamectine 4 26 22 Doramectine 111 112 108 Eprinomectine 4 4 1723 Ivermectine 108

16 (n=2*10) au 20/01/2008

111 17 (n=2*10) au 20/01/2008

106

Moxidectine 4 110 111

4. La capacité de détection CCβ

Pour les substances autorisées, le CCβ correspond à la concentration au delà de laquelle on peut conclure

que l’échantillon est véritablement non conforme (positif) avec une certitude statistique de 1-β, càd avec une certitude de 95 %.

La capacité de détection est obtenue suivant la formule CCβ = CCα + 1.64 Sr à la concentration considérée. Ces valeurs sont pour informations mais ne sont pas exploitées dans le cas des substances autorisées.



Les valeurs obtenues pour les CCβ sont reprises dans le tableau ci dessous : CCβ (ppb) FP

n= 3*11 CCβ (ppb) FM n=1*11

CCβ (ppb) FB n=1*11

Abamectine 4,5 27 24 Doramectine 122 124 116 Eprinomectine 4,5 4,5 1946 Ivermectine 116

17 au 20/01/2008 122 19 au 20/01/2008

112

Moxidectine 4,5 120 122 5. L’exactitude : rendement apparent 5.1. Validation principale sur foie de porc Le rendement apparent est le rendement calculé après correction par le standard interne ; il ne s’agit donc pas du rendement réel de l’extraction. Le rendement apparent a été calculé pour chaque niveau de fortification. Conc. dopage (ppb) Conc. calculée (ppb)

n=3*11 Rendement (%)

Abamectine 12.5 6.4 51,2 25 22.4 89,6 37.5 38.9 103,7

Doramectine 50 40.7 81,4 100 90.1 90,1 150 142.3 94,9

Eprinomectine 25 16.8 67,2 50 34.7 69,4 75 64.3 85,7

Ivermectine

15 au 20/01/2008 50

12.8 (2*10) 34.7

85.33 69,4

100 75.6 75,6 150 126.7 84,5

Moxidectine 25 24.9 99,6 50 46.4 92,8 75 74.3 99,1



5.2. Validation complémentaire sur foie de bœuf et mouton

Boeuf Conc. dopage (ppb) Conc. calculée (ppb)

n=1*11 Rendement (%)

Abamectine 20 27.5 137 Doramectine 100 119.1 119 Eprinomectine 1500 1272.0 85 Ivermectine 100 87.1 87 Moxidectine 100 107.4 107

Mouton Conc. dopage (ppb) Conc. calculée (ppb)

n=1*11

Rendement (%)

Abamectine 25 29.9 120 Doramectine 100 112.3 112 Eprinomectine 15 12.2 81 Ivermectine 15 au 20/01/2008

100 13.5 (2*10) 108.7

90 109

Moxidectine 100 112.9 113 Pour des teneurs inférieures comprises entre 1 et 10 ppb , le rendement obtenu doit-être compris entre –30 et +10 % ; pour des teneurs supérieures ou égales à 10 ppb, le rendement doit-être compris entre –20 et + 10 %. Dans certains cas, ces conditions ne peuvent être respectées. Afin de palier à cela, malgré l’ajout d’un

standard interne, un ajout dosé est effectué (pour tout pic détecté à 50 % du CCα) et les règles de rendement décrites ci-dessus sont appliquées.



6. Répétabilité et reproductibilité intralaboratoire.

6.1.Validation principale (foie de porc), ppb. Conc.

dopage (ppb)

Répétabilité r (2.8 Sr) ppb

Reproductibilité R (2.8 SR) ppb

CVr (%)n=3*11

CVr max 2/3 CVHorwitz

CVR (%) n=3*11

CVR max CVHorwitz

Abamectine 12.5 1.2 5.3 6.5 20.6 29.1 30.9 25 1.9 4.5 3.0 18.6 7.2 27.9 37.5 3.0 5.0 2.8 17.5 4.6 26.2

Doramectine 50 6.2 13.9 5.5 16.7 12.2 25.1 100 7.0 18.5 2.8 15.3 7.3 23 150 12.4 37.7 3.1 14.2 9.5 21.3

Eprinomectine 25 4.6 5.5 2.7 18.6 11.7 27.9 50 4.7 7.6 4.8 16.7 7.8 25.1 75 6.3 25.4 3.5 15.8 14.1 23.6

Ivermectine

15 50

1.51 6.6

1.51 15.7

4.2 (2*10) 6.8

20.1 16.7

4.2 (2*10) 16.2

30.1 25.1

100 7.2 13.6 3.4 15.3 6.4 23 150 13.7 41.2 3.9 24.2 11.6 21.3

Moxidectine 25 3.3 5.6 4.7 18.6 8.0 27.9 50 5.7 14.8 4.4 16.7 11.4 25.1 75 6.7 11.2 3.2 15.8 5.4 23.6

Toutes les valeurs de répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire satisfont à l’équation de Horwitz.



6.2. Validations complémentaires (foie de bœuf et mouton) Dans la validation complémentaire, uniquement la répétabilité est prise en compte étant donné que les essais sont analysés le même jour.

Mouton, ppb Bœuf, ppb Conc.

Dopage (ppb)


CVr (%) n=3*11

CVr max2/3 CVHorwitz

Conc. Dopage (ppb)


CVr (%) n=3*11

CVr max2/3 CVHorwitz

Abamectine 25 3.3 3.9 18.6 20 2.8 3.6 19.2 Doramectine 100 19.7 6.3 15.3 100 13.9 4.2 15.3 Eprinomectine 15 1.9 5.4 20.1 1500 381.3 10.7 11.6

Ivermectine 100 15 au 20/01/2008

18.8 2.6

6.2 6.9 (2*10)

15.3 20.1

100 11.0 4.5 15.3

Moxidectine 100 17.0 5.4 15.3 100 18.3 6.1 15.3 Toutes les valeurs de répétabilité satisfont à l’équation de Horwitz. 7. Vérification des critères d’identification. En HPLC-FLUO, le seul critère d’identification est le temps de rétention relatif (RRT). Ce RRT doit se situer dans un intervalle de 5 % par rapport au RRT d’un standard de référence. Dans 100 % des cas, ce critère est respecté. 8. Séléctivité et spécificité.

8.1. Sélectivité Cette analyse est sélective puisque nécessite une étape de dérivatisation pour transformer les molécules initiales en composés visibles en fluorescence. De plus, les longueurs d’excitation (365 nm) et d’émission (470 nm) utilisées sont spécifiques des avermectines.

8.2. Spécificité. La spécificité est démontrée par l’absence de pics aux temps de rétention des analytes dans les échantillons « blancs » donc non fortifiés. Aucun pic parasite n’a été détecté lors de la validation.



9. Stabilité/robustesse. Les solutions stock à environ 100 µg/ml dans le méthanol peuvent être conservées un an au congélateur à minimum –15°C. Les solutions intermédiaires et de travail peuvent être conservée un mois au frigo. Les échantillons sont stockés à min. –15°C avant d’être analysés.

Annexe photos

I‐MET‐LFSAL‐099 & 099a

Découpage du foie

Broyage

Mise en flacon et étiquettage

Prise d’essai

Ajout de némadectine (SI) à chaque échantillon

Préparation des levels d’étalonnage (ajout des réf.)

Vortexer les levels

Evaporer à sec les levels à 65°C

Ajout d’ACN aux échantillons

Vortexer les échantillons

Centrifuger à 4°C

Clean‐up du surnageant sur Alumine

Ajout de dérivatisant aux levels

Vortexer

Dérivatisation des levels (30’, 65°C)

Evaporer à sec les éluats des SPE alumines

Placer les levels dérivatisés quelques min. à ‐20°C

Mettre les levels dérivatisés en vial

Ajout de 500 µl D’ACN aux échantillons secs

Vortexer

Eluer sur SPE C18

Rincer 2x les tubes avec 2ml d’ACN

Ajout de 3ml d’hexane à l’éluat

Vortexer

Centrifuger à 4°C

Eliminer l’hexane (phase supérieure) après centrifugation

Evaporer à sec (65°C)

Ajout de réactif dérivatisant

Vortexer

Dérivatisation (30’, 65°C)

Refroidir à ‐20°C

Filtration et mise en vial

Mise des vials dans l’autosampler

Exemple de séquence HPLC

Echantillon conforme (pic de némadectine seul)

Némadectine (SI)

Ex. : Level 3 (purs + némadectine)

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Documents