validacija kvalitativnih metoda

7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda

http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 1/24

Validacija kvalitativnih metodaSeminarski rad



Sadržaj

1. Uvod ............................................................................................................................... 1

2.

Validacija ...................................................................................................................... 2 2.1.Točnost………………………………………………………………………………..3

2.2.Selektivnost i specifičnost ............................................................................................ 6

2.3.Linearnost……………………………………………………………………………..7

2.4.Stabilnost analita i standardnih otopina……………………………………………….9

2.5.Učinak matice…………………………………………………………………………9

2.6.Otpornost i osjetljivost metode……………………………………………………....10

2.7.LD i LQ…………………………………………………………………………….....10

2.8.Radno područje……………………………………………………………………....12

2.9.Robusnost………………………………………………………................................12

3. Strategija validacije.................................................................................................... 13

4. ISO…………………………………………………………………………………....14

5. Kvalitativne metoda i njihova validacija………………………………………......15

6. Zaključak ………………………………………………………………………….....22

Literatura



1

1. Uvod

Kemija zadire u sve aspekte materijalnoga svijeta. Njezine discipline povezane su sa

svim područjima znanosti i tehnologije. To se posebice odnosi na analitičku kemiju, jer su

rezultati kemijske analize temelj prirodnih znanosti, a pomoć su i u donošenju važnihzaključaka u društvenim znanostima i umjetnosti. Neizostavni su i pri donošenju

zakonodavnih odluka, posebice onih vezanih uz zaštitu i očuvanje okoliša i ljudskoga

zdravlja. Bez analitičkih mjerenja ne može se ocjenjivati kvaliteta materijala i proizvoda, pa je

analitička kemija nedjeljiv dio tehničkih znanosti i disciplina [14]. Svatko od nas u svom

analitičkom laboratoriju teži postizanju brzih, točnih i vjerodostojnih rezultata analize.

Najbolji način izbjegavanja problema tijekom uporabe određenih metoda jest provođenje

validacija analitičkih metoda. Također, validacijom se mogu utvrditi uzroci mogućih problema tijekom izvođenja metode, čime se postiže veliki stupanj pouzdanosti i pogodnosti

metode. Vrednovanje metoda ključni je postupak u utvrđivanju referentnih metoda i procjeni

kompetencije laboratorija pri postizanju pouzdanih i dosljednih rezultata analize. Stoga je

značenje širine okvira ovog termina posebice važno jer valja imati na umu i ulogu osiguranja

kakvoće i kontrole kakvoće. Kemijska analiza znači kemijsko rastavljanje, raščlanjivanje

cjelovitog ili kompleksnog na sastavne dijelove (grčki analysis). Zadaci kemijske analize

temeljno se svode na dobavljanje analitičkih informacija o kvalitativnom i kvantitativnom

sastavu ispitivanog materijala. Kemijskom analizom ustanovljava se sastav neke tvari

(kemijskog spoja ili smjese). Ako se pri tome ustanovljava samo prisutnost pojedinih

sastojaka, bez obzira na njihov stehiometrijski odnos, govorimo o kvalitativnoj analizi, a ako

se radi o određivanju sadržaja (mase, količine, koncentracije) pojedine sastavnice govorimo o

kvantitativnoj analizi. Dakle, kvalitativna kemijska analiza prethodi kvantitativnoj. Za

utvrđivanje prisutnosti nekog sastojka (elementa, spoja, atomske skupine) u ispitivanoj tvari

odnosno materijalu obično se upotrebljava pojam "dokazivanje" ili "detekcija", dok se u

kvantitativnoj analizi koristi pojam "određivanje".



2

2. Validacija

Izbor optimalne metode vrlo je važan rad pojedinog laboratorija, pa se u skladu s

programom osiguravanja kvalitete on temelji na znanstvenim i stručnim informacijama, koje

treba prilagoditi praktičnim uvjetima, kao što su vrijeme i cijena analize, točnost, preciznost

instrumenata te iskustvo i vještina analitičara [1]. Vrednovanje metode (validacija) je

potvrđivanje metode ispitivanjem i pribavljanjem stvarnih dokaza, da su ispunjeni posebni

zahtjevi u pogledu specifične primjene.1 Kada bismo htjeli validirati određeni analitički

proces ili sustav (Slika 1.), trebamo provesti vrednovanje svih njegovih bitnih koraka.

Validacijom određujemo i dokumentiramo prikladnost analitičkog sustava za određenu

namjenu i ona utvrđena ISO2 standardima. Validacija metode mora biti popraćena vrlo

iscrpnom dokumentacijom. K ada se želi validirati neka metoda treba ponajprije odreditinjezine izvedbene značajke. Izvedbene značajke izražene su kao analitički parametri pa

metode koje se podnose na službeno odobrenje moraju uključivati ispitivanja tih analitičkih

parametara (engl. performance characteristics) Općenito, izvedbene značajke/parametri

analitičke metode obuhvaćaju točnost (odnosno razlika mjerene i prave vrijednost), preciznost

(ponovljivost i obnovljivost rezultata), linearnost, stabilnost analita i standardnih otopina

(sposobnost dobivanja istih mjerenih rezultata tijekom duljeg vremenskog razdoblja),

selektivnost (sposobnost određivanja skupine sličnih sastojaka uzorka) i specifičnost(mogućnost nedvosmislenost određivanja analita u prisutnosti drugih sastojaka), učinak

matice, granica kvantificiranja, granica dokazivanja, otpornost metode, radno područje,

osjetljivost metode i iskoristivost.

1

Definicija prema pravilniku o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata («Narodne novine», broj 2/05), poglavlje 1., članak 2.) 2 Međunarodne organizacije za normizaciju ( ISO)



3

Slika 1. Prikaz tijeka analitičkog procesa preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza

u sustavu kvalit ete, Školska knjiga, Zagreb (2003) 285.

2.1. Točnost

Točnost je stupanj podudarnosti između rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne

vrijednosti. Dokazuje se utvrđivanjem istinitosti i preciznosti.

Točnost rezultata određene

analize zavisi i o upotrijebljenom priboru. Poznata je činjenica, da referencijske i standardne

metode traže baždareni pribor, kako bi se s te strane izvor pogrešaka smanjio na minimum [9]

( Slika 2. ).

Slika 2. Prikaz točnosti i preciznosti



4

Preciznost metode definiramo kao izraz slaganja između niza mjerenja provedenih iz istog

homogenog niza uzorka3 prema propisanom analitičkom postupku. Eksperimenti preciznosti

se rade u homogenim stvarnim uzorcima tj. u pripremljenim uzorcima. Ovisno o uvjetima u

kojima se određuje razlikujemo:

1. Ponovljivost je parametar kojom se izražava preciznost rezultata; analiza istog

uzorka kojega pod istim uvjetima analizira isti analitičar, na istoj opremi u

kratkom vremenskom razdoblju [8].

2. Međupreciznost je parametar koji nam opisuje rezultate ako smo radili neko duže

vrijeme u jednakom laboratoriju, no koji je bio podložan očekivanim promjenama

( različiti analitičari, instrumenti, reagensi iz različitih boca i različitih dobavljača)

3.

Obnovljivot je parametar koji nam opisuje rezultate ako smo radili neko duževrijeme u različitom laboratoriju, taj se parametar određuje u svrhu normiranja

metode i rijetko ga provodi sam laboratorij.

Rezultati (preciznosti) se mogu prikazati grafički kao odnos teorijske (očekivane) vrijednosti

prema izmjerenoj koncentraciji, ali obvezatno kao srednje iskorištenje. Te su najbolji

pokazatelji preciznosti standardno odstupanje4 (Jednadžba 1.) , varijanca ili srednje kvadratno

odstupanje 5 (Jednadžba 2.) ili r elativno standardno odstupanje (Jednadžba 3.).

3 Homogeni materijal je homogen u odnosu prema danom svojstvu ako su prosječne vrijednosti toga svojstva za

različite dijelove materijala unutar granice mjerne pogreške pri određivanju toga svojstva

Homogenizirani cjelokupni uzorak- skupljeni niz uzoraka homogeniziranih radi postizanja jednoličnosticjelokupnog uzorka (definicije prema M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga,Zagreb (2003) 324).4 Standardna devijacija ( s ili ) je prosječno odstupanje pojedinačnih vrijednosti numeričkog obilježja odaritmetičke sredine. 5

Varijanca (s2

ili 2

) je aritmetička sredina kvadrata odstupanja vrijednosti numeričkog obilježja od njihovearitmetičke sredine. Izražena je u istim jedinicama mjere kao i numeričko obilježje.



5

s= √ ∑ (− = )−1 (1)

2= ∑ (− = )−1 (2)

s - standardno odstupanje

s2 - varijanca

n - ograničeni broj mjerenja

- srednja vrijednost

- izmjerena vrijednost (i = 1 do n)

n-1 - stupanj slobode

RSO= ∙100 [%] (3)

RSO- relativno standardno odstupanje

Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja između stvarne, tj. prihvaćene

referencijske vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom određeni broj puta. Brojčani

pokazatelj istinitosti eksperimentalno je utvrđeno kao sustavna pogreška mjernog uređaja

( engl. bias ), računa se kao razlika aritmetičke sredine rezultata i referencijske vrijednosti

(Jednadžba 4.).

b= x - xref (4)

b- sustavna pogreška mjernog uređaja

- srednja vrijednost

xref - referentna vrijednost



6

ili sustavna pogreška mjernog uređaja, ali u postocima (Jednadžba 5.)

b(%)= − ref

∙100 % (5)

Također, istinitost možemo procijeniti usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima

dobivenim referencijskom metodom, te analizom uzorka poznate koncentracije i na kraju

nacjepljivanjem matice ili uzorka poznatom koncentracijom referencijskog materijala.

2.1.Selektivnosti i specifičnost

Specifičnost je mogućnost nedvosmislenog određivanja analita u prisutnosti drugih

sastojaka uzorka ( nečistoće, sastojci matice, razgradni produkti i sl.), kojim primjenom

specifičnih metoda određivanja ne smetaju [1].

Selektivnost je svojstvo metode da identificira ili kvantificira željeni analit, ali se pri

tome za razliku od specifičnih reakcija, moraju ukloniti smetnje koje mogu utjecati na

rezultate analize. Rijetke su metode selektivne samo za željeni analit nužno je stoga pri izboru

metode prepoznati ili predvidjeti moguće interferencije, koje treba maskirati ili selektivno

ukloniti. U kvalitativnoj analizi selektivan je onaj reagens koji reagira s malim brojem sličnih

tvari, a specifičan onaj koji u danim uvjetima daje reakciju samo s jednim sastojkom [1].

Selektivnost i specifičnost metode uvelike ovise o matici i inteferencijama unutar određene

metode.



7

2.2. Linearnost

Linearnost (mjerno područje) je određena kao mogućnost metode da unutar određenog

područja daje ispitane rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku [7]. Test

linearnosti potvrđuje da su otopine uzorka ;u koncentracijskom području u kojemu je odgovor

detektora; linearno proporcionalne koncentraciji. Test se obično provodi na pet

koncentracijskih razina u željenome radnom području metode [6]. Procjenjuje se matematički

i grafički (umjerna krivulja ili kalibracijski pravac) prema jednadžbi 6.

y= ax + b (6)

y- mjereni parametar

a- odsječak na ordinati ili slijepa vrijednost

x- koncentracija

b-nagib pravca

Za koeficijent korelacije uobičajeno se postavlja kriterij k ≥ 0,99, smatra se dokazom

prihvatljivog uklapanja podataka u regresijski pravac. Za vrlo niske koncentracije prihvaća se

i kriterij k ≥ 0,98 [7].



9

2.3. Stabilnost analita i standardnih otopina

Tijekom validacijskih ispitivanja analitičar dobiva neke informacije o stabilnosti reagensa,

mobilnih faza, standarda i otopina uzorka. Za rutinska ispitivanja kada se dnevno pripravlja i

analizira puno uzoraka često je bitno da otopine budu dovoljno stabilne da omoguće odgodu

mjerenja, npr. kod kvara instrumenta ili analiza tijekom noći primjenom sustava za

samouzorkovanje. Uzorci i standardi trebaju se ispitati kroz najmanje 48 sati, a određivanje

sastavnica treba se obaviti usporedbom sa svježe pripravljenim standardima. Ako otopine nisu

stabilne kroz 48 sati treba stabilnost poboljšati pronalaženjem adekvatnih uvjeta čuvanja ili

aditivima [24]. Svrha standardizacije u svakoj metodi je činiti rezultate točnima i

obnovljivima s različitim reagensima u različito vrijeme i u različitim laboratorijima.

Standardna otopina je reagens poznate koncentracije te sadrži preciznu i točno poznatukoličinu pročišćenog homogenog analita, cijena je pristupačna, reagira vrlo brzo s analitom,

ima visoku čistoću, stabilna je na zraku, a ostale osobine ovise o prirodi ispitivanog analita .

Služi za izradu umjer ne krivulje kao i za izradu autentičnih kontrolnih uzoraka [1]. Standardni

analit je analit poznatog i potvrđenog sadržaja i čistoće koji se u analizi koristi kao referentni.

2.4. Učinak matice

Učinak matice uzorka, donosno interferencija ili smetnja [1]. Matica sadrži analit i

brojne druge sastojke koji na različite načine utječu na dobiveni rezultat, a interferencije se

razlikuju zavisno o promatranom uzorku.

Slika 4. Shematski prikaz odnosa matice, analita i uzorka.



10

2.5. Otpornost i osjetljivost metode

Analitička osjetljivost je svojstvo promjene odziva instrumenta koji odgovara

promjeni izmjerene veličine (npr. koncentracije analita) [12] tj. svojstvo metode ili

instrumenta da razlikuje uzorke različitih koncentracija analita uz definiranu razinu pouzdanosti [1]. Treba naglasiti da na osjetljivost možemo utjecati dodatkom pojačala

izlaznog signala instrumenta ili povećanjem optičkog puta pri spektrofotometrijskom

određivanju te osjetljivost je konstantna samo u jednom, određenom, koncentracijskom

području.

2.6. Granica kvantificiranja LQ6 i granica dokazivanja LD

Granica dokazivanja je najmanja količina analita koja se može kvalitativno dokazivati,

dok je granica kvantificiranja je najmanja količina analita koja se može, dovoljno pouzdano,

odrediti [1]. Procjena može biti vizualna ili statistička. Vizualna se procjena može primijeniti i

kod neinstrumentalnih i instrumentalnih metoda, uglavnom samo za granicu detekcije

( svojstvo instrumenta da razlikuje signal od šuma instrumenta ), a procjenjuje se najmanji

signal koji se nedvojben može prepoznati.

Omjer signal/šum može se primijeniti samo na

analitičke postupke s baznom linijom, a prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu dokazivanja i

10 :1 za granicu kvantifikacije. Statistički se granice dokazivanja i kvantifikacije

mogu odrediti na bazi standardnog odstupanja signala i nagiba prema jednadž bi 7.

LD = 3.3 s/a (7)

odnosno

LQ = 10 s/a (8)

pri čemu je a nagib, a s standardno odstupanje regresijskog pravca.

Rabimo li metodu koja zahtjeva zadanu preciznost na granici kvantifikacije, pripremi se više

uzoraka poznate koncentracije u području oko moguće granice kvantifikacije, svaki se izmjeri

5 do 6 puta i izračuna se relativna standardna odstupanja za svaku koncentraciju. Zatim se

grafički prikaže odnos RSO-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na granici

6Granica kvantificiranja ( engl. limit of quantification) i granica dokazivanja (engl. limit of detection); kratice LQ

i LD prema M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga, Zagreb (2003)



11

kvantifikacije s točno određenom preciznošću kako se vidi na 4. slici. U praksi se obično

pripremi uzorak tako određene koncentracije i potvrdi preciznost višekratnim mjerenjem [7].

Parametar granice kvantifikacije iznimno je važan kod metoda kojima se određuju analiti u

tragovima koji i u vrlo niskim koncentracijama mogu štetno djelovati na zdravlje ljudi i okoliš

[7].

Slika 4. Određivanje granice kvantifikacije(na slici označena kao GK) sa zadanom

preciznošću , ilustrira kako se preciznost mijenja u funkciji koncentracije analita. Tako

RSO (na slici RSD) vrijednosti značajno rastu uz pad koncentracije analita. Veća

varijabilnost se očekuje

kada se razina analita pribl ižava granici dokazivanja. Analitičar mora prosuditi kod

koje koncentracije nepreciznost postaje prevelika za primjenu metode.

(slika preuzeta iz K.Lazarić, Validacija analitičkih metoda , Laboratorij, stranica 63.)



12

2.7. Radno područje

R adno područje je raspon između gornje i donje koncentracije analita unutar kojega

analitička metoda ima prihvatljivu točnost, preciznosti i linearnosti ( preporučeno radno

područje je 80-120 % koncentracije ispitivanog uzorka ). Za određivanje tog parametra nije potrebno provoditi zasebne eksperimente, nego se zaključci izvode iz studije linearnosti.

2.8. Robusnost

Robusnost se određuje kao mjera otpornosti analitičkog postupka na male, namjerne

promjene radnih uvjeta metode [7], te ako promjena nekog radnog uvjeta ne utječe bitno na

rezultat kažemo da je on u području robusnosti metode. Važno je naznačiti da kada se mijenja

jedan parametar ili uvjet drugi uvjeti ili parametri moraju ostati nepromijenjeni. Robusnost se

mora ispitivati na standardnim metodama, tzv. „in-house“ metodama te metodama koje su

standardizirane no mi smo pr omijenili jedan od parametra zbog učinkovitosti našeg

istraživanja. Tipični parametri kod ispitivanja robusnosti metode su stabilnost mjernih

otopina, duljina trajanja ekstrakcije, ispitivanje utjecaja različitih filtera, provjera preciznosti i

linearnosti metode uz rad nekog drugog tehničara i uz korištenje drugih instrumenata i

kemikalija u laboratoriju. Kod instrumentalnih metoda tipični parametri su variranje pH

vrijednosti mobilne faze i variranje sastava mobilne faze (HPLC) te korištenje različitih

kolona, rad kod različitih temperatura i brzine protoka (HPLC i GC) i sl.

Nije potrebno za svaku uporabu analitičke metode ispitati sve izvedbene značajke, već

samo one koje su bitne. Odabir parametara validacije radi se prema vrsti i namjeni metode

( Tablica 1. ). Laboratorijima u praksi ipak najviše problema predstavlja postavljanje kriterija

prihvaćanja na radne značajke metode, a ne njihov odabir. Razumijevanje značenje pojedinih

parametara i načina na koji se izvode u laboratoriju, poznavanje značajka metode i

regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija prihvatljivosti za svaki parametar, što

je također neizostavni dio validacije. Postavljeni kriteriji uspoređuju se s dobivenim

rezultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje izvješća. Validaciju trebamo

provoditi kada se radi o prilikom uvođenja nove metode, nakon svake promjene ili većeg

servisa instrumenta, za nenormirane metode, za metode razvijene u vlastitom laboratoriju,

nakon zamjene reagensa, ako analitičar primjenjuje prvi puta metodu. Ne postoji određeno

pravilo o opsežnosti validacije, jer je normom propisano samo da se ona provodi u onom

opsegu koji je dovoljan da metoda udovoljava potrebama za zadanu uporabu. Opseg



13

validacije određuju tehničke mogućnosti, troškovi, rizici, starost metode i učestalost njezine

uporabe [1].

Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitičkih metoda različitih

namjena Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline – Validation Of Analytical Procedures: Text

And Methodology

3. Strategija validacije

Validacijske izvedbene značajke ili parametri definiraju se prije početka samoga procesa, te

moraju odgovoriti na sljedeća pitanja:

a)

Kakvi će se analiti detektirati?

b) Kakav je učinak matice uzorka, odnosno interferencija?

c) Koje su očekivane koncentracijske razine i rasponi?

d) Koje su granice detekcije i kvantifikacije?

e) Koja je očekivana preciznost i točnost?

f) Kolika je postojanost metoda? Može li se koristiti slična oprema različitih proizvođača

ili je nužan specifičan instrument?

g)

Koja znanja i vještine pretpostavljeni korisnici moraju imati? h)

Koje specifične regulatorne zahtjeve potrebno zadovoljiti? [15]

Identifikacijski

testovi

Analiza tragova Sadržaj

kvantitativna Limit test

točnost ne da ne da

preciznost ne da ne da

ponovljivost

selektivnost da da ne da

LD* ne ne da ne

LQ* ne ne da ne

linearnost ne da ne da

područje ne da ne da

*LD- granica detekcije, LQ-granica kvantificiranja



14

4. ISO[1]

Normizacija je rad na sastavljanju odredaba i norma za opću i višekratnu uporabu radi

postizanja optimalne uređenosti i sukladnosti u određenom području, a sastoji se od izradbe,

prihvaćanja i primjene norme. Prema kodeksu normizacijske prakse iz 1994.godine, koji je

donesen radi osiguravanja kvalitete donošenja i primjene normi te njihova međusobnog

usklađivanja, normizacijski proces na međunarodnoj razini dragovoljan je i koordiniran pod

pokroviteljstvom Međunarodne organizacije za normizaciju ( ISO), Međunarodnog

elektrotehničkog povjerenstva ( IEC ) i Međunarodne unije za telekomunikacije ( ITU ).

Norma je dokument koji sadržava pravila uputa ili obilježja procesa proizvoda ili proizvodnih

metoda. Norme se mogu karakterizirati prema razini, subjektu i as pektu. Razina određuje je li

norma međunarodna, višenacionalna, nacionalna ili se odnosi na neko industrijsko ili

gospodarsko područje. Područje ili subjekt mogu biti različiti ( kemija, informatika, hrana,

tekstil itd.).

Prema ISO ciljevi normizacije su:

- smanjenje raznolikosti proizvoda i postupaka

- bolja komunikacija

-

razvoj svekolikog gospodarstva

- zaštita potrošača i interes zajednice

- uklanjanje tržišnih barijera



15

5. Kvalitativne metode i njihova validacija

Istraživači rasvjetljavaju područje koje ih zanima na različite načine, provođenjem

različitih vrsta istraživanja. S obzirom na metodološki pristup, dakle korištene metode

istraživanja, istraživanja se dijele na kvantitativna, kvalitativna i istraživanja kombiniranom

metodologijom [2]. Kvantitativna kemijska analiza ima zadaću odrediti količinu spojeva ili

elemenata koji se nalaze u ispitivanom materijalu (analitu). Važnost kvantitativne analize je

vrlo velika jer su na njenim rezultatima pronađeni osnovni kemijski zakoni. Rezultati tipične

kvantitativne analize proizlaze iz dva različita mjerenja. Jedno je mjerenje mase ili volumena

uzorka za analizu, a drugo je mjerenje nekog svojstva razmjerno količini analita u tom

uzorku.[13] Kvantitativne metode možemo svrstati na gravimetrijske metode ( određuje se

masa analita ili nekog spoja koji je u poznatom kemijskom odnosu s analitom ), volumetrijskemetode ( mjeri se volumen otopine reagensa potrebnoga za potpunu reakciju s analitom ),

elektroanalitičkim metodama ( mjere se električna svojstva ), spektroskopske metode ( mjere

interakciju između elektomagnetskog zračenja i atoma ili molekula analita, ili mjere zračenja

koje analit emitira) te metode koje se temelje na mjerenju svojstava kao što je odnos mase

prema naboju, brzina radioaktivnog raspada, toplina reakcije, termička vodljivost, optička

aktivnost i indeks loma.

Tijekom prošlog desetljeća uporaba kvalitativnih metoda se povećala, no njihova primjena je još uvijek manja nego kvantitativne metode te se terminologija unutar kvalitativnih metoda

još usavršava. Uglavnom se koriste kao rutinske laboratorijske metode [23]. Kvalitativnom

kemijskom analizom određuje se kemijski sastav tvari, tj. utvrđuje se od kojih je kemijskih

elemenata ili kemijskih spojeva sastavljena ispitivana tvar. Osim sastava, kvalitativnom se

analizom ispituju osobine raznih kemijskih elemenata i spojeva, primjenjuju kemijski zakoni i

prati tok kemijskih reakcija. U kvalitativnoj kemijskoj analizi primjenjuju se različite tehnike

rada: makrotehnika i semimikrotehnika. Najčešće se koristi semimikrotehnika zbog male potrošnje kemikalija i brzine postupka. Iako nema opće prihvaćene podjele kvalitativnih

metoda jedna od češće korištenih je ona koja se temelji na otkrivanju analita u određenom

uzorku koje može biti vizualno ili instrumentalno [3]. Vizualne metode se temelje na

opažanju osjetilom vida, okom promatrane reakcije između analita u uzorku i specifičnih

reagensa. Ono što vidimo nakon reakcije je promjena boje otopine ( npr. titracijske metode ) ,

boje testne trake ( npr. pH traka ), zamućenost otopine itd. [3]. Točnost određivanja, ove

metode, ovisi o iskustvu analitičara koji ju izvodi te je isto tako upitna njena primjenjivostkod složenijih sustava. Za razliku od vizualnih metoda kod instrumentalnih metoda postoje



16

značajne razlike kada se one primjenjuju u kvalitativnim, a kada u kvantitativ nim analizama.

Ova metoda se temelji na razlici u koncentracijama promatranog i kontrolnog uzorka, ako je

koncentracija promatranog uzorka veća od koncentracije kontrolnog uzorka možemo

zaključiti da je koncentracija analita veća od one u kontrolnom uzorku i obrnuto. Ta razlika

odnosno odziv uređaja prevodi se u binarni signal DA /NE ( prisutan/odsutan ili znad/ispod )

[3].

Razlikuju se četiri tipa kontrolnog uzorka :

a) negativni kontrolni uzorak u kojem nema traženog analita

b) pozitivni kontrolni uzorak koji sadrži točno određenu količinu analita

c) granični kontrolni uzorak onaj koji sadrži količinu analita koja odgovara graničnoj

vrijednosti

d ) „intermediate“ kontrolni uzorak je onaj koji sadrži analit, no ne u nekim značajnimvrijednostima.[23]

U okvirima kvalitativne analize osjetljivost i specifičnost predstavljaju sposobnost

testa za razlikovanje stvarno pozitivnih (osjetljivost) od stvarno negativnih (specifičnost)

uzoraka, poznatiji kao „ screening test “, te ih možemo iskazati prema jednadžbama 9 i 10 .

Broj lažno (+) pozitivnih i lažno (-) negativnih rezultata možemo procijeniti modificiranjem

COV, tj. smanjiti broj lažno (-) negativnih rezultata smanjenjem COV, odnosno smanjiti broj

lažno (+) pozitivnih povećanjem COV. COV ( engl. cut off value ) definiramo kao područje

granične vrijednosti u uzorcima poznatih koncentracija [22]. Lažno pozitivan rezultat znači da

je određena metoda prikazala da u testnom uzorku ima promatranog analita iako ga zapravo

nema. Visoka osjetljivost i specifičnost nekog testa osigurava izbjegavanje lažnog rezultata te

dobivenim parametrima možemo definirati pouzdanost metode. U slučaju utjecaja reagensa i

matice uzorka govorimo o slaboj selektivnosti samog testa: što je viša selektivnost to je veća

vjerojatnost identificiranja analita u uzorku [19]. F. Feigl 7 je definirao pojmove "selektivan" i

"specifičan" s gledišta kvalitativne kemijske analize. Pod pojmom specifičnosti (reakcije ili

reagensa) on shvaća indikativnost za samo jednu supstanciju, a pod pojmom selektivnosti

indikativnost za mali broj supstancija. Prema tome reakcije ili reagensi mogu biti više ili

manje selektivni dok reagens ili reakcija jest ili nije specifična. Specifičnost je najviši stupanj

7 Fritz Feigl (1891.-1971) ,kemičar, rođen u Austriji, nakon rada u Brazilu dobio njihovo državljanstvo, tvorac

tzv. „spot analysis“, dugo proučavao i kvalitativnu analizu



17

selektivnosti. Kako specifičnih reagensa ima daleko premalo zbog toga se odabiru oni sa što

većim stupnjem selektivnosti [20].

Osjetljivost možemo izračunati prema jednadžbi 10[3], a specifičnost prema jednadžbi 11[3]:

osjetljivost ( engl. sensitivity rate) =sp ()

sp ()+ ln() (10)

sp- stvarno pozitivan ( engl. true positive -tp)

ln- lažno negativan ( engl. false negative-fn )

specifičnost ( engl. specificity rate ) = sn ()sn(t)+ lp() (11)

sn- stvarno negativan ( engl. true negative -tn)

lp- lažno pozitivan ( engl. false positive-fp )

Tablica 2. Relacija između lažno pozit ivnih i negativnih te stvarno pozitivnih i negativnih

odziva( preuzeto iz S.L.R. Ellison, T. Fearn, Charasteristing the performance od qualitative

analytical methods: statistic and terminology, Terends in Analytical Chemistry, 24 (6) (2005)

469).

Kod kvalitativnih ispitivanja postoji granica ispod koje specifičnost postaje upitna. Da bi se

procijenio LD kod kvalitativnih mjerenja slijepi uzorci se obogaćuju analitom pri nekoliko

koncentracija i pri svakoj provodi 10 neovisnih mjerenja. Ponovljena mjerenja na raznim

razinama su randomizirana. Tada se konstruira krivulja % pozitivnih (% negativnih) rezultata

Promatrani sustav

Stvarni rezultat negativno pozitivno

negativno SN LP

pozitivno LN SP

ukupno nN,promatrano nP,promatrano

SP-broj stvarno pozitivnih, LN- broj lažno negativnih, LP-

lažno pozitivan, SN-stvarno negativan



18

u odnosu na koncentraciju pa se procjen juje granična koncentracija kod koje ispitivanje

postaje nesigurno [25].

Procjena LD vrijednosti ovisi da li se radi o instrumentalnoj ili ne-instrumentalnoj metodi. Za

instrumentalne postupke koriste se različite tehnike; npr., određuje se odnos signal/šumusporedbom rezultata ispitivanja uzoraka poznate koncentracije analita s rezultatima za slijepe

uzorke te se ustanovljava minimalna razina kod koje se analit pouzdano dade detektirati.

Prihvaća se odnos signal/šum bazne linije od 2:1 ili 3:1

Kod vizualnih neinstrumentalnih metoda LQ se obično određuje analizom uzoraka poznate

koncentracije i ustanovljavanjem minimalne razine pri kojoj analit može biti određen s

prihvatljivom istinitošću i preciznošću [22].

Najveći značaj za odabiranje neke analitičke reakcije imaju granične vrijednosti utvrđivanja

tj. mogućnost sigurnog dokazivanja što manje količine (mase) analita pomoću odabranog

analitičkog postupka. Granična vrijednost analita jest najmanja količina (apsolutna vrijednost)

ili najmanja koncentracija (relativna vrijednost) analita koja se još može signifikantno

razlikovati od slijepe vrijednosti koju daje mjerenje slijepog uzorka u kojem analit nije

prisutan; dakle to je onaj najmanji udio analita koji još izaziva specifični signal. Granična

vrijednost može se izraziti u kvalitativnom smislu kao granica identifikacije.

Robusnost je osnovno analitičko svojstvo kojim je opisana postojanost binarnog rezultata u

odnosu na neznatne promjene eksperimentalnih uv jeta (promjena količine uzorka, pH,

vremena izvođenja, temperature, postotka otapala i slično) [19].

Kvalitativni validacijski parametri se moraju pažljivo prepoznati i odabrati prema zahtjevima

metode [19]. Oni su uključeni u pojedinosti koje su povezane s informacijama koje želimo

dobiti, a ponajprije određujemo s obzirom na metodu i istraživani uzorak.



19

Tablica 3. Neki od najčešće korištenih parametara za kvalitativnu i kvantitativnu metodu

(preuzeto iz E. Trullols Soler , Validation of Analytical Methods , doctoral tehnsis (2006) 130)

Kvantitativne metode Kvalitativne metode

~parametri~

točnost: istinitost i preciznost lažno pozitivni i negativni rezultati

mjerna nesigurnost osjetljivost i specifičnost

osjetljivost i specifičnost selektivnost: interferencija

selektivnost: interferencija LD

raspon i linearnost granična vrijednost

robusnost robusnost

LD nepouzdanost



20

Zaključak

Validacijom analitičke metode dobit će se obavijesti o njezinoj točnosti i preciznosti, o

odnosu između koncentracije uzorka i odziva metode, o mogućim interferencijama iz matice

uzorka, o najmanjim koncentracijama koje će se moći utvrditi ili kvantificirati tom metodom i

doznat će se njezine najslabije, ali i najjače strane [7]. Kao kod svake metode moramo biti

pažljivi pri odabiru validacijskih parametara pa tako i kod kvalitativnih metoda. Kada je riječ

o kvalitativnoj analizi ili identifikaciji analita, nužna je potvrda indetiteta, tj. sigurnost da

odziv instrumenta potječe od analita, a ne od neke kemijske ili fizikalno slične tvari [1]. Zbog

toga treba odrediti specifičnost i selektivnost odabrane metode te i granicu dokazivanja do

koje je neka metoda pouzdana, na kraju odrediti i robusnost metode jer je njime opisana

postojanost binarnog rezultata svojstvenog za kvalitativnu metodu.



21

Literatura

[1] M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga, Zagreb 2003. [2] A. Tkalac Verčič, D. Sinčić Ćorić, N. Pološki Vokić, Priručnik za metodologijuistraživačkog rada, M.E.P. d.o.o., Zagreb ( 2010) 12

[3] E. Trullols, I. Ruisachez, F. Xavier Rius, Validation of qualitative analytical methods,

Trends in analytical chemistry, 23 (2) ( 2004)

[4] V. Gašljević,Validacija i mjerna nesigurnost, Biochemia Medica 20(1) (2010) 57-63

[5]

http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Ste p4/Q2_R1__Guideline.pdf ( 27.12.2014.)

[6] http://www.svijet-kvalitete.com/index.php/ispitivanje/2387-validacija-analitickih-metoda-

prakticni-aspekt (27.12.2014.)

[7] K. Lazarić, Validacija analitičkih metoda, Laboratorij, 61-64

[8] N. Mikulec, D. Samaržija, N. Antunac, Š. Zamberlin, Z. Kuliš, I. Horvat, Parametri

validacije instrumentalne metode za utvrđivanje ukupnog broja bakterija u mlijeku Mljekarstvo 54 (4) (2004) 299-314

[9] T. Slanovec, Utjecaj pipeta na točnost rezultata u analitičkoj praksi, Mljekarstvo, 22(1)

(1972) 20-22

[10] E. Generalić, S. Krka, Analitička kemija-vježbe, Split (2011) 12

[11] Z. Dragun, B. Raspor, Validacija određivanja metala atomskom apsorpcijskomspektrometrijom, 9. stručni sastanak laboratorija ovlaštenih za ispitivanje voda, 196810(2005)

[12] Eurachem, The fitness for purpose of analytical methods a laboratory guide to methodvalidation and related topics, second edition (2004) 7-44

[13] D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Školska knjiga, Zagreb(1999) 2

[14] M. Kaštelan-Macan, Hrvatsko nazivlje u analitičkoj kemiji, 57 (4) (2008) 175-188

[15] L. Huber, Validation of analytical methods, Agilent Technologies, Njemačka (2010)31-32

[16] H. F. de Brabander, P. Batjoens, K. de Wasch, D. Courtheyn, G. Pottie, F. Smets,Qualitative or quantitative for residue analysis, Trend sin Anal. Chem., 16 (1997) 485



[17] D. L. Massart, B. G. M. Vandeginste, L. M. C. Buydens, S. de Jong, P. J. Lewi, J.

Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Elsevier science B. V.

(1997)

[18] M. Sak- Bosnar, Uvod i podjela analitičke kemije, prezentacija, Odjel za kemiju, Osijek

[19] K. Samošćanec, Validacija kvalitativnih kromatografskih metoda, Biochemia Medica

19(l1) (2009) 85-86

[20] S. Luterotti, Uvod u kemijsku analizu, sedmo izdanje, Farmaceutsko-biokemijski

fakultet sveučilišta u Zagrebu (2014)

[21] E. Trullols, I. Ruisachez, F. Xavier Rius , J. Huguel, Validation of qualitative methods of

analysis that use control samples, Trend sin Anal. Chem., 24 (2005) 516

[22] S. Luterotti, D. Bicanic, Odabrane teme iz bioanalitike, četvrto izdanje, Zagreb, (2013)1-18

[23] J. M. Green, A practical guide to analytical method validation, Anal. Chem. News Feat.

(1996) 305-309

[24] S.L.R. Ellison, T. Fearn, Charasteristing the performance od qualitative analytical

methods: statistic and terminology, Terends in Analytical Chemistry, 24 (6) (2005) 468-476

[25] J. M. Green, A practical guide to analytical method validation, Anal. Chem. News Feat.

(1996) 305-309

validacija kvalitativnih metoda

Documents