SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

2120307

APLIKÁCIA MIKROBIÁLNYCH PEPTIDÁZ PRI ÚPRAVE

BIELKOVINOVEJ SUROVINY PRE POTREBY HUMÁNNEJ VÝŹIVY

DIPLOMOVÁ PRÁCA

2010 Bc. Renáta Halásová

SLOVENSKÁ POĽNOSHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

APLIKÁCIA MIKROBIÁLNYCH PEPTIDÁZ PRI ÚPRAVE

BIELKOVINOVEJ SUROVINY PRE POTREBY HUMÁNNEJ VÝŽIVY.

DIPLOMOVÁ PRÁCA

Študijný program: Technológia potravín

Študijný odbor: 6.1.13 Spracovanie poľnohospodárskych produktov

Katedra biochémie a biotechnológie

Vedúci záverečnej práce/školiteľ: doc. RNDr. Dana Urminská, CSc.

Nitra 2010 Bc. Renáta Halásová

Čestné vyhlásenie

Podpísaná Bc. Renáta Halásová vyhlasujem, že som diplomovú prácu na tému

„Aplikácia mikrobiálnych peptidáz pri úprave bielkovinovej suroviny pre potreby

humánnej výživy “ vypracovala samostatne s použitím uvedenej literatúry. Diplomová

práca bezprostredne nadväzuje na bakalársku záverečnú prácu „Proteolytické enzýmy

a ich využitie v potravinárstve“ vypracovanú v roku 2008.

Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre, 16. apríla 2010 .......................................................................

Poďakovanie

Touto cestou by som rada vyjadrila úprimné poďakovanie svojej školiteľke

doc. RNDr. Dane Urminskej, CSc., za venovaný čas, odborný dohľad a cenné

pripomienky, ktoré mi poskytovala počas tvorby tejto práce.

Abstrakt

Cieľom diplomovej práce bolo podrobnejšie charakterizovať proteolytické

enzýmy Subtilizín Carlsberg a Deuterolyzín vo vzťahu k ich hydrolytickej účinnosti.

Substrátmi pre enzymatickú hydrolýzu boli šroty rastlinných materiálov: 1 % alebo 5 %

pšeničný, kukuričný a sójový šrot, ku ktorým boli v roztoku optimálneho pH pridané

enzýmy Subtilizín Carlsberg alebo Deuterolyzín. Hydrolýza sa realizovala pri teplote

37 oC v časových intervaloch 0, 30, 60 a 120 minút. Hydrolytická aktivita

mikrobiálnych enzýmov bola stanovená pomocou formolovej titrácie. Deuterolyzín sa

vyznačoval nižšou hydrolytickou účinnosťou ako Subtilizín Carlsberg. Najviac

aminokyselín (12,74 mg) bolo stanovených v produkte po pôsobení peptidázy Subtilizín

Carlsberg na 5% sójový šrot. Najmenej degradovateľným substrátom bol pšeničný šrot

(6,30 mg), pričom vyššie koncentrácie aminokyselín (stanovených ako mg N) boli

v produktoch s 5 % obsahom šrotu. Optimálny čas hydrolýzy bol interval 30 – 60 minút.

The aim of this diploma thesis was to characterise in detail proteolytic enzymes

Subtilizín Carlsberg and Deuterolyzín in terms of hydrolytic effectivity. The substrates

of enzymatic hydrolysis were groats of plant material: 1 % or 5 % wheat, maize or soy

groat to which were added enzymes Subtilizín Carlsberg or Deuterolyzín in the solution

of optimal pH. The hydrolysis was carried out by temperature of 37 ºC in time intervals

0, 30, 60 and 120 minutes. Hydrolytic activity of microbial enzymes was determined by

formol titration. Hydrolytical effectivity of Deuterolyzín has been shown lower than

hydrolytical effectivity of Subtilizín Carlsberg. Most of amino acids (12,74 mg) were

determined in final product after reaction of 5 % soy groat with Subtilizín Carlsberg

peptidase. The least degradationable substrate was wheat groat (6.30 mg). Higher

concentrations of amino acids were determined as mg N in products of 5 % wheat groat

content. The optimal time interval of hydrolysis lasted 30-60 minutes.

Kľúčové slová: peptidázy, enzýmová hydrolýza, enzýmové hydrolyzáty

Key words: peptidases, enzymatic hydrolysis, enzymatic hydrolysates

Obsah

Zoznam skratiek................................................................................................................6

Úvod..................................................................................................................................7

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY........................9

1.1 Charakteristika a význam bielkovín ako surovín na prípravu humánnej výživy.....9

1.1. 1 Štruktúra bielkovín.........................................................................................9

1.1. 2 Význam bielkovín v potravinách.................................................................10

1.2 Charakteristika mikrobiálnych proteolytických enzýmov aplikovaných pre

cielenú úpravu bielkovinovej suroviny.......................................................................18

1. 2.1 Proteolytické enzýmy...................................................................................18

1. 3 Bielkovinové hydrolyzáty, charakteristika, význam , využitie...........................28

1. 3. 1 Charakteristika enzymatických hydrolyzátov..............................................28

2 CIEĽ PRÁCE..............................................................................................................43

3 MATERIÁL A METODIKA......................................................................................43

3.1 Proteolytické enzýmy............................................................................................43

3.2 Substráty - rastlinné bielkoviny.............................................................................43

3.3 Enzymatická hydrolýza bielkovín.........................................................................44

3.4 Formolová titrácia aminokyselín...........................................................................44

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA........................................................................................45

5 Závery..........................................................................................................................48

6 Zoznam použitej literatúry..........................................................................................49

Zoznam skratiek

AAS - amino acid score

ACE - angiotensin converting enzyme

EAAI - essential amino acid index

CS - chemical score

LPT - lipid transfer protein

EAI - emulsion activity index

 ESI - emulsion stability index

OPA - o-ftalaldehyd

EDTA - kyselina etyléndiamíntetraoctová

TNBS - kyselina 2,4,6-trinitrobenzénsulfónová.

IgE - imunoglobulín E

DH - degree of hydrolysis

P - prolín

E - kyselina glutámová

Q - glutamín

L - leucín

Y - tyrozín

6

Úvod

Bielkoviny, ako základné komponenty potravín majú širokú škálu funkčných

a štrukturálnych vlastností, ktoré výrazne ovplyvňujú vlastnosti potravín. V súčasnosti

sa bádanie sústreďuje na pochopenie bielkovinovej štruktúry a zlepšovanie bielkovín

ako multifunkčných zložiek pre potravinový priemysel.

Biologická a nutričná kvalita bielkovín je určená predovšetkým množstvom,

resp. potrebným zastúpením esenciálných aminokyselín, ktoré sú potrebné pre syntézu

látok bielkovinovej povahy v ľudskom organizme, ale aj hydrolyzovateľnosťou

bielkovín, ktorá limituje ich využitie z potravy. V technologickej praxi sa postupne

začínajú uplatňovať moderné biotechnologické postupy, medzi ktoré sa zaraďuje aj

enzymatická hydrolýza bielkovín použitím proteolytických enzýmov. Ideálne využitie

majú predovšetkým mikrobiálne enzýmy, ale v praxi (na základe historických

empirických skúseností) sa využívajú aj rastlinné alebo živočíšne enzýmy. Ďalším

problémom, ktorý súvisí s využiteľosťou potravinových bielkovín je skutočnosť, že

bielkoviny obsiahnuté v potravinách v prirodzenom stave nemusia mať optimálne

funkčné vlastnosti. Tieto vlastnosti môžu byť zmenené vystavením bielkovín rôznym

fyzikálnym, alebo chemickým vplyvom ako napríklad pH, iónová sila, teplota

a podobne, ako aj enzymatickým vplyvom napríklad využitím enzymatickej proteolýzy

(Nielsen – Nielsen, 1997). Aj v tomto smere je veľký priestor pre zlepšenie funkčných

vlastností bielkovín v potravinách parciálnou enzymatickou hydrolýzou. Z nutričného

hľadiska umožňuje enzýmová hydrolýza úpravu bielkovinových zdrojov a

optimalizáciu aminokyselinového a komponentného zloženia potravín.

Použitie enzymatickej hydrolýzy je „naturálny spôsob“ ako zmeniť vlastnosti

bielkovín. Enzýmy sú pomerne ľahko dostupné a ich využitím je možné dosiahnuť

požadované vlastnosti pri akceptovateľných nákladoch, pričom aj riziká vzniku

nežiadúcich reakcií a toxických produktov sú nižšie, ako pri iných metódach

modifikácie bielkovín. Hydrolýzou je možné zlepšiť fyzikálne, chemické, funkčné aj

nutričné vlastnosti bielkovín (Whei – Zhimin, 2006).

Enzýmovou hydrolýzou je možné získať širokú škálu produktov, ktoré

v závislosti od stupňa hydrolýzy majú rôzne účely použitia. Konečné zloženie

enzýmového hydrolyzátu je ovplyvnené predovšetkým voľbou substrátu, špecifikami

7

použitého enzýmu,  podmienkami počas hydrolytickej reakcie a dĺžkou priebehu

hydrolýzy. Produkty s nízkym stupňom hydrolýzy sa väčšinou využívajú ako funkčné

zložky potravín (zlepšenie emulznej schopnosti, tvorba peny a pod.). Produkty so

stredným stupňom hydrolýzy sa využívajú v potravinách, ako zlepšovače chuti,

fortifikanty nealkoholických nápojov a džúsov (Panyam – Kilara, 1996, Vioque et al.,

2000), vo výžive športovcov a  ako nutričné suplementy pre jedincov s tráviacimi

ťažkosťami. Produkty s najvyšším stupňom hydrolýzy majú uplatnenie v klinickej

výžive a v kojeneckej výžive.

8

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY

1.1 Charakteristika a význam bielkovín ako surovín na prípravu

humánnej výživy

1.1. 1 Štruktúra bielkovín

Po chemickej stránke, bielkoviny, polypeptidy, proteíny sú organické

makromolekuly tvorené aminokyselinami, ktoré sú usporiadané do lineárneho

polypeptidového reťazca a pospájané peptidovými väzbami medzi aminoskupinou

a karboxylovou skupinou susedných aminokyselín (Voet – Voet, 2004).

Aminokyseliny sú opticky aktívne molekuly, väčšina prírodných aminokyselín sa

nachádza v L-konfigurácii. Vlastnosti bielkovín závisia od ionizačného (nábojového)

stavu bočných reťazcov aminokyselín, ktorý je funkciou pH. Podľa polarity

postranného reťazca sa delia na nepolárne (glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín,

metionín, prolín, fenylalanín, tryptofán), polárne bez náboja (serín, treonín, asparagín,

glutamín, tyrozín, cysteín) a polárne s nábojom. Aminokyseliny s polárnym nabitým

reťazcom sú nabité kladne (zásadité aminokyseliny lyzín, arginín, histidín) alebo

záporne (kyslé aminokyseliny kys. asparágová, kys. glutámová).

Trojdimenziálna štruktúra bielkovín je popísaná na štyroch úrovniach. Primárna

štruktúra je daná genetickou informáciou, ktorá určuje poradie jednotlivých

aminokyselín v polypeptidovom reťazci. Zahŕňa tiež polohu základných kovalentných

väzieb, ako sú napr. väzby peptidové, disulfidové a esterové (Škárka – Ferenčík, 1987;

Ferenčík et. al, 2000). Pre sekundárnu štruktúru sú charakteristické pravidelné

konformácie (Michalík, 2003). Je to vlastne priestorové usporiadanie molekúl

polypeptidového reťazca, pri ktorom neberieme do úvahy postranné reťazce (Voet –

Voet, 2004). Medzi najrozšírenejšie elementy pravidelnej sekundárnej štruktúry patria

α-helix a skladaný list - β sheet. Nepravidelná konformácia bielkovinovej štruktúry je

charakterizovaná ako „náhodné klbko“ (Lehrman, 1990). Najčastejšie sa vyskytujúcou

štruktúrou u bielkovín je α-helix. Predstavuje najstabilnejšiu konformáciu vyznačujúcu

sa najnižšou energiou. Konformácia je stabilizovaná vodíkovými väzbami medzi

vodíkom naviazaným na peptidový dusík a kyslíkom karbonylu na štvrtom

aminokyselinovom zvyšku (v zmysle primárnej štruktúry) (Murray et al., 2002). Vzniká

9

tak silná vodíková väzba, rovnobežná s osou helixu, ktorá tvorí kostru bielkoviny.

Zatiaľ čo α – závitnica je tvorená aminokyselinami primárnej oblasti (štruktúry),

štruktúra skladaného listu v sebe zahŕňa úseky 5-10 aminokyselín z rôznych oblastí.

Peptidová kostra je v prípade skladaného listu takmer úplne extendovaná (Murray et al.,

2002).

Základný reťazec pozostávajúci z α a β štruktúr sa ďalej v priestore formuje a

vytvára konečnú fibrilárnu (vláknitú) alebo globulárnu (klbkovitú) formu bielkoviny

nazývanú ako terciárna štruktúra. Postranné reťazce sa vo vodnom prostredí na základe

elektrochemických silových pôsobení interagujú s cieľom vytvoriť nízkoenergetickú a

stabilnú formu. To znamená použitie čo najväčšieho množstva energie na denaturáciu,

rozrušenie, bielkoviny. Pritom druhé výrazné zníženie vnútornej energie predstavuje

natočenie hydrofóbnych častí proteínu "dovnútra" a hydrofilnych častí "vonku" do

vodného prostredia (Laššák, 2009). Množstvo bielkovín, hlavne s veľkosťou nad 100

kDa, je zložených z dvoch alebo viac polypeptidových reťacov, popisovaných ako

podjednotky bielkoviny. O presnom priestorovom usporiadaní týchto podjednotiek nám

udáva obraz kvartérna štruktúra.

Štruktúra bielkovín na všetkých úrovniach, primárnej, sekundárnej, terciálnej,

kvartérnej ovplyvňuje funkčné vlastnosti bielkovín v potravinách (Damodaran, 1997).

Trojdimenziálnu štruktúru bielkovín je možné sledovať pomocou X-lúčovej

kryštalografie alebo NMR technológiami. Purifikácia bielkovín od ostatných bunkových

komponentov je možná využitím viacerých techník, napríklad ultracentrifugáciou,

percipitáciou, elektroforézou a chromatografiou.

1.1. 2 V ýznam bielkovín v potravinách

Bielkoviny, ako zložky potravín spĺňajú dve základné úlohy:

(a) tú, ktorá sa vzťahujú k fyzikálno-chemickým vlastnostiam, esenciálnym pre

udržiavanie dobrej kvality potraviny;

(b) tú, ktorá poskytujú vyhovujúce nutričné požiadavky (Nakai –Modler, 1996).

Z uvedeného vyplýva, že význam bielkovín môžeme hodnotiť jednak z hľadiska

nutričného, a jednak z hľadiska technologického.

10

1.1.2.1. Nutričný význam bielkovín

Základnou požiadavkou racionálneho stravovania je dostatočný príjem

bielkovín v požadovanej kvalite a kvantite v závislosti od veku a životného štýlu

konzumenta.

Nutričná kvalita bielkovín v potravinách je daná:

koncentráciou bielkovín,

aminokyselinovým zložením bielkovín,

stráviteľnosťou bielkovín a dostupnosťou aminokyselín,

ďalšími faktormi, ako napríklad prítomnosť trypsínových inhibítorov a ďalších

antinutričných látok

Z   pohľadu koncentrácie bielkovín sú majoritným zdrojom bielkovín najmä potraviny

živočíšneho pôvodu, mäso, hydina, ryby (9 – 29 %) a strukoviny. Semená strukovín

obsahujú podľa druhu 19 - 45 % bielkovín. Obsah bielkovín v semenách hrachu je 22-

28 %, v sóji 35 - 45 %. Bôb obsahuje 32 - 34 % hrubých bielkovín (z toho

stráviteľných bielkovín je až 19,5 %) a až 50 % výťažkových bezdusíkatých látok.

Z aspektu samotných bielkovín je dôležitá skladba aminokyselín, konkrétne vysoký

obsah esenciálnych aminokyselín (Krúdy, 2010). Cereálie s obsahom bielkovín 7 – 15

% sú z hľadiska množstva menej plnohodnotným zdrojom bielkovín. Z netradičných

druhov obilnín sa dostávajú do popredia pohánka (10 – 14 %), láskavec (8 – 14 %)

a mrlík (15 – 18 %). Bielkoviny pohánky majú unikátne zloženie esenciálnych

aminokyselín so špeciálnymi biologickými aktivitami. Podieľajú sa na znižovaní

hladiny cholesterolu, znižovaní krvného tlaku, pomáhajú pri liečbe zápchy, pozitívne

ovplyvňujú peristaltiku čriev (Li - Zhang, 2001; Pšenáková - Faragó, 2006)).

Z esenciálnych aminokyselín je dôležitý obsah lyzínu, metionínu a tryptofánu. Tieto sa

v ostatných obilninách nachádzajú v nedostatočnom množstve (Muchová, 2007;

Moudrý, 2005). Pri hodnotení nutričnej kvality semena láskavca je dôležitý obsah

bielkovín, zastúpenie jednotlivých frakcií bielkovín a s tým súvisiaci obsah

esenciálnych aminokyselín. Gálová et al. (2008) uvádzajú, že obsah cytoplazmatických

bielkovín (albumínov a globulínov), ktoré sa vyznačujú najvyššou nutričnou kvalitou

súvisiacou s vysokým zastúpením esenciálnych aminokyselín, v semenách láskavca

varíroval od 46,2 % do 60,0 %. Na druhej strane, zastúpenie neplnohodnotných frakcií

11

bielkovín – zásobných bielkovín, bolo v rozsahu 22 % − 37,19 %, čo je v porovnaní so

pšenicou približne o 50 % menej (Muchová et al., 2000; Michalík et al., 2006).

Aminokyselinové zloženie bielkovín je dôležitým faktorom hodnotenia kvality

bielkovín. Za plnohodnotnú bielkovinu sa pokladá tá, ktorej aminokyselinové zloženie

zodpovedá vlastnej bielkovine organizmu. Na základe potreby esenciálnych

aminokyselín pre ľudský organizmus sa pre stanovenie kvality bielkoviny začalo

stanovovať aminokyselinové skóre AAS (Amino Acid Score), niekedy interpretované

aj ako CS – Chemical Score. Esenciálne aminokyseliny (valín, leucín, izoleucín,

metionín, treonín, fenylalanín, tryptofán, lyzín) si nedokáže živý organizmus

syntetizovať, a musí ich konzumovať vo forme potravy.

Výpočet AAS:

AAS = 100 Ai / Asi

kde: Ai – obsah danej esenciálnej aminokyseliny v testovanom proteíne

Asi – obsah tej istej aminokyseliny v štandardnom (referenčnom) proteíne

Nutričnú hodnotu proteínu určuje tá esenciálna aminokyselina, ktorá má zo všetkých

esenciálnych aminokyselín najnižšiu hodnotu kritéria AAS. Nazýva sa limitujúca

aminokyselina. Najväčšie rozdiely v obsahu aminokyselín v rôznych zdrojoch bielkovín

sú hlavne v obsahu lyzínu, menšie v obsahu sírnych aminokyselín a tryptofánu.

Rastlinné bielkoviny sú bohatšie na aminokyseliny arginín a glycín, kým v živočíšnych

bielkovinách je vyšší výskyt sírnych aminokyselín, a obsahujú tiež viac fenylalanínu

a tyrozínu ako rastlinné bielkoviny (Rakowska - Ochodzki, 2001). Pri obilninách sa

jedná o deficienciu lyzínu, treonínu a tryptofánu. Naopak, pri strukovinách je

nedostatočne zastúpená - či už v semenách alebo vegetatívnych častiach rastliny najmä

esenciálna síru obsahujúca aminokyselina metionín (Faragó, 2007).

Pohánka obsahuje 18 rôznych aminokyselín, pričom množstvo lyzínu je v porovnaní

s ostatnými obilninami až štvornásobne vyššie (Moravčíková - Hozová, 2005).

Láskavec má pomerne vyváženú skladbu aminokyselín. Z esenciálnych aminokyselín je

v ňom zastúpený relatívne vo vysokom množstve lyzín (9,48 g.kg-1), čo je približne

trojnásobok oproti pšeničnej hladkej múke. Podiel esencialnych aminokyselín

v pšeničnej múke je 26,34 g.kg-1, kým v  celozrnnej múke z láskavca je to až 43,23

g.kg-1. Nutrične vyvážené zloženie zrna láskavca mu dáva predpoklad k lepšiemu

12

využitiu v cereálnych technológiách. Mrlík má v porovnaní s obilninami vyšší obsah

lyzínu, histidínu, metionínu a cysteínu (Hozová-Moravčíková, 2010).

Kvalitu bielkoviny umožňuje určiť aj index esenciálnych aminokyselín EAAI (Esential

Amino Acid Index), ktorý je porovnaním aminokyselinového zloženia sledovanej

bielkoviny so zastúpením esenciálnych aminokyselín v štandardnej bielkovine vaječný

albumín (Muchová et al., 2007). Poskytuje informáciu o výživovej hodnote bielkoviny,

zahŕňa príspevok všetkých esenciálnych aminokyselín k výživovej hodnote proteínu.

Pre každú esenciálnu aminokyselinu sa určí hodnota AAS a vypočíta sa geometrický

priemer týchto hodnôt:

EAAI  =

kde: EAAI - Esential Amino Acid Index

A –  koncentrácia esenciálnych aminokyselín v sledovanej bielkovine, %

As –  koncentrácia esenciálnych aminokyselín v štandardnej bielkovine, %.

Obsah aminokyselín v potravinách je ovplyvnený aj spracovaním suroviny. Pri

priemyselnej výrobe potravín podlieha surovina rôznym vplyvom v závislosti od

spracovateľskej technológie. Pomerne často je surovina vystavená pôsobeniu vysokých

teplôt, tlaku, vody, alkalických alebo kyslých médií, čo tiež môže viesť k zmene

nutričnej hodnoty bielkovín. Pôsobením vysokých teplôt dochádza k stratám

esenciálnych aminokyselín a k zníženiu utilizácie bielkovín. Noguchi et.al. (1982) sa

zaoberali vplyvom extrúzie na bielkoviny a zistili, že počas extrúzie došlo k viac ako

40 % strate lyzínu v bielkovinovom substráte. Už Schroeder et al. (1961) skúmali vplyv

tepelného ošetrenia na nutričnú kvalitu bielkovín. V súlade s inými autormi dospeli

k záveru, že súčasne s nárastom pH a teploty stúpali aj interakcie sacharidov

s proteínmi, čo dokazoval aj pokles voľného aminodusíka. Z výsledkov vyvodili záver,

že nutričná hodnota bielkovín klesá so stúpajúcim množstvom sacharidov v substráte.

Stráviteľnosť a   dostupnosť aminokyselín je ďalším ukazovateľom nutričnej kvality.

Využiteľnosť, ktorá sa udáva ako koeficient využiteľnosti, t.j. pomer absorbovaných

živín k prijatým živinám (Muchová et al., 2007).

13

Ťažko stráviteľné sú napríklad lepkové bielkoviny cereálií tvorené prolamínmi

a glutenínmi, ktoré sa vyznačujú nízkou rozpustnosťou a nedostatočnou

hydrolyzovateľnosťou proteolytickými enzýmami zažívacieho traktu monogastrov

(Michalík et. al., 2004). Dobrou stráviteľnosťou sa naopak vyznačujú bielkoviny

pohánky, láskavca a mrlíka, ktoré neobsahujú lepok, na základe čoho sú tieto suroviny

cenným zdrojom bielkovín pre osoby citlivé na lepok. Jednou z metód ako dosiahnuť

lepšiu utilizáciu rastlinných bielkovín je suplementácia potravín bielkovinovými

koncentrátmi (obsah bielkovín min. 65 a max. 90 %) alebo izolátmi (obsah bielkovín

min. 90 %). Bielkovinové izoláty získané zo zŕn sezamu, odtučnenej múky kukurice,

hrachu, ako aj pšenice a sójových bielkovín, sa pridávajú do rôznych produktov,

obyčajne ako náhrada vaječného bielka (López et al., 2003).

Prítomnosť antinutričných látok výrazne ovplyvňuje nutričnú hodnotu bielkovín.

Bohaté na antinutričné látky sú semená strukovín, ktoré môžu vyvolať dietetické

poruchy, zníženie stráviteľnosti, využitia a príjmu bielkovín, výsledkom čoho je

sprievodná strata stráviteľných bielkovín. Medzi látky ovplyvňujúce stráviteľnosť patria

inhibítory trypsínu (ich obsah je v sóji 10-krát vyšší ako v hrachu a bôbe), ktoré blokujú

tráviace enzýmy a taníny. Ako antinutričné faktory pôsobia aj saponíny, ktoré

hemolyzujú erytrocyty, spôsobujú horkú chuť, dráždia sliznicu tráviaceho traktu a môžu

narušiť nervový systém, ďalej lektíny aglutimujúce erytrocyty a antivitamíny.

Prítomnosť a nepriaznivý vplyv antinutričných látok sa dá pomerne bez výraznejších

nákladov obmedziť hydrotermickým a tlakovým ošetrením strukovín (extrudéry,

expanzéry ) (Javor et al, 2001).

1.1.2.2. Technologický význam bielkovín

Potreba zlepšovať kvalitu potravín vyvoláva v súčasnosti veľký záujem

potravinárskeho priemyslu o funkčné bielkovinové zložky. Pod pojmom funkčné

vlastnosti bielkovín rozumieme akékoľvek fyzikálne alebo chemické vlastnosti, ktoré

ovplyvnia charakter potraviny v priebehu jej spracovania, skladovania, distribúcie

(Kinsella, 2007; Sikorski, 2001). Tieto vlastnosti bielkovín závisia od štruktúry

bielkoviny a prostredia.

Funkčné vlastnosti bielkovín ako komponentov potravín sú ovplyvnené

molekulovou hmotnosťou a tvarom molekúl bielkovín, ich primárnou štruktúrou

a diverzitou; komformáciou ovplyvnenou kovalentnými a nekovalentnými väzbami, ako

14

i elektrickým nábojom bielkovinových molekúl. Funkčné vlastnosti bielkovín tiež

ovplyvňujú interakcie bielkovín s ostatnými proteínmi, lipidmi, sacharidmi, vodou,

iónmi a aromatickými zložkami potravín (Day et al., 2006).

Interakcia bielkovín s ostatnými zložkami potravín vplýva na senzorické a

reologické vlastnosti potravín, textúru a ďalšie (Belitz et al., 2009). Chuť a vôňu

potravín ovplyvňujú najmä štiepne produkty bielkovín a chemické reakcie s ostatnými

zložkami potravín. Z technologického hľadiska je dôležitá interakcia bielkovín s vodou

(absorpcia/retencia vody, schopnosť napučiavania, adhézia, rozptýliteľnosť,

rozpustnosť, viskozita) (http 1). Na väznosť vody vplýva aminokyselinová skladba

bielkovín, konformácia bielkovín, povrchová polarita/hydrofobicita, pH, teplota,

a ďalšie faktory .

Rozpustnosť bielkovín je funkciou pH, iónovej sily prostredia, teploty a tlaku.

Líši sa v závislosti od zdroja bielkoviny a spôsobu spracovania počas izolácie (Nielsen,

1997). Najnižšia je rozpustnosť bielkovín v okolí izoelektrického bodu, čo sa využíva

na separáciu a izoláciu proteínov. So zvýšenou koncentráciou solí rozpustnosť

bielkoviny narastá, pri veľmi vysokých koncentráciách však naopak dochádza

k vysoľovaniu, čo sa tiež využíva pri izoláciii a purifikácii proteínov. Rozpustnosť

bielkovín narastá aj so stúpajúcim stupňom hydrolýzy. Je to spôsobené hlavne

redukciou molekulovej hmotnosti a nárastom polárnych skupín (Zayas, 1997). Pri

miesení, tepelnom opracovaní potravín, chladení, mrazení je dôležitou vlastnosťou

viskozita. Koeficient viskozity rastie exponenciálne s koncentráciou bielkovín.

Dôležitou technologickou vlastnosťou bielkovín je schopnosť tvoriť gél. Gelácia

je dej, pri ktorom sa základné stavebné jednotky spájajú a v konecnej fáze vytvoria

jedinú makromolekulu s objemom limitovaným objemom nádoby. Vlastnosti gélov

závisia od podmienok pri agregácii, keď dochádza spájaniu menších polymérnych

jednotiek na väčšie častice (Jesenák, 2005). Agregáciu ovplyvňuje koncetrácia

proteínov, teplota a dĺžka tepelného pôsobenia, iónová sila a pH.

Medzi typické rastlinné bielkoviny, ktoré sa v potravinárstve využívajú pre svoje

gelačné schopnosti patria sójové bielkoviny (glycinín, conglicinín) a pšeničný lepok.

Pšeničný lepok má unikátne vlastnosti, ktoré výrazne ovplyvňujú reológiu cesta.

Uplatňujú sa už v prvej fáze tvorby cesta, počas miesenia, kedy dochádza

k mechanicko-fyzikálnym zmenám lepku v dôsledku tvorby disulfidických väzieb

medzi lepkovými frakciami. Počas miesenia dochádza k agregácií proteínových

reťazcov, hydratácii škrobových zŕn a čiastočne neškrobových polysacharidov.

15

Vytvárajú sa glykoproteíny a vzniká systém voda -škrob - lepok, ktorý je čiastočne

emulgovaný (napr. monoacylglycerolmi a ich estermi, ktoré sa prirodzene nachádzajú

v múke) a tak v konečnom dôsledku dochádza k vytvoreniu kompaktnej amorfnej

štruktúry cesta (Muchová et al., 2009). Vlastnosti lepku sú v závislosti od suroviny

ovplyvnené pomerom gliadínov ku glutenínom, ako aj podielom nízko a vysoko

molekulárnych glutenínových podjednotiek (Edwards et al., 2003). Vysoko molekulová

vetvená polymérna bielkovinová frakcia gliadín (prolamín) je zodpovedná za súdržnosť

cesta, kým nízkomolekulárna lineárna polymérna bielkovinová frakcia glutenín

(glutelín) ovplyvňuje odpor voči natiahnutiu (Hosseney, 1994; Gažar - Bojňanská,

2010). Lepkové bielkoviny sú tiež zodpovedné za udržiavanie vlhkosti počas pečenia,

čo v konečnom dôsledku vplýva na textúru striedky chleba. Z povrchových vlastností

bielkovín sú z technologického hľadiska dôležité schopnosť tvoriť emulziu a penu.

Je všeobecne známe, že bielkoviny z rôznych zdrojov majú odlišné vlastnosti

(Tab. 1.1; Tab.1. 2). Z vyššie uvedeného vyplýva, že vhodnosť surového rastlinného

alebo živočíšneho materiálu na rôzne technológie spracovania, závisí od obsahu,

množstva a vlastností bielkovín. Pri kulinárskej úprave mäsa je dôležitý obsah

chromoproteínov, ktoré vplývajú na farbu mäsa, nízky obsah kolagénu a bohatý

myofibrilárny systém, ktorý zabezpečí požadovanú textúru. Iné požiadavky sa kladú na

použitie funkčných mliečnych bielkovín (kazeínu, srvátkového proteínového

koncentrátu alebo izolátu, mliečnych hydrolyzátov) do potravín. Tu sa zameriavame na

také vlastnosti ako rozpustnosť, absorpcia/retencia vody, tvorba peny, emulgačná

kapacita.

Tab.1. 1 Požiadavky na funkčné vlastnosti bielkovín ako komponentov potravín

Vlastnosti Prisudzovaná funkcia v potravine

senzorické chuť, vôňa, textúra, farba

optické nepriehľadnosť, zákal, farba

hydratačné rozpustnosť, rozptýliteľnosť, tvorba gélu, viskozita

povrchová aktivita emulzia, penivosť, šľahateľnosť

16

textúra viskozita, adhézia, agregácia, tvorba gélu

reologické agregácia, tvorba gélu, viskozita, extrudovateľnosť

Zdroj: http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené

Tabuľka 1. 2 Charakteristika funkčných vlastností bielkovín v niektorých

potravinách

BielkovinaEmugačná

schopnosťŠľahateľnosť

Tvorba

gélu

Tvorba

filmu

Stabilitatepelná/

v kyslom

prostredí

vaječný bielok

nízka vysoká vysoká stredná nie

vaječný žĺtok

vysoká nízka stredná nízka nie

kazeináty vysoká stredná nízka vysoká áno /nie

srvátka strednánízka až vysoká

nízka až vysoká

stredná nie / áno

sójový izolát

stredná až vysoká

nízka až stredná

strednástredná až

vysokánie / nie

zdroj: http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené

Tabuľka 1. 3 Požiadavky na funkcie bielkovín v rôznych druhoch potravín

PotravinaPožadované funkcie pre

všetky produkty

Požadované funkcie pre niektoré

produkty

nápoje rozpustnosť, koloidná stabilitastabilita voči kyselinám, tvorba

emulzie, väznosť vody

pekárske produktyrozpustnosť, tvorba emulzie,

tvorba gélu

tvorba peny, stabilita peny, väznosť

vody, modifikácia gluténu

cukrovinky tvorba peny, rozpustnosť tvorba emulzie, tvorba gélu

mrazené krémytvorba emulzie, tvorba peny,

rozptýliteľnosť

rozpustnosť, väznosť vody, náhrada

tuku

napodobneniny

mliečnych výrob.

tvorba emulzie, koloidná

stabilita

rozpustnosť, tvorba peny, stabilita

peny

detská výživa nutričná hodnota, rozpustnosť,

tvorba emulzie, koloidná

náhrada zložiek materského mlieka

17

stabilita pri záhreve

upravené mäso tvorba emulzie, väznosť vodyslabá viskozita v roztoku, tvorba

gélu, náhrada tuku

šľahané omáčkytvorba emulzie, koloidná

stabilita pri záhreveväznosť vody, tvorba viskozity

Zdroj : http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené

1.2 Charakteristika mikrobiálnych proteolytických enzýmov

aplikovaných pre cielenú úpravu bielkovinovej suroviny

1. 2.1 Proteolytické enzýmyProteolytické enzýmy- proteázy, sú fyziologicky a komerčne dôležitou skupinou

enzýmov. Patria do tretej triedy enzýmov – Hydrolázy (EC 3.4.). Katalyzujú

hydrolytické štiepenie peptidických väzieb -CO-NH- v bielkovinách a peptidoch.

V závislosti od miesta a spôsobu hydrolýzy sa delia na endopeptidázy a exopeptidázy

(Škárka – Ferenčík, 1987). Pre endopeptidázy sa v minulosti používal aj výraz

proteinázy. Názov peptidázy sa používal pre exopeptidázy. V roku 1992 Medzinárodná

organizácia pre biochémiu a molekulárnu biológiu (IUBMB) odporučila, aby sa pre

proteolytické enzýmy používal jednotný názov peptidázy (http 2).

Informácie vzťahujúce sa ku konkrétnym peptidázam sú zhrnuté vo viacerých

databázach. Medzi najznámejšie patria MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk)

a BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org) databáza.

Databáza MEROPS využíva hierarchickú klasifikáciu, založenú na štruktúre

enzýmu. Umožňuje vyhľadať enzýmy a ich inhibítory podľa mena, identifikátora, názvu

génu, producentského organizmu a substrátovej špecifity (Rawlings, 2010). Databáza

BRENDA zahŕňa informácie o funkcii, štruktúre, lokalizácii, izolácii, a stabilite

všetkých identifikovaných enzýmov bez ohľadu na zdroj enzýmu.

1.2.1.1. Zdroje proteolytických enzýmov

Proteolytické enzýmy reprezentujú triedu enzýmov, ktorá má významnú úlohu vo

fyziologických procesoch organizmov a v súčasnosti patria do jednej z troch

najrozšírenejších komerčne využívaných skupín enzýmov. Predstavujú 60 % svetového

predaja enzýmov. Enzýmy môžu byť získavané viacerými spôsobmi, napríklad

18

extrakciou z rastlinných či živočíšnych zdrojov, alebo produkciou mikroorganizmami

(Sondergaard et al., 2005), pričom každá skupina enzýmov vykazuje určité špecifiká.

Z rastlín sa ako zdroje pre izoláciu peptidáz využívajú časti a plody rastlín:

Carica papaya (papaín), Ficus glabatra a Ficus carica (ficín) Ananas comosu

(bromelaín).

Enzýmy živočíšneho pôvodu (trypsín, chymotrypsín, pepsín, renín) sa získavajú

z pankreasu jatočných zvierat. Ich dostupnosť je obmedzená množstvom živočíšneho

materiálu. Nevýhodou živočíšnych aj rastlinných peptidáz je ich producentský

organizmus, pretože rast a vývoj týchto organizmov je časovo náročnejší, ako je to

u mikrobiálnych buniek. Najrozšírenejším zdrojom pre získavanie industriálnych

enzýmov sú mikroorganizmy (Ibrahim, 2008). Všeobecnou výhodou využívania

mikroorganizmov je ich rýchly rast, široké spektrum produkovaných enzýmov

a možnosti génových manipulácií s cieľom zvýšenia, alebo urýchlenia produkcie.

Väčšina industriálnych enzýmov je produkovaných relatívne malým počtom rodov

mikroorganizmov, z húb sú najviac využívané rody Aspergillus, Trichoderma a

Streptomyces a z baktérií rody Bacillus (Leisola et al., 2010).

Baktérie- produkujú najčastejšie neutrálne a alkalické peptidázy, z producentov

sa najčastejšie využíva rod Bacillus. Bakteriálne peptidázy majú zvyčajne nižšiu

peptidolytickú aktivitu voči makromolekulovým proteínom a využívajú sa na výrobu

hydrolyzátov s nízkym stupňom hydrolýzy (10 -15 DH). Z tohto dôvodu degradačné

produkty získané použitím bakteriálnych proteáz obsahujú veľké množstvo

vysokomolekulových peptidov. Niektoré neutrálne peptidázy patria k metalopeptidázam

napr. thermolysin z Bacillus thermoproteolyticus a niektoré, napr. subtilisin BPN’ z

Bacillus amyloliquefaciens patria k Ser-peptidázam (http 3).

Bakteriálne neutrálne peptidázy majú relatívne nízku termotoleranciu a sú

aktívne v úzkom rozpätí pH (pH 5 - 8). Napríklad Neutrase® 0.8L (DSM) sa inaktivuje

za 2 minúty pri teplote 85 °C, avšak stabilita enzýmu závisí aj od substrátu

(koncentrácia, pH a pod.) (http 4). Nízka termotolerancia je výhodou pre kontrolu

reaktivity neutráz počas enzýmovej hydrolýzy pri výrobe hydrolyzátov s nízkym

stupňom hydrolýzy. Využitie neutrálnych peptidáz v potravinárskom priemysle má svoj

význam, nakoľko ich proteínové hydrolyzáty vykazujú menej horkú chuť ako pri

použití živočíšnych peptidáz. Bakteriálne neutrázy sú charakteristické ich afinitou

k hydrofóbnym aminokyselinám. Nakoľko nie sú citlivé voči natívnym rastlinným

inhibítorom, sú vhodné na využitie v pivovarskom priemysle (Rao et al., 1998).

19

Bakteriálne alkalické peptidázy sú charakteristické aktivitou pri alkalickom pH

a širokou substrátovou špecifitou, pri teplotnom optime asi 60 °C. Tieto vlastnosti im

umožňujú uplatniť sa vo výrobe čistiacich prostriedkov.

Mikroskopické vláknité huby - Aspergillus flavus, A. niger, A.oryze, Rhizomucor

pussilus, R.meiherei, rod Rhizopus, produkujú širšiu paletu enzýmov ako baktérie,

pričom peptidázy vykazujú aktivitu pri širokom rozpätí pH (pH 4 - 11) pri širokej

substrátovej špecifite. Aspergillus oryzae produkuje kyslé, neutrálne, aj alkalické

peptidázy. Nevýhodou však je, že ich reaktivita je obmedzená nízkou odolnosťou

enzýmov voči teplotám. Kyslé peptidázy majú otimálne pH medzi 4 a 4,5 a sú stabilné

pri pH 2,5 - 6. Tieto vlastnosti sú však dobre využiteľné vo výrobe syrov.

Fungálne neutrálne peptidázy patria medzi metalopeptidázy. Sú aktívne pri pH 7

a inhibujú ich chelatačné činidlá. Využívajú sa ako doplnkové enzýmy k rastlinným

živočíšnym a bakteriálnym peptidázam, pre ich schopnosť hydrolyzovať hydrofóbne

aminokyselinové väzby, čím prispievajú k redukcii horkosti proteínových hydrolyzátov.

Fungálne alkalické peptidázy sa tiež využívajú na modifikáciu potravových bielkovín.

Ehren et al. (2009) porovnávali účinnosť hydrolýzy lepku pomocou aspergillopepsínu

z Aspergillus niger a dipeptidyl peptidázy IV z Aspergillus oryzae. Ani jedna

z peptidáz použitých samostatne nepreukázala účinok na imunotoxické petidy, najlepší

hydrolytický účinok zaznamenali pri použití kombinácie oboch enzýmov.

Vírusy- význam majú virálne peptidázy v medicíne, kde sa skúma ich vzťah

k mnohým chorobám, ako je AIDS alebo rakovina. V potravinárskom priemysle sa

peptidázy získané z vírusov nevyužívajú.

Exopeptidázy ( EC 3.4.11.-19. )

Exopeptidázy katalyzujú štiepenie peptidových väzieb od konca

polypeptidického reťazca. V závislosti od toho, na ktorý koniec bielkoviny pôsobia, sa

ďalej delia na aminopeptidázy, dipeptid-peptidázy a tripeptidyl-peptidázy,

karboxypeptidázy, peptidyl-dipeptidázy a omegapeptidázy (Vodrážka et al., 1998).

Aminopeptidázy (EC 3.4.11.) odštepujú voľné aminokyseliny od N-konca

polypeptidového reťazca. V prokaryotických aj eukaryotických bunkách sa nachádzajú

v mnohých subcelulárnych organelách, sú zložkami proteínov membrán a cytosólu.

Väčšina aminopeptidáz sú metaloproteíny zinku (Stano et al., 2007).

V metabolizme bielkovín majú okrem pôsobenia na N-konce peptidov, aj viaceré

špecifické funkcie, ako napríklad aktiváciu a inaktiváciu biologicky aktívnych

20

bielkovín alebo odstránenie N-koncového metionínu z novosyntetizovaných proteínov

(Wilk et al., 1998).

Aminopeptidázy baktérií a mikroskopických vláknitých húb vykazujú rôzne

substrátové špecifity. Klionski et al. (1990) uvádzajú, že aminopeptidáza 1 (EC

3.4.11.22) má veľkosť 640 kDa a jej aktivitu stimulujú ióny Zn2+ a Cl-. Metionyl

aminopeptidáza 1, Aminopeptidáza Y a Aminopeptidáza I  sú aminopeptidázy

izolované zo Saccharomyces cerevisiae. Aminopeptidáza Y vyžaduje pre svoju aktivitu

prítomnosť iónov Co2+ a je inhibovaná prítomnosťou iónov Zn2+ a Mn2+. PepA

aminopeptidáza izolovaná z Escherichia coli vykazuje preferenciu pre leucín alebo

metionín a potrebuje pre svoju aktivitu prítomnosť zinku (Minh et al., 2009). Midwinter

– Pritchard (1994) izolovali Aminopeptidázu N s molekulovou hmotnosťou 96 kDa

zo Streptococcus salivarius subsp. thermophillus. Jej najvyššia aktivita bola

zaznamenaná v miestach väzby lyzínu, arginínu a leucínu. Arima et al. (2008)

purifikovali aminopeptidázu P z Streptomyces costaricanus. Enzým vykazoval širokú

substrátovú špecifitu a preferenciu pre ióny Zn2+.

Dipeptid-peptidázy (EC 3.4.13.) a  tripeptidyl-peptidázy (EC

3.4.14.) hydrolyzujú dipeptidy a tripeptidy na príslušné aminokyseliny.

Karboxypeptidázy (EC 3.4.16.-18.) a  peptidyl-dipeptidázy (EC 3.4.15.)

odštepujú koncovú aminokyselinu z C-konca polypeptidového reťazca (Polaina et al.,

2007).

Na základe charakteru aminokyselinových zvyškov v aktívnom mieste enzýmu

sa delia do troch skupín: karboxypeptidázy serínového typu (EC 3.4.16.) sú izolované

z Penicillium spp., Saccharomyces spp. a Aspergillus spp.. Majú podobnú substrátovú

špecifitu, ale vykazujú rôznorodosť v oblasti pH optima, stability, molekulárnej

hmotnosti a efektu inhibítorov. Metalokarboxypeptidázy (EC 3.4.17.) sú izolované z

rodov Saccharomyces a Pseudomonas a vyžadujú pre svoju aktivitu ióny Zn2+ a Co2+ .

Omegapeptidázy (EC 3.4.19. ) katalyzujú hydrolýzu koncových zvyškov

substituovaných, cyklizovaných alebo izopeptidovými väzbami spájaných aminokyselín

(Rao, 1998). Galvao et al. (2009) využili karboxypeptidázu A na odstránenie

fenylalanínu z hydrolyzátu srvátkového proteínu, čím dosiahli možné využitie

srvátkového hydrolyzátu pre ľudí trpiacich fenylketonúriou.

21

Endopeptidázy ( EC 3.4.21-99 )

Endopeptidázy štiepia peptidové väzby vo vnútri proteínovej štruktúry

vzdialené od konca substrátu. Naughton už v roku 1960 (Naughton et al., 1960) popísal

štyri rozličné typy katalytického mechanizmu endopeptidáz. Toto pozorovanie bolo

rozvinuté do praktického systému klasifikácie týchto enzýmov. Podľa typu zlúčeniny,

ktorá inhibuje ich aktivitu sa delia na: serínové, cysteínové, aspartátové,

metaloendopeptidázy, treonínové a zatiaľ neklasifikované endopeptidázy, ktoré nemajú

ešte presne charakterizovanú štruktúru katalytického miesta (Urminská, 1997).

Serínové peptidázy ( EC 3.4.21.)

Serínové peptidázy tvoria veľmi významnú skupinu enzýmov, či už z hľadiska

potravinárskeho alebo farmakologického. Zúčastňujú sa širokej škály fyziologických

procesov organizmu, vrátane trávenia, hemostázy a imunitnej odpovede (Zakharova et

al., 2009). Majú širokú substrátovú špecifitu a ich katalytické centrum je tvorené

serínovým zvyškom s voľnou hydroxylovou skupinou. Sú najrozšírenejšou skupinou

proteolytických enzýmov mikroorganizmov a živočíchov Patria sem predovšetkým

tráviace enzýmy živočíchov a enzýmy produkované mikroorganizmami (North, 1982).

Serínové peptidázy sú zvyčajne endopeptidázy a katalyzujú hydrolýzu peptidových

väzieb vo vnútri polypeptidového reťazca, ale boli popísané aj serínové peptidázy

katalyzujúcich odštiepenie jednej alebo viac aminokyselín z konca polypeptidového

reťazca (Cera, 2009).

Serínové peptidázy sú aktívne pri neutrálnom a alkalickom pH s optimom medzi

hodnotami 7-11. Majú širokú substrátovú špecificitu a vyznačujú sa aj esterolytickou

aktivitou. Sú to enzýmy s molekulovou hmotnosťou 18,5 - 35 kDa (Vodrážka et al.,

1998). Najviac preštudovanými Ser-peptidázami sú tráviace enzýmy trypsín a

chymotrypsín.

Trypsín (EC 3.4.21.4) je proteáza živočíšneho pôvodu, produkovaná

v pankrease. Štiepi polypeptidový reťazec len v miestach, kde sa v peptidovej väzbe

viaže karboxylová skupina arginínu alebo lyzínu, pri optimálnom pH 7 – 9 (Ferenčík et

al., 2000). Trypsín je produkovaný vo forme inaktívneho trypsinogénu, z ktorého

vzniká účinkom enzýmu enteropeptidáza. Trypsín je relatívne malý enzým s

molekulovou hmotnosťou 23,3 kDa a pH optimom 7 – 9. V súčasnosti patrí medzi

najčastejšie komerčne využívané enzýmy. V potravinárstve sa používa napríklad

Trypsín Novo vyrábaný firmou Novo Nordisk v Dánsku, získavaný z pankreasu

22

ošípaných. V kombinácii s chymotrypsínom sa využívajú na úpravu špeciálnych

bielkovín pre prípravu hypoalergénnych diét (Bonomi et al., 2000).

Úspešne sa tiež využíva na prípravu koncentrátov srvátkových proteínov. Mota

et al. (2006) skúmali pôsobenie trypsínu za rôznych podmienok teploty a pH. Hydrolýza

prebehla v časovom rozpätí 15 min. teplote 37° C a pH 9, ako aj pri použití teploty 50

°C a pH 8. Naopak pomalý priebeh hydrolýzy (120 min.) zaznamenali pri teplote 37 °C

a pH 8. Kyung-Koh et al. (2008) pozorovali hydrolytické účinky trypsínu na pšeničný

lepok. HPLC analýza preukázala zníženie množstva vysokomolekulárnych a zvýšenie

množstva nízkomolekulárnych frakcií. Beran et al. (2009) skúmali vplyv vysokého

(500 MPa) hydrostatického tlaku na tryptickú a chymotryptickú hydrolýzu mliečnych

bielkovín a hovädzieho sérového albumínu. Po aplikácii vysokého hydrostatického

tlaku v priebehu tryptickej hydrolýzy β-laktoglobulínu,  α-laktoalbumínu a hoväzieho

sérového albumínu boli zistené významné zmeny peptidových profilov a progresívne

zníženie množstva pôvodne prítomných nerozštiepených bielkovín. Okrem toho bolo

zistené významné zníženie zvyškových imunoreaktívnych produktov tryptického

hydrolyzátu β-laktoglobulínu a chymotryptického α-laktoalbumínu.

Chymotrypsín (EC 3.4.21.1) vzniká v tenkom čreve živočíchov a štiepi

substrát na miestach, kde sa na tvorbe peptidovej väzby zúčastňuje karboxylová skupina

aromatických aminokyselín (tyrozín, fenylalanín) alebo aminokyselín s rozmerným

nepolárnym reťazcom (metionín, leucín, tryptofán) (Lieberman – Marks, 2009).

Chymotrypsín je proteolytický enzým s pH optimom okolo 8. Vznik aktívneho

chymotrypsínu z chymotrypsinogénu prebieha v tenkom čreve účinkom trypsínu

(Ferenčík et al., 2000). Je inaktivovaný pankreatickým trypsínovým inhibítorom, ale za

účinku Ca2+ katiónov je tento proces spomaľovaný (Fioretti et al., 1994). Chymotrypsín

sa používa ako súčasť liekov pri liečení podliatin, zlomenín a rán. Castillo-Yáñez et al.

(2006) izolovali chymotrypsín z tráviacej sústavy sardiniek, ktorý sa môže využiť ako

biotechnologický preparát pre využitie odpadu v priemysle spracovania rýb, ako

materiálu pre produkciu kvalitného bielkovinového hydrolyzátu.

Karamac- Rybarczyk (2008) popísali chymotrypsínovú hydrolýzu šošovicových

bielkovín. Hydrolýza s dosiahnutým stupňom hydrolýzy 13 % prebiehala 120 min. a

bola kontrolovaná metódou pH-stat. Na rozdelenie produktov hydrolýzy podľa

molekulových veľkostí použili metódy SDS-PAGE a SE-HPLC. V hydrolyzáte boli

prítomné nehydrolyzované proteíny, ale prevládajúcu skupinu tvorili produkty

23

hydrolýzy s molekulovou hmotnosťou 0,5- 6,5 kDa, pričom sa nepozorovalo výrazné

zhorknutie hydrolyzátu.

Mikrobiálne Ser-peptidázy sú produkované všetkými druhmi

mikroorganizmov, no pre výrobný účel sa používajú hlavne baktérie, ktoré sú

producentami veľkého množstva extracelulárnych enzýmov (Vodrážka, 1993).

Serínové peptidázy trypsínového typu prednostne štiepia peptidové väzby

tvorené zásaditými aminokyselinami a ich optimálne pH je 8. Na ich získavanie sa

prevažne využíva produkcia baktériami rodu Streptomyces (Morihara et al., 1967;

Sinha et al., 1991; Fuhong et al., 2010).

Alkalické Ser-peptidázy vykazujú najvyššiu aktivitu pri pH10 a ich

producentmi sú baktérie rodu Bacillus, mikroskopické huby Aspergillus sp.,

Neurospora crassa a kvasinky Sacharomyces cerevisiae. Veľmi často využívanou

alkalickou proteázou je „Subtilizín“ produkovaný baktériou Bacillus licheniformis.

Nachádza sa v komerčných produktoch pod názvami Alkalase 2,4L (Novozymes) a

Protex L (Genencor). Alkaláza z Bacillus licheniformis bola použitá na hydrolýzu

proteínového izolátu z fazule mungo. Hong-Li et al. (2005) skonštatovali, že hydrolyzát

obsahuje vysokú ACE inhibítorovú aktivitu, pričom najvyššia aktivita bola

zaznamenaná po 120 min. hydrolýzy. Nehydrolyzovaný proteín inhibítorovú aktivitu

nevykazoval. Z výsledkov vyplýva, že alkalázou hydrolyzovaný proteínový izolát

fazule mungo má perspektívu pre použitie pri výrobe fyziologicky funkčných potravín

s antihypertezívnou aktivitou.

Aspergillus oryzae produkuje Ser-peptidázu distribuovanú pod názvom

Flavourzyme (Novo Nordisk) používanú na produkciu mäsových aróm z rastlinných

proteínov (Wu et al., 2000), alebo na získavanie rybích hydrolyzátov s dobrými

funkčnými vlastnosťami (Karam - Nicell, 1997).

Myxobacter alfa-lytické ser-peptidázy, produkované rodom Sorangium,

sú špecifické na štiepenie väzieb obsahujúcich karboxylové skupiny neutrálnych

alifatických aminokyselín. Do tejto podtriedy patrí aj enzým elastáza (Urminská, 1997).

Stafylokokové ser-peptidázy produkované Staphylococcus aureus

pôsobia špecificky na väzby kyslých aminokyselín pri pomerne širokom

pH optime 4,0 – 7,8 (Morihara, 1974).

24

Cysteínové peptidázy ( EC 3.4.22 )

Aktívne centrum cysteínových peptidáz je tvorené trojicou aminokyselín:

cysteínu, histidínu a glutamínu (Storer - Menard, 1994; Wagstaff et al.,2002). Patria

sem známe rastlinné enzýmy ako napríklad papaín, bromelaín, ficín, kaspázy, ako aj

rôzne enzýmy mikrobiálneho pôvodu.

V potravinárstve, najmä v mäsovom priemysle, má využitie na vápniku závislá

peptidáza kalpaín. V súčasnosti sa pozornosť sústreďuje na vysvetlenie vzťahov medzi

kalpaínom a jeho inhibítorom kalpastatínom v súvislosti s ovplyvnením postmortálnej

tenderizácie mäsa (Bracho – Timaure, 2008).

Historické využitie, založené na empírii, v potravinárstve má peptidáza papaín

(EC 3.4.22.2), ktorá sa získava zo zelených a nezrelých plodov papáje Carica papaya.

Okrem peptidových väzieb hydrolyzuje aj amidové a esterové väzby. Svojím účinkom

sa podobá chymotrypsínu, ale optimálne pôsobí pri neutrálnom pH. V potravinárstve sa

používa na prípravu proteínových hydrolyzátov a tenderizáciu mäsa a mäsových

produktov, v pivovarníctve pri čírení piva, v menšej miere v cukrovinkárstve na výrobu

žuvačiek a v mliekarenstve pri výrobe syrov (James – Simpson, 1996). Taktiež sa

využíva aj v iných oblastiach, napríklad vo farmaceutickom a textilnom priemysle napr.

pri postupe úpravy nezrážavej vlny. Výrobca papaínu, firma Deerland (http. 5) uvádza,

že optimálne pH pre aktivitu papaínu sa pohybuje v rozpätí pH 5-7, pri pH pod 3,5

a nad pH 10 je enzým inaktivovaný. V porovnaní s inými peptidázami je papaín

termostabilný, jeho teplotné optimum sa pohybuje medzi 65 – 80 °C, inaktivujú ho

teploty nad 90 °C. Bandyopadhyay – Ghosh (2002) použili papaín na hydrolýzu

proteínového izolátu sezamu. Najvyšší stupeň hydrolýzy sa dosiahol do 10 min. od

začiatku hydrolýzy, pričom počas hydrolýzy bolo pozorované signifikantné zníženie

molekulárnych hmotností peptidov. Výsledný hydrolyzát mal tiež iné funkčné vlastnosti

ako pôvodný proteín, výrazne sa zvýšila rozpustnosť, EAI (Emulsion Activity Index)

a ESI (Emulsion Stability Index). V praxi sa papaín aplikuje v pečivárňach pri výrobe

pečív z cícerovej múky pre potrebu bezlepkovej diéty. Cícerová múka dáva za

normálnych okolností drobivé cesto, ale po aplikácii papaínu je cesto kompaktnejšie a

lepšie tvarovateľné (Mikušová, 2010).

Ficín (EC 3.4.22.3) sa získava z latexu stromu Ficus glabatra a Ficus carica.

Zelené figy o hmotnosti 10 – 15 g obsahujú až 100 – 150 mg enzýmu. Ficín sa používa

na hydrolýzu rôznych bielkovín, na stabilizáciu piva a v nedávnej minulosti aj ako

25

alternatívna metóda na získavanie striebra z použitých fotografických filmov (Vodrážka

et al., 1998).

Bromelaín je skupinové pomenovanie enzýmov objavených v rôznych druhoch

čeľade Bromeliaceae, najviac je využívaný ananás Ananas comosus. Európsky výrobca

rastlinných proteáz firma S.A. BIOCHEM EUROPE (http 6) udáva, že najväčšia

koncentrácia bromelaínu sa nachádza v nižšie položenej – stopkovej časti zrelej rastliny

ananásu, v komerčne zaujímavom množstve je prítomný tiež v plodoch a listoch.

Podobne ako papaín má širokú škálu využitia vo všetkých odvetviach potravinárskeho

priemyslu. Bromelaín je známy svojou aplikáciou pri hydrolýze väčšiny rozpustných

proteínov, napr. pri výrobe oblátiek a napolitánok (Ortiz – Anon, 2000). V bielkovinách

štiepi predovšetkým v mieste Z-Arg-Arg. Bromelaín je aktívny pri pH 5 – 9 a teplotou

inaktivovaný pri 70 °C. Na rozdiel od papaínu a ficínu je glykoproteínom. Významné

využitie má aj vo farmácii, kde bol dokázaný protizápalový, protizrážací a

fibrinolytický účinok bromelaínu (Maurer, 2001).

Zingipain je názov pre GP-I a GP-II petidázy papaínového typu izolované

z rizómu zázvora (Zingiber officinale). Peptidázy GP-I a GP-II prednostne hydrolyzujú

peptidy s prolínovým zvyškom na P2 pozícii peptidu (Choi – Laursen, 2000). Peptidázy

sú inhibované iónmi kovov Hg2+, Cu2+, Cd2+ and Zn2+ (Ohtsuki et al., 1995).

Mikrobiálne cysteínové peptidázy sa podľa producenta delia do dvoch skupín:

clostripaínové peptidázy - producentom ktorých je Clostridium histolyticum, ktoré

špecificky pôsobia na bázické aminokyseliny a streptokokové peptidázy, ktoré sú

produkované baktériami Streptococcus sp. ako zymogény, ktoré sú autokatalyticky

aktivované na enzým. Tieto enzýmy majú širokú substrátovú špecifitu

a v potravinárstve sa využíva najmä peptidáza zo Streptococcus thermophilus, ktorou sa

odstraňujú tzv. horké peptidy (Fernandez-Espla – Rul, 1999).

Asparátové peptidázy ( EC 3.4.23 )

Označujú sa aj ako karboxylové endopeptidázy, lebo majú v katalytickom mieste

dve karboxylové skupiny, ktoré sú súčasťou kyseliny asparágovej. Medzi živočíšne

Asp-peptidázy patrí predovšetkým pepsín, ktorý sa nachádza v žalúdočnej šťave

stavovcov a vytvára sa z pepsinogénu A. Štiepi peptidové väzby, ktoré tvoria

hydrofóbne, predovšetkým aromatické zvyšky aminokyselín (Kageyama et al., 2009).

Štiepenie nastáva na C-konci od fenylalanínu, leucínu a kys. glutámovej, neštiepi pri

valíne, alaníne alebo glycíne. Optimálne pH pepsínu A je 2 - 4 a stabilný je pri teplote

26

60 °C. Pepsín je nevratne inaktivovaný pri pH > 6 (Ferenčík et al., 2000). Produkty jeho

pôsobenia sa nazývajú aj peptóny. Využíva sa na prípravu bielkovinových

hydrolyzátov pre špeciálnu výživu (detská výživa, instantné cereálie), pri výrobe syrov

a k prevencii chladového zákalu piva ( Vodrážka et al., 1998 ).

Mikrobiálne asparátové peptidázy sa delia na peptidázy pepsínového typu

a renínového typu.

Asparátové petidázy pepsínového typu produkujú Aspergillus, Penicillium,

Rhizopus, Trametes a Neurospora crassa (Rao et al., 1998). Sú to extracelulárne

enzýmy, ktoré majú rozsiahle komerčné využitie napr. pri výrobe sójových omáčok.

Mikrobiálny pepsínový typ aspartátových proteáz má veľmi jednoduché fyzikálne a

chemické vlastnosti živočíšneho pepsínu, vrátane nízkej esterolytickej aktivity.

Aspartátové peptidázy renínového typu produkujú rôzne mikroorganizmy,

Endothia parasitica, Mucor sp. a Aspergillus candidus (Rao et al, 1998)). Enzýmy z

Endothia a Mucor sa používajú pri výrobe syrov (Kalitz, 1988). V humánnej medicíne

sa skúmajú aspararátové peptidázy produkované kvasinkami Candida albicans

a Candida tropicalis, ktoré sú považované za vážny faktor virulencie vírusu HIV

(Hidalgo – Vazques, 2010). Prítomnosť týchto enzýmov je esenciálna pre životný

cyklus retrovírusov a toto môže byť dobrý smer pre chemoterapiu špecifickými

inhibítormi.

Metaloendopeptidázy ( EC 3.4.24 )

Metalopeptidázy môžu byť charakterizované na základe svojej substrátovej

špecifity:

a) stromelyzíny, prednostne degradujúce proteoglykány a bázické membránové

komponenty,

b) želatinázy, prednostne hydrolyzujúce želatíny,

c) kolagenázy, ktoré štiepia kolagén (Okada et al., 1986; Means et al., 2004).

Okrem niekoľkých výnimiek sa všetky komerčne využívané kolagenázy izolujú

z anaeróbnej baktérie Clostridium histolyticum. V prostetickej skupine metalopeptidáz

je prítomný ión kovu, zvyčajne zinku, ktorý môže byť v niektorých prípadoch

nahradený aj iným prechodným kovom. Prednostne katalyzujú hydrolýzu peptidov

s hydrofóbnymi postrannými reťazcami, obsahujúcimi napríklad fenylalanín a leucín.

Sú citlivé voči chelatačným činidlám ako napr. EDTA, ale inhibícia je zvyčajne vratná

27

pridaním iónov zinku, kobaltu a vápnika (Gripon et al ., 1980). Komerčný význam majú

predovšetkým mikrobiálne metalopeptidázy.

Kyslé metalopeptidázy produkuje Penicillium caseicolum, Penicillium

roqueforti, Aspergillus sojae a Aspergillus oryzae (Gripon et al., 1980). Neutrálne

metalopeptidázy sú špecifické voči hydrofóbnym a objemným aminokyselinovým

zvyškom. Okrem jedného atómu zinku sa v ich molekule nachádzajú aj dva až štyri ióny

vápnika, čo plní veľmi dôležitú úlohu v termostabilite týchto enzýmov. Z producentov

možno spomenúť Aspergillus sp. a Bacillus thermoproteolyticus, ktorý produkuje

enzým termolyzín (Grandi et al., 2009). Hatanaka et al. (2008) charakterizovali novú

metalopeptidázu z Streptomyces aureofaciens s názvom kybilyzín. Peptidáza

vykazovala substrátovú špecifitu pre tyrozín, prolín a leucín.

Alkalické metalopeptidázy sú produkované Pseudomonas aeruginosa

a Serratia marcescens. Myxobacter peptidáza I  je enzým špecificky pôsobiaci na

malé aminokyseliny a je produkovaný Sorrangium, Arthrobacte crystallopoites a

ďalšími Gram pozitívnymi baktériami. Myxobacter peptidáza II má vysokú

špecifitu pre peptidové väzby, ktorých sa zúčastňuje aminokyselina lyzín (Kalitz, 1998).

1.2.1.2. Príprava proteolytických enzýmov

Proteolytické enzýmy sa spravidla pripravujú submerznou kultiváciou

produkčného kmeňa rodu Bacillus (Bacillus subtilis alebo Bacillus licheniformis).

Enzýmový preparát sa z kultivačného prostredia získava centrifugáciou alebo filtráciou,

po separácii bakteriálnych buniek od média, s následným zrážaním anorganickými

soľami alebo organickými rozpúšťadlami. Získaný percipitát sa ďalej purifikuje

chromatografickými metódami, ako gélová filtrácia, ionomeničová a afinitná

chromatografia (Szabová, 2006).

1.3. Bielkovinové hydrolyzáty, charakteristika, význam , využitie

1. 3. 1 Charakteristika enzymatických hydrolyzátov

1.3.1. 1 Bielkovinové suroviny využívané na prípravu hydrolyzátov

Bielkovinové hydrolyzáty sú zmesi oligopeptidov, polypeptidov a voľných

aminokyselín. Enzymatickou hydrolýzou sa získa z pôvodnej bielkoviny zmes

28

štiepnych produktov od vysokomolekulových peptidov, cez nízkomolekulové peptidy

až po aminokyseliny.

Enzymatická modifikácia bielkovín je efektívna metóda, ako zlepšiť rôzne

funkčné vlastnosti bielkovín a rozšíriť možnosti aplikácie bielkovín použitím správneho

enzýmu, podmienok hydrolýzy a stupňa hydrolýzy, ktoré sú rozhodujúce Hydrolýza

potravinových bielkovín je široko využívaná pre pridanú hodnotu ako: zlepšenie

nutričných znakov, brzdenie zhoršenia kvality, zlepšenie funkčných vlastností

a odstránenie toxických alebo inhibičných zložiek (Clemente, 2000) pre zlepšenie

funkčných vlastností bielkoviny.

Enzymatická hydrolýza sa aplikuje tak na suroviny zo živočíšnych zdrojov, ako

aj rastlinných. Zo živočíšnych surovín sa najčastejšie využívajú mliečne bielkoviny,

mäsové bielkoviny: jatočná krv, kolagén, želatína, vaječný albumín. Mnoho autorov sa

venuje aj hydrolýze bielkovín rýb. Z rastlinných zdrojov sa využívajú strukoviny

(fazuľa, šošovica, vika, hrach, bôb, lupina, cícer), olejniny (repka, slnečnica, sezam) aj

obilniny. Zo strukovín je však využívanejším substrátom sója (Molina – Wagner, 2002;

Surówka et al., 2004; Zhong et al., 2007; Ryan et al., 2008). Z obilnín sa využívajú

bielkoviny ryže, kukurice, jačmeňa a pšeničný lepok, ktorý patrí zasa medzi najčastešiu

surovinu spomedzi obilnín.Veľký význam začínajú v súčasnosti nadobúdať aj

hydrolyzáty menej známych obilnín a pseudoobilnín ako napríklad ovos, láskavec,

pohánka a proso, ktoré sú dobrou alternatívou pre ľudí trpiacich intoleranciou na

pšeničný lepok.

Hydrolýzou bielkovín sa získavajú produkty, ktoré kvalitatívne zlepšujú

vlastnosti potravín a umožňujú prípravu hypoalergénnych a diétnych potravín (Lahl -

Braun, 1994; Vandenplas, 1995; Perrot et al., 1999; Yeboah, et al.,1999; Clemente,

2000). Klasickým spôsobom je kyslá hydrolýza za použitia anorganických kyselín.

Podstatne šetrnejším a menej agresívnym spôsobom je však enzymatická hydrolýza.

Umožňuje cielené pôsobenie, širšie využitie bielkovín a modifikáciu ich funkčných

vlastností (Javorský et al., 1987; Klomklao et al., 2006).

1. 3. 1. 2 Faktory ovplyvňujúce hydrolýzu, metódy zisťovania stupňa hydrolýzy

Pri reakciách enzýmovej hydrolýzy musíme brať do úvahy špecifitu enzýmu a

nasledovné faktory, ktoré ovplyvňujú celý proces:

29

koncentráciu substrátu a pomer enzýmu k substrátu;

rôznorodosť reakčných komponentov, t.j. peptidové fragmenty sú tak

produkty, ako aj reaktanty nasledujúcej reakcie;

rozmanitosť reakcíí, t.j. množstvo peptidových väzieb je narušených

paralelne aj v sekvenciách súčasne;

komplexnosť reakčnej skupiny t.j. existencia substrátovej inhibície,

produktovej diverzity a enzýmovej inaktivácie počas hydrolýzy;

početné exogénne vplyvy vrátane pH, teploty, iónovej sily a iné (Whei -

Zhimin, 2006).

Konečné zloženie hydrolyzátu závisí od odpoužitia konkrétneho enzýmu a od

stupňa naštiepenia bielkoviny (Krkošková - Šimková, 1998). Stupeň hydrolýzy (Degree

of Hydrolysis, DH) nám udáva, koľko z existujúcich peptidových väzieb bolo

hydrolýzou prerušených. Z technologického hľadiska je dôležité poznať mieru

hydrolýzy, resp. hydrolyzovateľnosti, pretože hydrolyzáty bielkovín majú odlišné

vlastnosti ako pôvodná bielkovina, prípadne je potrebné sledovať priebeh hydrolýzy

počas technologického procesu pri výrobe potravín.

Stupeň hydrolýzy možno stanoviť viacerými postupmi, najčastejšie využívané sú

však metódy OPA, TNBS, pH stat a formolová titrácia. OPA a TNBS sú metódy

založené na reakciách primárnych aminoskupín, ktorých množstvo stúpa so zvyšujúcim

sa stupňom hydrolýzy. Pri OPA metóde je činidlom o-ftalaldehyd a pri TNBS kyselina

2,4,6-trinitrobenzénsulfónová.

Metóda pH-stat je založená na monitorovaní pH a udržiavaní konštantnej

hodnoty pH pomocou acidobázickej titrácie. Množstvo prerušených peptidových väzieb

je úmerné množstvu spotrebovanej kyseliny resp. zásady počas enzymatickej reakcie.

Výhodou pH statu oproti metódam OPA a TNBS je, že túto metódu je možné použiť

počas hydrolýzy (Kuipers, 2007).

Formolova titrácia je založená na poznatku, že pri štiepení peptidových vätieb

dochádza k uvoľneniu karboxylových skupín aj aminoskupín. Naviazaním

formaldehydu na aminoskupiny sa umožní titrácia karboxylových skupín na vhodný

indikátor. Keďže výsledky jednotlivých metód nie sú zhodné, je potrebné pre

stanovenie stupňa hydrolýzy kombinovať minimálne dve metódy

30

Pre ukončenie reakcie je potrebné enzým inaktivovať. To sa môže uskutočniť

zmenou pH, zahriatím hydrolyzátu na takú teplotu, pri ktorej dôjde k denaturácii

enzýmu, alebo prídavkom enzýmového inhibítora (Kuipers, 2007).

V závislosti od molekulovej hmotnosti vzniknutých peptidov sa účinkom

proteolytických enzýmov predovšetkým zlepšuje rozpustnosť ako aj emulgačná

schopnosť bielkovín.

Klasifikácia hydrolyzátov podľa Pedrocheho

Pedroche et. al. (2003) zaradil hydrolyzáty produkované pre potravinársky

priemysel do troch skupín, v závislosti sa od dosiahnutého stupňa hydrolýzy

nasledovne:

1. Hydrolyzáty s nízkym stupňom hydrolýzy (nižším ako 10 %), ktoré sa

využívajú na zlepšenie funkčných vlastností potravín ako rozpustnosť,

penivosť, emulgačná schopnosť, absorpcia vody a tuku; využívajú sa pri

výrobe chleba, pekárenských výrobkov, zmrzliny, majonézy, mäsových

derivátov;

2. Hydrolyzáty s premenlivým stupňom hydrolýzy, obyčajne vyšším, ktoré sa

využívajú pre zlepšenie chuti. Sem patria aj hydrolyzáty lepku NFE-PN,

resp. NFE-S , ktoré sa využívajú ako arómotvorné zložky potravín. Tieto

hydrolyzáty sa používajú do polievok, mäsových vývarov, omáčiek,

predvarených jedál a mäsových produktov. Všeobecne známe sú napríklad

rastlinné hydrolyzáty (sójová omáčka), ktoré dodávajú do jedál chuť umami.

Posledné štúdie japonských a idonézskych sójových omáčiek vykázali, že

táto chuť je daná komponentami s nižšou molekulovou hmotnosťou ako 500

Da (Lioe et al., 2010);

3. Hydrolyzáty sa vysokým stupňom hydrolýzy, nazývané tiež ako extenzívne

hydrolyzáty (stupeň hydrolýzy vyšší ako 10 %), ktoré sa využívajú

v nutričných doplnkoch a v lekárskych diétach (hypoalergénne mlieka a

pod.). Zahŕňajú aj hydrolyzáty, ktorých cieľom je využiť alebo zlepšiť

nutričné vlastnosti bielkovín z ktorých boli vyrobené.

1.3.1.3 Využitie bielkovinových hydrolyzátov vo výžive človeka

31

Bielkovinové hydrolyzáty majú vo výžive ľudí široké využitie jednak ako

fortifikanty do energetických nápojov, geriatrických výrobkov, výživy športovcov a diét

na reguláciu hmotnosti a jednak na klinické použitie (Tab.1. 4). Ich hlavnými

výhodami sú vysoká rozpustnosť a ich optimálna absorpcia v črevách človeka.

Z dôvodu ľahšej absorpcie pre niektoré špecifické aplikácie vo výžive (výživa

podvyživených detí, choroby tráviaceho traktu dospelých) je potrebné aby potrava

obsahovala zmes malých peptidov a nie zmes voľných aminokyselín. Absorpcia

peptidov s krátkym reťazcom (di- a tripeptidov) sa považuje za účinnejšiu metódu

absorpcie aminokyselín v porovnaní s ekvivalentným množstvom voľných

aminokyselín. Nízkomolekulové peptidy sú tiež menej hypertonické ako

aminokyseliny, čo umožňuje dobrú absorpciu iných dietetických zložiek a eliminuje

osmotické problémy (Clemente et al., 1999).

32

Tab.1. 4 Možnosti využitie hydrolyzátov v o výžive človeka

Možnosti využitia hydrolyzátov vo výžive

Fotifikácia potravín hydrolyzátmi bielkovín

energetické nápoje

geriatrické výrobky

výživa športovcov

diéty na reguláciu hmotnosti

Klinické použitie

fenylketonúria (PKU)

tyrozinémia

hypoalergénna kojenecká výživa

akútne a chronické ochorenie pečene

syndróm krátkeho čreva

pankreatitída

vredový zápal hrubého črevazdroj:http://www.agroporadenstvi.cz/poradenstvi/ustavy/uzpi/aktuality/PAvyz05_01.pdf upravené

Z hľadiska prípravy výživovo hodnotnej potravy, diétnej alebo hypoalergénnej

potravy, má veľký význam príprava hydrolyzátov rastlinných bielkovín. Takéto

produkty majú široké použitie ako náhrada bielkovín živočíšneho pôvodu, pričom

surovinová základňa pre ich prípravu je vhodnejšia, prístupnejšia a aj menej

ekonomicky náročná ako je u živočíšnych zdrojov. Presnou, cielenou enzymatickou

hydrolýzou sa získa z  rastlinných bielkovín zmes štiepnych produktov od

vysokomolekulových peptidov, cez nízkomolekulové peptidy až po aminokyseliny.

Konečné zloženie hydrolyzátu závisí od použitia konkrétneho enzýmu a od stupňa

naštiepenia bielkoviny (Krkošková - Šimková, 1998). Enzymatickou hydrolýzou

surovín pre hypoalergénne potraviny sa zaoberali Barca et al. (2000). Pôsobením zmesi

pankreatických enzýmov na sójový šrot získali peptidy a aminokyseliny s veľmi nízkou

relatívnou molekulovou hmotnosťou (menšou ako 10 kDa), ktoré sú vynikajúco

rozpustné vo vodných roztokoch a stratili schopnosť pôsobiť ako alergén.

Zaujímavé sú práce niektorých autorov (Hong-Li et al, 2005; Gibs et al., 2003;

Tovar-Pérez et al., 2009), ktorí uvádzajú, že niektoré bielkovinové hydrolyzáty sóje,

33

fazule, láskavca, kazeínu (Contreras et al., 2009), môžu byť dobrými zdrojmi

bioaktívnych peptidov. Gibs et al. (2003) podrobili defosforylovaný a deglykolizovaný

sójový hydrolyzát pôsobeniu rôznych endopeptidáz (pronáza, trypsín, Glu C proteáza)

a purifikovali peptidy, ktoré vykazovali širokú škálu biologických aktivít (ACE

inhibítory, povrchovo aktívne a antitrombotické peptidy a peptidy s  antioxidačnými

vlastnosťami). Tovar-Pérez et al. (2009) získali ACE inhibítory z albumínovej

a globulínovej frakcie bielkovín láskavca. Najvyššiu ACE – inhibítorovú aktivitu (až 40

% inhibíciu) dokázali v peptidoch pripravených po 18 a 15-hodinovej hydrolýze

albumínov a globulínov alkalázou.

Hydrolýza hrachových bielkovín má pomerne veľký komerčný význam, pretože

umožňuje lepšie trávenie a súčasne odstraňuje natívne inhibítory tráviacich enzýmov,

ktoré sú bielkovinovej povahy. Napr. Perrot et al. (1999) hydrolyzovali hrachové

bielkoviny legumín a vicilín peptidázami pepsín a trypsín. Zistili, že legumín je

rezistentný voči pôsobeniu peptidáz.

Majoritnými alergénmi hrachu sú vicilicín (Pis s 1) a convicilicín (Pis s 2). Tieto

bielkoviny sú rezistentné proti tráviacim enzýmom (Fréres, 2008). Szymkiewicz-

Jędrychowski (2005) vystavili enzýmovej hydrolýze globulíny hrachu s cieľom znížiť

imunoreaktivitu globulínov. Enzýmy Alkaláza, pepsín a trypsín, pôsobili pri teplotách

37 °C a 50 °C po dobu 180 minút. Najvyšší stupeň hydrolýzy zaznamenali pri použití

Alkalázy (DH 25 % pri teplote 50°C). Najvyššiu redukciu imunoreaktívnych peptidov

legumínu a vicilínu zaznamenali pri hydrolýze trypsínom (DH 12 %), pričom

imunoreaktivita vicilínu sa znížila v menšej miere ako imunoreaktivita legumínu.

Častým alergénom sú aj legumíny šošovice. Cabanillas et al. (2010) sa zaoberali

hydrolýzou proteínov šošovice endopeptidázou (Alkaláza) a exopeptidázou

(Flavourzyme) za účelom redukcie imunoreaktívnych peptidov. Hodnotenie

imunoreaktivity hydrolyzátov bolo založené na detekcii IgE pomocou Elisa testu

použitím sér pacientov s dokumentovanou alergiou na legumíny. Napriek tomu, že pri

in vitro experimentoch zaznamenali značnú deštrukciu IgE epitopov, v sérach pacientov

boli detekované alergické proteíny.

Legumíny bôbu, hrachu a šošovice hydrolyzovali aj Sormus et al. (2009).

Majoritné zásobné globulíny (11 S globulíny) boli hydrolyzované pepsínom

a trypsínom po dobu 1, 5, 15, a 30 minút. Elektorforetická analýza hydrolyzátu

natívnych globulínov pomocou preukázala, že hydrolýzou danými enzýmami vzniklo

34

veľké množstvo krátkych peptidov a voľných aminokyselín, čo v konečnom dôsledku

viedlo k nižšej imunoreaktivite antigénu.

Výroba hypoalergénnych mliek je ďalšou oblasťou uplatnenia sa bielkovinových

hydrolyzátov. Úloha  hypoalergénnych mliek spočíva v znížení alergicity  všetkých

zložiek mliečnej bielkoviny. To sa dosiahne štiepením bielkovín kravského mlieka

použitím tepelnej a enzýmovej hydrolýzy. Mliečne prípravky s hydrolyzovanou

bielkovinou sa vyrábajú v dvoch formách - formule s nízkym stupňom hydrolýzy

(čiastočné hydrolyzáty, označované aj ako H.A.) – určené na prevenciu alergie a

formule s vysokým stupňom hydrolýzy (vysoké hydrolyzáty) – určené na liečbu alergie

na bielkovinu kravského mlieka (Košťálová et al., 2005). Extenzívne (vysoké)

hydrolyzované formule obsahujú peptidy s molekulovou hmotnosťou menej ako 1500

Da, zatiaľ čo parciálne hydrolyzované formule obsahujú zložky s molekulovou

hmotnosťou 3000-10000 Da. Mliečne hydrolyzáty môžu byť so 100 % obsahom

srvátkového proteínu, srvátka: kazeín v pomere 60 : 40, alebo s obsahom 100 %

kazeínu (Pedrosa et al., 2006). Ďalej sú dostupné antialergénne formule zo sójového

proteínu. Wróblewska et al. (2005) hydrolyzovali kazeínový izolát systémom

dvojkrokovej hydrolýzy bakteriálnymi peptidázami Subtilizín Carlsberg a Alcalase

2.4 FG (Novo Nordisk), pronase z Streptomyces griseus a papain (Sigma). Pre

hydrolýzu produktov využili chromatografické, elektrofoterické a imunochemické

metódy. Zistili, že napriek značnému úbytku imunoreaktívnych frakcií kazeínu,

vykazoval hydrolyzát prítomnosť alergénnych epitopov.

Pšeničný glutén ako alergén

Intentívne bádanou oblasťou je hydrolýza pšeničného gluténu, ako alergénu

spôsobujúceho celiakiu (celiakálna sprue, maloabsorpčný syndróm). Na odštartovanie

celiakálneho ochorenia vplývajú viaceré vlastnosti zásobných bielkovín zrna obilnín

(exogénne príčiny), ale aj endogénne príčiny dané receptivitou organizmu na príjem

lepkových bielkovín. Medzi exogénne príčiny treba zaradiť najmä faktor množstva a

faktor primárnej a sekundárnej štruktúry prolamínových determinant (Michalík -

Urminská, 2006). Z celkového obsahu bielkovín v celozrnom obilnom šrote tvorí 60 až

70 % frakcia ťažko rozpustných zásobných bielkovín. Práve tieto ťažko rozpustné

frakcie lepku a predovšetkým prolamíny s nízkou molekulovou hmotnosťou okolo 30

kDa sú zodpovedné za vznik celiakie (Szabová et al., 2003). Hydrolyzovať túto frakciu

je nesmierne náročné, čo potvrdzujú práce viacerých autorov.

35

T-bunky pacientov s celiakiou rozpoznávajú tri aminokyselinové sekvencie,

resp. peptidy, ktoré sú súčasťou α-gliadínových bielkovín a sú v nich intenzívne

zastúpené aminokyseliny prolín a glutamín: PEPQPQLPY, PQPQPLPYPQ

a PYPQPQLPY (Socha et al., 2010). V snahe hydrolyzovať práve tieto sekvencie

aminokyselín v gliadínoch zistili Shan et al. (2002), že trávením α-gliadínu

žalúdočnými a pankreatickými enzýmami in vitro sa produkuje vysokostabilný 33-

mérny peptid, ktorý obsahuje všetky tri T-bunkové epitopy.

De Angelis et al. (2009) hydrolyzovali glutén rôznych kultivarov Triticum

turgidum L. var. durum mikrobiálnymi peptidázami po dobu 72 hodín pri 37 °C.

Zistili, že na úplnú detoxikáciu 33-mérneho peptidu boli potrebné tri peptidázy

(aminopeptidázy typu X-prolyl- dipeptidylaminopeptidázy endopeptidáza) a na totálnu

hydrolýzu 33-mérneho peptidu na voľné aminokyseliny bola potrebná kombinácia

aspoň 6 rôznych peptidáz.

1. 3.1. 4 Bielkovinové hydrolyzáty pre zlepšenie funkčných vlastností bielkovín v

potravinách

Súčasné potravinárske technológie kladú vysoké požiadavky na bielkoviny, ako

funkčné komponenty potravín. S rozvojom nových technológií a produktov, musia

bielkoviny spĺňať nielen nutričné atribúty, ale aj náročné technologické požiadavky

moderného potravinárskeho priemyslu. Enzýmová hydrolýza je jednou z možností, ako

tieto požiadavky naplniť.

Produkty enzýmovej hydrolýzy sa vyznačujú lepšími fyzikálno - chemickými

vlastnosťami, predovšetkým zlepšenou rozpustnosťou a emulgačnou schopnosťou.

Okrem rastlinných hydrolyzátov má pre potravinárstvo veľký význam aj využitie

živočíšnych bielkovín a produktov ich hydrolýzy. Ako substráty sa využívajú

predovšetkým bielkoviny srvátky alebo čistý kazeín (Lu et al., 1996; Pintado et al.,

1999; Morato et al., 2000; Kumar et al., 2001; Cornelly van der Ven et al., 2002;

Gauthier – Pouliot, 2003).

Konrad et al. (2004) hydrolyzovali srvátkový koncentrát za účelom zlepšenia

penotvorných a emulgačných vlastností mliečnych výrobkov. Na hydrolýzu použili

pepsín, ktorý však neštiepil hlavnú bielkovinu srvátky – β-laktoglobulín.

Najrozšírenejšími hydrolyzátmi rastlinného pôvodu sú sójové hydrolyzáty.

Sójové bôby sú zdrojom proteínov rastlinného pôvodu, ktoré sú svojou kvalitou

36

porovnateľné s proteínmi živočíšneho pôvodu (Hrčková et al., 2001). Hydrolytickou

úpravou sójovej múky, alebo izolovaných proteínov, peptidázami sa produkujú proteíny

s modifikovanými funkčnými vlastnosťami, ako je vyššia rozpustnosť, stabilita peny

a emulgačná kapacita. Získané produkty nespôsobujú pri aplikácii problémy so

želatínovaním, zákalom a cudzou arómou (James - Simpson, 1996; Lukáčová -

Zemanovič, 1998; Hrčková et al., 2001; Hrčková - Šturdík et al., 2002). Problémom

enzymatickej hydrolýzy je však vznik horkých peptidov, kde intenzita horkosti

hydrolyzátu závisí od stupňa hydrolýzy (Lukáčová - Zemanovič, 1998; Hrčková -

Šturdík et al., 2002). Horké peptidy, prítomné v hydrolyzátoch, sú obyčajne tvorené 3 -

15 aminokyselinami hydrofóbneho charakteru. Skoro všetky peptidy, ktoré obsahujú

aminokyseliny ako leucín, izoleucín, tyrozín, prolín, valín, fenylalanín a tryptofán sú

horké a intenzita horkej chuti je úmerná počtu hydrofóbnych aminokyselín a dĺžke

peptidu. Na odstránenie horkej chuti proteínových hydrolyzátov, teda ďalšiu čiastočnú

hydrolýzu vzniknutých peptidov, sú komerčne dostupné preparáty aminopeptidáz

a karboxypeptidáz, ktoré postupným pôsobením od koncov peptidov skrátia chuťovo

horký produkt na zlúčeninu s toleranovanou chuťou (Hrčková et al., 2002). Kombinácia

endopeptidáz v primárnej hydrolýze a aminopeptidáz v sekundárnej hydrolýze

zabezpečí hydrolytický produkt s redukovanou horkosťou (Rao et al., 1998).

Witczak et al. (2005) sledovali reologické vlastnosti sójového hydrolyzátu,

ktorý pripravili zo sójovej múky s obsahom bielkovín 50,6 % pomocou enzýmov

Neutráza a Protamex produkovaných Bacillus (Novo Nordisk). Hydrolýza prebiehala

pri teplote 50 °C, pH 6,8 60 minút, pričom na 1g proteínu bolo pridaných 13 g vody.

Reologické vlastnosti hydrolyzátov sa stanovovali rotačným reometrom pri stálej

teplote 25 °C. Zistli, že zdanlivá viskozita suspenzie hyrolyzátu získaného pomocou

Neutrázy bola nižšia ako hydrolyzátu získaného pomocou Protamexu. Analýzou

suspenzie sa ukázalo, že štruktúra hydrolyzátu produkovaného Neutrázou nie je

homogénna, na rozdiel od suspenzie Protamexového hydrolyzátu, ktorá vykazovala

homogénnu a kompaktnú štruktúru. Z uvedeného vyplýva, že použitím vhodného

enzýmu sa môžu ovplyvniť reologické vlastnosti hydrolyzátov s ohľadom na cieľ

využitia.

Lamsala et al. (2006) sledovali rozpustnosť sójového hydrolyzátu pripraveného

peptidázou bromelaín, do stupňa hydrolýzy 2 % a 4 %. Zistili, že hydrolyzát vykazuje

vyššiu rozpustnosť vo vode pri pH od 3 do 7 oproti pôvodnému sójovému proteínu.

37

Hydrolyzáty si zachovali želatinačnú schopnosť. Analýza textúry sójového gélu

preukázala, že tvrdosť gélu sójového proteínu je po hydrolýze menšia.

Zaujímavé výsledky dosiahli Zhang et al. (2009) pri analýze antioxidačnej

aktivity sójových hydrolyzátov. Sójový hydrolyát vyrobili použitím troch komerčne

dostupných peptidáz: neutrálnej peptidázy z Bacillus subtilis (NP), validázy z

Aspergillus oryze (VAL), a alkalickej peptidázy z Bacillus licheniformis (AP). Výsledné

hydrolyzáty frakcionovali a zistili, že všetkých 12 frakcií vykazuje vysokú kapacitu

odstraňovania voľných radikálov. Tri frakcie s najvyššou antioxidačnou aktivitou, NP-

F1, Val-F1, a AP-F3, boli inkorportované do pomletého hovädzieho mäsa. Po 15. dňoch

skladovania stanovili, že frakcia Val-F1 nepreukázala signifikantný výsledok, ale

frakcia AP-F3 redukovala oxidáciu lipidov mletého mäsa o 20,1 % a frakcia NP- F1

o 12,9 %.

Zhao - Hou (2009) porovnávali 8 proteínových hydrolyzátov: 4 vyrobené zo sójového

proteínového koncentrátu (SPK) a 4 sójového izolátu (SI) limitovanou hydrolýzou

trypsínom a neutrázou, so stupňm hydrolýzy 1 a 2 %. Analýza produktov pomocou

SDS-PAGE ukázala, že hydroláty SPK a SI vyrobené trypsínom obsahovali viac

veľkých peptidov ako hydrolyzáty vyrobené pomocou neutrázy. Trypsínové

hydrolyzáty vykazovali tiež väčšiu emulgačnú aktivitu, pričom najlepšia bola

v hydrolyzátoch so stupňom hydrolýzy 1 %. Tieto výsledky korešpondujú so závermi

Chanpu et al. (2009), ktorí tiež zistli vysokú antioxidačnú aktivitu hydrolyzátov

hordeínu jačmeňa a bielkovín ryže pripravených pôsobením pepsínu a trypsínu.

Antioxidačnú aktivitu pepsínových hydrolyzátov cícera sledovali aj Arkan –

Yemenicioglu (2009). Z výsledkov vyplýva, že produkty kontrolovanej pepsínovej

hydrolýzy možno úspešne použiť na zvýšenie vychytávania voľných radikálov

a zvýšenie obsahu rozpustných bielkovín cícera. Antioxidačná aktivita proteínov

hydrolyzovaných pepsínom bola v emulzii olej vo vode porovnateľná s

nehydrolyzovanými cícerovými bielkovínami. Avšak enzýmové ošetrenie znížilo

stabilitu emulzie a peny.

Betancur – Ancona (2009) enzymaticky štiepili proteínový izolát fazule (Phaseolus

lunatus) pri 50 °C a pH 8 enzýmami Alkaláza a Flavourzým. Alkalázou sa pri 5 a 15

minútovej reakcii dosiahol väčší stupeň hydrolýzy ako s Flavourzýme, pričom

Alkalázou pripravené hydrolyzáty mali aj väčšie zastúpenie nízkomolekulárnych

peptidov. Obidva hydrolyzáty mali vyššiu rozpustnosť ako pôvodný proteínový izolát.

38

Celkovo hydrolyzát získaný Alkalázou vykazoval lepšiu rozpustnosť, zatiaľ čo

hydrolyzát pipravený pomocou Flavourzyme vykazoval lepšiu emulgačnú kapacitu.

Význam peptidáz stúpa aj so zmenou surovinovej základne potravinárskeho

priemyslu. Napr. Hindi-Tamelikecht et al. (1997) hydrolyzovali bielkoviny cícera

bromelaínom a chymotrypsínom, pričom získali nízkomolekulové peptidy a zmes

voľných aminokyselín. Bejosano a Corke (1999) použili ako substrát bielkoviny

láskavca. Zistili, že v porovnaní so sójovými proteínmi sú bielkoviny láskavca lepšie

rozpustné, a tým aj prístupnejšie pre pôsobenie peptidáz.

Netradičným využitím peptidáz je ich účasť na izolácii veľmi čistého olivového

oleja (Vioque et al., 2000), čo má význam pri príprave emulzií typu „olej vo vode“.

Tieto zmesi obsahujú predovšetkým sójový olej a hydrolyzáty rastlinných bielkovín,

pričom ale najkvalitnejší produkt sa získa z olív, a to keď sa uskutoční len 27 %

hydrolýza (Ramkumar et al., 2000).

Radha et al. (2008) pripravili hydrolyzát so 40 % DH zo zmesi olejnín (sója,

sezam a podzemnica olejná v pomere 1,1:1,7:0,7) a porovnali fyzikálno-chemické

a funkčné vlastnosti získanej zmesi peptidov so sójovým hydrolyzátom. Rozpustnosť

produktu bola nad 90 % pri pH 2-10 a zaznamenali signifikatný nárast množstva

voľných aminokyselín pri zlepšených funkčných vlastnostiach hydrolyzátu.

Kapp - Bamforth (2002), skúmali vplyv hydrolýzy albumínových

a hordeínových frakcií jačmeňa na stabilitu peny piva, pričom skonštatovali, že

albumíny sú rezistentné na cysteínové peptidázy ficín a papaín, ale sú hydrolyzovateľné

serínovou peptidázou trypsínom, pričom však hydrolýza je spojená so stratou stability

peny. Naopak, hordeín je rezistentný k digescii trypsínom, ale podlieha hydrolýze

ficínom a papaínom a limitovaná proteolýza viedla k vylepšeniu penovej stability

hordeínu. Proteináza A hydrolyzovala albumíny aj globulíny, čo však viedlo k zníženej

stabilite peny. Tieto závery sa zhodujú so závermi Breya et al. (2003), ktorí

skonštatovali, že proteináza A podstatne vplýva na degradácii hydrofóbnych

polypeptidov zodpovedných za stabilitu peny piva. Len približne 20 % hydrofóbnych

polypeptidov a 57 % LPT 1 proteínov bolo počas hydrolýzy rezistetných voči

proteináze A. Yalcın – Celik (2007) hydrolyzovali jačmenný proteínový izolát

Alkalázou za nasledovných podmienok: pH 8, teplota 37 °C, pomer enzýmu k substrátu

1:300, do DH 3 % a 6 % (pH-stat). Analýza pomocou SDS-PAGE preukázala, že

hydroláty obsahovali podstane väčšie množstvo peptidov s molekulovou hmotnosťou

menšou ako 6500 Da v porovnaní s pôvodnou bielkovinou. Pri analýze rozpustnosti

39

zistili, že rozpustnosť hydrolyzátov v destilovanej vode a v soľnom roztoku sa líšila

v závislosti od pH. V destilovanej vode bola nyjvyššia rozpustnosť pri pH 11 a najnižšia

pri pH 6, čo je hodnota blízka izoelektrickému bodu. So znižujúcim sa pH však

rozpustnosť narastala. Rozpustnosť hydrolyzátov v soľnom roztoku sa znižovala

úmerne s narastajúcou koncentráciou soli v roztoku. Z uvedeného vyplýva, že

rozpustnosť hydrolyzátov do veľkej miery závisí od pH a iónovej sily média.

Sladové mláto, ako surovinu na získanie proteínového koncentrátu a jeho

následnú hydrolýzu,využili Celus et al. (2009). Hydrolýza prebiehala Alkalázou pri pH

9 a teplote 60 °C, po dobu 1,7 a 120 minút, pričom získali hydrolyzáty s nízkym (1 %)

a s vysokým stupňom hydrolýzy (9 %). Po separácii produktov zistili, že frakcie

s dobrými emulgačnými vlatnosťami obsahovali menej ako 40 % peptidov s 

molekulovou hmotnosťou vyššou ako 14500 da, pričom tieto frakcie mali vysokú

povrchovú hydrofóbnosť. Frakcie s dobrými penotvornými schopnosťami obsahovali

menej ako 10 % peptidov s molekulovou hmotnosťou menšou ako 1700 Da. Frakcie

s dobrými penotvornými vlastnosťami vykazovali nižšiu povrchovú hydrofóbnosť,

okrem frakcií s vyšším obsahom proteínov s molekulovou hmotnosťou presahujúcou

14500 Da. Z uvedených zistení vyvodili záver, že pre dobré emulgačné vlastnosti

hydrolyzátu sa vyžadujú iné fyzikálno-chemické vlastností peptidov a bielkovín ako

pre penotvorné schopnosti.

Pšeničný glutén je vedľajší produktom pri výrobe pšeničného škrobu a je

dostupný vo veľkom množstve a v relatívne nízkej cene (Popineau et al., 2002).

Utilizácia pšeničného gluténu v potravinárstve je obmedzená hlavne jeho nízkou

rozpustnosťou, čo je spôsobené vysokou koncentráciou nepolárnych aminokyselinových

zvyškov, ako prolín, leucín, glutamín a nízkou koncentráciou ionizovateľných

postranných reťazcov, ako lyzín, arginín, kyseliny glutámová a asparágová.

Enzymatickou modifikáciou gluténu je možné získať surovinu s vyššou rozpustnosťou,

ako aj ďalšími zlepšenými vlastnosťami, napríklad zlepšené emulgačné a penotvorné

vlastnosti. Zlepšenie rozpustnosti pri pH 3-10, penivej schopnosti gluténu dosiahli

Wang et al. (2008) pomocou hydrolýzy 8 % disperzie pšeničného gluténu papaínom

a následnou frakcionáciou membrámovou ultrafiltráciou. Michalík et al. (1994)

použitím enzýmov Trypsín, Fc (fi. ABM Chemicals), Maxatáza (fi. Gist Brocades) a

bakteriálnej proteázy pripravenej na Katedre biochémie a biotechnológie FBP,

hydrolyzovali bielkoviny zrna pšenice. Najintenzívnejšiu produkciu štiepnych látok

stanovili v prvých časových fázach reakcie, čo je v zhode aj so závermi Bystrického

40

(1991), ktorý pozoroval analogický priebeh kinetiky hydrolýzy bielkovín semien

hrachu po pôsobení trypsínu, chymotrypsínu a elastázy. Wang et al. (2007)

hydrolyzovali pšeničný glutén pomocou enzýmu ProtamexTM (Novozymes) pri pH 4,8

pri teplote 48 °C. Po inaktivácii enzýmu z proteolytického hydrolyzátu pšeničného

gluténu membrámovou ultrafiltráciou (filter s pórmi 50 kDa) separovali dve frakcie

(retentát a permeát). Cieľom bolo zistiť ich vplyv na vlastnosti pšeničnej múky pri

pečení chleba. Zistili, že prídavok hydrolyzovaného pšeničného gluténu a jeho frakcií

zlepšili viskoelastickú charakteristiku pšeničnej múky, pričom najvýraznejší vplyv na

zmenu vlastností mal prídavok retentátu. Prídavok retentátu tiež zvýšil tvrdosť kôrky

chleba. Pri chlebe vyrobenom zo pšeničnej múky s prídavkom hydrolyzovaného

pšeničného gluténu a permeátu bola kôrka mäkkšia. Na predĺženie trvanlivosti chleba

mali priaznivý efekt obidve frakcie. Kong et al. (2006) enzymaticky hydrolyzovali

glutén niekoľkými komerčne dostupnými peptidázami (Alcalase 2.4L, PTN 6.0S,

Pepsin, Pancreatin, Neutrase and Protamex™), pričom porovnávali aj hydrolytický

efekt použitých enzýmov. Alkaláza preukázala najvyšší hydrolytický efekt (DH 15,8

%) a získaný produkt mal dobrú rozpustnosť, viac ako 60 %, pri pH 2-12.

Sendrejová et al. (2007) použili frakcie pšeničných bielkovín získané

diskontinuálnou frakcionáciou podľa Michalíka et al. (2002) na hydrolýzu živočíšnymi

peptidázami trypsín a pepsín. Hydrolýza prebiehala pri teplote 50 °C, pH 2,0 alebo pH

8,0 v časových intervaloch od 5 do 120 minút. Pri stanovovaní stupňa hydrolýzy

využitím metód pH-stat a OPA zistili, že DH určené metódou pH-stat pre hydrolyzáty

albumínov a globulínov (DH 3 %) a glutenínov (DH 3,19 %) trypsínom a pre

hydrolyzáty gliadínov (DH 0,52 %), glutenínov (DH 0,76 %) pepsínom boli nižšie ako

hodnoty stanovené metódou OPA. Výnimkou sú gliadíny hydrolyzované trypsínom, kde

bolo DH pHstat 2 %. V prípade frakcie pšeničných albumínov a globulínov, bol oboma

metódami zistený približne rovnaký DH.

Na zlepšenie vlastností gluténu využili limitovanú hydrolýzu pšeničného gluténu

chymotrypsínom Agyare et al. (2009). Hydrolyzovaný pšeničný glutén bol pripravený

proteolýzou chymotrypsínom pri 37 °C po dobu 4 hodín (DH 6,4 %). Hydrolyzát bol

následne podrobený pôsobeniu transglutaminázy (MTGase) pri 55 °C 1 hod. alebo 18

hod .pri 5 °C, pričom bolo stanovené zvýšenie emulgačnej aktivity pri pH 6,5.

Paraman et al. (2007) regulovanou enzymatickou hydrolýzou upravili rozpustnosť

a emulgačné vlastnosti bielkovín ryže. Optimálny stupeň hydrolýzy pre dobrú

41

emulgačnú kapacitu ryžového proteínu stanovili na 6 -10 %. Zistili, že napriek

vysokému stupňu hydrolýzy boli proteíny nerozpustné.

Kanu et al. (2009) hydrolyzovali odtučnenú sézamovú múku peptidázami

Alcalase® a Flavourzyme, pričom vznikli produkty s rôznymi stupňami hydrolýzy (1,19

– 18,8 %). Výsledné hydrolyzáty vykazovali výrazne vyššiu penivosť a emulgačnú

schopnosť, ale nižšiu stabilitu peny. Celkovo vykazoval proteínový hydrolyzát sézamu

získaný Alkalázou lepšie funkčné vlastnosti v porovnaní s hydrolyzátom získaným

použitím Flavourzýme.

1.3. 1.5 Faktory ovplyvňujúce aplikáciu hydrolyzátov

Aby mohli byť bielkovinové hydrolyzáty využité ako zložky potravín, musia

spĺňať niekoľko vlastností:

musia byť rozpustné a/alebo rozptýliteľné pri pH potraviny, do ktorej sú

pridané (napríklad, pre použitie do proteínových nápojov musia byť

vyššie uvedené hydrolyzáty rozpustné pri kyslom pH);

 musia mať akceptovateľnú chuť;

nemali by prejavovať príliš vysokú hygroskopicitu.

Zvýšená rozpustnosť po hydrolýze je všeobecný efekt hydrolýzy. Problematické

je však dosiahnutie akceptovateľnej chute, nakoľko živočíšne aj rastlinné zdroje

bielkovín sa podieľajú na charakteristickej horkej chuti, ktorá je ťažko maskovateľná

prídavkom ochucovadiel a sladidiel (Gianna et al, 1998).

Horká chuť je spôsobená prítomnosťou peptidov s nízkou molekulovou

hmotnosťou (>10 kDa) a hydrofóbnymi aminokyselinami v koncovej pozícii peptidov

Jedným z riešení je odstránenie horkých komponentov extrakciou v rozpúšťadle –

využíva sa napríklad sekundárny butylalkohol, v extrakčnom procese však dochádza

k strate 50 - 70 % esenciálnych aminokyselín. Ani adsorpcia horkých peptidov na

matricu (fenolové živice, rastlinný adsorbent, iónomeničové živice, silioxány) nie je

metódou, pri ktorej nedochádza k strate aminokyselín. Maskovanie horkosti aditívami

(polyfosfáty, cylodextríny, kyslé oligopeptidy) má nevýhodu vo zvýšení ceny

hydrolyzátu, pričom horká chuť nemusí byť dostatočne prekrytá (Vishwas et al., 2007).

42

Progresívnejšou metódou sa javí aplikácia prolín-špecifických exo-

a endopeptidáz, s ohľadom na predpokladaný vplyv prolínových zvyškov na horkosť

hydrolyzátov. Damie et al. (2005) upravili horkosť sójových a kazeínových

hydrolyzátov aplikáciou imobilizovanej aminopeptidázy izolovanej z intestinálneho

traktu kurčiat, pričom pri senzorickej analýze zaznamenali výrazné zníženie horkosti.

Výrazný vplyv na rozvoj horkosti produktu majú aj podmienky hydrolýzy

(FitzGerald - O´Cuinn, 2006). Li et al. (2008) napr. dosiahli zlepšenie chute sójového

hydrolyzátu, keď ho vystavili kombinovanému pôsobeniu enzýmu Alkaláza 2.4L a

enzýmov z extraktu Actinomucor elegans. Pri príprave bielkovinových hydrolyzátov

hrachu odporúčajú viacerí autori, ktorí sa zaoberali prípravou bielkovinových

hydrolyzátov z hrachu pred enzymatickou hydrolýzou rastlinný substrát tepelne

upravovať tak, aby sa inaktivovalo antitryptické pôsobenie.

Ďalšou problematickou vlastnosťou hydrolyzátov je ich hydroskopicita. Určitou

alternatívou sa javí enkapsulácia hydrolyzátov s použitím sušenia rozprašovanín (spray-

drying). Favaro-Trindade et al. (2009) využili zmes želatíny a sójového izolátu ako

„nosičov“ s cieľom zamaskovať alebo redukovať horkosť kazeínového hydrolyzátu,

pričom analyzovali 6 kombinácií: 3 vzorky s 20 % hydrolyzátu a 80 % zmesi želatína -

sójový proteínový izolát s podielom 50/50, 40/60 a 60/40 %; a tri vzorky s 30 %

hydrolyzátu a 70 % amesi želatíny a sójového izolátu s podielom 50/50, 40/60 a 60/40

%. Všetky vzorky vykazovali nižšiu hygroskopicitu ako samostatný kazeínový

hydrolyzát.

V ďalšej práci Mendanha et al. (2009) enkapsulovali kazeínový hydrolyzát

komplexnou koacerváciou so sójovým proteínovým izolátom a pektínom. Následne

hodnotili morfológiu, vlhkosť, hygroskopicitu, rozpustnosť, hydrofóbnosť a povrchové

napätie vzorky. Zitili, že hydrofóbnosť sa nepriamo úmerne znižovala s obsahom

hydrolyzátu v mikrokapsuli. Enkapsulované vzorky mali podobné povrchové napätie,

ale nižšiu hygroskopicitu, ako voľné hydrolyzáty.

43

2 CIEĽ PRÁCE

Cieľom diplomovej práce bola príprava enzymatických hydrolyzátov bielkovín

pôsobením mikrobiálnych peptidáz, s cieľom získať produkty - zmes peptidov a

voľných aminokyselín s vyššou nutričnou kvalitou a lepšou stráviteľnosťou.

Pre splnenie cieľa bolo potrebné:

- charakterizovať substráty pre pôsobenie proteolytických enzýmov – peptidy

a bielkoviny,

- spracovať literárny prehľad o charakteristike, rozdelení a využívaní proteolytických

enzýmov,

- uskutočniť hydrolýzu niektorých rastlinných substrátov pôsobením mikrobiálnych

petidáz,

- porovnať účinnosť jednotlivých enzýmov stanovením stupňa hydrolýzy formolovou

titráciou.

3 MATERIÁL A METODIKA

3.1 Proteolytické enzýmy Na prípravu enzymatických bielkovinových hydrolyzátov boli použité

proteolytické enzýmy (Sigma Aldrich Chemicals):

Subtilizín Carlsberg (EC 3.4.21.62) - je bakteriálna peptidáza z Bacillus

licheniformis s aktivitou 10,5 U.mg-1,

Deuterolyzín (EC 3.4.24.39) – je fungálna peptidáza z Aspergillus oryzae s

aktivitou 1,7 U.mg-1. Enzýmové preparáty boli do reakčných zmesí pridávané

rozpustené v tlmivom roztoku optimálneho pH v koncentrácii 1 % (hm.). pH optimum

uvedených enzýmov je podľa Sendrejovej (2008) nasledovné: subtilizín Carlberg 8,0 a

Deuterolyzín 3,5.

3.2 Substráty - rastlinné bielkovinySubstrátmi pre hydrolýzu pôsobením mikrobiálnych peptidáz boli rastlinné

suroviny - pšeničný, sójový a kukuričný šrot, ktoré boli v hydrolytickej reakčnej zmesi

v koncentrácii 1 % (hm.) a 5 % (hm.).

44

3.3 Enzymatická hydrolýza bielkovín Enzymatická hydrolýza bola realizovaná v bankách (banky s okrúhlym dnom)

v objeme 10 ml tak, že k naváženým 0,1 a 0,5 g substrátu bolo pridaných 10 ml

tlmivého roztoku, ktorého pH zodpovedalo pH optimu daného enzýmu.

Použité boli roztoky: 0,1 mol.dm-1 fosforečnanový tlmivý roztok pH 8,0 a

0,1 mol.dm-3 octanový tlmivý roztok pH 3,5 (Methods in

Enzymology, 1955). Banky boli uzatvorené zátkami a umiestnené do vodného kúpeľa,

ktorý bol temperovaný na teplotu 37 oC. Reakcia sa uskutočnila za stáleho mierneho

premiešavania 0 min., 30 min., 60 min. a 120 minút. Podľa postupu pre formolovú

titráciu bola hydrolýza zastavená inaktiváciou enzýmu pridaním 5 ml formaldehydu.

3.4 Formolová titrácia aminokyselín Formolová titrácia je založená na skutočnosti, že v dôsledku amfotérneho

charakteru aminokyselín sa nemôžu pre ich stanovenie využiť bežné acidometrické a

alkalimetrické titrácie, ale ak sa zablokuje zásaditá NH2 - skupina formaldehydom za

vzniku Schiffovej bázy, uplatní sa iba kyslý charakter COOH - skupiny a potom sa

môžu aminokyseliny titrovať anorganickými zásadami (Karlubík - Kyselovič, 1990).

Postup formolovej titrácie: K 10 ml bielkovinového hydrolyzátu sa pridá 5 ml

zneutralizovaného formaldehydu a zmes sa titruje 0,1 mol.dm-3 NaOH do intenzívneho

ružového sfarbenia. Ďalej sa pridá také množstvo 0,1 mol.dm-3 H2SO4, aby zmes zostala

len veľmi slabo sfarbená do ružova. Vzorka sa titruje 0,1 mol.dm-3 NaOH do rovnakého

sfarbenia ako vzorka kontrolného pokusu. Nakoniec sa pridajú ku kontrolnej vzorke

ešte 4 kvapky 0,1 mol.dm-3 NaOH a zároveň sa do analyzovanej vzorky pridá také

množstvo 0,1 mol.dm-3 NaOH, aby sa dosiahlo rovnako intenzívne sfarbenie ako v

kontrolnej vzorke. Sfarbenie je dôsledkom acidobázickej zmeny indikátora fenolftaleín,

ktorý sa pridáva do neutralizovaného roztoku formaldehydu (Karlubík - Kyselovič,

1990). Pri titrácii hydrolyzátu (zmesi aminokyselín) sa vyjadruje výsledok v mg

aminodusíka, pričom platí, že 1ml 0,1 mol.dm-3 NaOH zodpovedá 1,4 mg N.

45

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA

Diplomová práca je zameraná na využitie mikrobiálnych peptidáz, a preto boli do

hydrolytických zmesí aplikované dva enzýmy – bakteriálna peptidáza Subtlizín

Carlsberg a fungálna peptidáza Deuterolyzín. Guan et al. (2007) uvádzajú, že stupeň

hydrolýzy je vo veľkej miere ovplyvnený podmienkami, ktoré limitujú rozpustnosť

substrátov – aplikované enzýmy sa výrazne líšia svojím pH optimom, preto sme

predpokladali, že získame rozdielne hydrolyzované produkty.

Subtilizíny sú extracelulárne produkované serínové endopeptidázy, ktoré sa

vyznačujú pomerne dobrou termostabilitou (do 60 oC). Pomenovanie týchto enzýmov

vychádza z prvého produkčného mikroorganizmu, ktorým bola baktéria Bacillus

subtilis, ale v súčasnosti sa získavajú z viacerých druhov a kmeňov baktérií rodu

Bacillus (Štosová et al., 2005). Konkrétne Subtilizín Carlsberg je produkovaný

vysokoprodukčným kmeňom Bacillus licheniformis (Novo Nordisk, Sumantha et al.,

2006). Substrátová špecifita subtilizínov je pre aromatické a hydrofóbne zvyšky

aminokyselín (tyrozín, fenylalanín a leucín) (Gupta et al., 2002; Beg - Gupta, 2003).

Fungálne peptidázy z Aspergillus oryzae sú substrátovo špecifické pre

hydrofóbne aminokyseliny (Sumantha et al., 2006). V potravinárskom priemysle sa

používajú pri úprave vlastností múky, mäsa, na odstraňovanie horkej chuti hydrolyzátov

(Kanekanian et al., 2000; Saha - Hayashi, 2001; Hrčková et al., 2004).

Substrátmi pre enzymatickú hydrolýzu boli šroty rastlinných materiálov: zrna

pšenice, kukurice a sóje. Sóju sme použili ako neupravený substrát, teda nebola

odtučnená, ani tepelne upravená. Hydrolytická zmes obsahovala 1 % alebo 5 %

pšeničný, kukuričný a sójový šrot, ku ktorým boli v roztoku optimálneho pH pridané

enzýmy Subtilizín Carlsberg alebo Deuterolyzín. Hydrolýza sa realizovala pri teplote

37 oC v časových intervaloch 0, 30, 60 a 120 minút. To znamená, že pre každú

koncentráciu každého substrátu boli pripravené 4 reakčné zmesi s každým enzýmom.

Čas hydrolýzy 0 minút zodpovedá množstvu voľných aminokyselín, ktoré sa

nachádzajú prirodzene v substráte a do prostredia sa uvoľnia rozpustením v použitom

tlmivom roztoku. Zistili sme (Tab. 4. 1), že najviac voľných aminokyselín obsahoval

sójový šrot – 1,4 mg (spotreba NaOH pri titrácii bola 1 ml).

46

Tab. 4. 1 Enzymatická hydrolýza rastlinných substrátov peptidázou Subtilizín

Carlsberg.

Čas hydrolýzy, min Pšeničný šrot Kukuričný šrot Sójový šrot

1 % 5 % 1 % 5 % 1 % 5 % mg N

0 0,42 0,42 0,70 0,84 1,4 1,430 2,52 2,94 1,40 1,40 2,52 3,2260 3,50 3,64 3,92 5,46 4,62 9,24120 5,46 6,30 5,60 7,56 7,14 12,74

Hydrolytickú aktivitu mikrobiálnych enzýmov sme stanovili pomocou formolovej

titrácie, pri ktorej sa množstvo uvoľnených aminokyselín stanovuje titračne ako počet

mg aminodusíka.

Pôsobením peptidázy Subtilizín Carlsberg (Tab. 4. 1) bolo najviac aminokyselín

stanovených v produkte po hydrolýze sójového šrotu, a to 12,74 mg v reakcii s 5 %

substrátom. Pri aplikácii 1 % substrátu sme získali iba 7,14 mg N. Najvýraznejšia

aktivita enzýmu bola v čase medzi 30 a 60 minútou pôsobenia (nárast produktov

o 65,15 %), zatiaľ čo predĺžením pôsobenia enzýmu o ďalších 60 minút sme získali iba

o 27,47 % viac voľných aminokyselín. Sója obsahuje vysoké koncentrácie

peptidázových inhibítorov (trypsín inhibítora, Korének et al., 2003), a preto sa odporúča

takéto substráty pred enzymatickou hydrolýzou termicky upravovať. Predpokladáme,

že sa tým výrazne zvýši množstvo uvoľnených aminokyselín v produkte.

Napriek prítomnosti inhibičných látok sú strukoviny považované za veľmi

kvalitný zdroj surovín – bielkovín pre enzymatickú hydrolýzu, pretože tieto bielkoviny

sú najmä albumíny a globulíny, čo sú proteíny dobre rozpustné vo vodných roztokoch

solí a obsahujúce aj aminokyseliny esenciálne pre humánnu výživu. Bielkoviny

strukovím sú preto častým predmetom záujmu v oblasti prípravy peptidov

a aminokyselín. Napr. Krkošková et al. (1997) získali enzýmovou hydrolýzou

pôsobením Neutrázy na hrachové bielkoviny až 10,32 % - 15,12 % hydrolýzu. Karamać

et al. (2002) aplikovali na bielkoviny hrachu enzým trypsín a dosiahli stupeň hydrolýzy

10,4 % - 13,2 % pri teplote 50 °C. Vynikajúce výsledky získali Hrčková et al. (2001),

ktorí pôsobením enzýmu Flavourzyme na sójové bielkoviny pripravili produkt so

stupňom hydrolýzy až 39,5 %.

47

Hydrolýzou kukuričného šrotu sme získali 5,60 mg, rep. 7,56 mg N. Čo sa týka

množstva aminokyselín, je 5 % šrot vhodnejším substrátom, ale s pohľadu efektívnejšej

(a ekonomickejšej) prípravy hydrolyzovaných peptidov nie je rozdiel medzi 1 % a 5 %

substrátom významný. Päť-násobne vyššie množstvo substrátu malo za následok iba

1,35-násobné zvýšenia koncentrácie produktov.

Najmenej vhodným substrátom je pšeničný šrot. V reakčnej zmesi, ktorá obsahovala 1

% substrát sme po 60 minútach hydrolýzy získali iba 3,50 mg N, a v zmesi ktorá

obsahovala 5 % substrát 3,64 mg N. Najintenzívnejšie prebiehala hydrolýza v intervale

medzi 60 a 120 minútou pôsobenia, kedy sme v 5 % substráte stanovili nárast produktov

o 42,22 %.

Deuterolyzín je kyslá fungálna endopeptidáza. Zistili sme, že pôsobením tohto

enzýmu sa uvoľňuje výrazne menej aminokyselín z použitých rastlinných substrátov

ako pôsobením slabo alkalickej peptidázy Subtilizín Carlsberg (Tab. 4.2).

Tab. 4. 2 Enzymatická hydrolýza rastlinných substrátov peptidázou Deuterolyzín.

Čas hydrolýzy, min Pšeničný šrot Kukuričný šrot Sójový šrot

1 % 5 % 1 % 5 % 1 % 5 % mg N

0 0,28 0,28 0,42 0,56 0,70 0,7030 0,70 0,98 0,84 1,26 1,40 1,4060 1,40 1,54 1,26 1,82 2,94 4,06120 1,54 1,68 2,10 2,66 5,04 6,58

Najvyššie koncentrácie voľných aminokyselín sme získali z reakčnej zmesi, ktorá

obsahovala 5 % sójový šrot po čase hydrolýzy 120 minút. Enzým bol najviac aktívny

v čase medzi 30. a 60. minútou pôsobenia, predĺžením hydrolýzy o ďalších 60 minút

sme nezistili výraznejší nárast v množstve produktov.

Na základe záskaných výsledkov môžeme konštatovať, že lepšou hydrolytickou

účinnosťou vo vzťahu k rastlinným substrátom sa vyznačuje bakteriálna alkalická

peptidáza Subtilizín Carlsberg ako fungálna kyslá peptidáza Deuterolyzín. Napriek

tomu, že ani jeden substrát nebol pred enzymatickou hydrolýzou upravovaný, zistili

sme, že najvhodnejším je sójový šrot, potom kukuričný šrot a najmenej vhodným

substrátom pre enzymatickú hydrolýzu je pšeničný šrot.

48

Obidva aplikované enzýmy boli najviac aktívne čase od 30 do 60 minúty

pôsobenia pri teplot 37 oC. Výsledky súhlasia so závermi Krkoškovej – Macovej

(2006), ktoré peptidázu z Aspergillus oryzae použili na hydrolýzu pšeničných bielkovín

a Guan et al. (2007), ktorí aplikovali trypsín na hydrolýzu bielkovín ovsa. Spomalenie

hydrolytickej reakcie hydrolýzy môže byť spôsobené „vyčerpaním“ prístupných

peptidových väzieb v substráte (Zemanovič et al., 1991 a, b).

5 Závery

Výsledky diplomovej práce prehlbujú poznatky o využívaní peptidáz na úpravu

vlastností bielkovín, ako súčastí, alebo samostatných surovín pre prípravu potravín. Na

základe získaných výsledkov ke možné:

podrobnejšie charakterizovať proteolytické enzýmy Subtilizín Carlsberg a

Deuterolyzín vo vzťahu k ich hydrolytickej účinnosti,

určiť bielkovinové substráty vhodné na prípravu enzymatických hydrolyzátov

pôsobením enzýmov Subtilizín Carlsberg a Deuterolyzín,

pripraviť bielkovinové hydrolyzáty s predpkladanými lepšími fyzikálno-chemickými a

nutričnými vlastnosťami,

Subtilizín Carlsberg sa vyznačuje vyššou hydrolytickou účinnosťou ako

Deuterolyzín,

vhodným substrátom je sójový šrot, najmenej vhodným je pšeničný šrot, pričom

vyššie koncentrácie aminokyselín (stanovených ako mg N) boli v produktoch s 5 %

koncentráciou substrátov,

optimálnym časom hydrolýzy je interval 30 – 60 minút.

49

6 Zoznam použitej literatúry

1 AGYARE, K. K. - ADDO, K. - XIONG, Y. L.2009. Emulsifying and foaming

properties of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by

pH, temperature and salt. In: Food hydrocolloids    vol. 23, 2009,no.1, p. 72-81.

ISSN 0268-005X http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=20662757

1 ARCAN, I. - YEMENICIOG˘LU, A. 2009. Effects of controlled pepsin

hydrolysis on antioxidant potential and fractional changes of chickpea proteins.

In: Food Research International. vol.43, 2010, no. 1, p. 140–147.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2009.09.012

2 ARIMA, J. – UESUGI, Y. – IWABUCHI, M. – HATANAKA, T. 2008.

Streptomyces aminopeptidase P: biochemical characterization and insight into

the roles of its N-terminal domain. In: Protein Engineering Design and Selection

vol. 21, 2008, no. 1, p.45-53.Doi:10.1093/protein/gzm068

3 BANDYOPADHYAY, K. - GHOSH, S. 2002 Preparation and Characterization

of Papain-Modified Sesame (Sesamum indicum L.) Protein Isolates In: J. Agric.

Food Chem. vol. 50, 2002, no.23, p. 6854–6857. DOI: 10.1021/jf020320x

Dostupné na internete: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf020320x

4 BARCA, A. M. C. – MEDRANO, A. W. – JARA MARINI, M. – GONZALES

CORDOVA, A. F. – RUIZ SALAZAR, A. 2000. Enzymatic modification of the

functional, nutritional and sensorial properties of soya protein for special

nutrition. In: Arch. Latinoam. Nutri. vol. 50, 2000, no. 1, p. 26 – 34. PMID:

11048568

5 BERAN, M. - KLUBAL, R .- MOLIK P. - STROHALM J. - URBAN M.-

KLAUDYOVA, A. A. - PRAJZLEROVA, K. (2009): Influence of high

hydrostatic pressure on tryptic and chymotryptic hydrolysis of cow milk proteins.

[Vliv vysokého hydrostatického tlaku na tryptickou a chymotryptickou hydrolýzu

mléčných bílkovin.] High Pressure Research. vol. 29, 2009, no.1, p. 23-27. ISSN

0895-7959.

50

6 BEJOSANO, P. F. – CORKE, H. 1999. Poperties of protein concentrates and

hydrolysates from Amaranthus and buckwheat. In: Indus.Crops Prod., vol.10,

1999, no. 3, p. 175 – 183. Doi: 10.1016/S0926-6690(99)00021-7

7 BEG, Q.- K. – GUPTA, R. 2003. Purification and characterization of an

oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus

mojavensis. In: Enz. Microbial. Technol., vol. 32, 2003, p. 294 – 304.

http://dx.doi.org/10.1016/S0141-0229(02)00293-4

8 BELITZ, H.D. – GROSCH, W. – SCHIEBERLE, P. 2009. Amino Acids,

Peptides, Proteins. Food Chemistry.4.vyd. Springer Berlin Heidelberg.pg. 8-92.

ISBN(Online) 978-3-540-69934-7

9 BETANCUR-ANCONA, D. - MARTÍNEZ-ROSADO,R. - CORONA-CRUZ, A.

- CASTELLANOS-RUELAS, A. -JARAMILLO-FLORES,E.M.- CHEL-

GUERRERO,L. 2009 Functional properties of hydrolysates from <i>Phaseolus

lunatus</i> seeds In: International Journal of Food Science & Technology, vol.

44, 2009, no. 1, p. 128-137. Dostupné na internete:

http://www.citeulike.org/user/biblio24/article/3798369

10 BRACHO, S.U. - TIMAURE, N.J. 2008. Factors affecting activity of the

calcium-dependendt proteases and their participation in the process of meat

tenderisation. In: Asociación Latinoamericana de Producción Animal. vol 16,

2008, no 3, p.166-174. ISSN 1022-1301. Dostupné na internete:

http://www.alpa.org.ve/PDF/Arch%2016_3/alpa-2007-637.pdf

11 BREY, S.- COSTA S.- ROGERS, P.J. _ BRYCE, J. H. - MORRIS, P. C. -

MITCHELL, W. J. - STEWART, G. G. 2003. The effect of proteinase A on

foam-active polypeptides during high and low gravity fermentation. In. Journal

of the Institute of Brewing. vol. 109, 2003, no 3, p. 194-202. ISSN 0046-9750,

dostupné na internete: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=15310479

12 BYSTRICKÝ, P. 1991. Biochemická charakteristika hydrolýzy rastlinných

bielkovín. Autoreferát k dizertačnej práci, VŠV Košice, 1991, 26 s.

51

13 CABANILLAS, B.- PEDROSA,M.M - RODRÍGUEZ, J. - GONZÁLEZ, A. -

MUZQUIZ, M. - CUADRADO, C. 2010. Effects of enzymatic hydrolysis on

lentil allergenicity. In: Molecular Nutrition & Food Research. 2010. Published

online: 19 Mar 2010. PMID: 20306474

14 CASTILLO -YÁÑEZ,.F. J. - PACHECO-AGUILAR, R. – GARCÍA -

CARREÑO, L. F. - NAVARRETE-DEL TORO,M.Á. - FÉLIX LÓPEZ , M.

2006. Purification and biochemical characterization of chymotrypsin from the

viscera of Monterey sardine (Sardinops sagax caeruleus). In: Food Chem., vol.

99, 2006, no. 2, p. 252-259, Doi: 10.1016./j.foodchem.2005.06.052

15 CHANPUT, W.-THEERAKULKAIT,CH.-NAKAI,S. 2009. Antioxidative

properties of partially purified barley hordein, rice bran protein fractions and

their hydrolysates. In: Journal of Cereal Science vol.49, 2009, no3, p. 422–428.

doi:10.1016/j.jcs.2009.02.001

16 CELUS, I.- BRIJS, K.- DELCOUR.A.J. 2009. Fractionation and

Characterization of Brewers’ Spent Grain Protein Hydrolysates. In: J. Agric.

Food Chem. vol. 57, 2009, no. 12, p. 5563–5570 5563. DOI:10.1021/jf900626

dostupné na internete:

https://lirias.kuleuven.be/bitstream/123456789/239390/1/Celus+2009+J+Agr+Fo

od+Chem+57+5563-5570+.pdf

17 CERA, D.C. 2009. Serine proteases. In: IUBMB Life. vol.61, 2009, no. 5, p. 510

-515. Published Online: 29 Jan 2009. Dostupné na internete:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2675663/

18 CLEMENTE, A. – VIOQUE, J. – VIOQUE, R.S. – PEDROCHE, J. – MILLÁN,

F. 1999. Production of Extensive Chickpea (Cicer arietinum L.) Protein

Hydrolysates with Reduced Antigenic Activity. In: Journal of Agricultural and

Food Chemistry vol.47, 1993, no.9, p.776-3781. DOI: 10.1021/jf981315p

19 CLEMENTE, A. 2000 Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. In:

Trends in Food Sci. and Technol. Vol.11, 2000, no.7,p. 254-262.

http://dx.doi.org/10.1016/S0924-2244(01)00007-3

52

20 CONTRERAS, M.M. – CARRÓN, R. – MONTERO, J.M. – RAMOS, M. –

RECIO, I. 2009. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activityIn:

International Dairy Journal. Vol. 19, 2009, no.10, p. 566-573.

http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.05.004

21 CORNELLY VAN DER VEN - GRUPEN, H. – DRIES, B.A. DE BONT, -

VORAGEN, G.J ALPHONS. 2002. Optimisation of the angiotensin converting

enzyme inhibition by whey protein hydrolysats using response surface

methodology. In: Int. Dairy J. vol. 12, 2002, no. 10, p. 813 – 820. Doi:

10.1016/S0958-6946(02)00077-8

22 DE ANGELIS,M.- CASSONE, A - RIZZELLO,CARLO G. -GAGLIARDI, F.-

MINERVINI, F.- CALASSO, M.- DI CAGNO, R.- FRANCAVILLA,

R.GOBBETTI, M.2009 Mechanism of degradation of immunogenic gluten

epitopes (Triticum turgidum L. var. durum) by sourdough lactobacilli and fungal

proteases In:Appl. Environ. Microbiol. 2009 0: AEM.01630-09, Online ISSN:

1098-5336. dotupné na internete:

http://aem.asm.org/cgi/content/abstract/AEM.01630-09v1

23 EHREN, J. - MORÓN, B. - MARTIN, E. - BETHUNE, M.T. – GRAY. G.M.,

ET AL. 2009. A Food-Grade Enzyme Preparation with Modest Gluten

Detoxification Properties. PLoS ONE. vol. 4, 2009, no.7. e6313.

doi:10.1371/journal.pone.0006313 dostupné na internete:

http://www.plosone.org/article/info:doi

%2F10.1371%2Fjournal.pone.0006313;jsessionid=50A7BE49B7F68806346B20

2E2C319D56

24 FAVARO - TRINDADE, C.S. - SANTANA, A. - SMONTERREY -

QUINTERO. . E.S. - TRINDADE, , M.A - NETTO, F.M. 2010 . The use of

spray drying technology to reduce bitter taste of casein hydrolysate, In: Food

Hydrocolloids, vol.24, 2010, no. 4, p. 336-340. ISSN 0268-005X,

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2009.10.012

53

25 FERNANDEZ- ESPLA, M.D. - RUL, F. 1999. PepS from Streptococcus

thermophilus . A new member of the aminopeptidase T family of thermophilic

bacteria. In: Eur. J. Bioch., vol. 263, 1999, no. 2, p. 502–510. doi:10.1046/j.1432-

1327.1999.00528.x

26 DAMLE, M.V. JAMDAR, S.N. - HARIKUMAR, P. 2005. Modification of

protein hydrolysates by chicken intestinal aminopeptidases. poster . dostupné na

internete: http://www.barc.ernet.in/publications/nl/2006/200610-36.pdf

27 DAY, L. - AUGUSTIN,M.A. - BATEY,I.L - WRIGLEY,C.W.2006. Wheat-

gluten uses and industry needs. In: Trends in Food science&Technology.vol17,

2006 , p .82-90. Dostupné na internete:

http://www.agronavigator.cz/attachments/psenicny_lepek.pdf

28 EDWARD, N. M. – MULVANEY, S. J. – SCANLON, M. G. – DEXTER, J. E.

2003. Role of gluten and its components in determining durum semolina dough

viscoelastic properties. In:Cereal Chemistry, 2003, vol. 80, p. 755 – 763.

ISSN 0009-0352 

29 FARAGÓ, J. 2007. Druhá generácia transgénnych plodín na trhu: transgénne

rastliny so zvýšenou nutričnou hodnotou. poznatky z genetiky a šľachtenia

poľnohospodárskych rastlín Zborník zo 14. vedeckej konferencie, Piešťany :

VÚRV, 2007. Dostupné na internete: http://www.vurv.sk/files/53/zbornik_i.pdf

30 FERENČÍK, M. – ŠKÁRKA, B. – NOVÁK, M. – TURECKÝ, L. 2000.

Biochémia. Slovak akademia press, Bratislava, 2000. 924s. ISBN 80-88908-57-4

31 FITZGERALD, R.J - O'CUINN, G. 2006 Enzymatic debittering of food protein

hydrolysates.In: Biotechnology Advances, vol.24, 2006, no.2, p. 234-237.

dostupné na internete: http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.11.002

32 FIORETTI, E. - ANGELETTI, M. - LUPIDI, G. - COLETTA, M. 1994.

Heterotrophic modulation of the protease-inhibitor-recognition process. Cations

effect the binding properties of alpha-chymotrypsin. In: Eur. J. Biochem., vol.

225, 1994, no. 1, p. 459–465. doi:10.1111/j.1432-1033.1994.00459.x

54

33 FERENČÍK, M. - ŠKÁRKA, B. - NOVÁK, M. - TURECKÝ, L. 2000.

Biochémia. Bratislava: Slovak Academic Press, 2000, 924 s.,

ISBN 8088908582

34 FRÉREZ, R. 2008. Allergenicity of yellow pea protein. DHI,Final report.

Dostupné na internete:

http://www.dhi.pl/~/media/CC3AD16A1D7E4D54AB17EEAF17250437.ashx

[cit. 18.12.2009]

35 FUHONG, X. – YAPENG, CH. – XIUQING, Y. – JING, Y.- ZHIQUAN, X.-

YUANMING. L. – SHIJUN, Q. 2010. Purification and characterization of four

keratinases produced by Streptomyces sp. Strain 16 in native human foot skin

medium. In: Bioresource Technology. Vol. 101, 2010, p. 344–350. Dostupné na

internete: http://www.im.ac.cn/UserFiles/File/2009/200910/bioresource

%20technology.pdf [cit.18.2.2010]

36 GÁLOVÁ, Z. − PALENČÁROVÁ, E. −BALÁŽOVÁ, Ž. 2008. Nutričná kvalita

kolekcie genotypov láskavca.Nové poznatky z genetiky a šľachtenia

poľnohospodárskych rastlín Zborník z 15. vedeckej konferencie, Piešťany :

VÚRV, 2008. Dostupné na internete:

http://www.vurv.sk/files/105/zbornik_postery.pdf

37 GALVAO, C.M.A. – PINTO, G.A. – JESUS, CH.D.F. – GIORDANO, R.C. -

GIORDANO, R.L.C. 2009. Producing a phenylalanine-free pool of peptides after

tailored enzymatic hydrolyses of cheese whey.In: Journal of food engineering .

vol. 91, 2009, no.1, p. 109-117. ISSN 0260-8774 . Dostupné na internete:

http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=21252726

38 GAŽAR, R. - BOJŇANSKÁ, T. 2010. Zmeny konzistencie, vývinu a stability

cesta po prídavku pohánkovej, ovsenej, šošovicovej a cícerovej múky.In:

Potravinárstvo. mimoriadne číslo, február 2010. dostupné na internete:

http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/1/Gazar.pdf

39 GAUTHIER, S. F. – POULIOT, Y. 2003. Functional and Biological Properties

of Peptides Obtained by Enzymatic Hydrolysis of Whey Proteins. In: J. Dairy

55

Sci., vol. 86, 2003, p. 78 – 87. Dostupné na internete:

http://jds.fass.org/cgi/content/abstract/86/13_suppl/E78 [cit.14.2.2010]

40 GIBSS BERNARD, F - ZOUGMANB, A. - MASSEA, R. - MULLIGANC, C.

2003. Production and characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate

and soy-fermented food. In: Food Research International.vol.37, 2004, no. 2, p.

123-131. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2003.09.010

41 GIANNA, R. – GREGORIS, E. – RENZO,B. 1988. Process for the enzymatic

hydrolysis of a protein material. Patentový dokument: European Patent

Application EP0320717. Dostupné na internete:

http://www.freepatentsonline.com/EP0320717.html [cit. 10.12.2009]

42 GRANDI, C. – VITA, C. – DALZOPPO, D. - FONTANA, A. 2009.

Thermolysin and Bacillus subtilis neutral protease. In: International Journal of

Peptide and Protein Research.vol.16, 2009, no.4 , p. 327 – 338. DOI:

10.1111/j.1399-3011.1980.tb02594.x

43 GRIPON, J.C. - AUBERGER, B. - LENOIR, J. 1980. Metalloproteases from

Penicillium caseicolum and P. roqueforti: comparison of specificity and chemical

characterization. In: Int. J. Biochem., vol. 12, 1980, no. 3, p. 451-455. PMID

6998789

44 GUAN, H.L. - GUO, W.L. – HUAN, L. 2005. Mung-bean Protein Hydrolysates

Obtained with Alcalase Exhibit Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory

Activity In: Food Science and Technology International. vol. 11, 2005, no. 4, p.

281-287. DOI: 10.1177/1082013205056781

45 GUAN, X. – YAO, H. – CHEN, Z. – SHAN, L. – ZHANG, M. 2007. Some

functional properties of oat bran protein concentrate modified by trypsin. In:

Food Chem., vol. 101, 2007, p. 163 – 170.

HTTP://DX.DOI.ORG/10.1016/J.FOODCHEM.2006.01.011

46 GUPTA, R. – BEG, Q.K. – LORENZ, P. 2002. Bacterial alkaline proteases:

molecular approaches and industrial applications. In: Appl. Microbiol.

56

Biotechnol., vol. 59, no. 1, 2002, p. 15 – 32. Dostupné na internete:

http://xray.bmc.uu.se/Courses/PT/Lectures/Gupta.pdf

47 HATANAKA, T. - UESUGI, Y.- ARIMA, J.-USUKI, H. - WABUCHI, M.

2008 Biochemical characterization of a novel metalloendopeptidase from

Streptomyces aureofaciens TH-3 with post-proline hydrolysis activity In:

Enzyme and Microbial Technology. vol. 44, 2009, no. 5, p. 295-301.

http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2008.11.005

48 HIDALGO, J.A. – VAZQUES, J.A. 2010. Candisiasis. Dostupné na internete:

http://emedicine.medscape.com/article/213853-overview. Updated: Jan 11, 2010.

[cit. 10.4.2010]

49 HINDI-TAMELIKECHT, F. – DAUPHIN, C. – HAMON, M. – GRANGAUD,

J. P. – PRADEAU, D. 1997. Analytic and immunologic characterization of

chickpea (Cicer arietinum) protein hydrolysates obtained by bromelain and

chymotrypsin. In: J. Agri. Food Chem., vol. 45, 1997, p. 4758- 4762.

50 HOSSENEY, R. C. 1994. Principles of Cereal Science and Technology, second

ed. AACC, 1994, St. Paul, Minesota, 40. Pp.378. ISBN: 0913250430

51 HOZOVÁ, B. – MORAVČÍKOVÁ, P. 2010. Netradičné obilniny. Dostupné na

internete: http://www.potravinari.sk/page979sk.html [cit.15.3.2010]

52 HRČKOVÁ, M. – ZEMANOVIČ, J. – RUSŇAKOVÁ, M. 2001. Enzýmová

proteolýza sójovej odtučnenej múky. In: Bull. potravin. výskumu, vol. 40, 2001,

no. 4, p.. 301 – 310. ISSN 0231-9950

53 HRČKOVÁ, M. – ŠTURDLÍK, E. - ZEMANOVIČ, J. 2002. Potravinárske

využitie proteolytických enzýmov.In: Bull. potravin. výskumu, vol. 41, 2002, no.

2, p. 85 – 97. ISSN 0231-9950

54 HRČKOVÁ, M. – ŠTURDÍK, E. – MALIAR, T. – ZEMANOVIČ, J. 2004.

Biochemické vlastnosti proteolytických enzýmov. In: Chem. Listy, vol. 98, 2004,

no. 9, p. 842 – 850. ISSN 1213-7103, 0009-2770

57

55 CHOI, KH,.- LAURSEN, RA. 2000 Amino-acid sequence and glycan structures

of cysteine proteases with proline specificity from ginger rhizome Zingiber

officinale..In: Eur J Biochem. Vol. 267, 2000, no.5, PMID: 10691991 [dostupné

na internete: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10691991?dopt=abstract

56 IBRAHIM, C.O. 2008. Development of applications of industrial enzymes from

Malaysian indigenous microbial sources. In: Bioresource Technology. vol. 99,

2008, no. 11,p. 4572-4582. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2007.07.040

57 JAMES, J. – SIMPSON, B. K. 1996. Application of enzymes in food processing.

In: Crit. Rev. Food Sci. Nutri., vol. 36, 1996, no. 5, p. 437 – 463. ISSN 1040-

8398

58 JAVOR, Ľ. – SUROVČÍK, J. a kol. 2001 Technológia pestovania strukovín.

Dostupné na internete :

http://www.agroporadenstvo.sk/rv/strukoviny/strukoviny_uvod.htm

[cit.10.2.2010]

59 JAVORSKÝ, P. – KREČMER, F. – UHNÁK, J. 1987. Chemické rozbory v

zemědělských laboratořích. Praha, Ministerstvo zemědělství a výživy ČSR, 1987,

s. 9 – 32

60 JESENÁK, K. 2005.. Agregácia. In: Sól-gélové metódy. Bratislava, UK. ISBN

80-223-2071-4. dostupné na internete:

http://www.fns.uniba.sk/fileadmin/knihy/jesenak/2005metody/06.pdf [cit.

15.2.2010]

61 KALITZ, H.M. et al. 1988. Microbial Proteinases. In: Adv. Biochem. Engin./

Biotechnol., vol. 36, 1988, p. 1 – 65. ISSN 0724-6145

62 KAGEYAMA, H. – UEDA, H. - TEZUKA, T. – OGASAWARA, A. –

NARITA, Y. – KAYEGAMA, T. – ICHINOSE, M. 2009. Differences in the P1

´substrate specifities of pepsin A and chymosin. In: Journal of Biochemistry vol.

147, 2010, no.2, p. 167-174; Online ISSN 1756-2651

58

63 KANEKANIAN, A. – GALLAGHER, J. – EVANS, E.P. 2000. Casein

hydrolysis and peptide mapping. In: Int. J. Dairy Technol., vol. 53, 2000, no. 1,

p. 1 – 5. DOI: 10.1111/j.1471-0307.2000.tb02648.x

64 KANU, P.J. - KANU, J.B. - SANDY, E.H. - KANDEH, J.B.A - MORNYA,

P.M.P. - HUIMING, Z. 2009. Optimization of enzymatic hydrolysis of defatted

sesame flour by different proteases and their effect on the functional properties of

the resulting protein hydrolysate. Am. J. Food Technol., vol.4, 2009, no.6, p.226-

240. DOI: 10.3923/ajft.2009.226.240 URL: http://scialert.net/abstract/?

doi=ajft.2009.226.240

65 KAPP, G.R. – BAMFORTH, C.W. 2002 The foaming properties of proteins

isolated from barley. In:Journal of the Science of Food and Agriculture, vol.82,

2002, no. 11, p. 1276-1281. DOI: 10.1002/jsfa.1177dostupné na internete:

http://www.ingentaconnect.com/content/jws/jsfa/2002/00000082/00000011/

art01177#avail

66 KARAM, J. - NICELL, J.A. 1997. Potential applications of enzymes in waste

treatment. In: J. Chem. Technol. Biotechnol., vol. 69, 1997, no. 2, p. 141-153.

ISSN 0268-2575

67 KARAMAĆ, M. – AMAROWICZ, R. – KOSTYRA, H. 2002. Effect of

temperature and enzyme/substrate ratio on the hydrolysis of pea protein isolates

by trypsin. In: Czech J. Food Sci., vol. 20, 2002, no. 1, p. 1 – 6. Dostupné na

internete http://www.cazv.cz/2003/2002/potr1_02/karamac.pdf

68 KARAMAC, M . - RYBARCZYK, A. 2008. Chymotryptic hydrolysis of lentil

proteins and characteristics of the resulting hydrolysates.In: Polish journal of

food and nutrition sciences. vol. 58, 2008, no. 3, p. 351-357. ISSN 1230-0322

dostupné na internete: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=20635495

69 KARLUBÍK, M. – KYSELOVIČ,J. – 1990. Biochémia. Bratislava: Príroda,

1990. 260s. ISBN 80-07-00340-1.

59

70 KINSELLA, J.E. 2007. Functional properties of soy proteins. In: Journal of the

American Oil Chemists' Society. vol. 56, 2007, no. 3, p. 242-258. Dostupné na

internete: http://www.springerlink.com/content/q472251t76x55g73

71 KLIONSKI, D.J. – HERMAN, P.K. – EMR, S.D. 1990. The fungal vacuole:

composition, finction, biogenesis. In: Microbiological reviews.vol.54. 1990, no. 3

p. 266-292. Dostupné na internete: http://mmbr.asm.org/cgi/reprint/54/3/266.pdf

72 KLOMKLAO, S. – BENJAKUL, S. – VISESSANGUAN, W. – KISHIMURA,

H. – SIMPSON, B. K. 2006. Proteolytic degradation of sardine proteins by

trypsin from skipjack tuna spleen. In: Food Chem. vol. 98, 2006, p. 14 -22. ISSN

0308-8146

73 KRKOŠKOVÁ, B. - MACOVÁ, E. 2006. Hydrolýza bielkovín alternatívnych

obilnín. In: Trendy v potravinárstve, roč. 13, č. 1, 2006, s. 10 - 11. ISBN 1336-

085X

74 KRKOŠKOVÁ, B. – ŠIMKOVÁ, M. – STRÁŽNICKÁ, H. 1997. Enzýmová

hydrolýza bielkovín hrachu, In: Bulletin potravinárskeho výskumu, roč. 36, č. 4,

1997, s. 273 – 281.

75 KRKOŠKOVÁ, B. – ŠIMKOVÁ, M. 1998. Využitie enzýmov pri úprave

bielkovinovej zložky strukovín. In: Biotechnológie prípravy biologicky

aktívnych látok a ich využitie v pôdohospodárstve. Nitra: SPU, 1998, s. 37 – 43.

76 KORÉNEK, M.- VAŠKO, L. – KORENEKOVÁ, B.- ŠUTIAK, V.- NEUSCHL,

J.- KAŠTEL, R.- SOBEKOVÁ, A. – KREMEŇ, J.- LOHAJOVÁ Ľ.- HÚSKA,

M. 2003. Štúdium hydrolýzy albumínov hrachu proteázami tráviaceho traktu in

vitro. In Rizikové faktory potravového reťazca. [elektronický zdroj] : zborník

vedeckých prác z 3. medzinárodnej vedeckej konferencie, Nitra, s. 59 - 60. ISBN

80-8069-282-3. Dostupné na internete :

http://www.slpk.sk/eldo/rizikove_faktory03/korenek3.pdf.

77 KONG, X.- ZHOUA,H- QIANA, H 2006. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten

by proteases and properties of the resulting hydrolysates In: Food Chemistry, vol.

60

102, 2007, no. 3,p. 759-763. doi:10.1016/j.foodchem.2006.06.062 , dostupné na

internete: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.06.062

78 KONRAD, G. - KLEINSCHMIDT, TH. - ROHENKOHL, H. 2004. Enzyme

modification of milk protein concentrate for the improvement of foam and

emulsifying characters. Part 2.Effects on the surface area characters. In: Deutsche

Milchwirtschaft, vol. 55, 2004, no. 19, p. 780-783

79 KOŠŤÁLOVÁ, Ľ. – KOVÁCS, L. A KOL. 2005. Úvod do pediatrie.

Elektronická učebnica www.fmed.uniba.sk . Dostupné na internete:

http://www.fmed.uniba.sk/fileadmin/user_upload/editors/akademicka_kniznica/

dokumenty_PDF/1_Uvod_do_pediatrie_pre_nemedicinske_smery.pdf [cit.

5.4.2010]

80 KRÚDY, M. 2010. Strukoviny. Dostupné na internete: http://www.osivo.sk/?

id=STRUKOVINY [cit. 9.4.2010]

81 KUMAR, H. R. H. – MONTEIRO, P. V. – BHAT, G. S. – RAO, H. G. R. 2001.

Effectes of enzymatic modification of milk proteins on flavour and textural

qualities of set youghurt. In: J. Sci. Food Agric., 81, 2001, p. 42 – 45.

82 KYUNG-KOH, BONG. - AH- SONG, K. 2008. Effects of trypsin-hydrolyzed

wheat gluten peptide on wheat flour dough 2008. In: Journal of the Science of

Food and Agriculture, vol. 88, 2008, no. 14.pp. 2445-2450. dostupné na

internete:http://www.ingentaconnect.com/content/jws/jsfa/2008/00000088/00000

014/art00006

83 LAHL, W.J. – BRAUN, S.D. 1994. Enzymatic production of protein

hydrolysates for food use. In: Food Technol., vol. 48, 1994, no. 10, p. 68.

84 LAMSALA, B.P. - JUNG, S. - JOHNSON, L.A. 2006. Rheological properties

of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis. In: Food

sciece and technology. Vol. 40, 2007, no. 7, p. 1215-1223.

http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2006.08.021

61

85 LAŠŠÁK, M. 2009. Rosetta@home- Tajomstvo bielkovín. [cit.29.1.2010]

http://www.boinc.sk/clanky/rosetta-home-tajomstvo-bielkovin?page=full.

86 LEHRMAN, S.R. 1990. Fundamentals of protein biotechnology (edited by

Stanley, Stein). Marcel Dekker Inc, New York, 1990. p. 9- 38., pp 310. ISBN 0-

8247-8346-8

87 LEISOLA, M. – JOKELA, J.- PASTINEN, O. – TURUNEN, O. 2010. Industrial

use of enzymes. Dostupné na internete: http://66.102.9.104/search?

q=cache:QiFl0yb0330J:www.tkk.fi/Units/BioprocessEngineering/Kem-70.415/

INDUSTRIAL_USE_OF_ENZYMES.DOC+way+,producing,

+enzyme,proteolytic,Bacillus,submerged+fermentation,

+proces&hl=sk&ct=clnk&cd=21&gl=sk&client=firefox-a [cit. 1.2.2010]

88 LI, S. – ZHANG, Q.H. 2001. Advances in the development of functional foods

from buckwheat. In Critical Review in Food Science and Nutrition, vol.41, 2001,

no. 6, p. 451-454.

89 LI, L - YANG,Z.Z. – YANG, X.Q. - ZHANG, G.H. - TANG,S.Z.- CHEN, F.

2008. Debittering effect of Actinomucor elegans peptidases on soybean protein

hydrolysates. In: Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol.35,

2008, no. 1, p. 41 – 47. DOI - 10.1007/s10295-007-0264-y dostupné na

internete:- http://www.springerlink.com/content/h48855823015uw55

90 LIEBERMAN, M. – MARKS, A.D. 2009. Markś basic medical biochemistry

a clinical approach. 3.vyd. Lippincot William&Wilkins. p. 79, pp. 997. ISBN

13:978-0-7817-7022-4..

91 LIOE, N. H.- SELAMAT,J.- YASUDA, M. 2010. Soy Sauce and Its Umami

Taste: A Link from the Past to Current Situation. In: Journal of Food Science.

dostupné na internete: http://dx.doi.org/10.1111/j.1750-3841.2010.01529.x

92 LÓPEZ, G. – FLORES, I. – GÁLVEZ, A. – QUIRASCO, M. – FARRÉS, A.

2003. Development of a liquid nutritional supplement using a Sesamum indicum

L. protein isolate. In: Lebensm.-Wiss. U.-Technol., vol. 36, 2003, p. 67 – 74.

62

93 LU, X. J. – LIANG, L. L. – HUANG, H. J. – QIN, Y. – NING, Z. X. 1996. Effects of free amino acids on food taste. In: Food Sci., 1996, p. 10 – 12

94 LUKÁČOVÁ, V. – ZEMANOVIČ, J. 1998. Enzýmová hydrolýzy proteínov pri

výrobe potravín. In: Bull. potrav. výskumu, vol. 37, 1998, no.1, p. 19 – 31. ISSN

02319950

95 MAURER, H. R. 2001. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical

use. In: Cell Mol. Life Sci., vol. 58, 2001, no. 9, p. 1234-1245. PMID 11577981

96 MENDANHA, D.V - MOLINA ORTIZ,S.E.- CARMEN S. TRINDADE,F. -

MAURI,A. - QUINTERO,M. E. - THOMAZINI,M. 2009 Microencapsulation of

casein hydrolysate by complex coacervation with SPI/pectin, 2009 In: Food

Research International, vol. 42, 2009, no. 8, p. 1099-1104. ISSN 0963-9969.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2009.05.007

97 METHODS IN ENZYMOLOGY I. 1955. Edited by COLOWICK, S.P. –

KAPLAN, N.O., Section I. General preparative procedures, 16. Preparation of

buffers for use in enzyme studies. By G. GOMORI. Academic Press Inc.: New

York, 1955, p. 3 – 146.

98 MIDWINTER, G.R. – PRITCHARD, G.G. 2008. Aminopeptidase N from

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus NCDO 573: purification and

properties.In: Journal of Applied Microbiology. vol. 77, 1994, no. 3, p. 288-295.

10.1111/j.1365-2672.1994.tb03076.x. Dostupné na internete:

http://www3.interscience.wiley.com/journal/119974069/abstract?

CRETRY=1&SRETRY=0

99 MICHALÍK, I. 1994. Charakteristika cereálnych bielkovín, ich výživná kvalita

a vplyv na zdravotný stav. In: Výživa a zdravie, roč. 39, 1994, č 8, s. 159-160.

ISSN 00429406

100 MICHALÍK, I. 2003. Biochémia. 4. Upravené vydanie. Nitra: SPU 2003, 226 s.

ISBN 80-8069-171-1

63

101 MICHALÍK, I – URMINSKÁ, D. – PETR, J. – GÁLOVÁ, Z. –

KNOBLOCHOVÁ, H. 2004. Variabilita frakčnej skladby zásobných bielkovín

zrna cereálií a pseudocereálií. In: Proteíny 2004. s.17-20, ISBN 80-7157-779-0

102 MICHALÍK, I. et al. 2006. Výživná a technologická kvalita rastlinných

produktov a ich potravinárske využitie. Nitra: SPU, 2006. 198 s. ISBN 80-8069-

780-9

103 MICHALÍK,I. – URMINSKÁ,D. 2006. Bielkovinové determinanty celiakálneho

ochorenia. Protein determination of coeliac disease. In: Nové poznatky

z genetiky šľachtenia poľnohospodárskych rastlín. Zborník z13. Vedeckej

konferencie, Piešťany.VÚRV 2006, str.16 -19. dostupné na internete:

http://www.vurv.sk/files/25/zbornik_nove_poznatky..1._cast.pdf

104 MIKUŠOVÁ, I. 2010. Využitie papaínu v pečivárňach. [správa elektronickej

pošty] Správa pre: Renáta Halásová. 12.2.2010. [cit.12.2.2010]

105 MINH, P.N. – DEVROEDE, N. – MASSANT, J. – MAES, D. – CHARLIER,

D. 2009.Insights into the architecture and stoichiometry of Escherichia coli

PepA•DNA complexes involved in transcriptional control and site-specific DNA

recombination by atomic force microscopy. In: Nucleic Acids Research, 2009,

vol. 37, 2009, no 5, p. 1463-1476. Online ISSN 1362-4962. Dostupné na

internete: http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/gkn1078

106 MOLINA ORTIZ, S.E. - WAGNER, J.R. 2002. Hydrolysates of native and

modified soy protein isolates, structural characteristics, solubility and foaming

properties. In: Food Res. Int. vol. 35, 2002, no. 6, p. 511-518.

http://dx.doi.org/10.1016/S0963-9969(01)00149-1

107 MORATO, A. F. – CARREIRA, R. L . – JUNQUEIRA, R. G. – SILVESTRE,

M. P. C. 2000. Optimization of casein hydrolysis for obtaining high contens of

small peptides: use of subtilisin and trypsin. In: J. Food Com. Anal., 13, 2000,

no. 5, p. 843 – 857. http://dx.doi.org/10.1006/jfca.2000.0912

108 MORAVČÍKOVÁ, P., HOZOVÁ, B.2005. Netradičné obilniny. Výživa a

Zdravie, vol. 49, 2005, no.1.p. 6- 11.

64

109 MORIHARA, K. 1974. Comparative specificity of microbial proteinases. In:

Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., vol. 41, 1974, p. 179-243, Online ISBN:

9780470122860.

110 MORIHARA, K .- OKA, T.- TSUZUKIi, H., 1967. Multiple proteolytic

enzymes of Streptomyces fradiae. Production, isolation, and preliminary

characterization. Biochimica et Biophysica Acta. vol.139, 1967, no. 2, p. 382–

397. http://dx.doi.org/10.1016/0005-2744(67)90042-3

111 MOTA M. V. T. - FERREIRA I. M. P. L. V. O. - OLIVEIRA M. B. P.-

ROCHA C. - TEIXEIRA J. A.- TORRES D. -GONCALVES M. P. 2006 Trypsin

hydrolysis of whey protein concentrates : Characterization using multivariate

data analysis in: Food chemistry   ISSN 0308-8146  2006, vol. 94, no.2, p. 278-

286 

112 MOUDRÝ, J. a kol. 2005. Pohanka a proso. Praha: ÚZAPI, 2005. 206 s. ISBN

80-7271-162-8

113 MUCHOVÁ, Z. et al., 2000. Bielkovinové frakcie semena láskavca

(Amaranthus SP.). In Rostlinná výroba, roč. 46, 2000, č.7, s. 331-336.

114 MUCHOVÁ, Z. et al., 2007. Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu.

Nitra : SPU 2007. ISBN 80-7137-614-0

115 MUCHOVÁ Z. 2007. Technológia spracovania cereálií. 2. vyd. Nitra: SPU,

2007, 148 s. ISBN 978-80-8069-980-2

116 MUCHOVÁ, Z. - ŽITNÝ, B.- FRANČÁKOVÁ, H. 2009. Variabilita

kvalitatívnych parametrov pšeničných múk a modifikácia vlastností ciest

miesením. In: Acta fytotechnica et zootechnica.Mimoriad. číslo 2009, s.486-498

117 MURRAY, R.K. – GRANNER, K.D. – MAYES, A.P. – RODWELL, W. V.

2002. Harperova biochemie, 4.vyd. Nakladatelství H&H, Jihlava 2002. 871s.,

ISBN 80-7319-013-3

118 NAKAI, H.S. – MODLER, W. 1996. Food proteins properties and

charakterization. Wiley-VCH, 1996. p.1-15, 560 pp, ISBN-10: 0471186147).

65

119 NIELSEN, M.P. – DAMODARAN, S. – PARAF, A. 1997. Food proteins and

their aplications. Edited by Srinivasan Damodaran, Alain Paraf. Marcel Dekker,

Inc. New York, 1997. 664pp. ISBN 0-8247-9820-1

120 NOGUCHI, A. – MASSO, C. – DEL ROSARIO , R.R. 1982. Mailard reaction

during extrusion- cooking of protein enriched bisquit Lebensm. Wiss. Technol.

1982, 15,105.

121 OHTSUKI, K. - TAGUCHI, K. - SATO, K. - KAWABATA, M. 1995.

Purification of ginger proteases by DEAE-Sepharose and isoelectric focusing, In:

Biochimica et Biophysica Acta. Vol. 1243, 1995, no.2, p. 181-184. ISSN 0304-

4165. http://dx.doi.org/10.1016/0304-4165(94)00145-N

122 OKADA, Y. – NAGASE.H – HARRIS, E.D. . 1986. A Metalloproteinase from

human rheumatoid synovial fibroblasts that digests connective tissue matrix

components. In: J. Biol. Chem., vol. 261, 1986, no. 30, p. 14245–14255.

123 ORTIZ MOLINA, S. E. – ANÓN, M. C. 2001. Enzymatic hydrolysis of soy

protein isolates, DSC study. In: J. Thermal. Analysis and Calorimetry, vol. 66,

2001, p. 489- 499

124 PANYAM, D. - KILARA, A. 1996. Enhancing the functionality of food

proteins by enzymatic modification. In: Trends Food Sci Technology. Vol.7,

1996, n.4. p.120-125. http://dx.doi.org/10.1016/0924-2244(96)10012-1

125 PARAMAN,I. - HETTIARACHCHY, N. S. - SCHAEFER,CH.- BECK,I.M.

2007. Hydrophobicity, Solubility, and Emulsifying Properties of Enzyme-

Modified Rice Endosperm Protein Cereal Chemistry. vol. 84, 2007, no.4, p. 343-

349. DOI:10.1094/CCHEM-84-4-0343 dostupné na internete:

http://cerealchemistry.aaccnet.org/doi/abs/10.1094/CCHEM-84-4-0343?

cookieSet=1&journalCode=cchem

126 PEDROCHE, J. – YUST, M.M. – GIRÓN-GALLE, J. – VIOQWUE, J. –

ALAIZ, M. – MILLÁN, F. 2003. Plant protein hydrolysates and tailor –made

66

foods. In: Elektron J. Environ. Agric. Food chem. vol.2, 2003, n.1, p. 233-235.

ISSN 1579-4377

127 PEDROSA, M PASCUAL, C. Y.- LARCO, JI - MARTÍN ESTEBAN, M. 2006.

Palatability of Hydrolysates and Other Substitution Formulas for Cow’s Milk-

Allergic Children: A Comparative Study of Taste, Smell, and Texture Evaluated

by Healthy Volunteers In: J Investig Allergol Clin Immunol. vol. 16, 2006, no. 6,

351 - 356. Dostupné na internete: http://www.jiaci.org/issues/vol16issue06/4.pdf

128 PERROT, C. – QUILLIEN, L. – GUEGUEN, J. 1999. Identification by

immunoblotting of pea (Pisum sativum L) proteins resistant to in vitro enzymatic

hydrolysis. In: Sci. Aliments, vol. 19, 1999, p. 377 – 390.

129 PINTADO, M. E. – MALCATA, F. X. 2000. Hydrolysis of ovine, carpine and

bovine whey proteins by trypsin and pepsin. In: Bioprocess Engineering, vol. 23,

2000, p. 275- 282 ISSN1615-7605.

130 POLAINA, J. – MAC CABE, A.P. 2007. Industrial enzymes: structure, function

and applications. Springer pub. p. 169 pp.. 641. ISBN 978-1-4020-5376-4

131 POPINEAU, Y. - HUCHET, B. - LARRE, C. - BEROT, S. (2002). Foaming

and emulsifying properties of fractions of gluten peptides obtained by limited

enzymatic hydrolysis and ultrafiltration. Journal of Cereal Science, vol.35, 2002,

no. 3, p. 327–335. http://dx.doi.org/10.1006/jcrs.2001.0437

132 PŠENÁKOVÁ, I. – FARAGÓ, J. 2006. Rastlinné flavonoidy a ich potenciál pre

funkčné potraviny a nutraceutiká. Nové poznatky z genetiky a šľachtenia

poľnohospodárskych rastlín. Zborník z 13. vedeckej konferencie, Piešťany

VÚRV, 2006 . dostupné na internete:

http://www.vurv.sk/files/25/zbornik_nove_poznatky..1._cast.pdf

133 RADHA, C. - KUMAR, P.R. – PRAKASH, V. 2008.Preparation and

characterization of a protein hydrolysate from an oilseed flour mixture. In: Food

Chemistry. Vol. 108, 2008, no. 3, p. 1027.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.07.063

67

134 RAKOWSKA, M. – OCHODZKI, P. 2001. Nutritive role of food protein.

Properties of food proteins, ed. by Zdzislaw E. Sikorski 2001. CRC Press LLC.

p.217-232, 490 pp. ISBN 1-56676-960-4.

135 RAMKUMAR, C. - HARJINDER, S. - MUNRO, P. A. - SINGH, A. M. -

SINGH, H. 2000. Influence of calcium, magnesium, or potassium ions on the

formation and stability of emulsions prepared using highly hydrolyzed whey

proteins. In: J. Agric. Food Chem. vol. 48, 2000, no. 5, p. 1598 - 1604.

136 RAO, M.L. - TANKSALE, A.M. - GHATGE, M.S. - DESHPANDE, V.V. 1998.

Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. In: Microbiol.

Mol. Biotech. Rev., vol. 62, 1998, no. 3, p. 597-635. Dostupné na internete:

http://mmbr.asm.org/cgi/content/abstract/62/3/597

137 RAWLINGS, N.D. - BARRET, A.J. – BATEMAN, A. 2010. MEROPS: the

peptidase database. In: Nucleic acid research. vol38, 2010, D227-233. Online

ISSN 1362-4962. Dostupné na internete:

http://nar.oxfordjournals.org/cgi/screenpdf/38/suppl_1/D227 [cit.7.4.2010]

138 SAHA, B.C. – HAYASHI, K. 2001. Debittering of protein hydrolyzates.

In: Biotechnol. Adv., vol. 19, no. 5, 2001, p. 355 – 370.

139 SZABOVÁ, E. - URMINSKÁ, D. –MICHALÍK, P. 2003. Využitie

pseudocereálií na prípravu potravín pre pacientov s celiakiou.In: zbornik 2003

proceeding book rffch kfzfbp uniag konferencie/ 143 - 143 Rizikové faktory

potravového reťazca III, Nitra, 2003 dostupné na internete:

http://www.oxygy.com/zbornik2003-proceeding-book-rffch-kfzfbp-uniag-

konferencie/143

140 SZABOVÁ, E. 2006. Optimalizácia produkcie bakteriálnej peptidázy a jej

purifikácia chromatografickými metódami. Autoreferát dizertačnej práce. SPU,

FBP, Nitra, 2006, s. 5.

141 SENDREJOVÁ, E. - KARAMAĆ,M. - KOSIŃSKA,M. - AMAROWICZ, R. -

URMINSKÁ, D.2007. Pšeničné bielkoviny ako substráty na prípravu

enzymatických hydrolyzátov. 8. vedecká konferencia doktorandov a mladých

68

vedeckých pracovníkov, 2007, FPV UKF Nitra. p.274 – 276. Dostupné na

internete:

http://citadel.ukf.sk/konferencia/papers/PDF_Chemia/Sendrejova_Urminska.pdf

142 SHAN, L. – MOLBERG, O. – PARROT, I. et al. 2002. Structural basisi for

gluten intolerance in celiac sprue. In: Science. 2002, vol. 297, 2002, p. 2275-

2279. DOI: 10.1126/science.1074129

143 SCHROEDER, L. J. - IACOBELLIS, M. - SMITH, A. H. 1961. Influence of

Heat on the Digestibility of Meat Proteins. In: Journal of nutrition. vol 73, 1961,

p. 143-150

144 SINHA, U. - WOLZ, S.A. – LAD, P.J. 1991. Two new extracellular serine

proteases from Streptomyces fradiae. In: J. Biochem. vol.23, 1991, no. 10, p.

979–984. PMID: 1786859

145 SORMUS, C. P. – NEVES, V. A. - MACHADO, M. B. M. 2009. Enzymatic

Hydrolysis of Sweet Lupin, Chickpea, and Lentil 11S Globulins Decreases their

Antigenic Activity .In: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 57,

2009, no. 3, p. 1070-1075. DOI: 10.1021/jf803108c.

146 SONDERGAARD, A.H. - GRUNERT, G. K.- SCHOLDERER,J. 2005.

Consumer Attitudes to Enzymes in Food Production. In: Trends in Food Science

& Technology, vol.16, 2005, no. 10, p. 466-474. ISSN 0921-2244

147 STORER, A.C. – MENARD, R. 1994. Catalytic mechanism in papain family of

cysteine peptidases. Methods in Enzymology vol. 244, pg. 486–511 ISSN: 0076-

6879

148 SUMANTHA, A. – LARROCHE, CH. – PANDEY, A. 2006. Microbiology

and industrial biotechnolgy of food-grade proteases: a perspective. In: Food

Technol. Biotechnol., vol. 44, no. 2, 2006, p. 211 – 220. ISSN 1330-9862.

149 SURÓWKA, K. - MUDZISKI, D. - FIK, M. – MACURA, R. - ASOCHA, W.

2004. New protein preparations from soy flour obtained by limited enzymic

69

hydrolysis of extrudates. In: Innov. Food Sci. Emer. Tech., vol. 5, 2004, no. 2, p.

225-234. Dostupné na internete http://dx.doi.org/10.1016/ j.ifset.2004.01.005

150 SZABOVÁ, E. 2006. Optimalizácia produkcie bakteriálnej peptidázy a jej

purifikácia chromatografickými metódami. Dizertačná práca. Nitra : SPU, 2006

151 ŠKÁRKA, B. – FERENČÍK, M. 1987. Biochémia,2. prepracované vydanie.

Vyd. Alfa, Bratislava, 1987. 741 s.

152 ŠTOSOVÁ, T. – HAVLÍŠ, J. – LENOBEL, R. – ŠEBELA, M. 2005.

Proeteolytické enzýmy: Význam pro proteomiku. In: Chem. Listy, roč. 99, č. 12,

2005, p. 896 – 905. ISSN 1213-7103

153 TOVAR-PÉREZ, E.G. - GUERRERO-LEGARRETA, I.- FARRÉS-

GONZÁLEZ, A. - SORIANO-SANTOS, J. 2009. Angiotensin I-converting

enzyme-inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of

amaranth grain In: Food Chemistry. Vol. 116, 2009, no. 2, p. 437-444.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.02.062

154 SOCHA, P. - RAŽDÍKOVÁ, A.- URMINSKÁ, D. 2010. Optimalizácia

stanovenia prítomnosti celiakálne aktívnych bielkovín v cereáliách. In:

Potravinárstvo, ročník 4. Feb. 2010. p 497-508. Dostupné na internete:

http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/5/Socha.pdf

155 URMINSKÁ, D. 1997. Biotechnológia prípravy bakteriálnych Ser-proteáz a ich

biochemická charakteristika: Habilitačná práca. Nitra: SPU. 1997, s. 70.

156 VANDENPLAS, Y. 1995. The use of hydrolysates in allergy prevention

programmes. In: Eur. J. Clin. Nutr. vol. 49, 1995, no. 1, p. 84 – 9. PMID:

8647068

157 VISHWAS, D.M. – NARAYAN, J.S. – PADMANABHKURUP, H. 2007

Patentový dokument WO/2007/080599 : Enzymatic process for debittering of

protein hydrolyzate using imobilized peptidases. PCT/IN2006/000025. Pu. Date:

July 19, 2007. Dostupné na internete :

70

http://www.sumobrain.com/patents/wipo/Enyzmatic-process-debittering-protein-

hydro/WO2007080599.html [cit.12.12.2009]

158 VODRÁŽKA, Z. Biochemie 1, 2, 3. - 1. vyd. Praha : Academia, 1993. 506 s.

ISBN 8020004386.

159 VODRÁŽKA, Z. – RAUCH, P. – KÁŠ, J. 1998. Enzymologie. 3. preprac.

Vydanie, Praha: VŠChT, 1998, 171 s. ISBN 8070801247

160 VOET, D. – VOET, .J.G. 2004. Biochemistry. Printed in the United States of

America, 2004. 1523s. ISBN 0-471-19350-x.

161 WAGSTAFF, C. – LEVERENTZ, M.K. – GRIFFITHS, G. - THOMAS, B. –

CHANASUT, U. - STEAD, A.D. – ROGERS, H.J.2002. Cysteine protease gene

expression and proteolytic activity during senescence of Alstroemeria petals. In:

J. Exp. Bot. Vol.53, 2002, no. 367, p. 233-240. Online ISSN 1460-2431.

162 WANG,J.- ZHAO, M. - JIANG.Y. 2007. Effects of Wheat Gluten Hydrolysate

on Dough Properties. In: Food Technol. Biotechnol. Vol. 45, 2007, no.4, p. 410–

414. ISSN 1330-9862.

163 WANG, S. J.- ZHAO,M. M. - BAO, Y.- HONG, T.- ROSELLA, C.M. 2008.

Preparation and characterization of modified wheat gluten by enzymatic

hydrolysis-ultrafiltration. In: Journal of food biochemistry. vol.32, 2008, no.3, p.

316-334.  ISSN 0145-8884.

164 WEI, Q. – ZHIMIN, H. 2006. Enzynatic hydrolysis of protein: Mechanism of

kinetic model. In: Journal Frontiers of chemistry in China. Vol.1, 2006, no.3, pp

308-314. ISSN 1673-3614(online).Dostupné na internete:

http://www.springerlink.com/content/441119195516572m/

165 VIOQUE, J. – CLEMENTE, A. – SANCHEZ VIOQUE, R. – PEDROCHE, J. –

MILLAN, F. 2000. Effect of AlcalaseTM on olive pomace protein extraction. In:

J. American Oil Chemists´ Society, vol. 77, 2000, no. 2, p. 181- 185. ISSN 1558-

9331 (Online).

71

166 WITCZAK, M. - PTASZEK, A. - MUDZIN´SKI, D. Z. - SURÓWKA, K. –

GRZESIK, M. 2005. Rheological and AFM Characteristic of Hydrolysates

Produced by Limited Enzymatic Hydrolysis of Soy Flour Extrudates. In: Chem.

Pap. Vol. 59, 2005, no. 6b, p. 491—495. dostupné na internete:

http://www.chempap.org/papers/596ba491.pdf [cit. 3.2.2010]

167 WRÓBLEWSKA, B. - JĘDRYCHOWSKI, L. - SZABÓ, E.- HAJÓS, GY. 2005.

The reduction of cow milk proteins immunoreactivity by two-step enzymatic

hydrolysis. In: Acta Alimentaria. Vol. 34, 2005, no. 3, p. 307- 315. Online ISSN

1588-2535

168 YALCIN, E. – CELIK, S. 2007. Solubility properties of barley flour, protein

isolates and hydrolysates. In: Food Chemistry. Vol. 104, 2007, no.4, p. 1641–

1647 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.03.029

169 YEBOAH, F. K. - ALLI, I. - SIMPSON, B. K. - KONISHI, Y. - GIBBS, B. F.

1999. Tryptic fragments of phaseolin from protein isolates of phaseolus beans.

In: Food Chem. vol. 67, 1999, no. 2, p. 105 – 112.

http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(98)00058-2

170 ZAKHAROVA, E. – HORVATH, M.P. – GOLDENBERG, D. 2009. Structure

of a serine protease poised to resynthesize a peptide bond. In: PNAS. vol. 106,

2009, no. 27, p. 11034-11039. Dostupné na internete:

http://www.pnas.org/content/106/27/11034.full#abstract-1 [cit.6.4.2010]

171 ZAYAS, J. F. 1997. Functionality of proteins in food. Springer-Verlag Berlin

Heidelberg New York. Pp. 373, p. 6. ISBN 3-540-60252-6.

172 ZEMANOVIČ, J. – ŠTOLFOVÁ, D. – SILLOVÁ, J. 1991a. Enzýmová

hydrolýza kazeínu v membránovom reaktore. In: Bulletin potravinárskeho

výskumu, roč. 30 (10), č. 4, 1991, s. 299 – 304.

173 ZEMANOVIČ, J – SILLOVÁ, J. – ŠTOLFOVÁ, D. 1991b. Enzýmová

hydrolýza proteínov. In: Bulletin potravinárskeho výskumu, roč. 30 (10), č. 4,

1991, s. 291 – 297

72

174 ZHANG, L. - LI, J. - ZHOU, K. 2009. Chelating and radical scavenging

activities of soy protein hydrolysates prepared from microbial proteases and their

effect on meat lipid peroxidation. In: Bioresource Technology. vol. 101, 2010,

no. 7, p. 2084-2089. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2009.11.078

175 ZHAO, X. - HOU, Y. 2009. Limited hydrolysis of soybean protein concentrate

and isolate with two proteases and the impact on emulsifying activity index of

hydrolysates. In: African Journal of Biotechnology. vol. 8, 2009, no.14, p. 3314-

3319. ISSN 1684–5315

176 ZHONG, F. – WANG, Z. – XU, S.-Y. – SHOEMAKER, CH.F. 2007. The

evaluation of proteases as coagulants for soy protein dispersion. In: Food Chem.,

vol. 100, 2007, p. 1371 – 1376.

Elektronické zdroje

http 1 PROTEIN FUNCTIONALITY. IFTSA

http://www.iftsa.org/outreach/so/tutorials/ProteinFunctionality.pdf [cit.

18.1.2010]

http 2 ENZYME NOMENKLATURE

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/intro.html [cit. 11.1.2010]

http 3 MEROPS databáza. http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/family_index?

type=P#S [cit. 1.1.2010]

http 4 DSM. Neutrase® 0.8 L Description.

http://www.dsm.com/en_US/html/dnpus/an_neutrase_8_l.htm [cit.2.2.2010]

http 5 DEERLAND http://www.deerland-enzymes.com/enzymes.php?id=45

[cit. 5.3.2010]

http 6 S.A. BIOCHEM EUROPE http://www.biochem-europe.be/produits-

en.htm [cit.20.12.2009]

73